（果树学专业论文）苹果柱型同普通型品种间基因表达差异的研究.pdf

摘要 本文选用柱型果树舞姿和普通型富士构建了f 1 群体，以这两种果树以及它 们的杂交后代为材料，应用e d n a a f l p 技术结合b s a 的方法，分析了这两类树 体基因表达的差异。 用6 4 对引物组合进行了e d n a a f l p 分析。反向n o r t h e r n 杂交鉴定后，有 表达差异的共有1 9 条，f 其中1 条是非柱型果树特有的( f 特有) ；9 条是柱型特 有的( w 特有) 。克隆了1 1 个差异c d n a 片段。) 经核苷酸序列分析，在g e n e b a n k 中运用b l a s t 软件进行同源型序列比较，有5 个片段在库中同其它基因同源。 f 它们分别同源于2 6 s 核糖体r n a 、烟草3 一脱氧一磷酸合成酶、拟南芥中小泡运 输蛋白m r n a 、e x p a n s i n ( 膨大素) m r n a 、p 7 0 0 光系统i ia 一无辅基蛋白中的 p s a a la n dp s a a 2 基因，) 。对a 7 、a 1 6 两个基因再进行n o r t h e r n 杂交，a 7 蛋白同 源于玉米中可能的细胞色素p 4 5 0 单加氧酶。它在富士、非柱型后代、柱型后代、 舞姿中表达依次减弱。a 1 6 在富士中表达最强，在舞姿中几乎没有表达。细胞 色素p 4 5 0 单加氧酶是赤霉素合成途径中一个限速酶，它在舞姿中表达水平低从 而引起赤霉素的合成受到抑制，导致e x p a n s i n 水平含量降低。p 4 5 0 单加氧酶基 因合成的突变或缺失可能同柱型习性有关。 抛：妒掣糊析c d n a y - a f l p 葡咙要棚墼兰撕 a b s t r a c t i nt h i st h e s i s ，f 1p r o g e n yc o l o n yw a sc o n s t r u c t e db yt h ep a r e r so fw a l t za n d f u j ia p p l e t r e e i no r d e rt o s t u d y t h e g e n ec o n t r o l l i n g c o l u m n a r h a b i t ，g e n e e x p r e s s i o np a t t e m s a r ec o m p a r e db e t w e e nw a l t za n d f u j ia p p l e t r e ea n dt h e i r p r o g e n y w i t hc d n a a f l pm e t h o d c o m b i n g w i t hb s a w i t he d n a - a f l pm e t h o d ，t h eg e n ee x p r e s s i o nd i f f e r e n c ei sa n a l y z e dw i t h6 4 p a i r so f p r i m e r s a f t e rr e v e r s en o r t h e r nb l o t t i n g ，t h e r ea r e1 9d i f f e r e n t i a lf r a g m e n t s i na 1 1 11d i f f e r e n t i a l c d n a 行a g m e n t sa r e c l o n e d a f t e r s e q u e n c ea n a l y s i s a n d g e n e b a n kc o m p a r i n g ，t h e r ea r e5c d n a f r a g m e n t sw h o s es e q u e n c e sa r er e l a t e dt o k n o w ng e n e s t h e ye a c hi sr e l a t e dt ot h ef o l l o w i n gg e n e ：p h o t i n i af r a s e r i2 6 s r i b o s o m a lr n a g e n e ，n i c o t i a n a t a b a c u m 3 - d e o x y d - a r a b i n o h e p t u l o s o n a t e 7 - p h o s p h a t es y n t h a s ec h l o r o p l a s tp r e c u r s o r ( d a h ps y n t h e t a s e1 ) ，p u t a t i v ev e s i c l e t r a n s p o r tp r o t e i na r a b i d o p s i st h a l i a n a ，p i s u ma t i v u mc h l o r o p l a s tp s a a la n dp s a a 2 g e n e sf o rp 7 0 0c h l o r o p