（生物化学与分子生物学专业论文）药物环糊精超分子体的制备及表征.pdf

硕士学位论文药物，环糊精超分子体的制各及表征 中文摘要 超分子体是指在一定条件下，在主体分子的空间结构中全部或部分包入客体 分子后，形成的一类高级结构。环糊精( c d ) 具有内疏水、外亲水的独特分子 结构，是药物研究领域中重要的一类主体分子。药物与环糊精形成超分子体后， 药学性能将得到改善，主要取决于主客体的性质以及二者相互作用。 本研究选用白术挥发油、尼莫地平为模型药物，采用正交设计优化了白术挥 发油的提取工艺和白术挥发油与b c d 包合工艺；采用研磨法、冷冻干燥法和喷 雾干燥法制各了不同摩尔比的尼莫地平羟丙基b c d 超分子体，改善了模型药物 的性质。 同时，运用多种分析测试手段( 相溶解度法、溶出度测定、傅立叶变换红外 f t i r 、差示热分析d t a 、扫描电镜s e m 、x 射线衍射x r d 等) ，考察了白术挥 发油与1 3 一c d 、尼莫地平与羟丙基一b c d 超分子化前后的变化。 对于白术挥发油1 3 c d ，d t a 、x r d 、f t i r 、s e m 图谱有明显特征，直观地 反映了超分子体的形成和分子问相互作用，提示超分子化后具有更好的制剂性 能；g c 、t l c 结果表明挥发油的主要成分未发生明显变化，但挥发油的天然组 成有较大改变。 对于尼莫地平，羟丙基6 一c d ，相溶解度、d t a 、f t i r 、s e m 、溶出有效表征 了主客体分子间的相互作用，x r d 图谱差异不明显，结合计算机模拟研究确定了 尼莫地平与羟丙基一b c d 的结合方式。 这些表征不仅可作为判断主客体相互作用的指征，而且可以指导超分子体体 内行为的预测，提供质量控制依据，对推动超分子体在药物制剂中的应用具有重 要意义。 i l 硕士学位论文 药物，环糊精超分子体的制各及表征 a b s t r a c t s u p r a m o l e c u l a ri sf o r m e db yh o s ta n dg u e s tm o l e c u l a rw h e nag u e s tm o l e c u l a ri s f u l l yo rp a r t l yi n c l u d e di nt h es t r u c t u r es p a c eo f ah o s tm o l e c u l a r c y c l o d e x t r i n s ( c d ) ， w i t hs u i t a b l em o l e c u l a rs i z ea n de x c e l l e n tb i o c o m p a t i b i l i t y ，a r et h ei m p o r t a n th o s t r n o l e c u l a r so fs u p r a m o l e c u l a r si nt h er e s e a r c ha n da p p l i c a t i o no fd r u g s w h e nt h e d r u gi si n c l u d e di n t ot h ec a r i t yo ft h ec y c l o d e x 倒_ nm o l e c u l e ，s o m ei n t e r a c t i o nw i l l h a p p e na n dt h u st h ep h a r m a c e u t i c a lp r o p e r t i e sw i l lb ei m p r o v e d v o l a t i l eo i lo fb a i z h ua n dn i m o d i p i n ew e r et a k e na se x a m p l e si nt h i ss t u d y o r t h o g o n a ld e s i g nm e t h o dw a se m p l o y e dt oo p t i m i z et h et e c h n i q u eo fe x t r a c t i o no f v o l a t i l eo i la n dt h ep r e p a r a t i o no fv o l a t i l eo i lo f b a i z h u 1 一c d n i m o d i p i n e h p b c d i n c l u s i o nc o m p l e x e sw i t hd i f f e r e n tm o l e c u l a r sw e r ep r e p a r e d e x p e r i m e n t a l l yb y d i f f e r e n tm e t h o d s ( k n e a d e d ，丹e e z e d r y i n ga n ds p r a y d r