（农业昆虫与害虫防治专业论文）苏云金芽孢杆菌菌株的分离和cry基因的鉴定.pdf

摘要 本研究从河北各地区，东北地区，四川九寨沟，云南的昆明和丽江的林地和农田 采集土壤1 8 7 份，分离出b t 野生菌株7 6 株，伴孢晶体类型有菱形、方形、球型，充 分体现了我国菌株资源的多样性。筛出b t 菌株的土样共有1 4 份，筛出率为7 5 。 利用1 8 对鉴定c r y 基因型的通用引物对以上7 6 株菌和本室保存的5 7 株菌进行 了p c r 和p c r r f l p 鉴定：含有c r y l 型基因的菌株有7 6 株，含有c r y 2 基因型的菌 株有1 3 株，含有c r y 7 基因型的菌株有2 株，含有c r y 8 基因型的菌株有3 0 株，含有 c r y 9 基因型的菌株有6 株，含有c r y l i 基因型的菌株有2 0 株，含有c r y 3 0 基因型的 菌株有1 株，含有c r y 3 2 基因型的菌株有l 株，含有c r y 4 0 基因型的菌株有1 株。有 2 l 株未鉴定出基因型。1 3 3 株野生菌株的伴孢晶体s d s p a g e 分析结果表明：1 3 株同 时含有c r y l 型基因和c r y 2 型基因的菌株表达1 3 0 k d a 和6 0 k d a 的蛋白，其伴孢晶体 为菱形和方形；3 8 株只含有c r y l a c 基因型的菌株，都表达了1 3 0 k d a 的蛋白，其伴 孢晶体为菱形，细小菱形，方菱形，菱形和方形。3 0 株含有c r y 8 基因型的菌株，表 达了1 3 0 k d a的蛋白，伴孢晶体为球型。 菌株p c r 产物测序结果的同源分析表明：新菌株c y l 的基因与模式基因 ( g e n b a n k ：u 0 4 3 6 7 ) 的同源性为9 9 0 9 ，可以推测出菌株c y l 可能是一株含有c r y t a b 基因的新菌株，对鞘翅目害虫有杀虫活性。根据模式菌株b t s l 3 7 j 的基因序列 ( g e n b a n k ：m 6 4 4 7 8 ) 使用p r e m i e rp r i m i e r 5 软件设计了c r y 7 2 f c r y 7 2 s ， c r y 7 1 2 f c r y 7 1 3 s ，c r y 7 3 f c r y 7 3 s 三对引物用于扩增菌株c y l 的全长序列。得 到了1 5 6 9 b p ，2 1 3 2 b p ，1 3 0 6 b p 的产物。 含有c r y 8 基因的3 0 株菌株经过酶切分析基因型都为c r y 8 e a 。可以预测这些菌 株可能对鞘翅目害虫有活性。 w f s - 9 7 和w f s 1 2 分别含有o r y 3 0 和c r y 4 0 的基因，两菌株应该对双翅目害虫具 有杀虫活性。这些基因与已知基因的同源性均低于9 5 ，所以根据新的命名法，这几 个基因可能为在第二分类等级上有差异的新基因。 部分菌株对棉铃虫和小菜蛾做了生物活性测定，对于已得到鉴定结果的菌株，其 杀虫活性与预测的杀虫活性相一致。 关键词：苏云金芽孢杆菌；分离；鉴定；p c r r f l p ；c r y 基因；s d s p a g e i s o l a t i o no f b t h u r i n g i e n s i ss t r a i na n di d e n t i f i c a t i o no ft h e i rc r yg e n e s p o s t g r a d u a t e ：w uh u i x i a n m a j o r ：a g r i c u l t u r ei n s e c ta n dp e s tc o n 仃o l a d v i s o r ：w a n gq i n g y i n g a b s t r a c t i nt h i s s t u d y , 7 6b t i s o l a t e sw e r es c r e e n e df r o m1 8 7s o i ls a m p l e sc o l l e c t e df r o m f o r e s t sa n da g r i e u l t u r a is o i l sb e l o n g e dt oa r e a so fh 曲e ip r o v i n c ea n dn o r t h e a s to f c h i n a ，j i u z h a i g o uo fs i c h u a np r o v i n c e ，k u n m i n ga n dl i j i a n go fy u n n a np r o v i n c e s e v e r a l s h a p e so fc r y s t a l si n c l u d i n gb i p y r a m i d a l ，s q u a r e ，s p h e r i c a la n da m o r p h o u ss h a p ew e r e o b s e r v e di nt h eb t h u r i n g i e n