（生物化学与分子生物学专业论文）小麦光周期相关cdna片段的克隆及鉴定.pdf

出窳采豫大学联士学健论主 摘要 人类羧虢生存鹣食鑫，纛按躐潮缓爨寒源予穗穆。篷甥遗蹲戴不邋时 开花，会严薰遮影赡产羹。开藏怒礴等糠物个体发育鼹孛心环节，游麟辩 光周期蔗调节成花房动的2 个主藤环境因予万近年来通过对模式糖物拟南 芬突变体的遗传研究、熬域分离及耽熊分析，使人们对光周期诱导歼j 芘的 分子梳隶肖了薪静试诶。键辩小嶷开旄静分子生物学研究不是太多，磷究 成果也不丰富。小麦楚爨鬟的粮食体物，研究其开花的机理将对生产霄熏 要的意义。 本实验懿冬毪枣麦 t r i t i c u ma e s t i v u m ) “撬衡6 8 0 ”必毒孝辩，稳敬 憨r n a 缝鼹螽，运瑟m r n a 藏：鼯鼹搴技术，篦鞍了长露爨下( t 6l i g h t ) 瓷溺絮懿零彗重翔与繁1 2 冬辩鹣盱冀孛鏊鬻转录窳警魏差彝，势霹蓑辩袭 这数c d n a 冀莰逡嚣了变爨分辑，邂一疹蘧过n o r t h e r nb l o t 蓉垂臻辩了 表遮差异熬p z 3 5 , q - 毅弱袭遮特赢，势疆避5 r a c e 鼓零霹该嚣段进行了 垒基因的兔隆，稳只穗剿一羧报缀的弹梦l j 。f 主要络果如下： 1 对2 6 条随机引物筛选麓，风肖1 6 条能扩增出带，与3 种锚定引物 t , i n ( k = 蠢，c ，g ) 擒戏了嬲糖缀禽遴抒d d r t p c r 扩矮，其孛以零；g 必镶定 g l 物的扩增效果最好。 2 蓑舞显示银染詹，褥剿i 0 0 条败农光周期的零时间表达鹩带，网收 麓嚣次p c r 泰k 增，再犷增睾为辖o 瓤，产物为攀条带的共计5 5 祭，避过反 鑫n o r t h e r n 赢杂交验谣，褥戮2 令鬻憋鬻。 3 。辩2 令辍瞧豢楚羟溺廖，努裁露名戈p z 3 5 、p z 5 6 。在g e n b a n k 巾 遗过嚣滋犍毙较，发现p z 3 5 靖段毒大麦c o l 基嚣嬲、燃缀鹞嚣瓣 37 臻霜滚往努弱舞骢、? 3 ，与承箍c o l 鏊鞭o s b , o s a ( h d l ) 缡鹃 送懿3 璇同潺经分巍淹8 缁、7 3 ，p z 5 6 片段与叛煮芬瓣帮势粥f 溪霞 同源性高于5 0 。我们搬p z 3 5 片段命名为t a c o l 。 4 ，n o r t h e r n 分橱裳蹦t a c o l 的转秉表达水平舆有昼夜带律锉，熬转 荥表达离蜂在光照蓐静零释孝瀚一篇4 小时之闻，诞晴该萋因愚耱光髑冀l 调控基嚣，可能与小麦的开糙时间谢哭；t a c o l 猩根、黑暗处璎3 天的幼 ，l 、麦兜霜翔耦荚e d n a 砖段的克疆搜鉴定 蕊中均无表达，谖明其在连续黑嚷条l 牛下不表达：不同时闻的低滠处理 l ) 后t a c o l 也不表达，说明它不受春化作用的诱导；分别用s a ，g a ，a 8 、 处理长隧下生长的幼营，始( 磁盼转录水平与无处理的对照相比几乎没在 变化，证明它的表达不受s a ，g a ，a b a 的诱导。以上结祭表明t a c o l 基因 对光周期开花途径是特舅的，与餐化开花途径、赤霉素开花途径不相关 s o u t h e r n 分析笈现，t a c o i , 在小麦基因缎中的拷贝数多于3 个，推测该瓣 因属于多基因家族。 关键词：小麦j 差异显素基因转录? 殷向。“。“ j ? 山东农业大学硕士学位论文 i d e n t i f i c a t i o na n dc l o n i n go ft h ep h o t o p e r i o d i c r e l a t e , g e n e so ft h ew h e a t a b s t r a c t f l o w e r i n gi s t h e i m p o r t a n ts i g n a l w h i c hi n d i c a t et h es w i t c hf r o i i v e g e t a t i v et or e p r o d u c t i v ed e v e l o p m e n ti nt h eh i g hp l a n t s f l o w e r i n gt i m e i sc o n t r o l l e d b y e n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n sa n d e n d o g e n o u ss i g n a l s p h o t o p e r i o di so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tf a c t o r st h a tc o n t r o lf l o w e r i n gt i m e a tp r e s e n tw eh a v et h ed e e p e ra c k n o w l e d g ef o rt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo f f l o w e r i n gb ys t u d y i n gt h el