（生物化学与分子生物学专业论文）灰树花发酵条件和疏水蛋白提取方法的研究.pdf

南开大学硕士毕业生论文 作者：梁俊 摘要 本文拟在探讨食用真菌灰树花的培养条件，特别是培养基的最 佳配方，进而研究其疏水蛋白的提取纯化方法。 灰树花具有较宽广的碳源谱和氮源谱，其最佳碳源为土豆加葡 萄糖，最佳氮源为麸皮，无机盐磷酸二氢钾对菌丝的生长非常重要， 在添加了生长促进剂一板栗壳煮汁的作用下，菌丝增产达1 4 0 。培 养基中碳源浓度过高不利于菌丝的生长。比较氮氮源和生长促进剂之 间的不同组合对菌丝产量的影响，确定了灰树花发酵培养基的最佳组 合为6 葡萄糖，3 麸皮，15 板栗壳煮汁。 通过对瑞氏木霉疏水蛋白的提取方法的研究，证明了s d s 三步 法，双水相法等抽提方法对于提取真菌疏水崔白极为有效。 应用s d s 三步法和双水相法对灰树花疏水蛋白的研究证明灰树 花疏水蛋白分子量大约为1 2 k ，是一种i i 型疏水蛋白，其在菌丝外表 面和发酵液里大量存在，具有很高的疏水性。 关键词：灰树花；培养基：瑞氏木霉；疏水蛋白：双水相 南开大学硕士毕业生论文 作者：梁俊 a b s t r a c t t h i s p a p e r i sd e s i g n e d t o s t u d y t h ef e r m e n t a t i o nf a c t o r s ， e s p e c i a l l yt h eo p t i m a lc u l t u r ef o ri n c u b a t i o no fe a t a b l ef u n g ig r o f o l 口 f r o n d o s a g r o f o l af r o n d o s a l a k e s a d v a n t a g e o fr i c hr e s o u r c e so f c a r b o na n dn i t r o g e n t h eo p t i m a lc a r b o na n dn i t r o g e nr e s o u r c e sa r e p o t a t oj u i c e w i t h g l u c o s e a n dw h e a tb r a n r e s p e c t i v e l y p o t a s s i u m d i h y d r o g e np h o s p h a t ep l a y s a n i m p o r t a n t r o l eo nt h e g r o w t h o f g r o f o l a 弦o n d o s a w h e nt h ee x t r a c t i o i lo fc h i n e s ec h e s t n u ts h e l lw a s a d d e di nt h em e d i u mo fg r o f o l a 扣o n d o s a ? t h eg r o w t hr a t eo fm y c e l i a r e a c h e s14 0 c o m p a r i n gw i t hd i f f e r e n tc o m b i n a t i o no fs e v e r a l c a r b o na n d n i t r o g e nr e s o u r c e s ，t h eo p t i m a l f e r m e n tm e d i u mo f g r o f o l af r o n d o s ai s 6 o fg l u c o s e ，3 o fw h e a tb r a n ，a n d15 o f e x t r a c t i o no fc h i n es ec h e s t n u ts h e l l t ot e s tt h eis o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o nm e t h o d so f h y d r o p h o b i n so f t r i c h o d e r m ar e e s e ，s d s t h r e e s t e pm e t h o da n da t p sa r ei d e n t i f i e d a n ds h o w e dt h a tt h e s et w om e t h o d sa r e v e r ye f f i c i e n tt o e x t r a c tt h e h y d r o p h o b i n sf r o mf i l a m e n t o u sf u n g i t h r o u g hs y s t e m i c s t u d y i n g ，t h et y p e i i h y d r o p h o b i no fg r o f o r a 扣o n d o s aw a sf o u n da sas m a l lp r o t