s i si s o l a t e s b t h u r i n g i e m i sr e s o u r c e so fc h i n aw e r ea b u n d a n t a n dv a r i o u s t w e n t y - t h r e es o i l ss a m p l e sc o n t a i n e d 最t h u r i n g i e n s i s t h e yw e r ef o u n di n 7 5 o f t h e1 8 7s o i ls a m p l e s e i g h t e e np a i r so f u n i v e r s a lp r i m e r sw e r eu s e dt oi d e n t i f yc r y g e n e - t y p e so f7 6b t h u r i n g i e n s i si s o l a t e sa n d5 7b t h u r i n g i e n s i si s o l a t e sc o n s e r v e di nt h i s l a b o r a t o r ya tp r i m a r yr a n ko ft h eb t h u r i n g i e n s i sc r yg e n en o m e n c l a t u r es y s t e mt ou s et h e m e t h o do f p c r r f l p s e v e n t y - s i xi s o l a t e sh a r b o r e dc r y lg e n e s ，1 3i s o l a t e sh a r b o r e dc r y 2 g e n e s ，2i s o l a t e sh a r b o r e dc r y 7g e n e s ，3 0i s o l a t e sh a r b o r e dc r y 8g e n e s ，6i s o l a t e sh a r b o r e d c r y 9g e n e s ，2 0i s o l a t e sh a r b o r e dc r y l lg e n e s ，l i s o l a t e sh a r b o r e dt h ec r y 3 0g e n e ，li s o l a t e s h a r b o r e dt h ec r y 3 2g e n e 。1i s o l a t e sh a r b o r e dc r y 4 0g e n e s t w e n t y - o n ei s o l a t ec o u l d n t i d e n t i f yg e n e - t y p e s s d s p a g ew e r ed o n ew i t ht h ep a r a s p o r a lc r y s t a l so f1 3 5i s o l a t e s t h i r t e e ni s o l a t e s c o n t a i n i n gb o t hc r y lg e n e sa n dc r y 2g e n e sp r o d u c e d1 3 0 k d aa n d6 0 k d ap r o t e i nb a n d s ，a n d f o r m e db i p y r a m i d a l ，s q u a r ec r y s t a l s a l lo ft h et h i r t y - e i g h ti s o l a t e so n l yc o n t a i n i n gc r y l a c g e n e sp r o d u c e d1 3 0k d ap r o t e i nb a n d s ，f o r m e db i p y r a m i d a l , m i n i s t e rb i p y r a m i d a l ，s h o r t b i p y r a m i d a l ，b i p y r a m i d a l a n ds q u a r e c r y s t a l s t h i r t yi s o l a t e sc o n t a i n i n gc r y 8g e n e s p r o d u c e d1 3 0 k d ap r o t e i nb a n d s ，f o r m e ds p h e r i c a lc r y s t a l s p c r sp r o d u c t sw e r es e q u e n c e d h o m o l o g ya n a l y s i sw e r ed o n e ap a r t i a lg e n e s e q u e n c e o fg e n eo fc y is h a r e d 9 9 0 9 h o m o l o g yw i t hh o l o t y p eg