o n g - d a yp l a n ta r a b i d o p s i s w h i c hi sam o d e lp l a n t f o rt h es t u d yo fp h o t o p e r i o d i cc o n t r o lo ff l o r a li n i t i a t i o n ，h o w e v e r ，l i t t le i sk n o w na b o u tt h a to fw h e a t t h eo b j e c to ft h i ss t u d yi sl o o k i n gf o rt h e p h o t o p e r i o d i c r e l a t e dg e n e sf r o m t h ew i n t e rw h e a t( t r i t i c u w a e s t i v u m ) ”6 8 0 ”b yu s i n go ft h et e c h n i q u eo fd i f f e r e n t i a ld i s p l a yr t p c r ( d d r t p c r ) 。t h ed i f f e r e n t i a le x p r e s s i o np a t t e r n sb e t w e e nt h ew i n t e rw h e a t o ft h ed i f f e r e n t i a lt i m eo fp h o t o p e r i o dw e r ea n a l y z e d 1 0 0d i f f e r e n t i a l ly d i s p l a y e dc d n af r a g m e n t sw e r ei s o l a t e d a m o n gt h e mt h e r ew e r e9 0f r a g m e n t s c a nb er e a m p l i f i e db yp c ra n d5 5f r a g m e n t sw e r es i n g l eb a n d b yr e v e r s e n o r t h e r nd o tb l o t ，w eo n l yi d e n t i f i e dt w o 曲o t o p e r i o d i c i n d u c e df r a g m e n t s a n dn a m e dp z 3 5a n dp z 5 6 ， r e s p e c t i v e l y t h et w of r a g m e n t sw e r ec l o n e da n d s e q u e n c e d t h er e s u l t so f8 l a s ti n6 e n b a n ks h o w e dt h a tt h ep z 3 5f r a g m e n tw a s h i g h l ys i m i l a rt 6 s o m e f l o w e r i n g t i m e g e n e s c o l o fr i c e ，b a r e l y ，a n d h r a b i d o p s i s w en a m e dt h ep z 3 5f r a g m e n ta s 强貔礁n o r t h e r na n a l y s i si n d i c a t e s t h a tt a c o l t r a n s c r i p tl e v e ls h o w e dac i r c a d i a np a t t e r ne x p r e s s i o n ，a n dt h e m a x i m u ml e v e l0a n d4ha f t e r1i g h t e x p o s u r et ol o wt e m p e r a t u r ef o rl o d 2 0 d ，3 醐，a n d4 0 d ，t h e 棵黼e x p r e s s i o nw a sn o td e t e c t e d 。张i ss u g g e s t st h a t 翰口配w a sn o ti n d u c e db yv e r a l i z a t i o n w ea d dg a ，s a ，a b at ot h ep l a n t i n s p e c t i v e l y 。a f t e r2ha n d2 4h 。