厌氧菌ppt课件.ppt

厌氧菌病原生物学教研室,1,一、概述二、厌氧性细菌的检验三、临床常见的厌氧菌,2,(一)厌氧菌的概念、种类与分布(二)临床意义,一、概述,3,(一)厌氧菌的概念、种类与分布,概念厌氧菌（anaerobicbacteria）是指一大群在有氧条件下不能生长，必须在无氧条件下才能生长的细菌。厌氧菌的感染常常是临床上许多的疑难杂症，如“无菌性感染或脓肿”、“原因不明的发热”，以及某些感染性疾病迁延不愈和反复发作的重要原因之一。,4,对厌氧菌认识的进步,1.无芽胞厌氧菌无论在种类或数量上均大大多于有芽胞厌氧菌，无芽胞厌氧菌在临床厌氧菌标本检出率中约占9O%；,2.厌氧菌分布十分广泛，是体内正常菌群的组成成员，多为条件致病菌；,3.厌氧菌的感染遍及临床各科，且多为混合感染；,4.厌氧菌对常用的氨基糖甙类抗生素耐药，而对甲硝唑（灭滴灵）普遍敏感。,5.厌氧菌的分离鉴定较繁琐，目前国内大多医院尚未开展此工作，而发达国家早已列为临床检验常规。,5,种类,主要可分为两大类，一类是有芽胞厌氧菌，另一类是无芽胞厌氧菌。据目前最新资料显示，有芽胞厌氧菌只有一个菌属，即梭菌属，共130个种。而无芽胞厌氧菌已增至40多个菌属，300多个菌种和亚种；,6,表15-1重要的厌氧菌种类及其在正常人体内的分布,7,在人体正常菌群中厌氧菌占有绝对优势，例如肠道菌群中厌氧菌与非厌氧菌（包括需氧菌和兼性厌氧菌）的比例为，即达是厌氧菌，大肠杆菌等仅占0.1%。每克粪便含厌氧菌达个，皮肤、口腔、上呼吸道、女性生殖道的正常菌群中，也有大约是厌氧菌。,1000：1,99.9%,1000亿,80%90%,8,正常情况下菌群之间保持着微生态平衡，厌氧菌代谢产生的乙酸、乳酸等能抑制病原菌生长。如长期使用广谱抗生素、激素、免疫抑制剂等，在发生菌群失调或机体免疫力下降或细菌进入非正常寄居部位时，这些厌氧菌即可作为条件致病菌而导致内源性感染。,9,(二)临床意义,由厌氧菌引起人类的感染在所有感染性疾病中占有相当大的比重，有些部位的感染如脑脓肿、牙周脓肿、盆腔脓肿等80%以上是由厌氧菌引起的。其中一部分厌氧菌单独感染，大部分与需氧菌混合感染。,厌氧菌感染的条件,厌氧菌感染的临床特征,10,1.厌氧菌感染的条件,（1）局部组织血供障碍（内伤）（2）皮肤黏膜屏障破坏（外伤）（3）各种因素引起的机体免疫力降低（疾病）（4）菌群失调（药物）,11,2.厌氧菌感染的临床及细菌学指征,凡有下列情况者应怀疑有厌氧菌感染：（1）感染组织局部产生大量气体，造成组织肿胀和坏死，皮下有捻发音，是产气荚膜梭菌所引起感染的特征。（2）发生在粘膜附近的感染，口腔、肠道、鼻咽腔、阴道等粘膜，均有大量厌氧菌寄生，这些部份及其附近有破损，极易发生厌氧菌感染。（3）深部外伤如枪伤后，人或动物咬伤后的继发感染，均可能是厌氧菌感染。（4）常规血培养阴性的细菌性心内膜炎等。,12,（5）分泌物有恶臭，或为暗血红色，并在紫外光下发出红色荧光，均可能是厌氧菌感染。（6）长期应用氨基糖甙类抗生素治疗无效的病例，可能是厌氧菌感染。最近有流产史者，以及胃肠手术后发生的感染。（7）分泌物涂片经革兰染色，镜检发现有细菌，而常规培养阴性者；或在液体及半固体培养基深部长的细菌，均可能为厌氧菌感染。