e n e o f c r y 7 a b ( g e n b a n k ：u 0 4 3 6 7 1 t h en o ws t r a i nc y lw a sf o r e c a s t e dc o n t a i n i n gc r y t a bg e n e i no r d e rt oa n a l y z et h eg e n e so fc r y s t a lp r o t e i no fc y i ，t h r e ep a i r so fp r i m e r st h a ti s c r y r 2 f c r y 7 - 2 s ，c r y 7 1 2 f c r y 7 - 1 3 s ，c r y 7 3 f c r y 7 3 s w e r ed e s i g n e d , b a s e do nt h e g e n es e q u e n c e ( g e n b a n k ：m 6 4 4 7 8 ) o fh o l o t y p es t r a i nb t s l 3 7 j t h e r ew e r ep r o d u c t so f 1 5 6 9 b p ，2 1 3 2 b p ，1 3 0 6 b p b y t h e p c r m e t h o dw i m t h e p r i m e r s a b o v e t h i r t yi s o l a t e so fs t r a i n sc o n t a i n e dc r y 8g e n ew e r ea n a l y z e db yr f l p t h er e s u l t s h o w e dt h a ta l lo f t h es t r a i n sw e r ec r y 8 e ag e n et y p e 1 1 l e yw e r ef o r e c a s t e dh a v i n gt o x i c i t y t oi n s e c t sb e l o n g e dt oc o l e o p t e r 色 s t r a i n so fw f s - 9 7a n dw f s 1 2c o n t a i n e dg e n e so fc r y 3 0a n dc r y 4 0r e s p e c t i v e l y t h e yw e r ef o r e c a s t e dh a v i n gt o x i c i t yt oi n s e c t so fd i t p e r a g e n e so fc r y 3 0a n dc r y 4 0 s h a r e dah o m o l o g yo fl e s st h a n9 5 c o m p a r i n gw i t ht h e i rh o l o t y p eg e n e s w f s 一9 7a n d w f s - 1 2w e r ed e d u c e dt h a tt h e yh a dd i f f e r e n c e si nt h ed e g r e et w ob a s e do nt h en e w n o m e n d a t u r e s o m ei s o l a t e sw e r ed o n eb i o a s s a ya g a i n s tp l u t e l l ax y l o s t e l l a ，h e l i c o v e r p aa r m i g e r a s o m es t r a i n sw h i c hh a db e e nk n o w nt h ec r yg e n e se x p r e s s e dt o x i c i t yt o w a r d sp l u t e l l a x y l o s t e l l a , h e l i c o v e r p aa r m i g e r a t h i sr e s u l t sc o i n c i d e dw i t hp r o s p e c t i v et o x i c i t yw h i c h w e r ed e d u c e db yt h et y p eo f g e n ea n dp r o t e i n k e yw o r d s ：b t h u r i n g i e n s i s ；i s o l a t e ：i d e n t i f i c a t i o n ：p c r r f l p ：c r yg e n e ；s d s p a g e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑韭盔些盘堂或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意 