e i nw h i c he x i s t si nr i c hi nt h ec u l t u r e a n ds u r f a c eo fm y c e l i a ，t h em o l e c u l a rw e i g h to ft h i sp r o t e i ni sa r o u n d 1 2k d aa n di t s h y d r o p h o b i c i t yi sv e r yh i g h k e y w o r d s ： g r o f o l a f r o n d o s 口j c u l t u r e ；h y d r o p h o b i n ；t r i c h o d e r m a r e e s e ；a t p s 3 南开大学硕i 毕业生论文 作者：架俊 一刖百 1 1 疏水蛋白的概述 真菌疏水蛋白( h y d r o p h o b i n ) 是一类被真菌外分泌的具中等疏 水性的小分子蛋白质，成熟蛋白的疏水指数从0 0 i ( r o d a ) 到 0 6 0 ( s c 3 ) 差别很大，其序列含有8 个保守位点的半胱氨酸，最早 是由r o s e n b e r g 和kj e e b e r g ( 19 8 6 ) 在研究真菌与寄主吸附机理 时发现的，意指覆盖在真菌细胞表面的任何疏水物质( h y d r o p h o b i c s u bs t af i c e s ) 。后来，w e s s e ls 的研究小组( 1 9 9 7 ) 发现这利神秘的 两性蛋白可以在两相界面通过自我装配形成膜，从而改变介质表面 的疏水性。通过r t p c r 的办法，他们发现了某些基因相应的c d n a 序列可以编码约l o o 个氨基酸分子的小蛋白，它含有8 个半妣氨酸 残基和一段分泌性的信号肽。 就目前所知，疏水蛋白都以复合体的形式出现在真菌的气生菌 丝表面。在许多丝状真菌和食用真菌中都发现疏水蛋白的存在，到 目前为止已经在2 0 多种真菌中发现其存在，包括子囊菌，担子菌 和接和菌。疏水蛋白普遍存在于真菌的气生菌丝、侵染机构、或子 实体表面，且高丰度表达。由于其具有不同寻常的生化性质，很难 用常规的蛋白分析方法检测到其存在，直到最近几年通过鉴定其相 应的基因才发现他们，所有的疏水蛋白都编码一段信号肽。通过免 疫定位，蛋白提纯及n 末端氨基酸序列分析可以确定它靠是疏水蛋 白。 疏水蛋白特殊的性质在于其单体通过分子间的疏水作用吸引 水相、气相或者在水相和固相之间做出自我组装这种反应能力。通 过小范围的疏水交互作用，疏水蛋白分子单体可以自动组装成不溶 性多聚物。经提纯的疏水蛋白单体在离体条件下在水相和油相或水 相和疏水表面自动组装小杆状的结构( 如图1 ) 。 南开大学硕士毕业生论文 作者：粱俊 图1 疏水蛋白在真菌外表面形成的平面杆状结构 小杆状的直径为1 0 n j t i l3 r i m ，其与自然状态下分布于真菌子实 体、孢子、及气生菌丝表面的结构十分相像。该结构具有很强的 疏水性，可使水滴的接触角高达12 0 0 。通过这种杆状结构的进一 步组装，疏水蛋白形成约io n m 厚的一面呈疏水性而一面呈亲水性 的膜。该膜靠疏水的一面与疏水表面结合而使亲水的一面暴露于 外从而使疏水表面转变成为亲水表面；或者靠亲水的一面与亲水 表面结合从而使亲水表面转变成为疏水表面。疏水蛋白形成的双 性膜的这种性质在真菌发育过程中起到十分重要的作用，有利于 真菌菌丝与疏水表面建立紧密粘附，参与了植物致病真菌的致病 过程，并赋予疏水蛋白重要的工业应用价值。 1 2 疏水蛋白的结构 疏水蛋白有一个 8 个半胱氨酸的保守序 列：x z3 8 一c - x xs 一9 一c c x l i 一3 9 一c - - x 8 23 c x5 9 一c c x 6 18 一c x2 一i3 ( 其中x 表示除苯丙氨酸外的其他氨基酸) 。尽管疏水蛋 白有相似的性质，但其氨基酸的排列方式具有显著的不同，能够产 生不同的疏水形式。w ess e ls 把它们分为i 和i i 型的疏水蛋白。i 型的疏水蛋白具有两个功能域，以二硫键为中心形成为四个“环” 状结构，第二个环与第四个环的大小差异很大。相对而言，i i 型疏 南开大学顿士毕业生论文 作者：粱傻 水蛋白的第二个环和第四个环疏水性明显占优势，含有大量的氨基 酸残基( m 、i 、l 和v ) ，并环绕着无极性氨基酸残基( g 和a ) 或者对 疏水性没有影响氨基酸残基( t 和y ) ，因而，疏水蛋白单体能折叠 成为二亲性的结构，同时环状结构中也包含了其它的二级结构( 如 图2 ) 。i 型的疏水蛋白的半胱氨酸残基之间的问隔氨基酸残基静类 及数目变化很大，而在i i 型的疏水蛋白中则变化很小。疏水蛋白中 所有的半胱氨酸残基都参与了二硫键的形成。 图2l 型和i i 型疏水蛋白的一级结构 ( a ) 在1 型和l i 型疏水蛋白中间隔半胱氨酸残基的序列长度。在第一个 半胱氨酸之前的氨基酸序列包括在分泌过程被切去的信号肽序列。( b ) 假 设二硫键都类似于it 型疏水蛋白c e r a t o u l m i n ( c u ) 的形式，疏水蛋白象 是带两个结构域的蛋白。