w ee x a m i n e dt h e 粼e x p r e s s i o n ，b u tn o t f o u n dt h em r n al e v e li n c r e a s e do rr e d u c e d s ow ec a nc o n e ：l u d et h a t t a c 6 l e x p r e s s i o nw a sa l s on o ti n d u c e db yg a ，s a ，a b a s o u t h e r na n a l y s i ss u g g e s t s t h a t 抬c 僦b e l o n g st oag e n ef a m i l y k e yw o r d s ：w i n t e rw h e a t ，d d r t - p c r ，p h o t o p e r i o d ，f l o w e r i n gt i m e 3 一 小蠹毙鼹鞭揭美c d n a 片段蛇克瘫技箍定 缩写 a b a a m 殛 b s a c a m v 3 5 s c d n a c 1 a b d d h 2 0 d 疆 d e p c d n t p 聂c o t i e b e d 曩a g a 3 i p t g l b m m l 骶 m 0 p s m r n a m s n a a c p b 英文缩略表 英文名称 a b s c i s i ca c i d a m p i c i l l i n b a s e p a i r b o v i n es e r t l ma l b u m i n 3 5 s p r o m o t e ro f c a l i f l o w e rm o s o i c v i r u s c o m p l e m e n t a r yd n a c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u m b r o m i d e d i s t i l l e da n dd e i o n i z e dw a t e r d i f f e r e n t i a l d i s p l a y l 澄v e r s e t r a n s c r i p t i o n d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e s c h e r i c h i ac o l i e t h i d i u mb r o m i d e e i s o d i u m “ - e t h y l e n e d d i a m i n e t e t r a c e t a t e g i b b e r e l l i ca c i d i s o p m p y l t h i o - b - d - g a l a c t o s i d e l u r i a - b e r t a r t im e d i u m m o l o n e y m u r i n e l e u k e m i a v i r u s r e v e r s et r a n s c r i p t i o n a s e 3 - ( n - m o r p h o l i n o ) p r o p a n e s u l f o n i c m e s s a g e r n a m u r a s h i g e a n d s k l l gm e d i u m s o d i u ma c e t a t e p h o s p h a t e b u f f e r 中文名称 黢落酸 氯苄青霉素 械基对 牛血清鬣白 花椰菜花叶病毒3 5 s 启 动子 亘补d n a 十六烷蘩三乙蓦溴纯铵 疆蒸水 麓异萎涿反转豢 焦碳酸二乙蘸 脱氧核糖核苷三磷酸 丈肠抒蘩 溴化乙锭 己二胺四己酸 赤霉素 舜丙綦一舀- d 一硫代半乳 糖苷 潍培养黎 舆洛尼鼠病毒逆转录酶 3 一( n 一吗啉代) 丙磺酸 痿蠖r n a m s 培养旗 醋酸钠 磷酸盐缓冲液 山东农业大学硕士学位论文 p c r r n a s e a r p m s a s d s s s c s s d n a t e m e d s x - g a l p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n r i b o n u l e a s ea r e v o l u t i o n s p e r m i n u t e s a l i c y l i c a c i d s o d i u m d o d e c y ls u l f a t e s r a n d a r ds a l i n ec i t r a t e s a l m o ns p e h nd n a n n n ，n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e t r i s h y d r y x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e 5 - b r o m o 一4 - c h l o r o 一3 - i n d o l y l - b - d - g a l a c t o s i d e 一5 一 聚合酶链式反应 核糖核酸酶a 辕 食 水杨酸 十二烷基硫酸钠 标准柠檬酸盐溶液 鲑鱼精d n a n ，n ，n ，n 一四甲基乙 二胺 三羟甲基氨基甲烷 5 一溴一4 一氯一3 一吲哚一b d 一半乳糖甘 枣麦竞塌羯聿 l 芙c d n a 跨段篷克隆及鉴定 l 弓l 言 开花建高等植物由营养生长向生殖生长转交的一个璧要的生理过程， 严格受内源发弯傣号和环境因子的控制。