学位论文作者签名：签字日期：年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑韭盔些盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权亟韭壅些盘茎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 导师签名： 签字日期：年月日签字日期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 勃起 叫年6 具l 踟 电话： 邮编： 苏云金芽孢杆菌菌株的分离和c r y 基因的鉴定 i 引言 苏云金芽孢杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，简称b t ) 是存在于土壤中的一种革兰阳 性细菌，周生鞭毛或无鞭毛，在其孢子形成期能在菌体内形成伴孢晶体。这些伴孢晶 体主要由2 7 k d a 1 4 0 k d a 的蛋白质组成具有高度专一的抗虫作用【l j ，对人畜及非目标 昆虫无害，自2 0 世纪5 0 年代以来，b t 制剂已作为一种微生物杀虫剂在农业，林业， 环境卫生方面得到越来越广泛的应用。随着新分离菌株的不断出现，人们对该茵杀虫 活性的认识不断加深。目前已证实，不同i c p 对包括鳞翅目( l e p i d o p t e r a ) 、双翅目 ( d i p t e r a ) 和鞘翅目( c o l e o p t e r a ) 等9 个目的5 0 0 多种昆虫有不同程度的杀虫活性 【2 l 。这促使人们从不同地区分离不同的b t 菌种，到目前为止全世界已分离到五万株 以上的菌株( 3 】。 1 1 苏云金芽孢杆菌的生物学特性及其分布 苏云金芽孢杆菌的营养体为粗壮的直杆菌，两端钝圆，通常以成簇、分散形式排 列，或以两到四个菌体组成短链，间或看到长链状。菌体大小为( 1 2 1 8 ) 1 t m x ( 3 5 ) r t m 。但不同的亚种另有差异。以周生鞭毛运动或无鞭毛不运动。营养体生长到稳 定期的后期，在其一端或中央开始形成一个卵圆形的芽孢( s p o r e ) 如图卜l 。其大小 依亚种而异。如苏云金亚种( s u b s p t h u r i n g i e n s i s ) 的芽孢约( 0 8 o 9 ) i t m x 2 o a m ， 武汉亚种的芽孢约为o 5 5 9 m x l 3 8 9 m 。芽孢为该菌的休眠体，对高温和干燥等不良环 境有较强的抵抗力。生长至衰亡期后芽孢囊破裂，芽孢被释放出来。在部分亚种中， 如幕虫亚种( s u b s p f i n i t i f u s ) 等中，其芽孢从营养体分离后，芽孢与伴孢晶体分离后 被包裹在芽孢外套里不发生分斟”。 围1 昆虫病原眦伴孢晶体的形成 f i g if o c m a t i o n o f t h e t o x i c p a r a s p r a lc r y s t a l i n t h ei n tp a t h o g e nb t 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 伴孢晶体通常位于菌体的另一端，其形状大小与数目依亚种与菌株的不同而异。 一般呈菱形、长菱形、方形等形状，但也有呈圆形或椭圆形、无定形【5 “j 、三角形一j 、 镶嵌形【l0 】等。每个营养体可形成一个至数个伴孢晶体j 。 苏云金芽孢杆菌在土壤、病死昆虫、贮藏物、植被以及污水、尘埃等基质上均有 广泛的分布，而土壤作为微生物的大本营，也是苏云金芽孢杆菌分布最为丰富的生境， 如死虫、枯枝落叶、尘渣、污水等的苏云金芽孢杆菌菌株，最终也随着生物大循环而 回到土壤中。因此，土壤环境往往被选择作为研究不同苏云金芽孢杆菌资源的材料， 许多对特定目标昆虫有毒的亚种( 或菌株) 也从土壤中被分离到。 研究表明，苏云金芽孢杆菌的亚种和血清型在土壤中的分布表现出一定的地域特 性，且分布数量与土壤类型、p h 值、土壤腐植质、植被及其他微生物种群与数量有 关。d e l u c c a 等从美国1 1 个州采集的土壤样品中分离菌株以h 5 a b 和h 3 a b 占优判”j ， 其分布土壤的p h 值在4 9 8 0 。p a d u a 等从菲律宾各地采集的土样中分离的苏云会 芽孢杆菌菌株以h 3 a b 、h 9 和h 7 占优判b l 。在国内李荣森等报道了从云南、贵州、四 川和陕西等省采集土壤样品，分离得到的菌株菌株中h 3 和h 5 出现频率最剐，其次 是h 5 ，h 7 ，h 1 3 0 罗绍斌从云、贵、川、粤等省分离的苏云金芽孢杆菌菌株，发现其 血清型分别属于h l ，h 2 ，h 3 等1 4 种血清型【1 5 】。冯书亮等对河北省不同生态地区苏 云会杆菌资源调查结果表明，河北省有h i ，h 3 ，h 4 ，h 5 ，h 6 ，h 1 0 ，h 1l 等多种血 清型的苏云金芽孢杆菌分布【l 叫。彭可凡等7 】从湖南湖北等省分离得到的菌株主要为 三种血清型h 3 ，h 7 ，h 1 6 0 华中农业大学也分别对西北、西南、华中、华南、华北、 东北以及东南沿海各省的苏云金芽孢杆菌的资源进行了调查，并对该菌的分布数量与 土壤类型进行了比对分析，发现该菌在西北的栗钙土、华南的红壤、东北的黑钙土和 草甸土以及棉花、小麦与高粱等植被的土壤中的检出率较高【i $ j 9 。 