,13,二、厌氧性细菌的检验,（一）标本的采集运送与处理（二）检验程序（三）检验方法,14,（一）标本的采集运送与处理,标本的采集与运送是否适当，对厌氧菌培养能否成功至关重要。须注意两点：标本不能被正常菌群所污染；应尽量避免接触空气。,15,此外还需注意：培养基要新鲜配置做耐氧试验菌落太小，可用放大镜观察胞外酶试验需要足够的菌液浓度,16,1.标本的采集方法,在一般情况下，应从无正常菌群寄居的部位采取标本，用无菌操作抽取无菌体液，包括有血液、关节液、心包液、腹腔液、胸腔积液和膀胱穿刺液等；以及深部脓肿渗出物，经气管抽取的肺渗出物或直接由肺抽取渗出物以及其它组织穿刺液等。,17,下列标本无送检价值，不宜做厌氧菌培养：鼻咽拭子；齿龈拭子；痰和气管抽取物；胃和肠道内容物、肛拭；接近皮肤和粘膜的分泌物；褥疮溃疡及粘膜层表面；排出的尿或导尿；阴道或子宫拭子；前列腺分泌物。,18,表1-2不同部位标本采集法,19,在紧急情况下，可用棉拭子取材，并采用适合的培养基传送，做厌氧菌培养，最理想是能取得组织标本，因厌氧菌在组织中比在渗出物中更易生长，而且组织标本可真实反映出感染过程的细菌学变化。,20,2.标本运送中应尽量避免接触空气，方法如下：,21,1.针筒运送法如图1-1所示,22,2.无氧小瓶运送法通常用来运送少量脓液，用无菌青霉素小瓶作采样瓶。瓶内装培养基0.5ml，加入少量刃天青（resazarin）。(如图1-1)3.棉拭运送法一般不用，因棉拭子中有空气不利于厌氧菌生长。4.大量液体标本运送法装满标本瓶，即可驱除瓶中的空气，加盖密封即可运送。5.组织块运送法组织块放在密封的厌氧罐中运送。罐内放入一团用酸化硫酸铜浸泡过的钢丝绒。6.厌氧袋运送法。,23,3.处理与观察标本送到实验室后，应在2O30min内处理完毕，最迟不超过2h。如果一时来不及接种，可将标本置室温下保存。一般认为标本不要冷藏。每次标本接种前均应观察标本的性状，包括标本的气味、是否脓性、带血或腐败物质等，厌氧菌的代谢产物中有某些带气味的物质，对厌氧菌的鉴定很重要。均要求详细记录。,24,(二)检验程序见图15-1,25,（三）检验方法,1.直接镜检除血液外，各种标本均须在接种前摇匀后，取1滴均匀涂布在玻片上，然后作革兰染色、镜检，观察细菌的形态和染色性，并估计标本中大致的含菌量，用+、+、+、+等符号作半定量记录。,26,肉眼观察及直接镜检的临床意义：结合肉眼和显微镜下观察的结果，对标本中可能有的细菌作出估计，便于选择培养基，进一步检查，及时通知临床，指导用药；通过开始的镜检与以后的培养结果作比较，为实验室衡量工作质量提供根据。标本的直接涂片染色镜检和标本性状与气味，结合标本来源，可提供许多有用的信息，为初步鉴定和进一步鉴定起到指导作用。,27,例如：标本发臭，镜检发现染色不均，形态奇特者，常为厌氧菌感染。两端钝圆着色深，中间着色浅不均匀，且有空泡，长短不一的革兰阴性杆菌常为脆弱类杆菌。革兰阳性杆菌，无芽胞，呈乳酸气味者，可能是乳酸杆菌。菌体分支，呈棒状，X,Y,V或栅栏状排列，且在脓汁中发现黄色颗粒，有琥珀酸气味者，大多是放线菌。涂片是革兰阳性芽胞杆菌，肯定是梭状芽胞杆菌属的细菌涂片为革兰阳性芽胞杆菌，有异丁酸，异戊酸味，标本来自抗生素相关性肠炎，多是艰难梭菌。