h y l la - a p o p r o t e i n s a 1 6a n da 7a r ea g a i na n a l y z e db y n o r t h e m b l o t t i n g t h ee x p r e s sl e v e lo fa 7 r e d u c e dg r a d u a l l yi nt h eo r d e ro f f u j i ， f 1 p r o g e n y , c o l u m n a rp r o g e n y , w a l t z t h ea m i n oa c i do fa 1 6i s r e l a t e dt ot h e p u t a t i v ec ”o c h r o m ep 4 5 0m o n o o x y g e n a s e t h ee x p r e s s i o nl e v e lo f i ti st h eh i 曲e s t i nf u j i ，a n dt h el o w e s ti nw a l t z t h ei n h i b i t i o no f c ”o c h m m ep 4 5 0m o n o o x y g e n a s e c a l la f f e c tt h eb i o s y n t h e s i so fg a s ot h a tt h ec o n t e n to fg a i sl o w ，w h i c hc a u s et h e e x p a n s i no fl o wl e v e l t h em u t a t i o no rd e l e t i o no ft h e s eg e n e sm a y b er e l a t e dt o c o l u m n a rh a b i t k e yw o r d s ：a p p l e c o l u m n e x p r e s s i o na n a l y s i s e d n a a f l p 第一章文献综述 一差异表达基因克隆方法研究进展 1 引言 通过比较不同的组织、发育阶段和不同的环境下样品中m r n a 的含量，可以鉴定差异 表达的基因，这些基因可能有代谢或形态上的功能。随着分子生物学的发展，越来越多的 基因组序列信息被阐明，但同时，未知功能的基因序列也随之增加。由于未知功能基冈的 表达模式同己知功能基因的表达模式之间存在类似性，可能表它他们之间存在功能同源性， 所以基因的表达水平分析对鉴定有机体中未知序列的功能是非常有价值的。 利用基因表达之间的差异以及一系列的p c r 技术，人们建立起许多克隆基冈的方法： 如比较熟悉的差别筛选，差异显示法，e d n a a f l p 方法、代表性差示分析、抑制性筹减 杂交、以及用于人规模分析表达模式的序列表达分析和基因芯片技术等。 2 差异表达基因克隆方法简介( 原理、应用和优缺点) 2 1 差异筛选( d i f f e r e n t i a l s c r e e n i n g ) 本方法的原理是取不同组织或物种或不同环境诱导因素下同一组织的m r n a ，构建这 两种组织的c d n a 文库，然后以这些m r n a 为模板，合成放射性标记的e d n a 探针，将 e d n a 探针分别与表达目的基因的e d n a 文库进行杂交筛选，经放射自显影后可看到：含 目的基因的重组体克隆在x 光底片上均呈现黑斑，而不含目的基因的重组体菌落的x 光底 片在目的基因位置不呈现黑斑，由此对照原平板，便可挑出含目的基冈的菌落，再对这样 的克隆进行测序，鉴定，就可能分离到这种植物特异表达的基因。理论上，著别筛选能鉴 定任何著异表达的基因，但是，它对于高丰度的m r n a 而言是一种有效的方法，而低丰度 m r n a 克隆则很难用此方法检测出。鉴定低丰度的著异表达的方法是通过减法杂交富集底 丰度的e d n a 作为探针，进行文库的筛选。减法杂交的基本原理是以两种有差异表达的细 胞，从含有目的基因的一种细胞中提取m r n a ，作为模板制成探针，同过量的另一种不含 目的基因细胞的m r n a 杂交，形成d n a ：r n a 杂交分子，通过亲和层吸柱或生物素而分离 含有目的基因的e d n a ，得到的这个单链探针进行e d n a 文库的筛选或构建减法文库。 利用这个方法从植物细胞中鉴定低丰度m r n a 的一个典型的例子是二磷酸核酮糖羧 化酶的小亚基基因( r b e s ) 光敏素基因p a y 的e d n a 的克隆( b e d r o o k e t a 1 ，1 9 8 0 ；h e r s h e y e ta 1 1 9 8 4 ) 。 尽管差异筛选在目前克隆基因分离工作中仍广泛使用，但在实践应用中却存在诸多方 面的局限性，主要表现在：( 1 ) 灵敏度低，( 2 ) 该技术需要构建文库，需从文库中筛选人 量克隆，费事费钱，( 3 ) 减法杂交回收片断的效率低。 2 2m r n a 差别显示( m r n ad i f f e r e n t i a ld i s p l a y ) 此方法是l i a n g 和p a r d e e 于1 9 9 2 年首次报道的。