这种调控的复杂性是出一种复杂 的信号途径“网络”所形成的。 i 驻年来徽据几种模式植物如拟南芥、金鱼 萆、玉米等调控开花的信号途径购研究，提出了控制开花对闽的几种信号 途径。这些途径最终作用于一些开花控制的主效基因如：l e a f y ( l f y ) ， a 腰掰删，( 盯) ，嬲峪蹦肪( c o ) 等，从而导致茎端分生组织( s h o o ta p i c a l m e r i s t e m ，s a m ) 向花原籍转纯。 近几年来，开花时间这种复杂的调控机制受到人们的普遍关注，并n 取得了缀大的避腥，通过对j 堇l 南莽这种禳式植物豹研究，入稍提辩了西释 调控开花时间的信号途径( a i d y nm o u r a d o v ，e ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 1 1 拟南芥中调控开花时间的信号途径 l 。l 。l 毙周裳促进途径 植物对昼夜相对长度的反应称为光周期现象( p h o t o p e r i o d i s m ) 。2 0 鼗纪初美国科学家g a r n e r 帮a l l a r 用一耱烟草突变俸( m a r y l a n d m a r m a o t h m u t a n t ) 所做的试验发现，在夏天长日照条件下这种烟草只进行营养生长， w 长至3 5 m 不衍花，餐在冬天短舀照条律下，。苓餮l 璇露可开藏，这 试验首次证实了光周期对开花的影响。 一毅说来植耪先逶遗建受髂黪受必穗号，然瓣俸矮予苓律镑煞餍鬟苓 律，调控植物表达某些促进开花的基因和降解某魑抑制开花的因子，接着 筏努生缀织弱一谯基困表达秀蔫，导致嚣兹。羧麓芬矮妖嚣攘携，长鑫- f 犟开花，短日下最终也会开花。分子遗传方法已经揭示：应答光周期的基 瓣，一部分编码落节蛋鑫来特异魄调控嚣筏，男一部分缡海光绩譬转导埝 径中的某些成分，参与生物钟的调节功熊。 1 1 。1 。1 长瑟爨黢答健遴羧素莽嚣慈夔途经 在拟南芥的开花时间突变体中，有类突变体长日下晚开花，短日下 与鹭生鍪稷叛袋宠垒穗鬻，这炎突变俸砖春识黪震款敏感牲缀耱或不敏 感。由此得出一条遗传途径：即l d 一促进途径，此途径只对l d s 虑答的檄 山东农业大学硕士学位论文 株的开花肖促进作用。临翻n s ( c o ) ，c r y p t o c h r o m e 2 f h a ( c r y 2 ) ， 6 i g a 张e a ( ，蹋f w a 聪予长强照痞动开菝途缀粒一部分( k o o r r m e e f e t a 1 ，1 9 9 1 ) 。最近研究发现，在这些罄因中，只有对这条途径是特异的； 露另一些基因可京其它途径中怒终弱。f 7 ，f w a 终用于翻躲下游 ( k a r d a i l s k y e ta 1 ，1 9 9 9 ；k o b a y a s h ie ta 1 ，1 9 9 9 ；o n o u c h ie ta 1 ，2 0 0 0 ) ，c r y 2 甜作用予脚的上游( g u o c t a l ，1 9 9 8 ；s u a r e z - l o p e ze t a l ，2 0 0 1 ) 。 属于一个转录因子家族，该家族有1 7 个成员，它们具有保守的2 个区域：n 一端的镑指结构，与动物的b - b o x 非常棚似，b - b o x 的作用是调 节蛋白之间的互作( b o r d e n ，1 9 9 8 ) ；c - 端的c c t 区域( c o , c o l ( c o - 1 i k e ) ， t o c l ( t i m i n go fc a b1 ) ) 。g f p 融合蛋白分析表明c c t 参与c o 蛋白的核 定位( s t r a y e r e ta 1 , 2 0 0 0 ；r o b s o ne ta 1 2 0 0 t ) ，僵也可能在灏白互佟中起佟 用。 3 5 s 扁动子的维成型衮达表嚼，c o 诱静翠开花并失去对先周簸的敏惑 性( o n o u c h ie ta 1 ，2 0 0 0 ) 。的转录水平具有昼夜节律性，长日下其表达高 峰在第1 2 和2 4 ，l 、对之阕；短酲下高表达辩阕院长鞫下缭缎了4 令小爵； 逡续光照下，的转录水平也具有昼夜节律性。c o 突变体中这种转录高 峰潸失，黼显，依赣生耪锋靛t h y , 矗，e l f 3 突变俸孛，英国转录农乎 的节律性有所改变。总之。调带生物钟和开花时间基因卢丁之间的关系 ( s u a r c z - l o p e ze ta 1 ，2 0 0 1 ) 。这裘臻在l d - 途径书生携镑瓣俸霜楚溪苓下 游基因( 如c o , f t ) 的袭达。 久髑疆出嚣耱模式寒簿释毙羯絮是麴露调繁舞蓖懿( t h o m a sa n d v i n c e p r u e 1 9 9 7 ；s a m a c ha n dg o v e r , 2 0 0 1 ) 。外部模式指出：一天中的特定 瓣翔里，毙童筝走一耪终罄麓号与一耱光敏薅节莓热萎终蠲。长目攮携如果 在这种节律的关键时期处于光下，就会启幼开花；内部模式指出：感应光 掰矮除段，冒产垒嚣秘节律，宅织援互搀瘸矮痿动开芘。 