（生物化学与分子生物学专业论文）粘细菌次级代谢生物合成基因的功能研究.pdf

；。 啊 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用 过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示了谢意。 研究生签名：殓直蓬 日 期：鲨坦：6 ：! 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的 复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内 容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可 以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研 究生院办理。 研究生签名：淦壹蓝导师签名：日期：独：! ：! 中文摘要 粘细菌次级代谢生物合成基因的功能研究 研究生冷晓燕指导老师毛晓华教授 东南大学生命科学研究院 发育与疾病相关基因教育部重点实验室 中文摘要 目的： 粘细菌作为一类重要天然产物的产生者，可产生异常丰富的次级代谢产物，在微生 物新药的开发研究中是极好的菌种资源。粘细菌d k l 6 2 2 基因组测序发现存在至少1 8 种 次级代谢产物生物合成基因簇，绝大多数编码聚酮合成酶( p k s s ) 和非核糖体肽合成酶 ( n r p s s ) ，但大部分生物合成基因所编码的代谢终产物还不清楚( 称孤儿生物合成基 因簇) 。本论文试图弄清几个孤儿生物合成基因所编码的末端产物，分析基因的功能， 为挖掘粘细菌次级代谢编码潜能，进而寻找新的先导化合物或生物活性物质做些探索。 方法： 本实验使用逆转录p c r 技术对三个次级代谢生物合成基因( m x 3 7 7 9 、m x 4 5 9 2 、 m x 3 6 2 0 3 6 2 1 ) 的表达情况进行了研究。随后通过同源重组在基因编码区上游定向插入 n e o 启动子，构建启动子定向整合菌株；同时构建了基因阻断菌株。通过高效液相色谱一 二极管阵列全波长扫描分析基因阻断菌株、启动子定向整合菌株和野生型菌株的代谢图 谱的差异来鉴定相关天然产物。 结果： 1 利用逆转录p c r 分析孤儿生物合成基因表达情况，在野生型菌株中，m x 4 5 9 2 和 m x 3 6 2 0 不表达，m x 3 7 7 9 有微弱的表达。通过同源重组分别获得了m x 3 7 7 9 、m x 4 5 9 2 、 m x 3 6 2 0 的启动子定向整合菌株和基因阻断菌株。 2 在两个已用逆转录p c r 检测的启动子定向整合菌株中，m x 3 7 7 9 表达明显增强， m x 4 5 9 2 开始表达。 3 在本文所采用的发酵条件下，高效液相色谱一二极管阵列全波长扫描分析 m x 3 7 7 9 、m x 4 5 9 2 基因阻断菌株、启动子定向整合菌株和野生型菌株的代谢图谱，没有 发现明显差异。 结论： 1 本实验构建了粘细菌三个孤儿生物合成基因m x 3 7 7 9 、m x 4 5 9 2 、m x 3 6 2 0 的启动 子定向整合菌株，引入n e o 启动子驱动后m x 3 7 7 9 的表达显著增强，m x 4 5 9 2 也由沉默状 东南大学硕士学位论文 态启动表达；本文还分别构建了三个孤儿基因的阻断菌株。这些工作为进一步研究粘细 菌孤儿生物合成基因的末端产物和功能奠定了基础。 2 现有条件下m x 3 7 7 9 、m x 4 5 9 2 表达菌株与阻断菌株的代谢图谱没有差异，其原因 可能是缺乏次级代谢产物生产所需的前体，也可能是产物在分离过程中丢失，或因为产 量非常低，“编码”的代谢产物根本上逃脱检测。因此，借助更灵敏的检测方法或通过 优化发酵条件及产物分离程序可望最终鉴定出孤儿基因编码的末端产物。 关键词：粘细菌，次级代谢，生物合成基因，表达，同源重组 i i 【) b j e c t i v e ： m y x o b a c t e r i u mc o u l dp r o d u c eq u a n t i t i e so fs e c o n d a r ym e t a b o l i cp r o d u c t s ，w h i c hm a k e i tt ob et h eg o o ds o u r c ei ns e a r c h i n gn e w d r u g s s c a n n i n go ft h em x a n t h u sd k16 2 2g e n o m e s e q u e n c er e v e a l e da tl e a s t18d i f f e r e n tb i o s y n t h e t i cg e n ec l u s t e r sf o rt h ep r o d u c t i o no f s e c o n d a r ym e t a b o l i t e s ，m o s to ft h e me n c o d i n gp o l y k e t