其主要原理是利用大多数真核细胞 基因m r n a 的结尾处有多聚腺苷酸( p o l y a ) 结构，在其3 端设计p o l y t m n 引物( m 代 表g c t , n 为g c t a 中的任意一种) 以两类细胞株的r n a 为模板，各自进行逆转录反应， 然后用与反转录相同的锚定引物和1 0 个碱基组成的随机引物对生成c d n a 进行低温退火 的p c r 扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳在相邻泳道上平行显示扩增结果，电泳槽带使两类 细胞株的基因表达差异情况一目了然。然后把凝胶中含有差示d n a 片段的部分切出后网 收进行第二次扩增，将二次产物进行扩增测序，与基因库中己知基因序列做同源比较，或 以此克隆片段作为探针e d n a 在文库进行筛选，从而获得更大的d n a 片段甚至是完艇的 基因编码片段。差异显示技术的策略中刚一系列锚定引物与随机引物组合把不同种细胞进 行分组反转录与p c r 扩增，这样极微小的基因表达差异就可以被放人，通过电泳放射 j 显 影得以检测出来。由1 2 种p o l y t m n 或3 种p o l y t m 锚定引物合成的c d n a 可以代表细胞 中全部基因的表达种类和水平，而由引物组合所进行p c r 扩增则可将细胞之间有差异的基 因的表达片段显示出来。差别显示技术自1 9 9 2 年建立后，一直在不断进行着改进。如在 1 9 9 4 年，i t o 等对于3 端锚定引物的设计由固定两个碱基变为一个碱基固定的引物，这就 使原米1 2 种引物减至3 种即可( 5 t 1 2 g ，5 t 1 2 a ，5 t 1 2 c ) ，这样做减少了每个m r n a 样品对逆转录反应种类的需要，并且把由于简并性引起的某些r n a 的代表性差和r n a 数 最过多现象降低到最低程度；在随后的两年中，研究人员有在3 端引物和5 端随机引物末 端分别加上了限制性内切酶识别位点，使得5 端引物条数改为8 条，长度为1 3 b p ，而3 ， 端引物则由1 8 个碱基组成。此外，许多学者针对该技术在操作中假阳性高的问题，还从设 计对照，提取细胞质r n a ，更换放射性标记物以及改变p c r 反应条件等方面提出了相应 解决方案，以求这一技术得到进一步完善。 这一技术建立以来从微生物到人类基因的克隆得到了_ r 泛的应川。拟南芥基i n ( n a p ) 一系列c d n a 的克隆是用此方法得到的。它已被成功地用于分离臭氧诱导的植物基因的 e d n a ( s h a r m aa n dd a v i s ，1 9 9 5 ) 。在植物的不同的生长发育阶段，果实成熟时基因表达的 差异，肿瘤形成，种子发育的过程，各种环境条件下诱导表达的基因，与生物钟相关的基 因等都可以用此方法分离。 同差减杂交和差异筛选相比，它具有很多优点：( 1 ) 速度快，较易操作：( 2 ) 由于p c r 扩增技术的应用，使得低丰度m r n a 的鉴定成为可能，且灵敏度高；( 3 ) 可同时比较两种 以上不同的来源的m r n a 样品间基因表达的差异。尽管差别显示技术有以上诸多方面的优 点，但在实际操作中仍存在一些问题：( 1 ) 假阳性率高达5 0 左右，重复性著，使得后来 的鉴定l ：作任务加重；( 2 ) 需要的r n a 量较多；( 3 ) 理论上，这个方法能检测真核细胞中 9 5 的差异，但是实际上它的敏感性取决于引物序列和竞争模板结合位点的作用；( 4 ) 转 2 录的信号强度和起始m r n a 的浓度之间并没有很明确的关系，这就排除了域的芹异，使结 果不准确。 2 3r n a 指纹技术( r n a a r b i t r a r i l yp r i m e d p c r ，r a p - p c r ) 该方法于1 9 9 2 年几乎与d d r t p c r 同时报道( w e l s h je ta 1 ，1 9 9 5 ) ，且两者的原理 基本一致。首先从样本中提取总r n a ，用随机引物合成e d n a 的第一条链，再用同样的引 物p c r 合成e d n a 的第二条链，凝胶电泳可以显示全部p c r 产物，从中收回差异表达的 基因片段，进行克隆、测序。 该方法采用随机引物不但将o l i g o ( d t ) 逆转录m r n a ，也可将p o l y ( a ) 的结尾的m r n a 转录出米，避免了信息的丢失。有实验表明，r a p p c r 在一定的反应条件下，重复性相当 好，r n a 的浓度、d n a 的污染等均对结果无明显影响；组问条带的亮度差异在2 0 以上 即可定为基因有差异表达。但该方法需要较高的变性温度和较低的离子强度；并且随机引 物可能止好在某一类基因的保守区或分散的基因重复序列区，这样可能只扩增一类基冈。 然而，r a p p c r 在r a n 的多态性和不同的发育阶段r n a 表达类别的著异显示上却有其 用武之地。f o w l e r 等( 1 9 9 8 ) 用这个方法分析了紫花苜蓿胚胎形成时早期基因表达变化。 