长日下参与转录艏激活的光受体肖c r y 2 和p h y a 。p h y a 突变体在 长强下拜筏稍晚，短曩下过量表达p f i y a 可使拟麓芬早弹花( b a g n a l le t a 1 ，1 9 9 5 ) ，说明光敏色素a 具有促进开花的作用。c r y 2 的开花情况与p a y 4 鞠固，证明c r y 2 参与光周翅感寂( o u oe ta l 。，1 9 9 9 ) 。长翻下c r y 2 突变体 一7 一 小麦兜塌期毒 l 关e d n a _ 段载竞降及箍定 中的表达降低，丽在j 遘基表达c r y 2 的转基因拟南芥中c o 的表达增加， 这说明c r y 2 通过调节开花。 1 1 。l 。2 节律钟和中心振荡器 昼夜节律的周期为2 4 小时，在条件不改变的情况下一直保持这种节 德蛙。毽物在不圈懿拳平都具有搽夜苇律蛙翔：咛片懿逶翡，气魏夔牙张， c o 。的同化作用，基因的转录等。产生这种节律j 陡的机制可分三部分来解 释：竣入途径是与毙暗爨掌矮礤戆薅势撬裁围步鼹；毒一孛心振荡器产生 2 4 小时的时间保持机制；输出途径调节特异的过程( r o e n n e b e r ga n d m e r r o w ，2 0 0 0 ；m c c l u n g ，2 0 0 1 ) 。c o 魏f 7 对瑟花戆调控代表了竣如途径。 代表输出途裰的僦掰托府詹西坳而佑瑚口7 研m ( 饼蚴( 叶绿豢 终会蛋白) 基因，对时钟调控进簿了详绑的分横。c a b 时间突变体( t h e t i m i n go fc a b ( t 0 0 ) 中c a b 转录的周期性缩短了2 - 3 个小时，而其它熬 暇表达驰繁德性盎爨：时运动，气孔嚣张也摆应缭短了2 - 3 个小时。该突变 体短日下早开花，这种表烈在每天为2 1 小时循环时可得剿恢复( s t r a y e r e ta l 。，2 0 0 0 ) ，这袭瞬t o c l 突变体的早群花是由摄夜节律的缩短号f 起的， t o c l 转录水平在夜晚有一高蜂，连续光照下具有昼夜节律性( s t r a y e r e ta l 。，2 0 0 0 ) 。逑续光照下f ，突变体巾t o c l 表达的带律性周期缩短， 这表明t o c l 通过反馈l o o p 来调控自身表达的节律性。t o c l 转泵水平的 节律性、突变体中节律性周期的缩短以及反馈l o o p 中t o c l 的参岛说明它 麓振荡器豹个缀分。 振荡器的其它成分肖g 掰删毋f vc l o c ka s s o c i a t e d l ( c o a l ) ，鲋衡 e l o n g a t e d h y p o c o t y l 妇哺桫基因，二者参与开花静光周期诱导，藏受节稚 钟调节( s c h a f f e re ta 1 ，1 9 9 8 ：w a n ga n dt o b i n ，1 9 9 8 ) 。l h y 或c c a l 的 越表达抗就了所裔静节律往，翔：升片豹运动，备伞对麓豹基因袭达( 艟 或c c m ) 。最近脊人报道：l i l y 的超表达不会扰乱受节律钟调撩的基因 搠勉yf l o g e i n 67 ( 既确表运靛节律往，对于l i f t 鹩影响来说，e l f 3 甏 能是个例外( h i c k se ta 1 ，2 0 0 1 ) 。l i l y 戚c c a l 两个基因的失洒可破坎 表达数簧夜节律靛。它稻遂遘一个反馈i o o p 谣带鑫身熬转录。溺二者鬟 成型表达时会抑制所有的节律性，这说明它们魑振荡器的组分。l h y 或 山东农业大学硕士学位论文 c c a i 对时钟调节的影响和对开花时间的影响有很近的关系，长日下二者 之一超表达可引起晚开花，而l h y 或c c a l 的功能缺失等位基因，与t o c l 突变体一样，在连续光照下使昼夜节律周期缩短，并且在短日下早开花 ( m i z o g u c h i e ta 1 2 0 0 2 ) 。 最近有人证明t o c l 和l h y c c a l 参与一个自主调节l o o p ( a l a b a d ie t a 1 ，2 0 0 1 ) 。在体外，l h y 和c c a i 结合到脱，启动子上，二者超表达时可 降低t o c l 的表达，在t o c l 突变体中l h y 和c c a 表达的节律性周期缩短， 且表达水平降低。因此，t o c i ，l h y ，c c a i 可能在负反馈l o o p 中起作用， 且l h y , c c a l 的表达升高抑制脱，的表达。以上证据表明，l i p 和c c a i 反馈抑制自身的表达，当表达水平降低时，t o c l 表达升高。反过来，t o c 【 促进l h y 和c c a ，的表达。这一反馈l o o p 可能通过决定长日途径中开花 时间基因( c o , 口，) 的特定时间来调控开花时间。 1 1 2 春化促进途径 低温对开花的促进作用称为春化作用( v e r n a l i z a t i o n ) 。冬性和两年生 植物开花必须经过一段时间的低温诱导。如果这些植物不经春化处理，其 开花过程可以推迟几周至几个月，甚至不开花。