y i n g ) t h ed r u g ，c da n dt h e i rb i n a r ys y s t e m sw e r ec h a r a c t e r i z e db yd i f f e r e n t i a l s c a n n i n gc a l o r i m e t r y , f o u r i e r t r a n s f o r m a t i o n i n f r a r e d s p e c t r o s c o p y ，x - r a y d i f f r a c t o m e t r ya n ds c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p ya n ds oo n w i t ht h ec o m p u t e r - a i d e d s i m u l a t o r ，t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nd r u ga n dc dw a se v e n t u a l l yw e l lc h a r a c t e r i z e d as e r i e so fe v i d e n tc h a r a c t e r i s t i c so fv o l a t i l eo i lo fb a i z h u p = c di n c l u s i o n c o m p l e xw e r ep r e s e n t e di nd t a ，x r d ，f t i r a n ds e m ，i n d i c a t i n ga ni m p r o v e m e n t o fp h a r m a c e u t i c a lp r o p e r t i e s g ca n dt l ca n a l y s i ss h o w e dn st h a tt h en a t u r a l c o m p o s i t i o no ft h ev o l a t i l eo i lh a d b e e nc h a n g e dw i t ht h eu n c h a n g e de s s e n t i a l c o m p o n e n t s n i m o d i p i n e a n dh p b c dh o s t - g u e s ti n t e r a c t i o nw e r ec h a r a c t e r i z e d b y p h a s e s o l u b i l i t ys t u d y ，d t a ，f t i r ，s e ma n dd i s s o l u t i o ns t u d y ，e x c e p tf o rx r d w i t ht h ec o m p u t e r a i d e ds i m u l a t o r ，t h ec o n j u g a t i o nm o d a l i t yo fn i m o d i p i n ew a s s u c c e s s f u l l yd e t e r m i n e d a l lt h e s ec h a r a c t e r i z a t i o n sc o u l dn o to n l yh e l pu st oe s t i m a t et h ei n t e r a c t i o n b e t w e e nt h eh o s ta n dg u e s t ，b u tc o u l db et h eg u i d a n c eo ft h ep r e d i c t i o no ft h e s u p r a m o l e c u l a r si n - v i v ob e h a v i o ra n dt h ea c c o r d a n c eo f t h eq u a i i qc o n t r 0 1 a n dt h u s t h i ss t u d yh a st h ei m p o r t a n ts i g n i f i c a n c ef o rt h ea p p l i c a t i o no ft h es u p r a m o l e c u l a rt o p h a r m a c e u t i c s i i i 学位论文独创性声明 本人郑重声明： 1 、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。 2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究 成果。 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构 已经发表或撰写过的研究成果。 