2 4r c 4 d ( r f l p c o u p l e d d o m a i n - d i r e c t e dd i f f e r e n t i a ld i s p l a y ) f i s h e r 等于1 9 9 5 年把d d p c r 在技术与限制性片段氏度多态性( r f l p ) 结合起来， 建立了r c 4 d 技术。它的主要原理是从样品中提取r n a ，用一个o l i g o ( d t ) 日i 物和一个p c r 卜游引物来合成第一链e d n a 。在双链e d n a 的合成过程中，j l hp c r 下游引物和根据家族 特定区域设计的引物( f a m i l y s p e c i f i c d o m a i n s ) 进行p c r 扩增，从而产生了一个平端的家 族e d n a 。然后用一种识别位点比较多的酶酶切在双链e d n a ，连上接头，p c r 用一个接 头引物和f s d 引物进行扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离差异片断。 这个技术主要用来分析不同发育阶段，不同组织和不同有机体内多基冈家族的表达情 况。这个方法第一个应用到分析玉米雌性和雄性花序m a d s b o x 基冈家族( f i s h e re l a 1 。1 9 9 5 ) 。它与d d p c r 技术相比，有以下特点：( 1 ) r c 4 d 引物设计是根据 f s d ( f a m i l y s p e c i f i c d o m a i n s ) 序列设计的，引物较眭且特异性好，克服了较短的随机引物在 重复p c r 扩增时对参数的过分依赖：( 2 ) 筛选出来的基因属于特定的基因家族，而且筛选 出的基因在n o r t h e r nb l o t t i n g 上能完全重现，所以，可避免不必要的重复性实验；( 3 ) 此 方法分离出来的e d n a 二次扩增后可赢接测序，避免了孤克隆，而且其序列不可能位丁3 端非翻译区，避免了d d p c r 筛选出的片段有时不能提供信息的可能：( 4 ) d d p c r 剑目 前为t h 还只是一个定性的方法，而r c 4 d 提供的的是一个半定量的结果；( 5 ) 这个方法的 一个主要限制是它需要一个位丁3 基因上游的保守区。 3 2 5c d n a a f l p( c d n a a m p l i f i e d r e s t r i c t i o n f r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ) 1 9 9 5 年z a b e a u 等发展了一种新型的分子标记，即扩增片段长度多态性( a m p l i f i e d f r a 哪e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，a f l p ) 。a f l p 结合了随机p c r 和特异p c r 的优点，能同 时揭示基因组d n a 多个限制性片段的长度多态性。此项技术设计了针对两种限制性内切 酶的通用接头以及可与接头序列和限制性酶切位点的序列配对的专用引物。在检测a f l p 时，先用两种内切酶( 一般采用识别位点分别为6 个和4 个碱基的两种内切酶，以产生较 小的酶切片段) 酶解基因组d n a ，再将接头连接到所产生的限制性片段两端，然后用特定 的引物扩增连接后的限制性片段和混合物，最后通过电泳显示扩增片段。a f l p 所用的专 _ h j 引物在酶切位点序列的3 端还延伸出数个脱氧核苷酸，这些核苜酸的数目和碱基组成决 定了a f l p 产物的特异性和数量。冈此，a f l p 兼具r f l p 和r a p d 两种方法的优点，而 且a f l p 能提供比r a p d 和r f l p 更多的基因组多态性信息。鉴于a f l p 的这些优点，近 年来a f l p 己在遗传多样性研究、种质鉴定、遗传图谱的构建和基因定位上获得了成功的 应用。以a f l p 为基础，b a c h e m 等( 1 9 9 6 ) 发展了一种新的r n a 指纹技术，即c d n a a f l 只 并川这种技术筛选到一些在马铃薯块苇发育中特异表达的基冈。c d n a a f l p 的基本方法 是分别提取两种材料的r n a ，用逆转录酶和多聚d t 引物合成c d n a ；用两种限制性内切 酶( 识别位点分别为6 个和4 个碱基的酶) 消化后，接上接头( 由核心序列、酶特异序列、 延伸序列三部分组成) ，以相应的接头为引物，先用p c r 预扩增，然后以一个和多个特定 的碱基为引物，p c r 选择性扩增，跑变性测序凝胶电泳，指纹图谱由放射性标记的一个引 物产生，回收筹异条带，用做探针去筛选c d n a 文库或克隆进质粒载体，进行测序来获取 目的基冈。 h a b u 等( 1 9 9 7 ) 比较了l p o m o e ap u r p u m a 的两个品系中花芽的差异表达并得到了一些 c h a l c o n e 合成酶基因( 在f l a v o n o i d 生物合成途径中一个关键酶) 。同差异显示相比较，此 方法有很多优点。