i d es y n t h a s e ( p k s s ) a n dn o n r i b o s o m a l p e p t i d es y n t h e t a s e ( n r p s s ) b u tm o s to ft h ef i n a lp r o d u c t se n c o d e db yt h eb i o s y n t h e t i cg e n e s i su n k n o w n ( c a l l e do r p h a nb i o s y n t h e t i cg e n ec l u s t e r ) i nt h i ss t u d y , w e a t t e m p tt of i g u r eo u t f i n a lp r o d u c t sw h i c ha r ee n c o d e db yt h eo r p h a n b i o s y n t h e t i cg e n e sa n da n a l y s et h ef u n c t i o n s o ft h e s eg e n e s w ea l s oa t t e m p tt od os o m ee x p l o r a t i o nf o r d i g g i n gs e c o n d a r ym e t a b o l i t e b i o s y n t h e t i cp o t e n t i a l a n df u r t h e r f i n d i n gn e wl e a dc o m p o u n d so r b i o l o g i c a l a c t i v e s u b s t a n c e s m e t h o d ： w ea t t e m p t e dt oa n a l y z ee x p r e s s i o n so ft h r e es e c o n d a r ym e t a b o l i t eb i o s y n t h e f i c g e n e s ( m x 3 7 7 9 m x 4 5 9 2 m x 3 6 2 0 - 3 6 2 1 ) b yr t - p c r s u b s e q u e n t l y , n e o p r o m o t e rw a si n t r o d u c e d u p s t r e a mo ft h ec o d i n gs e q u e n c eb yh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n ，a n dg e n ed i s r u p t i o ns t r a i n w a sa l s oc o n s t r u c t e d h p l c - d a dw a su s e dt oa n a l y s et h es p e c t r u mo f s e c o n d a r ym e t a b o l i t e s p r o d u c e db yg e n ed i s r u p t i o ns t r a i n ，n e o p r o m o t e ri n t e g r a t e ds t r a i na n dt h ew i l d t y p es t r a i ni n f u l lw a v e l e n g t hs c a nt oi d e n t i f yt h ec o r r e s p o n d i n gn a t u r a l p r o d u c t s r e s u l t s ： 1 e x p r e s s i o n so fo r p h a nb i o s y n t h e t i cg e n e sw e r ea n a l y z e db yr t - p c r i nw i l d t ) ，p e s t r a i n ，m x 4 5 9 2a n dm x 3 6 2 0d i dn o te x p r e s s ，w h i l em x 3 7 7 9w a sw i t hw e a ke x p r e s s i o n b v h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n ，n e o - p r o m o t e ri n t e g r a t e ds t r a i na n dg e n ed i s r u p t i o ns t r a i no f i i i 东南人学硕士学位论文 m x 3 7 7 9 m x 4 5 9 2 m x 3 6 2 0w e r ec o n s t r u c t e d 2 i nt h et w on e o p r o m o t e ri n t e g r a t e ds t r a i n sh a v i n gb e e nd