1 2 苏云金芽孢杆菌的分离 许多国家都在进行b t 资源进行了调查及菌株筛选工作 2 0 - 2 6 1 。根据苏云金芽抱杆 菌的生理生化特性，广泛采用的分离方法土要有： 温度筛选：苏云金芽孢杆菌的芽孢中的皮层的主要成分是肽聚糖，是不含营养细 胞的多聚糖磷壁酸，它保持着芽孢的脱水状态和耐热性。在芽孢形成过程中，会产生 大量d p a - c a 鳌合物，使得芽孢中的生物大分子形成耐热凝胶。在8 0 热处理2 0 分 钟，苏云金芽孢杆菌芽孢也不会死亡网，并且休眠的芽孢在7 0 8 0 的亚致死温 度处理1 5 分钟，活化效果最幽l 好，不但促其快速萌发，还可提高芽孢的成活率【l ”。 温度筛趔孤3 0 】工作量大，b t 要达到一定浓度才能检出。 醋酸钠抗生素选择性筛选：苏云金芽孢杆菌芽孢的萌发，直接受p h 值影响。当 p h 值为7 0 时，芽胞萌发率达8 5 以上，当p h 值低于6 5 或高于8 5 时，芽孢萌发 率极低。因此，加入适量醋酸赫的培养基可选择性地抑制b t 芽孢的萌发，使芽孢经 热处理而不被杀死。而其它种类的芽孢杆菌芽孢因不被抑制萌发，使芽孢经热处理而 被杀死，从而消除干扰菌以达到高效分离筛选的目的【3 1 - 3 4 】。抗生素能钝化酶的活性， 2 苏云金芽孢杆菌菌株的分离和c r y 基因的鉴定 阻止微生物新陈代谢的某些环节，从而对微生物产生选择性作用。实验中，采用青霉 素培养基终浓度可保持在( 4 0 0n g m l 2 0 0 n g m l ) 筛选可增大抗菌谱，最大限度的 淘汰干扰菌。该方法筛选b t ，可有效抑制其它芽孢杆菌的生长，使得类似b t 菌落的 干扰菌大为减少，可大大提高b t 的分离效率3 5 l 。 1 3 苏云金芽孢杆菌的血清型及其亚种 自1 9 0 1 年首次被分离以来，苏云金芽孢杆菌的分类地位一直存在许多争论，其 主要原因就在于该菌与其近缘种蜡状芽孢杆菌( b a c i l l u sc e r e u s ) 在形态学及生理生 化特征上的广泛相似性，即这两种细菌的主要区别仅限于苏云金芽孢杆菌能产生伴孢 晶体等极少数特征。鉴于这一特征是与染色体外遗传物质( 即质粒) 有关，因而这一 特性容易受到外界因素的影响( 如高温、表面活性剂等) 而丧失，因此，许多学者认 为应将苏云金芽孢杆菌列为蜡状芽孢杆菌之下的一个亚种【3 6 】。直到伯杰氏鉴定细菌 学手册( 第七版) 将该菌确定为一个独立的种以后，有关该茵分类地位的认识才逐 渐统一“j 。随着苏云金芽孢杆菌分离体的不断涌现，以及对其杀虫活性谱认识的不断 加深，建立一种系统有效的种内分类方法就显得r 益迫切了。各种分类方法被相继提 出，并将该菌区分为不同的亚种( s u b s p e c i e s ) 、变种( v a r i e t i e s ) 、血清型( s e r o t y p e s ) 、 生物型( b i o v a r s ) 、致病型( p a t h o v a r s ) 及晶体型( e r y s t o v a r s ) 【3 7 】。但迄今被普遍接 受和采用的是由d e b a o a ca n d b o n n e f o i 提出的鞭毛抗原【3 8 l ( h 抗原) 的特异性而划分 为不同的血清型，再区分为不同亚种的方法。大部分亚种仅包含一个血清型，而部分 亚种则有两个或两个以上的血清型，这是由于鞭毛抗原由两种或两种以上的成分组 成。当苏云金芽孢杆菌制各的鞭毛抗原免疫动物时，在它体内可产生抗体。而含有抗 体的血清能与抗原发生特异性的结合，即发生凝集反应。如果一株苏云金芽孢杆菌的 h - 抗血清，只与自身抗原发生凝集反应，而不与任何其他菌株的抗原发生凝集反应， 那么。这个菌株就是一个新的h - 血清型。如果一个菌株的h 抗血清与另一个已知菌 株的抗原彼此之间进行凝集反应，但经过交叉吸收试验，这个菌株还含有不能被已知 菌株吸收完全的新的抗原成分，那么，这个菌株即被认为是含有新亚因子的h 型。 新h 血清型和含有新亚因子h 型的菌株都可以被定为亚种【l l 】。以往的苏云金芽孢杆 菌的亚种中，大多数亚种是这样被确定的。近年来，从世界各地分离出大量的菌株， 血清型亚种数量迅速增加。到2 0 0 6 年7 月，b t 血清型已达到7 1 个，血清型亚种达 到9 4 个【3 9 1 。 1 4 苏云金芽孢杆菌的毒素 苏云金芽孢杆菌生长代谢过程中，可以产生多种对昆虫有致病性的杀虫毒裂删。 按照其存在的部位，这些毒素通常可分为内毒素与外毒素两大类。其中外毒素是该菌 在生长过程中分泌到胞外的代谢产物；内毒素亦称晶体毒素，是以蛋白质晶体结构的 形势存在于细胞内，并随芽孢囊的破裂和芽孢的释放而释放到胞外，是主要的杀虫毒 3 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 素。h e i m p e l 将这些毒素进一步分为小外毒素、p - 夕 毒素、8 - 内毒素和t - 步 毒素四类 4 1 1 。 小外毒素亦称磷脂酶c ，是一种热不稳定的对昆虫肠道有破坏作用的酶。