要强调的是在i 型疏水蛋白中，第4 个和第8 个 半胱氨酸残基之前为l v i x p h o 和x ( x 代表除w 外的任一氨基酸，p h o 指任一疏水性氨基酸) ，在其之后为s t 。p i x 和v i 残基。显示的为裂 褶菌的i 型疏水蛋白s c 3 和s c 4 以及榆枯萎病菌o p h i o s t o m du t m i 的i i 型 疏水蛋白c u 和瑞氏木霉t r i c h o d e r i t z dr e e s e i 的h f b i 。 由于存在这种结构的差别，t 型和i i 型疏水蛋白具有显著不同 南开犬学硕士毕业生论文作者：粱俊 的性质：i 型疏水蛋白可以复合物的形式从真菌表面抽提，该复合 物不溶于热的5 d s ，而可以用冷的三氟乙酸将其打散，而i t 型疏水 蛋白则可以溶解于热的s 1 3 s 和6 0 的乙醇。 有关疏水蛋白在细胞内的肽链折叠和构象变化研究不多。疏 水蛋白前体带有的n 端信号肽在分泌之后就被切去。成熟的疏水 蛋白在细胞外具有三种状态：游离单体、可溶性多聚体和界面自 组装的多聚体膜。在水溶液中，单体形式存在的疏水蛋白，如e a s ， 基本无结构，只出现可能由四个二硫键稳定的反向平行的b 一折叠 结构小区。随着时间的发展和溶液条件的变化，疏水蛋白会形成 多聚体胶体溶液。用分子筛层析等技术分析s c 3 ，发现在缓冲液 中s c 3 以二聚体存在，伴随少量单体、四聚体和更大的聚合体， 二聚体的形状被拉伸，寡聚化在低温4 度下很慢，但在室温f 很 迅速。低聚化受离子强度的严重影响，纯水中可以观察到短寿的 单体s c 3 ；低p h 不影响但高p h 可加快低聚化。而x 一射线衍射利 分子筛层析显示i i 型疏水蛋白h f bi i 在高浓度下主要以四聚体形 式存在。我们实验室用s e p h a d e xg 5 0 分子筛层析也验证h f b i 在水 溶液中以各种分子量的多聚物形式存在。疏水蛋白在亲水一疏水界 面的自我组装成膜中，单体以亲水型和疏水型基团在界面的相反 两边自我定向，其构象发生显著变化。在水一t e f l o n 界面伴随着 其。一螺旋结构的增加。而在水一空气界面发现的b 一折叠结构形 式的增加。当经如s d s 和t w e e n 8 0 试剂于8 5 处理，t e f l o n 表 面的s c 3 构象能达到b 一折叠结构。疏水蛋白n 一螺旋结构和b 一 折叠结构两种形式都使其紧密的粘附于疏水表面，不能被水沈 脱，但n 螺旋形式能被冷的去垢剂除去。 关于疏水蛋白的三维结构所知不多。x 射线的光电光潜学研 究表明s c 3 的甘露糖残基暴露在装配好的s c 3 膜的亲水面。有证据 显示二聚体s c 3 是浴液中聚合和亲水一疏水界面自我组装的起始 元件。分析h f b i 和h f b i i 的膜结构，其高度有序的二维晶体结 构中，小室类似四聚体。h f b i i 膜的原子分辨率的结构组成显示， 订h 火学 i | j f j 毕业生论义 作者：粱俊 蛋白表瓯基本亲水，为一n 一螺旋的紧密单环和包裹两个二硫健 洲个反向平行的s ，链。8 发夹环含有几个保守的脂肪族侧链， 形成扁平的疏水碎片。 a b 幽3a 疏水蛋白s c3 自我装配时的平行杆状结构( 黑色标j 己代表 10 0 n m ) 。b 疏水蛋白s c 3 使亲水表面变成疏水性。 w e s s e ls 最近( 1 9 9 7 年) 对2 0 种真菌疏水蛋白作了序列相似 性比较，发现除疏水蛋白的信号肽部分外，在已知的疏水蛋白中，氨 基酸仅有13 的同源性和17 相似性。这一结果表明，对于不同真菌 疏水蛋白，改变或重复使用除构建其二级结构的半胱氨酸外的某 氨基酸并不会改变其正常的生物学功能。 幽4 不同疏水蛋白的氯基酸序列比较 尽管在真菌中广泛存在富含半胱氨酸的其他小蛋白，但i = 1 以 南开大学硕士毕业生论文 作者：粱俊 根据疏水蛋白的这些结构和疏水蛋白的其他特殊性质对其进行疏 水蛋白的鉴定。许多外分泌小蛋白含7 8 个半胱氨酸，如蛇毒素、 细胞外转脂蛋白、所谓的植物外分泌的警卫素、结合几丁质的凝集 素等，但这些蛋白不是在真菌的外表而，不具有半胱氨酸附近的l 司 源序列，也不能在两性界面形成由蛋白复合体形成的蛋白膜。同样， 其他真菌外分泌蛋白由于不具有疏水蛋白的结构和性质，也不属于 疏水蛋白。 目前对疏水蛋白组装前和组装后结构的探索仍处于初级阶段。疏 水蛋白i i 的组装多变，而疏水蛋白i 的组装则必定发生了稳定的结构 变化，由于其组装不能被除甲酸和三氟乙酸外的其他溶液逆转。疏水 蛋白i 结构非常稳定，尽管其复合体可以被甲酸和三氟乙酸打散，但 这些被打散的疏水单体可以重新组装成稳定的蛋白膜，这种去组装和 组装可以重复很多次。只有通过结构分析才能透彻研究疏水蛋白的自 我组装和其不同凡响的改变界面的性质。 1 3 疏水蛋白的生物学功能 1 3 1 帮助真菌克服气液屏障形成气生结构 为了长到空中，菌丝面临着周围水膜高的表面张力( 7 2m j m 。) ，气液屏障阻止气生菌丝的发生。