5 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示 了谢意。 作者签名： 日 期： 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 作者签名： 日期： 硕士学位论文药物，环糊精超分子体的制各及表征 第一章前言 1 1 超分子体理论基础知识 1 1 1 超分子体系 超分子体系( s u p r a m o l e c u l a r ) 是两个或两个以上的分子通过分子间非共价 图1 - 1环糊精三维结构图 相互作用集合在一起所形成的具有一定复杂性及组织性的高级结构整体。这些分 子间作用大部分是属于主体客体作用类型，主要包括空间效应影喻下的范德华 力、静电力、氢键力、电荷转移相互作用、耳7 【相互作用以及疏水作用等弱相互 作用。目前研究的众多超分子主体有冠醚、杯芳烃( c a l i x a r e n e ) 和环糊精 ( c y c l o d e x t r i n ，c d ) ，其中c d 是药物研究领域中最为重要的一类主体分子( 图 1 ，1 ) 。 11 2 环糊精简介 环糊精是一类由d 吡哺葡萄糖通过淀粉经酶解环合后得到的由a 1 , 4 糖苷键 连接而成的环状低聚糖化合物。最常见的三种环糊精是a 一、3 - 及? - c d ，分别含 有6 、7 、8 个葡萄糖基。以1 3 - c d 的应用最为广泛，水溶性约为1 8 5 ( w v ，2 5 ) 。 通过对b c d 的化学修饰，可以得到安全无毒、水溶性更好的环糊精衍生物， 目前有羟丙基一p 一环糊精、磺丁醚一p 一环糊精等。羟丙基一1 3 一环糊精 ( h y d r o x y p r o p y l b c y c l o d e x t r i n ，h p p - c d ) 是p c d 与1 ，2 环氧丙烷缩合而成的亲水 性衍生物m 】。b c d 的r 1 、r 2 和r 3 上的羟基被羟丙基随机取代，生成2 一h p p c d 、 硕士学位论文 药物环糊精超分子体的制备及表征 2 ，3 一h p 一1 3 一c d 、2 , 6 一h p 一1 3 一c d 及2 ，3 ，6 h p b c d 等同系物。通过对1 3 - c d 的羟丙基 化，破坏其分子内氢键，使水溶性显著提高。而h p b c d 易溶于水，室温下溶 解度 5 0 ( w v ) ，甚至可高达7 5 ( w v ) 以上。当其浓度 研磨法：精密称取1 3 c d ，加适量水研稀，精密称取白术挥发油加入其中， 研匀后，置于胶体磨中，研磨一定时间。近年来其应用也较为普遍口”。 以上所得样品真空干燥即得包台物粉末。 比较指标： ( 1 ) 外观饱和溶液法、超声法包合过程中肉眼可见油滴聚集并浮于表面，包 合干燥后得淡黄色粉末。石油醚洗涤后得淡黄色液体，紫外扫描证明为未包合的 挥发油。而研磨法包合过程中无油滴聚集现象，分散均匀；干燥后得白色粉末。 说明白术挥发油不易分散，研磨可以助其分散，利于包合。 ( 2 ) 差热分析( d t a )测试条件：升温范围5 0 3 5 0 。c ，升温速率1 2 。c r a i n ， 样品量约5 m g 。结果显示饱和溶液法与超声法所得包合物仍然显示挥发油的特征 峰，而研磨法制得的包合物中挥发油特征峰消失，表明已形成新的物象。 9 硕士学位论文 药物，环糊精超分子体的制各及表征 ( 3 ) 包合率测定精密称取2 9 包合物，加5 0 m l 石油醚分3 次洗脱后低温挥干 1 叩2 0 0 3 0 0 c 图3 - 1 不同制备方法得自术挥发油邝c i ) 包台物的d t a 谱 再加5 0 m l 无水乙醇回流提取1 h 。滤过，收集滤液定容。取该样品稀释1 0 0 倍后 在2 0 0 4 0 0 n t o 范围内经紫外分光光度计于2 5 2 n m 下测定吸收值。利用标准曲线 求出包合物中挥发油含量，进而求得包合率。 包合率( ) 一实际含油量( g ) 挥发油加入量( g ) 1 0 0 二( 1 ) 结果饱和溶液法包合率7 2 3 5 为，超声法为6 8 2 7 ，研磨法为8 1 7 3 。 证实研磨法最佳。 干燥温度的筛选 将研磨法制得的包合物( 约含2 9 挥发油) 固定干燥时间3 h ，选择5 0 。c 、6 0 。c 、 7 0 。c 、8 0 分别恒温干燥，测定包合率，平行三组，结果见表3 。1 。 表3 - 1 包合物干燥温度筛选表 结果确定5 0 。c 为最佳干燥温度。 白术包合率测定方法的建立 测定波长的确定 文献报道，白术挥发油中苍术酮( a t r a c t y l o n ，检测波长2 5 2 n m ) 的含量 硕士学位论文 药物，环糊精超分子体的制各及表征 高，为主要有效成分，应作为白术挥发油质量控制的主要指标。因而，拟采用紫 外分光光度法测定包合率。 按2 0 0 0 年版中国药典一部白术鉴别项下采用正己烷制备供试样品，考虑到 毒性较大，结合文献报道【2 们，采用无水乙醇作处理溶剂。 