,28,2.分离培养,（1）初代培养：临床标本中厌氧菌的初代培养比较困难，不仅要有一个与人体内感染部位相似的无氧环境，而且还要选择适当的培养基。,培养基选择,标本接种,厌氧培养方法,29,培养基的选择,强化血琼脂平板（BAP）本培养基是一种非选择性培养基，几乎能培养出所有的厌氧菌。卡那-万古霉素冻溶血琼脂平板（KVLB）大多数类杆菌属、普雷沃菌属和紫单胞菌属都生长良好，梭杆菌和厌氧球菌不能生长。七叶苷胆汁平板（BBE）只有耐胆汁的脆弱类杆菌组的细菌与可变梭杆菌和死亡梭杆菌不被抑制。卵黄平板（EYA）用于选择产气荚膜梭菌。,30,CCFA培养基选择艰难梭菌。乳酸钠培养基选择韦荣球菌。改良FM培养基选择梭杆菌。BS培养基选择双歧杆菌等。几乎所有的厌氧菌都有其专用的选择性培养基。其他适用于需氧和微需氧菌生长的培养基等。,31,以上厌氧培养在接种标本前必须处于无氧状态，所以各种琼脂平板要求当天配制或放在充以CO2的容器内，置于4冰箱保存，限在12d内用完。培养基用前24h必须置于无氧环境，使其预还原或使用预还原（Prereducedanaerobicsteri1ized，PRAS）制作的培养基。液体培养基，在用前必须煮沸10min，以驱除溶解氧，并迅速冷却，立即接种。,32,标本的接种,每份标本至少应接种3个血琼脂平板，分别放置于有氧、无氧和含5%1O%CO2环境中培养。如仅要求厌氧菌生长，除接种上述培养基外，还应接种一种或几种选择性培养基，抑制其它细菌生长，以利于厌氧菌生长。同时应接种一支液体培养基增菌用，如平板无菌生长时，可用液体培养重新转种。,33,厌氧菌培养方法,常用方法有厌氧罐法、气袋法和厌氧手套箱法等。前两种方法比较简便，不需特殊设备，适用于小型实验室，后一种方法设备较为复杂而昂贵，但效果最佳。,34,厌氧罐培养法,本法类型较多，但都不外乎用一个可严密封闭的罐子，应用物理或化学方法造成无氧环境。常用方法有冷触媒法和抽气换气法、钢末法等。冷触媒法、钢末法较为简便、安全；抽气换气法比较可靠。,35,图1-3厌氧罐法,36,以上介绍的厌氧罐培养法，都应用厌氧指示剂检查其罐内是否为无氧状态，一般使用美蓝指示剂，无氧为白色，有氧为蓝色。,37,气袋法,本法原理与冷触媒法相同，只是将厌氧罐用无毒、透明的塑料袋代替，其中有产生氢气和二氧化碳的安瓿一支，已还原成美白的安瓿一支，袋内放钯催化剂，每一塑料袋内可放入1一2个平板。,38,厌氧手套箱培养法,厌氧手套箱（anaerobicg1ovebox）是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一。厌氧手套箱（图1-4）的问世，大幅度地提高了厌氧菌的阳性检出率。,39,图14厌氧手套箱的外形与结构,40,其它培养法,适用于基层实验室中应用。如平皿焦性没食子酸法、庖肉基法、生物耗氧法、液体培养基法与高层琼脂培养法等。除某些脆弱类杆菌和产气荚膜梭菌外，大多数厌氧菌的初代培养生长较慢。故厌氧培养在37至少应培养48h。如疑为放线菌则应延长7296h。,41,（2）次代培养和厌氧菌的确定,标本经48h初代培养后，用放大镜观察平板上的菌落性状。