对s c 3 基因缺失的菌株( a s c 3 菌株) ，培养液的表面张力仅降低到4 5m jm ，荠且形成的 气生菌丝很少。向培养液中加入纯s c 3 疏水蛋白，培养液的表面 张力的下降程度和气生菌丝的形成状况得以完全恢复。当真菌形 成一定数量的水下营养菌丝体时，疏水蛋白基因表达。水下菌丝 分泌的疏水蛋白扩散到水一空气界面，在此处疏水蛋白自我组装 成一层两亲性薄膜。伴随着水的表面张力的极剧下降( 低到2 7m j t n 。) ，这能使菌丝向空中生长，形成气生菌丝等挺水结构。 1 3 2 赋予真菌菌丝以疏水性 向s c 3 基因缺失的菌株培养液中加入纯s c 3 蛋白，形成的气生 菌丝表面是亲水性的而非疏水性，这表明气生菌丝表面疏水性薄 阿 大学坝i 毕业生论文 膜的疏水蛋白米源于生k ”的气生菌丝顶端实时自我分泌的i m 非溶液中现有的s c 3 。气生菌丝顶端分泌的疏水蛋白不能够扩散 到培养液q ，只在亲水细胞壁与疏水空气之间的界面上进行绢 装。组技好的薄膜的亲水而朝向细胞壁而疏水面暴露在字气巾， 闻此气生菌丝表现为疏水性( 蜘i 图5 ) 。 疏水蛋白不仅赋予气生菌丝以疏水性，而目+ 覆盖于其它气生 结 = ：j ，如子! 戈体、产孢菌丝和孢子的表面甚至一些真菌的营养菌 丝的表而，r 实体和地投内部通气孔道的表面。疏水性表而有利 于孢予的扩散和营养菌丝的分散。州通气孔道的疏水性，对真菌 存潮湿环境下进行气体交换魁必须的。 疏水蛋白使细胞壁更完槌。 最近，。实验鼎示疏水蛋白彳i 但对亲水与疏水界面起作用，而 它对细胞壁基质的交联也起作用。实验显示s c 3 参与儿t 质同 葡聚糖的( 1 3 ) 一6 一连接过程。as c 3 菌株在培养液中产生大量的孙 胶( 1 ，3 1 ，6 一b 葡聚糖) ，与此i 司时细胞壁中连接到几丁质的 l ，3 1 ，6 一b 葡聚糖的数目相应下降。重新导入s c 3 基因，细胞壁组 成恢复到野尘型状态，i 正实s c 3 对细胞壁的组装起作用而不是单 纯的覆盏十菌丝的表面。然而，其在细j 臌壁交联l | r 起作用的机制 仍足未知。 b 南开大学硕士毕业生论文作者：梁俊 图5 ( a ) 裂褶菌气生菌丝形成的模式。菌丝内的箭头代表新台成的 s c 3 单体转运到生长的顶端即s c3 的分泌处。s c 3 在水中菌丝的顶端分泌， 扩散到培养液中，在培养液与空气界面组装成一层两亲性薄膜同时伴随 着水的表而张力的急剧下降，能使菌丝突破培养液与空气的界面。水 气生菌丝分泌的疏水蛋白不能扩散到环境中，其在细胞壁与空气的界面 自我组装成小丰t 层，赋予这些气生菌丝以疏水性。( b ) 菌丝吸附刨疏水 表面的模式。通过在细胞壁与疏水基质问的界面自我组装，s c 3 使茁丝刚 着到这种疏水基质上 1 3 3 粘附茵丝到疏水表面 对在疏水性固体如t e f l o n ( 特氟纶，聚四氟乙烯) 上生长的 野生型裂褶菌菌丝，s c 3 定位于细胞壁和t e f l o n 表面之间。s c 3 是 通过连接亲水性细胞壁与疏水性固体的方式参与到真菌对疏水 表面的附着中( 图4 b ) 。而s c 3 突变株对疏水表面的附着很不紧 密。在自然界中，裂褶菌附着到疏水性木质素上，可能对木材的 降解很有帮助。在榆枯萎病菌o p h i o s t o m au l m i 表达的疏水蛋白c u 使病菌和传播该病的小蠹虫有效的粘附，从而间接地参与了致病 过程。而稻瘟霉m a g n a p o r t h eg r is e a 的m p g l 使该病菌粘附于水 稻页面，形成附着胞。 1 3 4 保护作用 疏水蛋白覆盖在真菌的表面，保护真菌细胞抵抗恶劣环境： 化学与酶的处理干燥和细菌感染。疏水蛋白是一种弱免疫原，覆 盖真菌表面屏蔽了其它抗原，使病源真菌抵抗免疫系统攻击。 1 3 。5 其它生物学功能 疏水蛋白作为毒素和诱导物，可以诱导植物防卫系统进行反 应。不但促进孢子扩散，还形成亲水环境，促进孢子萌发。使菌 丝吸附到疏水表面，结合紧密，此时可能还是个发育信号。 南开大学硕士毕业生沦文 作者：粱俊 疏水蛋白在自然界里广泛地存在着，同一种真菌还存在着不 同种的疏水蛋白。不同疏水蛋白在真菌不同的发育阶段表达，具 有不同的生理功能。这些随着新疏水蛋白的不断发现必将揭示其 更多的特性和作用。 1 4 疏水蛋白基因表达的调节 由于疏水蛋白参与了病菌真菌各种各样的形态过程，因而其调 控机理复杂。来自钩巢曲霉( 4 卵e 昭j ，u 彻，d “，a 月0 的疏水蛋白基因ro da 是由中心调控基因br la 调控的，但是，它不受“下游调控：于 ( d o w ns t l e a mre g u la t o ts ) ”，例如基因weta 和ab aa ，所调控。e ascc g 一2 的启动予分析表明，疏水蛋白基因eas 的顺式作用 元件可以调控该基因对昼夜节律，光线和营养饥饿的响应。基因e as 在早上表达是由一段称为激活的生物钟因子dna 片段所控 制的。蓝光和菌丝体生长会抑制该基凶的表达。基因sc 】、sc4 和sc6 都受到仅在双核阶段的交配型基因调节，特别是基因fb f 的作用。而基因s c3 则在单核阶段大量表达。