标准曲线的建立 配制挥发油样品的无水乙醇溶液系列浓度，在2 5 2 n m 处测定吸收值。将相 应数据回归得标准曲线( 图3 2 ) ：a - 0 0 0 7 6 + 0 0 3 8 5 c ( * 1 0 g m l ) ，相关系 数r 2 = 1 。白术挥发油溶液浓度在5 5 1 8 0 g m l 范围内与吸收度呈良好的线性关 系。 图3 - 2自术挥发油，无水乙醇回归标线 样品供试液的制备和包合率的测定 精密称取2 9 包合物，加5 0 m l 石油醚分多次洗涤后低温挥干，再加5 0 m l 无水乙醇回流提取2 h 。滤过，收集滤液，定容至5 0 m l 。取l m l 加无水乙醇定 容至5 0 m l 后在2 5 2 n m 处测定a 值。 取挥发油对照品配制标准溶液( 9 1 0 1 0 e d m l ，a 2 5 加，= o 3 4 3 ) ，按对照品 比较法求出挥发油含量( ) ，结果为1 2 8 0 。 挥发油含量的计算按( 2 ) 式进行： 挥发油含量( ) = 实际吉油量( g ) 包合物总量( g ) 1 0 0 ( 2 ) 精密度试验 精密称取包合物样品，按上述测定方法制备样品供试品溶液，进行紫外测定。 硕士学位论文 药物环糊精超分子体的制各及表征 a 平均值o 3 8 6 ，r s d 为0 2 3 ，符合要求。 稳定性试验 精密称取包合物样品，按上述测定方法制各样品供试品溶液，分别于0 、 3 0 、6 0 、9 0 、1 8 0 m i n 进行测定，r s d 为0 1 3 。表明，样品供试品溶液在1 8 0 分钟内稳定。 阴性样品的干扰 精密称取相当量的p - c d ，按上述步骤同法处理后紫外测定。a 2 5 2 i l 。为o 0 0 2 。 根据阴性干扰忽略不计的原则，阴性样品的吸收度应小于o 0 4 。符合要求。 重现性试验 精密称取包合物2 0 2 4 9 、2 0 1 7 9 、2 0 1 1 9 、2 0 1 5 9 、2 1 0 7 9 、2 0 1 l g ，按上述 方法制备六份样品供试品溶液，分别进行紫外测定。计算的挥发油含量分别为 1 2 7 8 、1 2 6 6 、1 2 7 9 、1 2 6 4 、1 2 7 l 、1 2 7 9 ，r s d 为0 5 3 。表明， 测定方法的重现性良好。 加样回收率试验 己知含量样品稀释一倍( 5 2 m g m l ) ，精密量取0 1 m l ，分别加入挥发油对 照品贮备液( o 5 2 m g m l ) ，o 8 、1 0 、1 2 m l ，定容至1 0 m l 。摇匀，测定，并以 下列公式计算回收率。 加样回收率= ( 测出量- 样品中含量) 添加对照品量x 1 0 0 ( 3 ) 结果见表3 2 。 表3 - 2 挥发油含量测定方法的加样回收率实验表 回收率符合9 5 10 5 的要求。 空白回收率试验 硕士学位论文 药物，环糊精超分子体的制各及表征 精密称取挥发油如前述方法热回流提取、稀释后紫外测定，计算出挥发油 含量。测定值与处理前挥发油含量的比值即挥发油含量测定方法的空白回收率 ( 见表3 3 ) 。 表3 - 3 挥发油含量测定方法的空白回收率实验表 处理前挥发油含量( g m l )处理后挥发油含量( g m e ) 空白回收率( )平均值 4 0 2 x 1 0 。3 4 0 1 x 1 0 。9 9 7 5 结果表明空白回收率高于9 8 ，平均达9 9 2 5 ，因此可忽略不计。 白术挥发油t 3 一环糊精超分子体制备的正交优化 考虑到诸多因素对包合物形成和质量的影响，在预试验的基础上，采用研磨 法制备包合物( 研磨条件：磨盘直径4 c m ，转速2 9 0 0 r m i n ，功率0 3 k w ，缝隙 5 9 m ) ，对制备时p c d 与油的配比、加水量比及研磨时间进行了探讨。 因素水平表( 见表3 4 ) 表3 - 4因素水平表 表3 - 5 正交实验表及结果 硕士学位论文 药物，环糊精超分子体的制各及表征 实验方法及数据 按表3 - 4 用l 9 ( 3 4 ) 正交表安排实验，以包合率为指标，根据正交试验结果 优选出最佳制备条件。结果见表3 5 。 表3 6 挥发油师糊精包合正交实验方差分析表 f o0 5 ( 2 2 、= i 9 0 0 0 由表3 5 、3 - 6 的结果分析表明，影响白术挥发油，1 3 c d 包合物质量的因素 影响顺序为b c a ，水：1 3 c d 的比例是影响研磨法包合效果的关键因素。最 佳试验方案为a 2 8 2 c 】，即投料比( b c d ：白术挥发油) 为6 ：1 ( w w ) ，加水 量为2 ：1 ( w w ) ，包合1 5 m i n 。 优选条件为：精密称取b c d 于胶体磨中，加2 倍量水研稀，加入1 6 倍重 量的白术挥发油，置于胶体磨中，研磨1 5 m i n 后取出，5 0 。c 真空干燥4 h 即得包 合物粉末。 工艺验证得包合物平均挥发油含量为1 3 5 ，平均包合率8 9 6 。