( 1 ) 因为在c d n a 连上接头后首先进行预扩增，所以只需少量的起始r n a 样品；( 2 ) 因为预扩和选扩中用特定的引物和街头，所以假阳性极低，重复性好；( 3 ) 因 为带的强度是模板含量的直接体现，所以可以确定基因之间量的差异。这个方法的不足之 处是在c d n a 分子上需要合适的酶切位点。用不同的酶切组合，可能产生的转录模式不一 样。c h r i s t i a nw b 等( 1 9 9 8 ) 对各种参数进行了系统的分析和优化，h h a r l i n g s 等( 1 9 9 9 ) 针对 c d n a - a f l p 在不相似的基因库之间克隆基因可行性这个问题，从限制性内切酶的选择、 酶的消化温度及引物设计上又做了一些修改，使c d n a a f l p 的可行性更高。 2 6e d n a 代表性差示分析( c d n a r e p r e s e n t a t i o n a ld i f f e r e n c ea n a l y s i s ) e d 4 代表性差示分析是通过突变型( 驱动d n a ，d r i v e r ) 与野生型( 检测d n a ，t e s t e r ) 基因组之间的差异比较来分离和鉴定突变基因的方法。此项技术最早由h u b a n km 和s e h a t dg 下1 9 9 4 年将其应用于克隆差别表达基因上，获得了成功。以野生型基因组c d n a 为 t e s t e r ，而突变型c d n a 为d r i v e r ，可获得缺失序列，相反以突变型e d n a 为t e s t e r ，野生 c d n a 为d r i v e r 可获得重排和扩增的基因。此方法的基本过程是：( 1 ) 检测c d n a ( d r i v e r ) 和驱动c d n a 的制备：提取正常或突变型材料的r n a 反转录成c d n a ，分别崩同一种识 别4 碱基序列的限制性内切酶切割，连上含有酶切位点的寡核苷酸接头，并以接头为引物 进行p c r 扩增，将大小不等的c d n a 片段分离纯化；将此酶接头切除，再连上另一组含有 该酶酶切何点的接头制成检测c d n a ，异常或正常基因组c d n a 切f 接头后，不在连上另 一组接头，制成驱动c d n a ，形成的平均疑度为2 5 6 b p 的c d n a 片段代表群，保证了绝大 多数遗传信息均能被p c r 扩增；( 2 ) 液相杂交：将t e s t e r 与大大过晕的d r i v e r ( 1 ：1 0 0 2 0 0 ) ， d r i v e r 过量的目的是使用t 群中特异性序列没有遗漏的可能；在适当的缓冲体系中高温变 性，低温复性后出现四种情况的组合d n a 片段：自身退火形成的t e s t e r d r i v e r ，两端均能 和引物配对，产物双链d n a 数量星指数递增。t e s t e r d r i v e r 杂交体只能是单引物扩增，产 物为单链d n a 分子，其数量呈线形递增，d r i v e r d r i v e r 杂合物由于分子两端没有与新引物 配对区而无法进行扩增：t e s t e r 和d r i v e r 单链片段；( 3 ) 特异片段的富集：去掉单链d n a 分子，差异双链c d n a 便完成了第一轮富集。实验中使用过量d r i v e rd n a 目的是充分使 用t e s t e rd n a 中和d r i v e rd n a 相同的片段进行杂交，酶解去除，只有差异双链的c d n a 经p c r 几轮循环得以有效富集。r d a 充分发挥p c r 以指数形式扩增的双链模板。而以线 性形式扩增单链模扳的特性，通过消减和富集，使得目的基因片段得剑特异性扩增。 北京人学朱玉贤( 1 9 9 7 ) 等人采用r d a 法，比较赤霉素( g a ) 处理前后g 碗豆细胞 内基因表达的差异，已经克隆到与碗豆短日不衰老性状相连锁g a 诱导表达p p f - 1 基因。 r d a 无疑在引物设计上是十分巧妙的，它的优点是可重复性好，假酐| 性少。由于模板 d n a 的复性和扩增都在7 2 * ( 2 进行，排除了c d n a 的非特异性扩增。因此，用此方法得到 的d n a 差异性片段做探针进行后续的t 作成功效率较高。但是，这种方法的缺点是( 1 ) 实验组低丰度的分子自身杂交的几率很低，所以被扩增和克隆的几率仍很低；( 2 ) 酶切连 接步骤太多，e d n a 会损失很多，所以可能漏掉关键基因；( 3 ) 需要较多的起始材料，更多 依赖于p c r 技术，不可同时进行数个材料之间的或不同处理之间的比较；对材料的要求也 较高，材料之间不能存在过多的差异，存在小片段缺失时也不能检测。 2 7 抑制性差减杂交( s u p p r e s s i o n s u b t r a c t i o nh y b r i d i z a t i o n ) 由于r d a 存在的缺点，d i a t c h e n k o l 等( 1 9 9 6 ) 提出了一种克隆基冈的新方法一抑制 性差减杂交( s s h ) 。该方法运用了杂交动力学原理，即丰度高的单链c d n a 在退火产生同 源杂交速度快丁丰度低的单链e d n a 。