裂褶菌s fl ，2 2 7 t 月e 所有的疏水蛋白都受到基因thn 产物的调控，该基因控 制气生菌丝的形成。稻瘟病菌疏水蛋白基因mpgl 是由营养饥饿 所调节，氮或碳饥饿都会大量诱发该基因的表达。基因mpgl 受到 控制氮源利用的位点nu t1 所调节，该位点与分别来自钩巢曲霉 和脉孢霉的area 和i 9 il2 基因具有同源性。分析基因mpg1 的启动子发现nut1 可以识别该基因类似gata 的结合位点。基 闻nprl 和npr2 所编码的反式作用元件也可以调控基因mpg l 的表达，并且该病菌致病过程中所必须的二个基因，氮或碳饥饿调 控这二个基因的表达。疏水蛋白基因的调控是比较复杂的，单个基 因受到多个反式作用因子的调控。 1 5 疏水蛋白的应用前景 南开大学硕j + 毕业生论文作者：粱俊 1 5 1 疏水虽白的安全性 因为疏水蛋自在人类消化蘑菇和真菌发酵食品时被摄入，所 以认为它们无毒，使用在食品中是安全的。另外，数据初步显示 疏水蛋白既非带细胞毒性也非强免疫原性，因此认为在医学使用 l 1 是安全的。 1 5 2 改变表面的属性 疏水蛋白在遇到亲水疏水界面时形成一层两亲性薄膜的特 性使它们能改变表面的可湿性。悬浮液体( 如油滴) 或浸泡固体 ( 如t e f l o n ) 于疏水蛋白溶液中，能使其疏水性表面变得亲水( 图 7 a b 、。相反的，在玻璃或滤纸上蒸发疏水蛋白溶液能使这些材料 变成疏水性。重要的是，与如b s a 的结合相比，i 型疏水蛋白与这 些支撑物的结合特别紧密。纸或t e f l o n 上的疏水蛋白薄层用水洗 不去，甚至抵抗1 0 0 普通试剂的抽提，而相比，用热s d s 处理很 容易从疏水表面上完全除去b s a 。 由于疏水蛋白具有这些特性，所以能被应用于医学和科技领 域的不同方面。例如：在医学移植物的表面组装上疏水蛋白，能 提高这些移植物的生物相容性或者能防止微生物细胞粘附到如 导管的表面：在果蔬保鲜上面，由于疏水蛋白具有表面活性并能 够瞬时自我装配，因此可以在果蔬表面形成层防腐保鲜被膜， 这层被膜不仅可以防止多种微生物对果蔬的侵害，而且可以直接 食用，不用除去，甚为方便，弥补了保鲜膜及蜡封技术的缺陷。 1 5 3 表面活性 在食品制造业上，由于疏水蛋白可改善食品对抗相交能力并形 成稳定泡沫，稳定泡沫不仅在通气情况下产生，而且溶解度随不同 压力而改变，这样就使得其在密封食品生产上发挥重要作用；在日 用产品中，疏水蛋白还可以作为洗洁产品的成分，根据其疏水、亲 水两相间的转变，可通过自我装配而将面部的油脂等疏水的成分包 裹起来，再用水清洗将其除去，也可以作为保护秀发的天然膜，使 发部维持清洁并保持一定水分；作为一种生物表面活性剂，疏水蛋 白还可以用于促进土壤中的污染物的降解和应用在石油泄漏后回 m i ：_ ：i _ = 学顺卜毕业生论文 收石油的过程中，疏水蛋白强表面活性将能很好的完成这方面的任 务。 1 5 4 作为蛋白和细胞固定化的媒介 a b c d 勘擎镩掣柏峰臼撇烈j i 国 堪簟体_ 捩蠢l 融l 台蛋白 辩越酶野帕骧承量臼 麟嚣黟噌制嘲油 翻6 疏水夤白在亲水与疏水界面自我组装的特性能政变表面 的可湿性。( a ) 在疏水蛋白水溶液中气泡或油滴表面包被着 两亲性膜，能使奠稳定的存在j 水中。( b ) 类似的。肖。片 疏水傩塑料如t e f l o n 浸泡_ 】= _ 这样的溶液中，塑料被紧密料附| _ f 勺 蛋向膜包被，使其淡面变得可泓。( c ) 相反，疏水虽向单体 存采水性表面变千，能使表面变得疏水。( d ) 融台蛋臼的自 我组装町以赋二p 表面以特殊的性质“；比町以在成膜后对 膜直接修饰。 疏水蛋白交联上配体或形成融合蛋白，使特定分予黏附到表 面，可使特定分子固定化到特定表面。如在生物传感器一h 作为引 发心，进一步的，与特定功能的蛋白，如脂酶，形成融合蛋白后， 利用疏水蛋白在同体表面形成稳定的两性单层蛋白膜的特性，可以 将特定分了l 划定在膜的特定而。 南开大学硕士毕业生论文作者： 粱俊 1 5 5 作为纳米材料和基因工程研究的材料 根据t h o m a s ( 1 9 9 5 ) 的定义，疏水蛋白单体3 n m ，覆盖在表面 形成1 0 n m 厚薄膜的性质也使这些蛋白成为纳米科技； 1 有价值的候 选材料，而且研究不同疏水蛋白混合时的聚合特性也是个有趣的纳 米课题。 疏水蛋白的基因工程被用于研究蛋白的结构与功能的关系，或 用于优化其结构以用于特定方面。例如，能改变疏水蛋白的溶解特 性或改变两亲性薄膜的亲水而或疏水面的生物物理性质。疏水蛋白 的n 一末端部分是暴露在组装好的疏水蛋白膜的亲水面，因而这个 部分将成为修饰改造的首选。删去或加入氨基酸能改变疏水蛋白的 生物物理性质或协助特定细胞或分子的附着。实际上，形成的融合 蛋白可以用双水相等疏水蛋向特定的提纯方法快速的纯化这些配 体分子。 疏水蛋白的良好应用需要这些蛋白能被大量地生产( 比如达 克升级) ，虽然在一些应用中，用量也许很少( 1n a g 的s c 3 足以 包被1i n 。2 的t e f l o n ) 。野生型裂褶菌菌株向培养液中分泌的s c 3 达6 0m gl 。1 以上，这使裂褶菌成为到目前为止最佳的i 型疏水蛋白 的生产者。