其活 性可被胰蛋白酶的脲破坏，在p h 值超过l o 或低于3 5 的情况下，该毒素也失 去活性。 d 一外毒素即苏云金素( t h u r i n g i e n s i s ) 是一种热稳定的外毒素。通常在营养 生长阶段产生并分泌到胞外该毒素对脊椎动物也有一定的毒性，但并不是所有 的亚种和菌株都能产生该毒素。 6 一内毒素即伴胞晶体毒素，是由一至几种杀虫晶体蛋白组成的特异性的晶格 结构 t 外毒素能使卵黄澄清的一种蛋白质，其对昆虫的毒力尚不确定。 除上述毒素外，近年来从该茵菌株或代谢产物中分离纯化了多种辅助蛋白( h e l p e r p r o t e i n s ) ，如p 1 9 ，p 2 0 和p 2 1 蛋白；以及多种营养期杀虫蛋白【4 2 l ( v e g e t a t i v e i n s e c t i c i d a l p r o t e i n ，v i p ) 。 1 5 苏云金芽孢杆菌的c r y 基因分类及其鉴定 i 5 1 苏云金芽孢杆菌c r y 基因分类系统的建立 苏云金芽孢杆菌菌所释放的伴孢晶体类型同杀虫活性存在很大的相关性，通过鉴 定菌株的c r y 基因类型可以预测其杀虫活性，同时对于发现新基因、新杀虫谱也有十 分重要的意义。血清型及其亚种分类方法以及形态和生化特征的鉴定分类方法不适合 b l 菌株在杀虫防病方面的应用。因此针对c r y 基因类型的分类方式逐渐被普遍接受并 得到广泛应用。 1 9 8 1 年美国的s c h n e p f 和w h i t e l e y 克隆了苏云金芽孢杆菌的第一个c r y 基因，并 于1 9 8 5 年发表了它的核酸序列。1 9 8 9 年该基因被命名为c r y i a a ，标志着b t 的研究 进入了分子时代m 1 。1 9 8 9 年h o f i e 和w h i t e l e y 提出了c r y 基因分类方法【州。1 9 9 5 年 c r i e k m o r e 等人在第2 8 届国际无脊椎动物病理学会年会( s i p ) 上提出了新的分类系统 只根据氨基酸序列的同源性而非6 内毒素的生物活性来确定其不同的分类等级。由 于这一分类方法形成了一个趋向完善的、开放式分类系统，因此目前已得到公认。 根据c r i c k m o r e 等建立的新分类规则，6 - 内毒素基因编码蛋白质氨基酸序列的同 源性低于4 5 定为第一分类等级，用阿拉伯数字表示；同源性在4 5 7 8 之间定 为第二分类等级，用大写英文字母表示；同源性在7 8 9 5 之间定为第二分类等 级，用小写英文字母表示；同源性在9 5 以上定为第四分类等级，用阿拉伯数字表示 4 5 1 ，如图l - 2 所示。同时还提出了对新基因命名的要求： 苏云金芽孢杆菌中编码具有杀虫活性的晶体蛋白基因，如大多数现有的杀虫基 因。 编码的蛋白质具有杀虫活性。 4 苏云金芽孢杆菌菌株的分离和c r y 基因的鉴定 表达的毒素蛋白必须存在于伴胞晶体中。 基因的核苷酸序列或蛋白质序列必须在一个土要的国际数据库( 如e m b l ， g e n b a n k 或p i r ) 中登记。 现行系统的命名方法： 像h w 系统一样，将具有溶细胞作用的毒素编为c y t ，其他毒素编为c r y ，相 应的基因编为叫f 和c r y 。 第一分类等级用阿拉伯数字书写而不再用罗马数字。彼此之间同源性不超过 4 5 的晶体蛋白命名为不同的第一分类等级，如：c r y l 和c r y 2 。 第二分类等级用大写英文字母表示，与h w 系统相同。这一等级之间的同源性 在4 5 7 8 ，如：c r y l a 和c r y l b 。 第三分类等级与h w 系统一样用小写英文字母表示，但不再用括号，这一等级 的同源性区分范围在7 8 9 5 之间，如：c r y l a a 和c r y l a b 。第三等级也不是非用 不可的。特别是对那些种类不多的类型，如c r y l c a 可以简单的称为c r y l c 。 第四分类等级是h w 系统中没有的，用阿拉伯数字书写。该等级亦是最终等 级，彼此间的同源性大于9 5 。该等级在一般情况下是不用的，其编号主要为了说明 其来源。如c r y l a c 3 和c r y l a e 5 完全相同【删。 苏云金芽孢杆菌的基因类群至2 0 0 6 年共列出5 3 群3 9 8 个基因，其中c r y 基因5 l 群，c y t 基因2 群。其中近l 3 来自各大公司的专利或未发表资料。第一群是最大的 类群，共1 2 类3 6 亚类。这是从h w 系统中c r y ，延伸和发展起来的，从c r y l a 发展 到c r y l l 。h w 系统中的c r y 仃现定为c r y 2 a ，之下分为a ，b 和c 亚类 ( h t t p ：l l w w w b i o l s s u s x a c u k h o m e n e i lc r i c k m o r e b t t o x i n s 2 h t m l ) 。 c r y 3 与原来的c r y 勿相对应，但把c r y l i i c 排除出去了( 其新名称为c r y t a ) ，共 3 类4 亚类。c r y 4 对应于原来的c r y 形但c r y l l c 命名为c r y l o a 。