e t e c t e db yr t - p c r ， e x p r e s s i o no fm x 3 7 7 9w a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e da n dm x 4 5 9 2 s t a r t e dt oe x p r e s s 3 u n d e rt h ef e r m e n t i o nc o n d i t i o n so ft h i sp a p e r ，h p l c d a dw a su s e dt oa n a l y s et h e s p e c t r u mo fs e c o n d a r ym e t a b o l i t e sp r o d u c e db ym x 3 7 7 9 m x 4 5 9 2g e n ed i s r u p t i o ns t r a i n ， n e o - p r o m o t e ri n t e g r a t e ds t r a i na n dt h ew i l d t y p es t r a i ni n f u l lw a v e l e n g t hs c a n h o w e v e r c o m p a r a t i v em e t a b o l i cp r o f i l i n gr e v e a l e dn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ea m o n gt h e t h r e es t r a i n s c o n c l u s i o n ： i i nt h i ss t u d y , t h r e en e o p r o m o t e ri n t e g r a t e ds t r a i n so fo r p h a nb i o s y n t h e t i cg e n e s m x 3 7 7 9 m x 4 5 9 2 m x 3 6 2 0i nm y x o c o c c u sx a n t h u sw e r ec o n s t r u c t e d a f t e rn e o p r o m o t e rw a s i n t r o d u c e d ，e x p r e s s i o no fm x 3 7 7 9w a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e da n dm x 4 5 9 2s m g e d t oe x p r e s s f r o ms i l e n ts t a t e t h r e eg e n ed i s r u p t i o ns t r a i n sw e r ea l s oc o n s t r u c t e d t h e s ew o r k m a d eb a s i s f o rf u r t h e rs t u d yo ff i n a lp r o d u c t sw h i c ha r ee n c o d e db yt h eo r p h a nb i o s y n t h e t i cg e n e sa n d t h ef u n c t i o n so ft h e s eg e n e s 2 u n d e rt h ee x i s t i n gc o n d i t i o n s ，t h em e t a b o l i cp r o f i l e so fm x 3 7 7 9 m x 4 5 9 2g e n e e x p r e s s i o ns t r a i na n dd i s r u p t i o ns t r a i nr e v e a l e dn od i f f e r e n c e i ti sp o s s i b l et h a tb i o s y n t h e t i c p r e c u r s o r sr e q u i r e df o rt h ep r o d u c t i o no f t h es e c o n d a r ym e t a b o l i t ea r en o ta v a i l a b l e b e s i d e s ， p r o d u c t sm a ya l s ob el o s td u r i n gt h es e p a r a t i o np r o c e s s i ti sa l s op o s s i b l et h a tt h e e n c o d e d m e t a b o l i t e ss i m p l ye s c a p e dd e t e c t i o nb e c a u s eo fv e r yl o wa s s u m e dp r o d u c t i o ny i e l d s t h e r e f