从而使原来在丰度上有差别的单链c d n a 相对含量 p c r 达到基本一致。而所谓抑制p c r ，则是利用链内退火优先于链问退火，从而使非目的 序列片段反向重复序列在退火时产生类似发卡互补结构无法与引物配对，从而选择性抑制 了非目的基冈片段的扩增。 其具体过程是：提取两种细胞内的m r n a 反转录成c d n a ，酶切后得到t e s t e r 与d r i v e r 样本的平末端c d n a 片段。将t e s t e re d n a 均分两份，分别接上接头1 ( a d a p t o r l ) 和接头 2 ( a d a p t o r 2 ) 。接头设计上由一长链( 4 0 n t ) 和一短链( 1 0 n t ) 组成的一端是平端的双链d n a 片段，长链3 、端与c d n a 5 端相连。长链外侧序列( 2 0 n t ) 与第一次p c r 引物相同，而 内侧序列与第二次引物相同。此外，接头上含有t 7 启动子序列及内切酶识别位点，为以 后连接克隆载体和测序提供方便。用过量d r i v e r 样品分别与两份t e s t e r 样品进行第一次筹 减杂交，分别得到4 种产物。这种不充分杂交使得单链e d n a 分子在浓度上基本相同。同 时由于t e s t e re d n a 与d r i v e rc d n a 序列相同片段大都形成异源双链，使得t e s t e rc d n a 中差异表达基因得到第一次富集。混合两份杂交样品，同时加入新的变性d r i v e re d n a 进 行第二次差减杂交，此次杂交只有第一次杂交后经差减和丰度均等化的单链t e s t e rc d n a 能与d r i v ee d n a 形成双链分子。这一次杂交进一步富集了差异表达的c d n a ，并且还形成 了两个5 端分别接不同接头的双链分子；5 填平末端，假如根据接头长链序列设计的内、 外侧引物进行p c r 扩增。第一次p c r 是基于其抑制效应。只有两端分别是接头1 和接头2 的具有差别表达的序列片段得以指数扩增。第二次p c r 极大提高了扩增的特异性，使得差 异片段得到大量富集，并可用于后续的筛选工作。 此方法目前在医学上尤其是肿瘤方应用比较多。s h r i d h a rv ( 2 0 0 2 ) 采用s s h 方法对子 房瘤早期和晚期表达的基因进行了比较。 s s h 自从在克隆基因的实验采用以来，其优势是非常明显的，主要表现在：( 1 ) 因为 被扩增和克隆的双链c d n a 的每条链来源于第一次杂交的不同体系而且义进行了第二次杂 交，所以具有很高的特异性。( 2 ) 具有高度灵敏性，由于在反应中将丰度不同的单链分子含 量归一化，保证m r n a 检测成功。( 3 ) s s h 方法在一次反应中，可同时分类出上百个差异 表达的基因，这一点远远胜于d d r t - - p c r 和r d a 。当然，s s h 缺点与r d a 法相似：实 验组中带不同接头的低丰度单链e d n a 与互补链杂交的几率很低，不易被扩增克隆：加接 头过程中会有e d n a 损失；对起始材料要求较多，在数量上需要几微克m r n a ，因此对于 来源样本困难的采用此方法可行性差。但s s h 仍是目前较有效的克隆目的基因的新方法。 2 8 获得全长基因的消减杂交法( f u l ll e n g t h g e n es u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n l 这个方法是z h a o 等1 9 9 8 年首先建立的。其原理是分别将实验组和扣除组的m r n a 反转录，其中对于实验组，利用m r n a 的3 p o l y ( a ) , 尾和5 g g g 帽结构分别在c d n a 两 6 端加上序列相同的锚定引物，对丁：扣除组，将其c d n a 进行随机引物p c r 扩增制各扣除探 针，同时掺入生物素( b i o t i nd u t p ) 然后将实验组的c d n a 生物素的扣除探针进行液相杂交， 杂交反应物用连有链亲和素的磁珠吸附掉杂交体及未杂交上的扣除探针，得到实验组独有 的c d n a ，然后用锚定引物将其扩增并克隆。这种方法有两大优点：杂交后未杂交上的实 验组单链c d n a 可直接作为模板被扩增，所以低丰度的c d n a 被扩增克隆的几率大大提高 可以直接获得全长c d n a ，使获得功能基因的速度大大加快。 2 9 差异消减展示( d i f f e r e n t i a ls u b t r a c t i o nd i s p l a yd s d ) 差异消减显示( d s d ) 是1 9 9 8 年j o s e 等针对差异显示的缺点而提出的改进方法。此方法 可显著降低假阳性，增强重复性及敏感性，同时保持了对轻度、中等程度改变的对r n a 的识别。它的最大改进是：在d d r t p c r 出现差异条带后，克隆差异条带之前，先对p c r 扩增产物进行差减杂交，即在回收目的差异条带的同时，回收对方响应范围内的条带。