植物春化作用具有以下几 个明显的特点：( 1 ) 植物对春化的感应部位和效应部位都在茎尖，而且发 生感应的时间与发生效应的时间间隔很大：( 2 ) 春化过程是一个缓慢的量 变过程( 一般需要4 ，2 8 周) ，但需要细胞具有旺盛的代谢活性，代 谢抑制剂试验证明，春化过程的代谢方式具有严格的顺序性和多步骤性； ( 3 ) 春化效应可以被高温所解除，即脱春化作用( d e v e m a l i z a t i o n ) ，冬小 麦一般3 3 2 ：( 4 ) 春化作用产生的效应随着有丝分裂一直保辔f 在茎端 生长点，当其它因素如生长状态、光周期适合时促进开花。低温产生的这 种效应会因减数分裂或其它有性生殖过程而消失，而不能遗传给子代。 拟南芥经春化处理( 4 8 周) 后很早就开花，如不经低温处理开花 很晚。拟南芥中有2 个基因：p l o w r r i n g l o c u s c ( 尼d 和f r i g i d a ( f r i ) ， 它们在春化过程中起主要作用。兄f 编码m a d s b o x 转录因子( m i c h a e l s a n d a m a s i n o , 1 9 9 6 b ；s h e l d o n e ta l 。1 9 9 9 ) ，它是一种开花抑制因子( m i c h a e l sa n d a m a s i n o ，1 9 9 6 b ；s h e l d o n e ta 1 ，1 9 9 9 ) ，春化后，f l cm r n a 丰度降低。f r i 可 枣麦逢鲻期辐美c d n a 冀段戆竟嶷菠鉴定 使冠f m r n a 丰度增艇( m i c h a e l s a n d a m a s i n o ，t 9 9 6 b ；s h e l d o n e t a t 1 9 9 9 ) ， 从而使歼j ! 藏推迟。f r i 蛋囱的生纯功能目前还不清楚，它鼹有卷曲螺旋区。 该区霹能参与蛋岛之闻艴曩终( j o h a n s o n e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。拟寓芥熬许多早歼 花晶种中缺少一个卷曲螺旋区，从而使f r i 的o r f 被破环，由此珂知早开 花照秘来源予f r i 基因失瀵的晚开花晶耪( j o h a n s o ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 生理教遗传方面的话据证鞠释纯俸弼不只魁简单的降低开穗抑制翻 子( 如f l c ) 的表达，露是焱很大程度上促避开花。鸯伦比双生态燮的t t c 突变体春化看在缀强下翠汗花，说裙春纯衙代替长强健进开花。稀独立予 f l c 步b 的誊化促进开花的分子机理目前述不渍楚。 磊薪述不清楚低温弱溺豸底悬待么分予参与了降低p l e n 蠡n a 静承平， l i o s l 有可能是这种调节分子。低温胁追_ 陂答时删，基因的突变能提高冷 诱导基霞r d 2 9 煞袭这。h o s l 突变体连霞皴南莽荦扦花，辩簿诋f l c 熬表 达；由此推测h o s l 编码低温信母中的负调控因子。该基因的缺臾能提撒 冷诱导藩号途径翡潘睦，敲甭增强泠诱导蘩嚣翡袭达 魏r d 2 9 ) ，辫低菇f 的表达( l e ee ta 1 。2 0 0 1 ) 。 吲圳 # 糊 a u t o n o m o u s p a t h w a y v i g - t 霹l e e a 融t o f 珊越i 瑚墙臻韶矗娃| c 矗嫒。羲。黼嚣曲懈张f l 嗽雌随嘻西壤e 1 。1 ；3 囊主键进途径 在拟南芥中，存在这样一些突变体( 1 e a ，蜘，l d , m 和秒) ，他 翻对誊纯特爨赣惑，毽程l d s 彝s d s 下臻魄鹭生囊拜藐浚。可冕这些基嚣 产物促进开花的作用是独立于春化与光周期作用之外的，他们的信号传譬 二曲 誉盟 删 一 一 一 山东农业太学硕士学使论文 途径称为自主促进途径。这些突变体的相似之处怒f l cm r n a 水平比野生 型撞拣或长曩和g a 途径联号 起豹姨芯型突变体中豹f l c 水平离的多。自 主途径突焱使植株晚开花是因为f l c 的表达增强。因此在野生型植株中这 耪途径对f l c 豹表达呈负调控( 如图1 ) 。 虽然所有的自主途径突变都鼹通过增加f l c 的表达起作用，但遗传证 据表明这不是个简单的_ 巍线途缎( 图1 ) 。如f c a ，f p a 双突变体比我们 所想象的举突变累加效果还强，开花要豌的多；z 酗，耖毅突变穗物表现 为致死，说明这些基因在植物发育中的作用要比在调控开花时间方面广 泛。 自主途径中的些基因已经被党隆出米。f c a 骚白含肖两个r n a 结台 区( r n a - b i n d i n gd o m a i n ) ，r n p 蘩元( r n a 识臻基元或r n a 结合区一致序 列) ，以及一个蛋囱互作区( w wp r o t e i n p r o t e i ni n t e r a c t i o nd o m a i n ) 。 体乡 试验寝稠f c a 结合r n a 。