o r e ，b yt h eu s eo f m o r es e n s i t i v ed e t e c t i o nm e t h o d s ，o rb yo p t i m i z i n gt h ef e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n sa n dp r o d u c ts e p a r a t i o np r o c e s s e s ，i ti se x p e c t e dt oe v e n t u a l l yi d e n t i f yt h ef i n a l p r o d u c t sw h i c ha r ee n c o d e db yt h eo r p h a nb i o s y n t h e t i cg e n e s k e y w o r d s ：m y x o c o c c u sx a n t h u s ，s e c o n d a r ym e t a b o l i t e ，b i o s y n t h e t i cg e n ec l u s t e r , e x p r e s s i o n ，h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n i v 日u 文 第 第 第 第 参考文献 v 刖舌 ) 亡_ 1 日! j舌 微生物能够产生丰富的具有生物活性的天然产物。无数的抗真菌类，抗细菌类和抗 癌药物已经从这些菌中分离出来。但是随着越来越多的微生物药物被发现与分离，发现 具有新型作用机制和结构类型的药物日趋困难。然而日益严重的致病微生物耐药性正在 加速抵御已有药物的效力，人类必须加快研究开发新型药物。 粘细菌具有强大的次级代谢产生能力，超过1 0 0 种不同的基本化合物和大概5 0 0 种结 构衍生物已经被鉴定。这些次级代谢产物绝大多数结构新颖，作用机制多样，例如抑制 电子传输，破坏细胞骨架，抑制核酸聚合酶的活性等。粘细菌产生的次级代谢产物在其 他生物活性物质产生菌中极少发现，这使粘细菌成为新颖药物先导化合物的重要来源。 目前，基于全基因组测序工作，我们能从遗传水平上评价一种微生物的次级代谢产 物产生能力。黄色粘细菌d k l 6 2 2 基因组测序发现至少1 8 种次级代谢产物生物合成基因 簇，绝大多数编码聚酮合成酶( p k s s ) 和非核糖体肽合成酶( n r p s s ) ，但大部分生物 合成基因所编码的代谢终产物还不清楚( 称孤儿生物合成基因簇) 。本文选择3 个孤儿生 物合成基因簇进行分析，m x 3 7 7 9 是黄色粘细菌d k l 6 2 2 的一个编码聚酮合成酶月 核糖体 肽合成酶杂合蛋白的基因，m x 4 5 9 2 是一个编码非核糖体肽合成酶的基因，m x 3 6 2 0 3 6 2 1 是一个编码聚酮合成酶i ( t y p eip k s ) 的基因簇，它们的末端产物不清楚。本文拟弄清 这些基因所编码的末端产物，分析基因的功能，为挖掘粘细菌次级代谢编码潜能，进而 寻找新的先导化合物或生物活性物质做些前期探索。 本实验包括二部分，第一部分：构建启动子定向整合菌株和基因阻断菌株；第二部 分：通过高效液相色谱对次级代谢产物进行初步分析。 东南大学硕士学位论文 文献综述 孤儿生物合成基因的功能研究 许多具有药用价值的，研究比较透彻的天然产物是由两个大型的多功能合成酶，即 非核糖体肽合成酶( n r p s s ) 和聚酮合成酶( p k s s ) 催化合成的。这两种酶由不同的模 块组成，每个模块负责掺入一个特殊的前体。每个模块又由不同的结构域组成，每个结 构域催化聚酮或肽的骨架组装过程中的一步反应【lj 。一般来说，p k s 包括负载模块 ( l o a d i n gm o d u l e ) ，线性组织的多个中间模块，以及一个小的硫酯酶( t e ) 或释放域。 每个模块均含有几个结构域，其中酮基合酶( k s ) ，酰基转移酶( a t ) 和酰基载体蛋白 ( a c p ) 是聚酮链延伸所必需的。此外，模块中还可能含有l 3 个修饰酮基的结构域： 酮基还原酶( 1 ) ，h 脱水酶( d h ) 或k l h d h + 烯酰基还原酶( e r ) 。在n r p s 中 也有类似的模块结构，每个模块含有3 个必需的结构域：腺苷酰化结构域( a ) ，缩合 结构域( c ) 和肽酰载体蛋白结构域( t ) 。这3 种酶共同完成氨基酸单元的延伸。此外 各模块中还可能含有差向异构化、甲基化和氧化3 个修饰结构域【2 】。随着越来越多的基 因组测序的完成，微生物基因组中大量的次级代谢生物合成基因位点被发现，许多基因 编码聚酮合成酶( p k s s ) 和非核糖体肽合成酶( n i 冲s s ) ，但大部分生物合成基因所编 码的代谢终产物还不清楚( 称孤儿生物合成基因簇) t 3 1 。研究孤儿基因簇有助于更加深 入地理解次级代谢生物合成机制；有望发现有药用价值的生物活性天然产物或结构新颖 的药物先导化合物，用于研发新型药物，为人类的健康做出一点贡献。目前，有五种研 究孤儿生物合成基因功能的方法和策略。 