对于i i 型疏水蛋白，如h f b i 的纯化研究已经走向了中 试。疏水蛋白工业化和基因：亡程的改造必将为疏水蛋白在诸多应 用方面的研究提供更为广阔的前景。 1 6 疏水蛋白的提取与纯化 对于大规模工业化生产来说，能否找到一种高效的大量提取 疏水蛋白的方法十分重要，这也是国际上疏水蛋白研究的热点之 一。目前，对疏水蛋白的纯化主要是依据其特殊的溶解性质。i 型 的疏水蛋白可以从真菌细胞壁中以复合体形式分离提纯，该复合体 不溶解于s d s ，而冷的三氟乙酸可以小范围地打破疏水交互作用， 有效地溶解疏水蛋白的单体，同时保证疏水蛋白完整性和生物学活 性。因此，菌丝体结合的i 型疏水蛋白，例如a g a r i c u sb i s p o r u s 产 生的a b h 3 ( l u g o n e se ta l ，1 9 9 8 ) 和a b h l ( l u g o n e se ta l 。19 9 6 ) 南开大学硕士毕业生论文 作者：粱俊 m a g n a p o ，t h e 产生的m p g l ( t a lb o te t a 1 1 9 9 6 ) p 珀 1 2 0 f s o s t r e a t u s 产生的p o h 2 年np o h 3 ( 6s g e ir s d 6 t t i i 、e ta 1 1 9 9 8 ) ， 还有s c 0 m l i n 0 产生的s c 3 和s c 4 ( d ev r ie se ta 1 19 93 ) 等等， 提取方法均先将菌丝体通过热的i 一2 s d s 处理除去杂蛋白，再用 冷的三氟乙酸把疏水蛋自从细胞壁中提取出来。而i i 型疏水蛋白， 由厅j c h o d e r m ar e e s e j 产生的h f b i 则是通过按次序将菌丝经过 5 mp h 6 0 并包含2 s d s 或1 s d s ( 1 0 0 。c ) 的柠檬酸钠溶液和0 ，1 t f a 2 0 a c n ( n a k a r i s e t e ta 1 1 9 9 6 ) 处理，再通过离子交换层 析或高压液相色谱进行纯化的方法来得到的。 上述方法主要都是应用在实验室小规模提取，而对于大规模提 取方法目前报道还比较少。最近，芬兰国家技术研究中心生物工程 和食品研究所已经发表了双相层析法和s d s 大量分离纯化瑞氏木霉 ( 1 ，i c h o d e r m ar e e s e i ) 疏水蛋白的方法。此法简便易行，进一步的 研究还在进行当中。本实验室经过实验验证利用s d s 和疏水蛋白 ；t f b i 的疏水作用结合，可以将该蛋自从大量的杂蛋白中有效分离出 来。然后采用高盐浓度的k c l 可以沉淀s d s ，从而使得疏水蛋白进 入水相。这个简单的三步抽提法为工业大规模提取疏水蛋白提供了 一条途径。同时，研究发现，疏水蛋h f b i 具有良好的热稳定性， 在8 5 度左右都不会变性沉淀，而这个性质使其他的蛋白并不具备 的，可以考虑作为分离纯化的方法。对于存在于发酵液中的疏水蛋 白，实验室小规模提取可以将发酵液一7 0 0c 冰箱中过夜，然后置于 冰上溶解，存在于发酵液中的疏水蛋白即可聚合成絮状沉淀，离心 分离后将沉淀置于三氟乙酸或2 0 乙腈中即可使沉淀中的疏水蛋白 溶解。 我们根据文献结合各种疏水蛋白的提取方法总结出了对未知 疏水蛋白的提取和初步的鉴定方法。对于菌丝可以先用热的s d s 洗， 然后将洗后的s d s 液用双水相法进行抽提。具体双水相法是根据疏 水蛋白对于某些去污剂具有有较高溶解度，将去污剂与含疏水蛋白 的抽提液充分混和，由于疏水蛋白与去污剂有较高亲和力，在去污 6 南开大学硕士毕业生论文作者：粱俊 剂和水相的分层中，疏水蛋白将离开水相而与去污剂共存。分离去 污剂后，于去污剂中加入与去污剂有较高亲和力的有机试剂如正丁 醇_ j 以将去污剂萃取而分离得到疏水蛋白。双水相疏水蛋白萃取法 如图： 图7 双水相萃取法示意图 如果菌丝中存在能溶解于热的s d s 中的疏水蛋白i i ，则可以通 过第二步的双水相法得到具疏水蛋白特征的小分子蛋白然后将 菌丝用蒸馏水反复冲洗，再低温下用三氟乙酸或者2 0 乙腈处理 如菌丝中存在疏水蛋白i ，则可以在三氟乙酸或2 0 已氰中得到 通过这套方法我们已经对瑞氏木霉，少根根霉，和灰树花的疏水 蛋白进行了提取和鉴定同时，在研究i i 型疏水蛋白h f b i 的大规 模纯化时发现向较纯的一定浓度的h f b i 溶液中通入空气或用疏 水棒搅拌，则在溶液中出现白色絮状漂浮物，同时溶液中总蛋白 含量减少；而对应浓度b s a 溶液经如此处理却无此现象。因此， 我们认为絮状物是h f b i 的多聚体。这种现象对疏水蛋白的检测和 纯化很重要，相关研究正在进行。 1 7 前期的研究基础 本实验室乔老师已经于芬兰从事真菌疏水蛋白的研究9 年， 具有丰富的理论基础和经验。我们针对瑞氏木霉疏水蛋白的研究 已经历时几年，针对瑞氏木霉的疏水蛋白进行了s d s k c l 三步 法，三氟乙酸和乙腈抽提法，双水相法以及凝胶过滤法等抽提方 法系统的研究；另外针对疏水蛋白纯化也有疏水柱和高压液相的 南开大学硕七毕业生论文 作者：粱俊 理论和实验基础，并据此纯化 = _ j 了测序级的疏水蛋白并获得了瑞 氏木霉疏水蛋白的抗体。 