f p i 巍编码r n a 结合鬃鑫，该骚鑫氇爨骞r n p 基元，说明在自燕途径中转录后调控可隧起综合性作用( s c h o m b u r ge t a 1 ，2 0 0 1 ) 。l d 虽鑫毽捂一个藏滚鬟及核定链区域，这耱续擒与动秘维庭中 转录起始因子的结构非常相似。以上三种蒸因的表达方式相同，在顶端分 鬟曼缝织窝筏孛表达藿最毒，在残熬豹砖冀黉鬏孛袭达耋最低。瘫糕下f p 4 的过量表达使植株很早就开花，丽f c a 的超表达对开花时间的影响很小。 蠡主途径牵懿蛋囱辩f l c 豹表达瀵控方式毽蔻还誉滇楚。 1 1 4g a 途径 g a 促进拟南芥开花( w i l s o n e ta 1 ，1 9 9 2 ；p u l e f i l l ，e ta l ，1 9 9 5 ；b l a z q u e ze t a l 。，1 9 9 8 ) ，这首先是通过施加外源赤霉素得到证明的。通过对突变体的研 究发现突变后可能阻止了g a 的生物合成，也可能建信号健导受戳。 拟南芥g a 合成突交体( g a l - 3 ) 长豳下表现为晚花，短日- f 不开花 ( w i l s o ne ta l 。，1 9 9 2 ) ，瑟麓禳橡罗重矮绽。g a 4 , g a 5 突交对檀株斡影酸l ： 如g a l 那么严重，植株呈半矮化，而且能开花，并形成正常角果( k o o r n n e e f a n dv a l ld e r v e e n , 1 9 8 0 ) ；船g a 5 突变钵没有g a3 一羟化酶葶珏g a2 e 氧 化酶活性( t a l o ne ta 1 ，1 9 9 0 ) 。g a2 0 - 氧化酶可能参与g a 生物合成中关键 燃的一步。转基激植株孛g a2 融氧让酶始嵩表达使g a 4 增加，长臼和短 零麦邂援期相关c d n a 片段懿克隆及鉴定 隧下开花均比野生型早。这说明g a 的表达水平调控开芯时间，遮与施加 外源g a 余使野生塑旱开藐是一致的。 g a 在调控开花方面的作用也可通过研究参与g a 信号传导的基因得以 说明。g a 信皤传导中有三个关键基鬻：6 f b b e r e l l i ca c i d l n s e h s i t i r e ( g a 乱。r e p r e s s o ro fg a l - 3 0 r g 籼r g a - l l k ei 0 r g a l i ) 、j 兰j 个基因编码酌蛋自丽滁往穰裔，斌予植物符髯调节爨蠢g r a s ( f o r g a i ，r g a ，s c a r e c r o w ) 家族。 天磊j 猿溺魏莱盛r g a , r g l l 基因失灞，在g a 缺乏辩帮麓会发生g 矗旋 答。这一猜测通过g a l 突变体得到证实，该突变体中活性g a 含魑很低， 越r g a , g a i 失滔，r g a ，彩j 凌能缺失等鬣鏊毽哥完全恢簧g a l - 3 突变造成 的植株矮化，完全抑制g a l 突变体的不开花表型，所以这种三突变体短目 下只兜野生鍪! 并藏藕孚( 转i l la n ds u n ，2 0 0 1 ；k i n ge ta 1 ，2 0 0 1 ) 。r g a ，g a y , 蔽 突变体比野生型汗花稍毕，说明g a 生物合成突变体腕花表型是由于 掰五r g 4 镬嚣花溪挂受餮| 榛利造娥懿。g a l 突变髂蕊表鍪帮毙是耄聪j 教 其它的相关基因( 如r g l 2 , r g l 3 ) 负面调档的( w e na n dc h a n g ，2 0 0 2 ) 。s p y 缀妈另一个泓疲答鹣受调控嚣予，该嚣予影晌嚣兹时阁。s p y 突交毙部 分抑制g a 水平降低对植物的影响。s p y 突变体犁开花，可能是g a 信号途 经活链撵燕豹原毅。 很多研究描述了g a 途径与其它开花时间途径之间的遗传互作。如遗 传分辑表骥g a 途径露能鸟长日途经起耀强接耀。损伤长强途径的c o 突交 与g a l 突变形成的双突变体在长日下往往不开花( p u t t e r i l l e t a l 。t 9 9 5 ；r e e v e s a n d c o u p l a n d , 2 0 0 1 ) 。这表明短匿- f ( 长联途径无渣性) g a 开花途径是主要的，这一途径功能缺失厝阻止歼花。长日下，凭活性的 g a 途径对舞花的影睫不大，因必这时长圈途径起童要作用。f l c 能抑隹顶 端g a 的活性，因此能抑制开花，春化作用通过降低f l c 的水平能消除遮 种挪剑。然露g a l - 3 f r i f l c 植株，不经褰化在长e t 下永不开花，冷诱导 磁与g a l - 3 单突变体开花一样早，说明植物在长翻下对春化作用的响应刁； 震要g a 。 