一、生物信息学预测产物的化学结构 基因组的研究促进了次级代谢生物合成途径的发现，提高了预测孤儿基因相关产物 结构的能力。从无数生物合成基因簇的研究中，我们了解了次级代谢生物合成的基本原 则。结合生物信息学，完全有可能预测孤儿生物合成途径的产物。 生物信息学预测的第一步是用计算机尽可能正确地预测孤儿基因簇编码的产物的 化学结构。基于这些预测，就能够推测或至少估计一些物理化学特性，如质量范围，特 征性的紫外吸收谱，化合物的极性。这样，就能通过对试剂，层析材料尤其检测方法( m s ， u v ，e l s d ) 的选择来优化抽提和分级分离过程。许多情况下，结构搜索可以显示跟药 学活性物质家族有显著相似性或包含已知的药效团，甚至生物活性能被预测并应用于检 测p j 。这种基因组介导的方法，被证明是非常有效的，并已导致了一些新的代谢产物的 发现。来自粘细菌s t i g r n a t e l l aa u r a n t i a c as ga 1 5 菌株的孤儿生物合成基因簇，被预测参与 铁螯合化合物的生物合成，后来发现确实负责形成m y x o c h e l i n 【4 ，5 1 。在链霉菌s c o e l i c o l o r 2 文献综述 中，通过生物信息学分析，根据一个编码非核糖体肽合成酶的孤儿基因簇翻译序列推导 出了该n r p s 催化合成的三肽铁载体c o e l i c h e l i n 的总体结构【6 】，但是这些预测结果没有被 证实，直到三年以后，s y l v i el a u t r u 等人发现c o e l i c h e l i n 的合成需要由三个模块组成的 n r p s ( c c h h ) 和酯酶( c c h j ) 的参与，通过实验真正发现了该化合物 j 。 生物合成的共线性原则，即模块的数目和类型与延伸单元的数目和类型存在相关性 【8 j ，该原则被绝大多数例子证实了，但是越来越多不符合该原则的例子被发现。基本结 构域重排 9 , 1 0 】，模块跳跃，重复模块使用【1 1 1 ，翻译后修饰，这些背离导致了不精细的预 测也标志了该方法的局限性。 二、基因敲除结合代谢图谱的比较发现孤儿途径的产物 基因敲除也提供了一个有效的方法去发现孤儿生物合成途径的产物。一旦次级代谢 生物合成基因簇被鉴定，就可以通过阻断目的基因簇，然后将突变株的次级代谢产物图 谱与野生型的比较来鉴定相关天然产物。l c m s 或d a d h p l c 仪器被应用来比较次级代 谢产物图谱。m f i l l e r 和他的同事证明了该方法的有效性。基于n r p s 的筛选，在粘细菌 s t i g m a t e l l aa u r a n t i a c a 中发现了几个孤儿途径。通过d a d h p l c 分析比较基因敲除突变株 与野生型的代谢图谱发现了相关天然产物，即铁螯合物m y x o c h e l i n sa 和b 【1 2 】，五肽化合 物m y x o c h r o m i d e ss 1 _ 3 i l 引，聚酮化合物a u r a f u r o n sa 和b t l 4 1 。 基因敲除策略的优点首先是即使不能正确预测孤儿途径的产物，或只知道孤儿基因 簇的片段，该方法都能用；其次，直接证明了目的孤儿基因簇参与了所鉴定的化合物的 合成【3 1 。 三、基因组同位素方法( 基因组序列分析结合同位素标记) 寻找孤儿途径 的产物 基因组同位素方法( g e n o m i s o t o p i c ，g i ) 是研究n r p s 或n r p s p k s 杂合孤儿生物合成 途径的方法。一旦这样的基因簇被发现，相关的次级代谢产物或至少肽的一部分就可以 用生物信息学预测。接着，通过例如r t _ p c r 或n o r t h e mb l o t 分析孤儿基因簇是否表达。 然后，用生物信息学分析选出一个氨基酸，该氨基酸会被特异地引入到孤儿基因簇的最 终产物中。这种特殊的前体以同位素标记的形式如1 5 n 或1 札1 3 c 去饲养细菌，使用这 种前体的天然产物在分离过程中就能通过1 h - 1 5 no r1 札1 3 cn m r 被追踪网。 p s e u d o m o n a sf l u o r e s c e n sp f - 5 菌株基因组数据挖掘发现的n r p s 孤儿基因簇证明了该方法 的有效性【l5 1 。从基因组的序列分析发现该孤儿基因簇编码一个脂肽合成酶。然后，用生 物信息学分析显示亮氨酸是合成该孤儿基因簇相应产物的最佳前体。结合同位素标记， 1 5 n 境氨酸进行饲养，通过同位素介导的1 h _ 1 5 n h m b c 核磁共振检测发现了一类新的有 东南大学硕士学位论文 生物活性的环状脂肽o r f a m i d e sa ，b 和c i l 6 l 。 选择一个合适的氨基酸对该方法的成功是至关重要的。必须明确孤儿肽中的氨基 酸。因此，要做一个确认步骤，如亚克隆相关的腺苷酸化结构域并表达，然后用a t p p p i 交换实验i l 。7 j 或其他方法【l8 】来描述氨基酸的底物特异性。为了提供该研究的特异性，需要 了解相关的天然产物的氨基酸亚结构。