1 。8 立题的目的和意义 充分的证据证明疏水蛋白可能为真菌表达最为丰富的蛋白之 ，其对于真菌的生长发育和真菌与环境和其它组织的相互作用起 到非常关键的作用。一种真菌可能含有几种不同的疏水蛋自基因， 而每种疏水蛋白都有着特殊的功能。这些疏水蛋白似乎只有形成不 溶性的疏水亲水双性膜时才能发挥其生物学功能。对于疏水蛋白 的研究有两个热点：一，了解疏水蛋白自我组装成为双性膜的分子 机制；二，对于其生物学功能的研究，揭示这些蛋白在真菌的发育 和及其相关的植物的发育中的重要的作用和充当的关键的角色。同 时，由于疏水蛋白这种神奇的蛋白如l 所述在工农业和食品卫生业 中有着巨大的潜在应用价值，并且大部分真菌疏水蛋白由于产生其 的为食用真菌，具有无毒性，目前对于疏水蛋白的研究国际上还是 一个热点，目前国内的研究才刚刚开始，我们关于疏水蛋自研究对 于二发现新的疏水蛋白基因、了解其性质和结构和生物学功能、填补 国内研究的空白有着重要的意义。食用真菌特别是灰树花分泌多糖 对于强身健体、提高人体免疫力、抑制癌症的发生有着重要的作用 的意义，其工业发酵生产已经有了相当大的规模。因此，关于灰树 花疏水蛋白的研究对于了解灰树花的生长发育，同时由于灰树花有 较大的生产规模，因此其疏水蛋白的应用必然有更大的市场价值。 灰树花疏水蛋白与灰树花产多糖的复合应用也是将来极具诱惑的 研究方向。 南开大学硕士毕业生论文 作者：粱俊 二材料与方法 2 1 实验材料 。 2 1 1 菌种 菌株名称培养温度 t r i c h o d e r m ar e e s e iv t t d 一9 8 6 9 22 9 6 r o ，o r af r o n d o s n 来自天津市工微所2 4 2 1 2 培养基 2 1 3 瑞氏木霉改良培养基 葡萄糖( 2 0 0g 1 ) ，蛋白胨( 4 0g 1 ) ，酵母抽提物( 1 0g 1 ) ， k h 2 p 0 4 ( 4 0g 1 ) ，f n h 4 ) 2 s 0 4 ( 2 8g i ) ，m g s 0 4 7 h z o ( 0 6g 1 ) ， c a c l 2 2 h 2 0 ( 0 8g 1 ) 和超微量元素溶液( 2m l 1 ) 。消前p h 用h c l 凋到4 6 。 2 1 ，4 灰树花斜面培养基 马铃薯2 0 0 9 l ，葡萄糖2 0 9 l ，k h 2 p 0 40 5 9 t ，m g s 0 4 7 h 2 0 1g l ， 琼脂2 0 9 l 。 2 1 5 灰树花种子发酵液 不加琼脂，其余同斜面培养基。 2 1 6 灰树花发酵培养基 p d a 培养基1 l 加k h 2 p 0 41 9 ，m g s 0 4 7 h 2 0 05 克 2 1 7 疏水蛋白s d s 抽提系统 s d s 抽提液：1 s d s ，l0 0m m t r i s h c ，p h9 0 。 蛋白质沉淀剂：盐酸10 0 u l 1 ，丙酮5 0 0 m l ，正丁醇5 0 0 m l 2 1 8 s d s p a g e 主要相关试剂 电泳电极缓冲液：o 2 5 m o l t r is ，0 1 9 2 m o l 1 甘氨酸，0 1 s d s 2 上样缓冲液：t r i s h c l ( 0 5 m ，p h 6 8 )2 m l ，甘油2 0 m l 、 1 0 s d s4 m l 、0 1 溴酚兰0 5 m l 、巯基乙醇1 m l 、双蒸水 1 5 m l 。 染色固定液：5 0 0 m l 甲醇、1 0 0 m l 冰醋酸、0 6 9 考马斯亮蓝。 脱色液：5 0 0 m l 甲醇、1 0 0 m l 冰醋酸。 19 南开大学硕士毕业生论文作者：梁俊 2 1 9 主要试剂： 1 3 1 丙稀酰胺单体及亚甲基丙稀酰胺购自华美。 1 。3 2 已氰色谱纯，上海化学试剂有限公司 1 3 3 去污剂c 13 e 0 2 ，芬兰赫尔辛基大学l i n d e r 实验室 1 3 4 w e s t e r n b l o t 所用一抗及二抗来自于芬兰赫尔辛基大学 l i n d e r 实验室 1 3 5 正r 醇，丙酮，无水乙醇，土温等( 化学纯、天津市化 学试剂三厂) 。 2 1 1 0 主要仪器设备 高速离心机heraeuss e p a t e e hc r y o f u g e 真空冷冻干燥器 c h r i s t l 一1 ，g e r m a n y h p l c 色谱仪与检测器 w a t e r6 0 0 e ，9 9 6 p d a ，u s a 超声波破碎仪j y 9 2 。1 1宁波新芝科器研究所 笔式酸度计 h a n n a ，p o r t u g a l 2 2 实验方法 2 2 1 对灰树花培养基的优化筛选 2 2 1 1平板培养法选择碳源及氮源 在不同的培养基中央接适量菌丝，2 5 度培养10 天，用游标卡尺 测菌丝长度；用热水溶解培养基，将菌丝分离后用热水反复冲洗， 6 0 度烘干称重。 