每个平板挑选5个不同性状菌落，每个菌落分别接种23个平板，每个平板划分46个区，分别作几个菌落的次代培养。然后分别放入有氧、无氧和含5%1O%二氧化碳环境中培养48h。确定需氧菌、兼性厌氧菌、二氧化碳菌和专性厌氧菌。,42,3鉴定试验,可据厌氧菌的菌体形态、染色反应、菌落性状以及对某些抗生素的敏感性等作出初步鉴定。最后鉴定则要进行生化反应及终末代谢产物（气液相色谱法）等项检查。有条件者，尚可进行PCR、基因探针技术进行鉴定。,43,4检验结果分析与报告,根据革兰染色镜检，菌落性状、耐氧试验及药敏试验若发现厌氧菌可初步报告：“检出厌氧菌，形似菌”；再根据生化反应及终末代谢产物作最终报告：“分离鉴定出菌”，“药物敏感试验：”。有条件的单位可采用基因探针或PCR技术，快速准确的检测厌氧菌。,44,三、临床常见的厌氧菌,（一）厌氧性球菌（二）革兰阴性无芽胞厌氧杆菌（三）革兰阳性无芽胞厌氧杆菌（四）梭状芽胞杆菌属,45,（一）厌氧性球菌,GC：主要包括消化球菌属（黑色消化球菌Peptococcusniger）和消化链球菌属（Peptostreptococcusanarobius）等9个种。GC：主要包括韦荣球菌属（Veillonella）、氨基酸球菌属（Acidaminococcus）和巨球菌属（Megasphaera）。,46,临床意义,黑色消化球菌和消化链球菌在临床上可引起人体各部组织和器官的化脓性感染，常与其它细菌混合感染。韦荣球菌致病力不强，为条件致病菌。临床标本可采自软组织脓肿和血液。大多见于混合感染。,47,（二）革兰阴性无芽胞厌氧杆菌,革兰阴性无芽胞厌氧杆菌是一大群不形成芽胞的厌氧杆菌，种类较多，包括类杆菌属、普雷沃菌属、卟啉单胞菌（紫单胞菌属）和梭杆菌属等。它们是人体正常菌群的重要组成成员，部分菌株可作为条件致病菌，引起厌氧菌感染。,48,临床意义：,类杆菌常寄生于人的口腔、肠道和女性生殖道，是一种条件致病菌，主要引起内源性感染。其中脆弱类杆菌占临床厌氧菌分离株的25，占类杆菌分离株的50，居临床厌氧菌分离株首位。脆弱类杆菌也可引起女性生殖系统、胸腔及颅内感染。,49,产黑色素普雷沃菌主要寄居在正常人体的口腔、女性生殖道等部位，组成这些部位中的正常菌群，仅次于脆弱类杆菌。本属菌群可单独引起感染，但更常见与其它厌氧菌、需氧菌或兼性厌氧菌引起的混合感染。女性生殖道及口腔感染较为多见。,50,卟啉单胞菌属主要分布于人类口腔、泌尿生殖道和肠道，在正常人体的检出率低。今年来发现动物源性紫单胞菌在被动物咬伤的人体感染者中发现，从不同类型临床感染者的口腔、胸腔、皮肤、软组织、阴道、阑尾的病灶中分离出。,51,核梭杆菌在临床感染中最常见，在口腔、生殖器、胃肠道和上呼吸道中被发现，它引起的临床感染类型酷像产黑色素普鲁沃菌和紫单胞菌，它可引起咽炎、扁桃体炎、中耳炎、上颌窦炎、龈炎和牙周炎，有时并发单核细胞增多症。,52,（三）革兰阳性无芽胞厌氧杆菌,本组细菌革兰阳性无芽胞厌氧杆菌(anaerobicnonsporeformingGram-positivebacilli)在临床厌氧菌中约占15。临床常见的有丙酸杆菌属、优杆菌属、乳酸杆菌属、双歧杆菌属、蛛网菌属和放线菌属。厌氧菌中，革兰阳性无芽胞杆菌有6个属，几十个菌种，鉴定不易。Bailer(1986)认为首先