而且，被选择的氨基酸要仅存在于孤儿途径的产 物中，没有被掺入到其他代谢产物的组分中。g i 方法的优点是它能直接研究孤儿途径的 产物，即使由于基因簇不完全，基因不成簇，模块跳跃或模块的重复使用，生物活性和 物理化学特性没被正确地预测；或特征并不显著，如低的分子量，弱的紫外吸收，低的 或不同的生物活性，跟其他产生的化合物一样的物理特性【3 】。 四、异源表达孤儿生物合成途径 异源表达是将孤儿天然产物生物合成途径从原本的产生者转移到优化的异源宿主 系统。一旦成功，不但可以获得大量结构复杂的化合物，而且可以用遗传学方法衍生其 结构，如“途径工程学”，“诱变合成”，“组合生物化学 去优化效价，毒性和药物动力 学参数。另外，通过转移“沉默的 次级代谢途径( 在实验室条件下不表达) 或宏基因 组学来源的孤儿途径，产生潜在的生物活性化合物【1 9 1 。而且，异源表达也是生长缓慢的 微生物如蓝细菌和真菌所需要的。万一获得的化合物在临床试验中需要进一步的研究， 异源表达能解决供给问题【3 】。该策略的应用已经发现了几种新的有生物活性的代谢产物。 m i n a s 和同事在链霉菌s t r e p t o m y c e sc o l l i n u s 的基因组内鉴定了一个沉默的聚酮类孤儿基 因簇，在s c o e l i c o l o rc h 9 9 9 宿主菌中克隆并功能性表达3 5 k b 的基因簇，产生了化合物 c o l l i n o n e 【2 0 j 。一些粘细菌的化合物也已成功地由异源表达产生。p s e u d o m o n a sp u t i d a 成功 地表达了s c e l l u l o s u ms oc e 5 6 基因组中的一个“沉默”基因，得到了化合物f l a v i o l i n 2 1 】。 然而，尽管知道了该基因的产物，甚至用不同的培养条件，在s oc e 5 6 菌株的抽提物中还 没有检测到目的化合物。因此，该基因似乎只在异源表达宿主中表达，这也证明了该技 术在挖掘粘细菌基因组方面的实力【2 2 1 。 然而，该方法仍然是一项具有挑战性的工作。缺点例如大的基因( 3 0 k b ) 很难被 转移，要么转移后不见了，要么不完全表达、低产率。而且，对于一些微生物来说，如 海洋蓝细菌，建立的宿主系统还不够完善。为了解决这些问题，研究者正全力以赴研究 新的方法，建立新的宿主系统。所以，异源表达有发展前景，是一个有价值的方法，尤 其当孤儿途径是沉默的或是从宏基因组研究开始的f 3 】。 五、调节因子调控生物合成基因产生天然产物 一个增加天然产物的量，以及“打开 次级代谢产物基因表达的方法是对次级代谢 的调节因子进行遗传操纵2 3 1 。这一策略依赖于次级代谢生物合成的调节因子的鉴定。鉴 4 文献综述 定后，过表达正调节因子或抑制负调节因子能够增强生物合成基因的表达，导致大量的 目的化合物。在s c e l l u l o s u ms oc e 5 6 菌株中与c h i v o s a z o l e 基因簇启动子区域特异结合 的调节蛋白( c h i r 和n t c a ) 2 4 , 2 5 j 的发现充分证明了这一方法。利用磁珠分离技术，即 启动子垂钓( p r o m o t e rf i s h i n g ) 方法鉴定了调节因子c h i r 。c h i r 的失活导致c h i v o s a z o l 产量的急剧下降，确定了c h i r 作为c h i v o s a z o l 合成的正调节因子。随后，在s oc e 5 6 突变株中过表达c h i r 导致了c h i v o s a z o l 的产量提高了5 倍，而没有改变s oc e 5 6 的己知 的其他代谢产物的产量，如e t n a n g i e na n dm y x o c h e l i n 。与c h i r 相反，n t c a 是一个负调 节因子，它的失活会产生c h i v o s a z o l e 高产菌株，在摇瓶实验中，产量从1 5 0 m g l 增加 到7 0 0 m g l 。然而，调节子的鉴定主要还是依赖于完整的基因组序列的确定，因为鉴定 的蛋白片段要回归到相关的编码基因。如果没有基因组序列信息，可以采用非定向的转 座子为基础的方法，它包括转座位点的鉴定，构建相当数量的突变株及其后的次级代谢 产物图谱的变化分析。s t i r 的发现证明了这一方法，s t i r 是筛选1 2 0 0 个转座突变株之 后，得到的负责s t i g m a t e l l i n 合成的正向调节因子【2 6 1 。转座子插入到s t i r 造成s t i g m a t e l l i n 产量2 0 倍的减少。总的来说，这些数据清楚地表明，对参与次级代谢生物合成的调节 机制的定向操纵是一个用来提高产物产量的有效的工具【2 3 j ，虽然上述例子是对已知化合 物产量的调节，但是该方法完全可以应用到调节孤儿基因相应产物的产量上。 本文总结了五种研究孤儿生物合成基因功能的方法和策略，运用这些方法已经得到 了一些相应的化合物。