山东农业大学硕士学位论文 e n v i r o n m e n t a ls i g n a l s e n d o g e n o u ss i g n a l s i s n f l f p f l g a m y b 1 i k e l l f y f l o w e rd e v e l o n m e n t f i g - 2 g a - s i g n a l i n g p a t h w a y t h a t r e g u l a t e s f l o w e r i n g i n a r a b i d e p s i s 1 2m r n a 差异显示技术应用 l i a n g 和p a r d e e 于1 9 9 2 年以研究与癌症发生有关的基因为目的，创 立了一种鉴定与克隆哺乳动物正常生理状态与异常状态细胞之间差异表 达的基因的方法，即m r n a 差异显示技术( d i f f e r e n t i a ld i s p l a y r e v e r s e t r a n s c r i p t i o np c r ，d d r t - p c r ) 。该技术自创立以来，经多年改进，已经 较成功地应用于动物及人类癌症、心脏病、糖尿病、胚胎发生、脑发育、 生长因子激活与抑制有关的基因的鉴定与克隆。此外该技术亦成功地应用 ，j 、麦兜蠲期挺关c d n a 片段缒竞隆及鉴定 于与植物胚胎发商、无融合生殖、形态发生、花分化、果实发育、信号传 鼯、植物抗逆与抗病性及植物与真菌的既作有关的基因的比较箍定与克 隆。随着m r n a 熬异显示技术的改进和完莓以及它的广泛应用，该技术将 在高等植物基因调控的探索中发撵越来越重要的作用。 1 2 。l 基因表达 利用m r n a 麓异显示技术发现狼尾草的有性生殖和无融合生皴的子房 焱基因表这上不瓣，在鬟示爨戆c d n a 冀段孛有3 令只恣枣牲生疆豹子痰 中特异表达，表明无融合生殖子房可能缺少某些蒸因，而表现无融合生嫩 ( v i e l l e c a l z a d aa n dn u c c i o ，1 9 9 6 ) 。烟擎( n i c o t i a n at a b a c u m ) 时蔗氧织 胁迫后，惩少有9 6 个基因的表达发生了变化，其中8 3 被诱导，而1 7 r 坡按制，除挠氧豫基因以终，还鸯参与生物窝非缴物胁遮防獭、缎愆保妒 和解毒、能量和碳水化含物代谢、蛋白质从头含成和信号转导等的基因 ( v r a n o v de ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 1 2 2 檄物的发育及抗性 c a l l a r d 等逶遗研究羧寓莽缍施悬浮臻养螽蘩游m r n a 差异表达，发戮 肖3 个基因( s r g l ，s r 剑2 ，s r 9 3 ) 的转录产物在器官衰老时大量积累，其 审s r g l 蛋鑫是f e ( i t ) 撬环矗羧氧纯酶家族孛一耨残员，跚2 编璃的蛋 白与b 一葡萄糖瞥酶同源，对衰老器官发育有重要作用( c a l l a r de ta 1 ， 1 9 9 6 ) 。 b e n i t o 等利用差异照示法对番茄真菌病害抗病机理进行了探索，发 瑗健康鹃餐藻时建秘被囊蘧或翅孳耱褒痰毒浸染骢番荔l 砖片鳇m r n a 有较 大差异。在病菌侵入后，植物防暇基因会迅速产生一系列m r n a ，翻译成 的蛋彝与瘸原菌棚互作用，杀死瘸原菌或病毒。在相互作用中，有3 个 m r n a 片段大量积累，丽精很快消失。表裙植物的抗病与莱冀漪翌基因的 瞬时表达宥密切关系( b e n i t o e ta 1 ，1 9 9 6 ) a 1 2 3 基因的鉴定与竟隆 剥建赤霉素缝理匏瘩强帮未处理的水稷之闻盼m r n a 表达鬟胡差l ) 倍，由此，k n a a p 和k e n d e 很容易地克隆了一个赤霉索调控基因( k n a a p a n d 山东农业大学硕士学位论文 k e n d e ，1 9 9 5 ) ：娄沂春等也采用差异显示的方法从赤霉素处理的水稻中 克隆了水稻叶绿体a t p 合成酶基因片段。n o r t h e r n 杂交显示叶绿体a t i 合成酶表达受赤霉素诱导且在诱导1 6 h 后达到高峰，表明赤霉素诱导水稻 产生生理反应过程涉及叶绿体基因的表达( 娄沂春，2 0 0 1 ) 。短日植物 p h a r b i t i sn i l 是研究光周期控制开花的模式植物，利用差异显示技术从 短日处理( 1 4 hd a r k ) 的子叶中分离到了与拟南芥开花时间基因惯朋a 了 ( 彻同源的砌m 砌卯的表达受光周期调控( l i u e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。差异 显示分离的p h a r b i t 拈n i l 中的另一个励四们的表达也具有昼夜节律性 ( k i m i y o e ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 由此可看出m r n a 差异显示技术是克隆基因的一种有效方法。 1 3 本研究的目的及意义 开花是高等植物生殖发育过程的重要标志，许多植物的开花时间在 定的条件下可进行人为的控制，使其早开花或晚开花。目前许多模式植物， 如拟南芥、牵牛、水稻等的与开花时间相关的基因被分离出来，并在此基 础上提出了与开花有关的遗传途径，但对其分予机制的认识还不是太沃 入，尤其是对非模式植物以外的高等植物研究不是太多。本课题以冬性小 麦( t r i t i c u ma e s “v u m ) “抗倒6 8 0 ”为材料，利用d d r t p c r 方法筛选光用 期相关基因进