原来的c r y l v d 命名 为c r y l l a 。原来的叫r 基因分为两类，由于c y t a 和c y m 的同源性只有3 9 1 4 。丌。因 此他们分别归为c y t l 类和c y a 类。 1 5 2 苏云金芽孢杆菌c r y 基因的鉴定方法 p c r - r f l p 鉴定：这种鉴定方法是台湾学者k u o 和c h a k 创立了一种新的鉴定 b t 晶体蛋白基因的研究方法嗍。根据各基因的保守区域，在5 和3 各设计一个适于 一大类c ，) ，基因的通用引物，进行p c r 扩增，产物用两种限制性内切酶( r e ) 消化，不 同基因d n a 的酶切片断的长度不同。根据电泳分析所产生的这种差异来判断不同菌 株所含的不同基因的鉴定方法。 简并引物鉴定1 4 9 1 ：c o r i n a 等分析了c r y l a a ，c r y l d a ，c r y 8 c a ，c r y 9 a a ，c r y 7 a a ， c r y 4 a a ，c r y l l b ，c r y 3 a a ，c r y l l a a ，c r y 2 a a 的保守区肽段设计了五个简并引物。 将五个简并引物按延伸方向组合出五对简并引物。第一次扩增仅使用其中一对简并引 物用于p c r 。第二次p c r 反应将第一次反应得到的产物用作模板，引物为设计的五 个简并引物。最后克隆并测序第二次的扩增产物，以确定菌株的基因型。该方法的主 5 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 要优点在于所设计的五个简并引物不但可以检测出已被描述过的基因，还可以检测出 未知的c r y 基因。 多重p c r 鉴定f f o - s 司：是一种混合引物鉴定方法。引物分为通用引物和高度同源 的特异性引物。这种方法用于鉴定已知基因是准确、特异的，但对于新基因鉴定还需 借助其它研究方法，并且特异性引物系统设计耗时，耗资金。 随机扩增多态性d n a ( r a p d ) 鉴定i 5 5 】：随机扩增多态性d n a ( r a p d ) 分析 是以人工合成的各种核苷酸序列为引物，通过p c r 技术扩增d n a 片断后，根据所扩 增出的d n a 多态性分析进行遗传作图或特种鉴定。b t 作为原核生物，d n a 较真核 生物染色体简单，所以指纹图谱代表性不高；另外r a p d 鉴定要有标准菌株为对照， 仅以鉴定d n a 组上的差异。 杂交鉴定 s 6 , s t ：应用此方法首先要设计并合成大量d n a 探针，并且较p c r 鉴定 耗时费力，新基因确定的类型需要借助其它方法做进一步鉴定。 基因芯片是2 0 世纪9 0 年代发展起来的建立在杂交基础上的一项前沿生物技术1 5 乳 5 9 1 ，该鉴定方法是适应基因组时代的强有力的技术之- - 鲫。 对c r y 蛋白进行鉴定可最直接、最准确的获得b t 基因型、杀虫活力等相关信息， 并可确定被表达基因。但此法仅适于对已知基因所表达的蛋白的鉴赳“j 。对于c r y 蛋白测序而言，其真实性非其它方法所比拟，但由于存在许多问题，还不具备应用条 件，但最具科学性，最有发展前剽“6 3 o 1 6 苏云金芽孢杆菌的c r y 基因与伴孢晶体形态及杀虫活性的关系 伴孢晶体的形态因c r y 基因的不同而不同【，例如：c r y l 型基因编码菱形晶体； c r y 2 型基因编码立方形晶体：c r y 3 型基因编码方形晶体；c r y 4 型基因编码无定形晶体； c r y 8 型基因编码球形晶体；c r y l l ，c r y 3 0 ，c r y 4 0 型基因编码球形晶体。因此，在有些 情况下根据显微形态的观察，可以推测菌株所含基因类型。 不同c r y 基因编码的蛋白具有不同的杀虫活性。通常c r y l ，c r y 2 ，c r y 9 基因编码 蛋白对鳞翅目害虫有杀灭活性【6 5 】： c r y l b ，c r y h ，c r y 3 ，c r y 7 ，c r y 8 ，c r y l 8 基因编 码蛋白对鞘翅目害虫具有毒力 6 6 - 6 8 1 ；c y t l ，c y t 2 ，c r y 2 ，c r y 4 ，c r l o ，c r y l l ，c r y l 6 ， c r y l 7 ，c r y l 9 ，c r y 2 4 ，c r y 2 5 ，c r y 2 7 ，c r y 2 9 ，c r y 3 0 ，c r y 3 2 ，c r y 3 9 ，c r y 4 0 基因对双翅 目有活性1 6 9 - 7 2 】；c r y 5 ，c r y 6 ，c r y l 2 ，c r y l 3 ，c r y l 4 ，c r y 2 1 基因编码蛋白可杀灭线虫 【7 3 7 4 】 杀虫晶体蛋白对人和家畜无害，又不污染环境，在农业、林业害虫的防治上得到 了广泛的应用。随着生物技术的发展，新的c r y 基因不断被分离克隆，人们可以用基 因工程的方法将分离的c r y 基因进行遗传改良，构建不同的工程微生物或培育抗虫的 植物品种等，显示了苏云金芽孢杆菌c r y 基因广泛的应用前景。 