但是在很多情况下，我们对复杂天然产物的生物合成在分子水平 上没有一个全面的认识，对生物合成途径的许多操作是无效的或生产产量低，因此，需 要对n r p s 和p k s 结构与功能的关系、生物合成基因表达调节以及生物合成机制进一 步深入研究瞵j 。尽管如此，越来越多的基因组测序的完成推动了生物合成途径的发现。 借助依赖于基因组信息的方法，我们可以预测微生物的生物合成潜能以及产物的化学结 构，进行有目的的筛选，而不同于一般的随机筛选。利用基因组数据挖掘开发微生物次 级代谢产物编码潜能以及通过组合生物合成定向改造生物合成途径将大大拓展微生物 天然产物的来源和化学结构的多样性，加快新型微生物药物和先导化合物研制步伐。 参考文献 1 】w e n z e ls ，m i i l l e rr t h ei m p a c to fg e n o m i c so nt h ee x p l o i t a t i o no ft h em y x o b a c t e r i a l s e c o n d a r ym e t a b o l o m e j n a t u r a lp r o d u c tr e p o r t s ，2 0 0 9 ，2 6 ( 11 ) ：13 8 5 4 0 7 2 】黎志凤，e t i e n n en g u i m b i ，李越中等埃博霉素( e p o t h i l o n e s ) 的p k s n r p s 杂合基因 簇 j 】生物工程学报，2 0 0 3 ，1 9 ( 5 ) ：5 11 - 5 1 5 【3 】g r o s sh s t r a t e g i e st ou n r a v e lt h ef u n c t i o no fo r p h a nb i o s y n t h e s i sp a t h w a y s ：r e c e n t e x a m p l e sa n d f u t u r ep r o s p e c t s j a p p lm i c r o b i o lb i o t e c h n o l ，2 0 0 7 ，7 5 ：2 6 7 - 2 7 7 东南人学硕上学位论文 4 】s i l a k o w s k ib ，k u n z eb ，n o r d s i e kg ，e ta 1 t h em y x o c h e l i ni r o nt r a n s p o r tr e g u l o no ft h e m y x o b a c t e r i u ms t i g m a t e l l aa u r a n t i a c as ga 1 5 j e u rjb i o c h e ，2 0 0 0 ，2 6 7 ：6 4 7 6 6 4 8 5 【5 】5 g a i t a t z i sn ，k u n z eb ，m a i l e rr ，i nv i t r or e c o n s t i t u t i o no ft h em y x o c h e l i nb i o s y n t h e t i c m a c h i n e r yo fs t i g m a t e l l aa u r a n t i a c as ga 15 ：b i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i z a t i o no far e d u c t i v e r e l e a s em e c h a n i s mf r o mn o n r i b o s o m a lp e p t i d es y n t h e t a s e s j p r o cn a t la c a ds c iu s a ，2 0 0 1 ， 9 8 ：1 1 1 3 6 1 1 1 4 1 【6 c h a l l i sg l ，r a v e lj c o e l i c h e l i n ，an e wp e p t i d es i d e r o p h o r ee n c o d e db yt h es t r e p t o m y c e s c o e l i c o l o rg e n o m e ：s t r u c t u r ep r e d i c t i o nf r o mt h es e q u e n c eo fi t sn o n r i b o s o m a l p e p t i d e s y n t h e t a s e j f e m sm i c r o b i o ll e t t ，2 0 0 0 ，18 7 ：11 l 一1 14 7 】l a u t r us ，d e e t hr j ，b a i l e yl m ，e ta 1 d i s c o v e r yo fan e wp e p t i d en a t u r a lp r o d u c tb y s t r e p t o m y c e sc o e l i c o l o rg e n o m em i n i n g j n a t u r eb i o t e c h n o l ，2 0 0 