回 收的差异条带用非生物素标记的引物与d n t p 扩增，其p c r 产物进行消减杂交，用链亲和 素一生物素磁珠分离系统去除杂交产物，剩下的产物由带有“p d a t p 的d n t p 进行扩增， 可重复差异显示，增加差异条带的特异性。 此项技术最大的优势是获得的差异条带在r n a 印迹上重现性好，保持了中等程度改 变的差异表达基因的出现与克隆。特别是长距离p c r 的应川，使得此项技术有可能成为目 前筛选差异表达基因比较有效的方法。它的唯一缺点是步骤繁琐，工作量大。 2 1 0 交互差减r n a 差别显示技术( r e c i p r o c a ls u b t r a c t i o nd i f f e r e n t i a lr n a d i s p l a yr s d d ) 交互差减r n a 差别显示技术是由k a n g 等( 1 9 9 8 ) 最新提出的结合差减杂交和差别显示 两项技术发展而出的一种有效、快速分离差别表达基因的方法。该方法应用于肿瘤鉴定的 研究，可鉴定和克隆己知的和高比率的未知序列，这包括作为增强和一致表达进展功能的 c d n a s ，分别成为增强进展基因( p e g e n ) 和一致进展基因( p s g e n ) 。目前通过交互差减 r n a 差别显示技术已鉴定出了1 6 条差别表达的基因，其中有5 条为未知的p e g e n ，6 条 为未知p s g e n 。该方法主要由三部分组成： 交互差减( r e c i p r o c a ls u b t r a c t i o n ) ：首先是要获得两个具有差别基因表达的细胞系的 e d n a 文库，然后将这两个文库进行交互差减杂交，从而获得两个差减c d n a 文库，随后 通过体内剪切得到质粒c d n a 文库。 差异显示( d i f f e r e n t i a ld i s p l a y ) ：由差减杂交e d n a 文库获得的纯化质粒可直接进行差 异显示，p c r 扩增和进行5 序列凝胶电泳并切割回收差异条带。扩增斤的d n a 片段转 膜，并分别与米自两个不同细胞系总r n a 经反转录制备”p 标记的c d n a 进行杂交。 r s d d 目前被证实对丁有效且快速鉴定发生在复杂基因组以及细胞生理变化中表达分 析( e x p r e s s i o nd i s p l a y ) ：运用反向n o r t h e m 印迹分析( r e v e r s e n o r t h e r nb l o t t i n g ) 雨n o r t h e r n b l o t t i n g 分析鉴定经在扩增的d n a 片段的差异表达。反向n o r t h e r nb l o t t i n g 是将差异显示得 到的扩第一链探针进行杂交。2 3 4 条再次扩增的d n a 片段中有1 8 1 条被探测到( 7 7 ) ， 其差异表达显示水平比两种细胞间n o r t h e r nb l o t 分析要高1 8 倍。最后经n o r t h e r nb l o t t i n g 分析得到两种细胞系差别表达的d n a 片段被克隆到载体上进行测序分析。 2 1 l 基因芯片技术 基因芯片技术，也称为微阵列杂交技术( e d n am i c r oa r r a yh y b r i d i z a t i o n ) 。此方法首 次应_ i n | j 到拟南芥中( s c h e n ae ta 1 ，1 9 9 5 ) 其原理是将大量的探针分子固定于支持物上，后与 标记的样品c d n a 进行分子杂交。根据杂交结果来判断基因的表达情况。其主要方法是将 待分析的样品分离，扩增，标记：芯片制各：样r i ! 与芯片进行杂交；检测杂交结果。 基因芯片技术第一次运用到拟南芥根和芽的差异表达分析上( s c h e n ae ta 1 ，1 9 9 5 ) 。r u a n 等( 1 9 9 8 ) _ _ i j 微阵列杂交技术分析了拟南芥中不同器官和不同发育阶段基因的表达情况。基 因芯片在基因表达检测，寻找新基因，d n a 测序，突变体和多态性的检测等方面有重要的 应用。 此项技术的晟大优点是一次能分析大量的样品，而且敏感性较高。其缺点是所需要 的步骤比较繁琐，制各样品比较麻烦，且所需仪器设备比较昂贵。 2 1 2 基因表达的序列分析( s e r i a la n a l y s i so f g e n ee x p r e s s i o n ) 基因表达的序列分析( s a g e ) 是v e l e u l e s c u 于1 9 9 5 年建立的大规模的检测基因之间表 达差异的方法。主要通过两种限制性内切酶( 锚定酶和标签酶) 对双链c d n a 进行酶解，获 得短的序列标签f 9 1 0 b p ) ，将其分离，接双标签，克隆，测序计算机软件处理，掌握标签 数并通过查阅g e n b a n k 获得标签代表基因的表达丰度。它的基本原则是短标签( 9 b p i o b p ) 是从一个转录本内的精确位置处分离得到，含有识别转录本的充分信息；连接短标签， 在单一克隆中对它们测序，便可以个系列方式有效分析多个转录本。