6 苏云金芽孢杆菌菌株的分离和c r y 基因的鉴定 t h r e e d o m a i nc r yp r o t e i n s 1 。 2 。3 。 广 二 篓 i l 二 i ，c 广r 一 三爱 一e 嚣 r 广 l - - - 一 鹜 蔓一 窦 錾 鏊 f i | | 雾 巾 j 。d 翰 强 1 c | | | | il _ r | | | | | i _ j 1 。c 掰 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 1 7 本研究的目的及意义 目前苏云金芽孢杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ) 己成为应用最成功，前景最好的生物 杀虫剂，受到世界各国的广泛关注。b t 的分离鉴定作为基础性研究，在发现新型c r y 蛋白基因与应用方面具有重要的作用。 现在所使用的b t 杀虫晶体蛋白类型单一，杀虫普较窄。而且多年反复应用b t ， 个别害虫对它产生了一定程度的抗药性 7 5 - 7 8 l 。筛选并快速鉴定出新的b t 菌株，对于 扩大苏云金芽孢杆菌的杀虫谱，预防害虫产生抗性具有十分重要的意义【7 9 1 。 由于土壤蕴含着丰富的微生物资源，地域多样性赋予了土壤微生态种类多样性的 特点，土壤成为筛选不同种类b t 原始菌株的最普遍、最直接的来源，从士壤中分离 b t 也就成为获得新型b t 菌株的主要有效手段与途型8 2 l 。本研究采用醋酸钠抗生素【s l 】 方法显著提高b t 分离的出菌率，而且镜检时平板中所生长的杂菌数少，因此提高了 筛选效率。 本文采用p c r r f l p 鉴定方法，鉴定c r y 基因 8 2 - 8 9 1 。结合s d s p a g e 对菌株伴 孢晶体蛋白进行分析，从而快速预测出不同菌株的杀虫活性。该鉴定方法对苏云金芽 抱杆菌的资源分布，高效筛选优良和含有新型基因的菌株，以及基因克隆、构建工程 菌并对获得抗虫转基因植物 9 0 - 9 3 1 具有十分重要的理论和实践意义。 8 苏云金芽孢杆菌菌株的分离和c r y 基因的鉴定 2 1 材料及仪器 2 1 1 材料 土样：见表1 。 2 材料和方法 表i 土样来源及特性 o r i g i n o f s o l ls a m p l e sa n d t h e i r c h a r a c t e r i s t i c s 9 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 蔓主坌茎丝堑堕堕堡竺坌曼翌：z 至旦竺鳖塞 培养基： l l 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 1 ) 液体l b 培养基( 2 0 0 m l ) ：蛋白胨2 9 ，酵母粉l g ，n a c l 2 9 ，调p h 7 2 7 4 ，1 2 l ，高压灭菌3 0 r a i n ，4 c 保存。l b 固体培养基：在液体培养基中加 入1 5 琼脂。 2 ) l b 醋酸钠液体培养基( 5 0 r a l ) ：蛋白胨o 5 9 ，酵母粉0 2 5 9 ，n a c l0 5 9 醋酸 钠1 8 9 ，调p h 值7 2 7 4 ，1 2 1 ，高压灭菌3 0 m i n 。 3 11 2 l b 固体培养基：l b 固体培养基中加入等体积蒸馏水，1 2 1 ，高压灭菌 3 0 r a i n 。 抗生素：氨苄青霉素( a m p i c i l l i n ，a m p ) 。 引物：表2 - 3 列出了所用引物。 衰3p c r - r f l p 鉴定引物及序列。 t a b l e2 - 3p t n “s e q u e n c e s 缸c w t - 2 f c t y 7 - 2 s o y 7 - 1 2 f c r y 7 - 1 3 s c w 7 - 3 w c w 7 - 3 s 为c a m b a a k 中登录的& ，7 路凶m 6 4 4 7 8 的特异引物使j l jp i 啪衙p r i m i e t 5 软件设计) p c r 扩增扁预期产物大小分掰为t 5 6 9 b p ，2 1 3 2 b p 1 3 0 6 1 节 2 1 2 试剂 1 2 苏云金芽孢杆菌菌株的分离和c r y 基因的鉴定 1 ) p c r 扩增试剂：1 0 p c r 缓冲液、d n t p 、t a q 酶等购自宝生物公司和生工 生物工程公司。 2 ) 限制性内切酶：购自宝生物公司和生工生物工程公司。 3 ) d n a 和蛋白的标准分子量试剂分别购自海泰克生物公司和纽英伦生物技( 北 京) 公司。 4 ) b t 质粒d n a 提取液 溶液i ：5 0 m m o l l 葡萄2 5 m m o f l t f i s - h e i ( p h 8 o ) ，1 0 m m o f l e d t a ( p h 8 o ) 。 溶液i i ：o 2 m o f l n a o h ，i s d s ( 现用现配) 。 溶液i i h 3m o l l k a c ，用冰醋酸调至p h 4 8 。 5 ) r n