5 ，1 ：2 6 5 - 2 6 9 8 】b o d eh b ，m f i l l e rr t h ei m p a c to fb a c t e r i a lg e n o m i c so nn a t u r a lp r o d u c tr e s e a r c h j a n g e w a n d t e c h e m i c ，2 0 0 5 ，4 4 ：6 8 2 8 6 【9 】s h e nb p o l y k e t i d eb i o s y n t h e s i sb e y o n dt h et y p ei ，i ia n di i ip o l y k e t i d es y n t h a s e p a r a d i g m s j c u r ro p i nc h e mb i o l ，2 0 0 3 ，7 ：2 8 5 - 2 9 5 【10 】m a i l e rr d o n tc l a s s i f yp o l y k e t i d es y n t h a s e s j c h e mb i o l ，2 0 0 4 ，11 ：仙 11 】w e n z e ls c ，m a i l e rr f o r m a t i o no fn o v e ls e c o n d a r ym e t a b o l i t e sb yb a c t e r i a l m u l t i m o d u l a ra s s e m b l yl i n e s ：d e v i a t i o n sf r o mt e x t b o o kb i o s y n t h e t i c l o g i c j c u r to p i n c h e mb i o l ，2 0 0 5 ，9 ：4 4 7 - 4 5 8 12 s i l a k o w s k ib ，k u n z eb ，n o r d s i e kg ，e ta 1 t h em y x o c h e l i ni r o nt r a n s p o r tr e g u l o no ft h e m y x o b a c t e r i u ms t i g m a t e l l aa u r a n t i a c as ga l5 j e u rjb i o c h e m ，2 0 0 0 ，2 6 7 ：6 4 7 6 - 6 4 8 5 【1 3 】w e n z e ls c ，k u n z eb ，h 6 f l eg ，e ta 1 s t r u c t u r ea n db i o s y n t h e s i so f m y x o c h r o m i d e ss 1 _ 3 i ns t i g m a t e l l aa u r a n t i a c a ：e v i d e n c ef o ra ni t e r a t i v eb a c t e r i a lt y p eip o l y k e t i d es y n t h a s ea n df o r m o d u l es k i p p i n gi nn o n r i b o s o m a lp e p t i d eb i o s y n t h e s i s j c h e m b i o c h e m ，2 0 0 5 ，6 ：3 7 5 - 3 8 5 【14 k u n z eb ，r e i c h e n b a c hh ，m o i l e rr a u r a f u r o naa n db ，n e wb i o a c t i v ep o l y k e t i d e sf r o m s t i g m a t e l l aa u r a n t i a c aa n da r c h a n g i u mg e p h y r a ( m y x o b a c t e r i a ) 【j 】ja n t i b i o t ，2 0 0 5 ， 5 8 ：2 4 牛_ 2 5 1 15 】p a u l s e ni t ，p r e s sc m ，r a v e lj t h ec o m p l e t eg e n o m es e q u e n c eo ft h ep l a n tc o m m e n s a l p s e u d o m o n a sf l u o r e s c e n sp f - 5 j n a tb i o t e c h n o l ，2 0 0 5 ，2 3 ：8 7 3 8 7 8 【16 】g r o s sh ，s t o c k w e l lv o ，h e n k e l sm d ，e ta 1 t h eg e n o m i s o t o p i ca p p r o a c h ：as y s t e m a t i c m e t h o dt oi s o l a t et h ep r o d u c t so fo r p h a