2 2 1 2种子液制备 将斜面培养基菌丝连同固体培养基充分捣碎，用药勺刮取混合 物混入种子培养基，种子培养基装量为 10 0 m l 2 5 0 m l ，于 2 5 2 0 0 r m i n 培养7 天。 2 2 1 3发酵培养基的培养 将不同的培养基按1 0 0 m 1 2 5 0 m l 装量，接1o 的种子液， 2 5 2 0 0 r m i n 培养7 天。 2 2 1 4 菌丝生物量的测定 发酵培养基真空抽滤，用水反复冲洗后6 0 烘干称重。 南开大学硕士毕业生论文 作者：粱俊 2 2 2 疏水蛋白的提取 2 2 2 1 发酵液中疏水蛋白的提取 将发酵液置7 0 冰箱过夜，于冰上融化后5 0 0 0 r m i n 离心，取下 相沉淀溶解于4 下溶解2 0 乙腈，5 0 0 0 r m i n 离心后上相冻干。 2 2 2 2 菌丝中疏水蛋白的提取 将发酵菌丝用水反复冲洗，按2 m l 克的量加入s d s 缓冲液，置 于1 0 0 水浴中1 小时并不时振荡，5 0 0 0 r m i n 离心，上清加入2 的c 13 e 0 2 ，2 8 保温3 0 分钟后，取上相去污剂，加入与上相等量 正丁醇，分层后留下相进行检测。s d s 抽体液处理后的菌丝用蒸馏 水细3 次，在t f a0 超声处理5 分钟，处理液冻干检测。 2 2 3 疏水蛋白的检测 2 2 3 1s d s p a g e 对于疏水蛋白抽提方法的初步鉴定采用s d s p a g e 法，由于已 经得到了瑞氏木霉的疏水蛋白及抗体，通过w e s t e r b l o t 可以对采用 的抽提方法进行初步的检测。s d s p a g e 上层浓缩胶浓度为5 ， 下层分离胶浓度为2 0 。 胶的制作方法为：先灌分离胶，将4 m l 的4 0 丙烯酰胺单体、 2 m l 的去离子水、2 m l 的4 分离胶缓冲液充分混合，再加入3 0 u l 的a p s ，8 u l 的t e m e d ，迅速灌入玻璃槽，上层加入0 5 m l 的水保 和正丁醇封口；待分离胶凝了之后，将0 5 m l 的4 0 丙烯酰胺单体、 l m l 的4 浓缩胶缓冲液、3 5 m l 的去离子水、2 0 u 1 a p s 、5 u l t e m e d 充分浑匀，迅速倒入己灌分离胶的玻璃槽中，插入梳子。 s d s p a g e 的电极缓冲液为p h 值为7 8 的0 2 5 m l t r i s 甘氨酸缓 冲液。 电泳之后将分离胶染色液中染色2 0 分钟，水冲洗之后用脱色液 脱色，脱色过程换脱色液2 3 次。 2 2 3 2w e s t e r b l o t 一、转膜 ( 1 ) 当s d s p a g e 电泳即将结束时，用蒸馏水清洗石墨板，擦干。 南开大学硕士毕业生论文作者：梁俊 ( 2 ) 戴上手套，切6 张滤纸和1 张硝酸纤维素膜。滤纸和膜的大小要 和凝胶的大小完全相等或小于凝胶。否则，两滤纸边缘的接触会造 成电流短路，大大降低转移的效率。 ( 3 ) 把硝酸纤维素膜漂浮于一盘去离子水的水丽k ，借毛细作用使膜 从下往上湿润后，将膜完全浸没于水中。浸泡5 分钟以除去滤纸膜 上残留的气泡。 ( 4 ) 在一浅托盘中加入少量转移缓冲液，把6 张滤纸浸泡于其中。 ( 5 ) 戴上手套，按如下方法安装转移电泳槽： a 平放石墨电极的底座，此石墨极为阳极。 b 在石墨板上放置3 张经转移缓冲液浸泡过的滤纸，对齐然后用一 玻璃移液管在滤液面上滚动，以排除残留气泡。 c 把硝酸纤维素滤膜放在滤纸堆上，要保证精确对齐，避免在滤纸 与硝酸纤维素膜之问留 有气泡。 d 从电泳槽上取出s d s 聚丙烯醚胺凝胶，把凝胶转移到一盘去离子 水中略微漂洗一下，然 后准确平放于硝酸纤维素滤膜上。把凝胶左下角置于硝酸纤维素滤 膜的标记角上，戴手套排除所有气泡。 e 把另一组的3 张滤纸放在凝胶上方，同样需确保各层精确对齐并 避免气泡。 ( 6 ) 将转移电泳槽上盖扣到石墨电极转移膜胶复合体上。连接电 源，注意正负极。根据胶面面积按0 6 5 一1 o m a c m 2 接通电流，电 转移】小时。 ( 7 ) 断开电源并拔出槽上插头，从上到下拆卸转移装置，逐一掀去各 层，把凝胶取出进行抗体标记。 二、封闭 配封闭液：称0 6 9 脱脂奶粉，加入2 0 m t b s ，再加入吐温一2 ( ) l o o u l 即可。 将膜置于封闭液中3 0 m in ，用不含脱脂奶粉的t t b s 洗膜。 南开大学硕士毕业生沦文 作者：粱俊 三、加一抗 配一抗反应液：加入1 5 0 0 0 的h f b i 兔抗体。 在一抗反应液中振摇硝酸纤维素膜6 0 m i n ，用t b s 、t t b b 、t b s 、 t b s 洗膜，每次 1 5 m i n 。 四、加二抗 配二抗反应液：加入l 1 0 0 0 的a p 偶联的羊抗兔抗体a 在二抗反应液中振摇硝酸纤维素膜6 0 m i n ，用t b s 洗膜4 次，每次 1 5 m i n 。 五、显色 a p s b1 0 m 1 + b c i p 母液3 4 u l + n b t 贮存液6 6 u l ，硝酸纤维素膜 放入其中振摇，约1 0 m i n 后显色。