s a g e 的主要步骤： 1 提取m r n a ，以o l i g o d t 为引物合成d s c d n a ；2 锚定酶酶解生物素标记的d s c d n a ；3 磁珠分离带有标记的e d n a 3 端酶解片段；4 酶解片段与设计好的两种连接子分别结合；5 使用标签酶( 1 y p es 酶) ，释放c d n a 标签：6 连接标签成双标签：7p c r 扩增烈标签：8 分 离、连接双标签并克隆、测序。通常用有4 b p 识别位点的限制性内切酶( 锚定酶) 酶切c d n a ， 因为平均每2 5 6 b p 切割一次，这一范围内大多数转录本被认为是最大的。t y p es 酶在距其 不对称识别位点2 0 b p 处精确切割。连接子的设计考虑用标签酶切割连接产物后可以释放含 有短片段c d n a 的连接子。双标签序列的扩增以非常完整的方式提供标签序列的定位和间 隔。扩增产物含有2 个尾尾相接的标签( 一个d i t a g ) ，亦有锚定切点。使得最终在测序模板 上，每两个双标签问有4 b p 的间隔。尤其重要的是双标签分析进行丁扩增步骤之前，以保 8 证彻底消除扩增可能引起的混乱。适合的标签数决定于实际所需；使用不同的锚定酶，将 保证有效地识别预测丰度的转录本。 v e l c u l e s c u 等人用s a g e 方法分析了酵母基因组基因，得到代表4 6 6 5 个基因的6 0 6 3 3 个转录本，可显示的表达水平为平均每个细胞0 , 3 到2 0 0 多个转录本。p o l y a k 研究了p 5 3 诱导的细胞凋亡，与对照组相比，识别的7 2 0 2 个转录本中，在有p 5 3 基因表达的细胞内， 只有1 4 个( o 1 9 1 转录本明显增高。就此发现了这1 4 个转录本代表的基因依赖于p 5 3 蛋白， 在细胞凋亡的过程中起作用。m a t s u m u r ae ta l1 9 9 9 年完成了第一例高等植物的s a g e 分析。 研究了水稻幼苗中大约6 0 0 0 个基因的1 0 ，0 0 0 多个标签，发现了一个金属硫囚基囚。 s a g e 分析基因表达的程度可同基因芯片技术相比，也能分析低丰度的m r n a ，检测 转录产品之间微小的差异。它有两个比基因芯片技术更好的优点：可以分析未克隆的d n a ； 而且除了一台测序仪外，不需要特殊的仪器；由于s a g e 克隆只包含2 0 5 0 个标签，所以 一个典型s a g e 的文库比基因芯片技术中的c d n a 克隆文库建立要容易。s a g e 另一个特 点是它的数据输出系统使分析较为简单。但是在得到9 b p 的标签序列过程中，技术上的不 完善和技术本身存在的缺陷，使这个技术的应用性不如芯片技术应用性广，但是这些问题 一直在改进着。 尽管这些方法都可以应用于差异表达分析，但是它们也有特定的优势在某一方面。如 果是检测数量性状表达的差异，一般应用基因芯片技术和序列表达分析。如果是检测 质量性状表达的基因或想克隆差异表达的基因，一般应用c d n a a f l p 和d d r t 技术。 上述所讨论的差异表达方法都会在分析时产生过多或不足的数据。原冈可能是一个 m r n a 转录的信号不止一个。差异表达技术只能提供稳定的m r n a 的表达情况，而不能检 测在植物基因调控中其重要作用的后转录的基因表达情况。例如，m r n a 稳定性的改变， 蛋白质( 去) 磷酸化的翻译效率。 二柱性苹果的研究进展 l 柱型苹果来源 柱型苹果( c o l u m n a r a p p l e ) 是独干、短枝和极紧凑树型的苹果新品种类型。第一代 柱型苹果品种威赛克( w i j c i km c i n t o s h ) 是1 9 6 1 年在加拿大b r i t i s hc o l u m b i a 省某苹果 园一株5 0 年生的旭( m c i n t o s h ) 树上突变而来的( l a p i n s ，1 9 7 4 ；1 9 7 6 ；k e l s e y e ta 1 ，1 9 9 2 ) 。 因为它的特殊的树型，所以威赛克的出现立即引起了果树育种学家的极大兴趣，许多人开 始从事柱型苹果品种选育的研究。7 0 年代初，由英国东茂林园艺植物研究所t o b u t t 最早负 责实施全面而系统的柱型苹果品种育种计划。1 9 8 5 年育成了舞乐( b a l e r oo rt u s c a n ) 、舞 9 佳( p o l k ao rt r a j a n ) 、舞姿( w a l t zo rt e l a m o n ) 、舞美( m a p y p p o l e ) 四个种。经过三年 的实验后，1 9 8 8 年注册登记专利，并定其商品名为“芭蕾苹果”( b a l l r i n aa p p l e ) 。1 9 8 9 年 邑蕾苹果在英国c h e l s e a 博览会上首次公开展出，轰动了整个园艺界。 2 柱型苹果的生物学特性 2 1 生长、结果特性 株型苹果节间极短( 1 5 i c m ) ，萌芽率特高( 3 8 3 ) ，成短枝力和成叶从枝力非常强， 叶片大而厚，叶色深，叶片栅栏组织发达，光合性能强。树体呈自然单干形，即所谓独干。 干上着生人姑短枝叶从枝，极少或无侧生延长枝。柱型苹果的整个树冠是一个瘦高的圆柱 体，8 年生树高24 3 2