与已报道 1 4 硕士学位论文药物环糊精超分子体的制各及表征 工艺【2 3 】比较，该优选工艺环糊精用量少( 一般环糊精与挥发油比例为8 ：1 或1 0 ：1 ) ， 时间短( 一般采用饱和溶液法，耗时长) ，挥发油含量高于已有的1 0 1 ，包合 率稍低于报道的9 0 。 3 1 _ 2 白术挥发油0 一环糊精超分子体的表征 3 1 2 1 材料与仪器 c d r 4 p 差动热分析仪( 上海精密科学仪器有限公司) ， 阳极转靶x 射线衍射仪d m a x r c ( 日本理学公司) ， s x 4 0 扫描电镜( 日本明石) ， n e x u s 一6 7 0 傅立叶变换红外( n i c o l e tu s a ) ， c p 3 8 0 0 气相色谱仪( v a m a n ) ； 石油醚、无水乙醇等其他试剂均为分析纯。 3 11 2 2 白术挥发油，1 3 司；糊精超分子体的d t a 测定 测试条件 升温范围5 0 3 5 0 。c ，升温速率1 2 。c m i n ，样品量约5 m g 。 结果与讨论 t 3 一c d ( a ) 、白术挥发油与b c d 物理混合物( b ) 及白术挥发油b c d 包合物( c ) 的d t a 图谱见图3 2 。 1 3 。c d 在8 2 9 。c 和2 1 5 1 处有两特征峰，分别为环糊精的脱水峰和熔融分 解峰 2 4 】：物理混合物为白术挥发油与b c d 的简单叠加，仍然显示了1 3 c d 的特 征峰，仅是由于挥发油中低沸点挥发性成分的存在，使1 3 一c d 的脱水峰由8 2 9 降低至7 6 7 。c ；在包合物中，b c d 的两特征峰消失，说明b c d 空腔中的水 分子已被置换出来；同时，出现了新特征峰，起始与结束温度之间的跨度增大， 热熵值明显减小，据此推测挥发油与b c d 之间不是简单地吸附，而是发生了分 子间作用，生成新的物象。 硕士学位论文 药物，珂：糊精超分子体的制各及表征 殳。 、。7 1 0 0 t e p 糯r e t 3 0 0e d r e t u rl ： 图3 - 2b c d ( a ) 、白术挥发油，b - c d 物理混合物( b ) 和包合物( c ) 的d t a 图谱 f i g - 3 - 2d t ac u - v e so fb c d ( a ) ，p h y s i c a lm i x t u r e ( 1 3 1a n di n c l u s i o n c o m p l e x ( c ) o f v o l a t i l eo i lo f b n i z h u ! 一c db i n a r ys y s t e m 3 1 2 3 x 射线粉末衍射 测试条件 室温，c u k 且靶，扫描速度2 。m i n 。 结果与讨论 采用x 射线粉末衍射技术可有效地测定晶体化合物的晶型变化。白术挥发 油与b c d 物理混合物( a ) 及白术挥发油邝- c d 包合物( b ) x 射线粉末衍射图见图 3 - 3 。包合物和物理混合物的主要特征峰明显不同( 表3 - 7 ) 。这些新特征峰的出现， 表明包合物形成新的晶型。 1 6 硕士学位论文 药物环糊精超分子体的制备及表征 t 0 0 0 02 0 - 0 0 02 曲e 乜坩b a 13 0 - 0 0 04 0 0 0 0 图3 - 3 白术挥发油b c d 物理混合物( a ) 、包合物( b ) 的x 一射线衍射谱 f i g3 - 3 p o w d e rx - r a yd i f f r a c t i o np a t t e r n so fp h y s i c a lm i x t u r e ( a ) a n di n c l u s i o nc o m p l c x ( b 1o f v o l a t i l eo i lo f b a i z h u b - c db i n a r y s y s t e m t a b 3 - 7t h ed i f f r a c t i o na n g l e s ( 2o ) a n dr e l a t i v ei n t e n s i t y ( i 1 0 ) o fp h y s i c a lm i x t u r ea n d i n c l u s i o nc o m p l e xo f v o l a t i l eo i lo f b a i z h u b c db i n a r ys y s t e m 3 1 2 4 扫描电镜图分析 测试条件 粉末研匀镀金，固定于铜网上。加速电压2 0 k v 。 结果与讨论 白术挥发油与t 3 一c d 物理混合物( a ) 及白术挥发油c d 包合物( b ) 的 s e m 结果见图3 - 4 ，两者晶态存在明显差异：物理混合物中大部分挥发油小颗粒 棱角分明、边缘清晰地附着于1 3 一c d 方晶表面，而包合物中挥发油小颗粒嵌入b c d 方晶内，两者糅合，界面模糊，使1 3 c d 转呈分枝状晶体，与x 射线粉末 衍射分析结果一致；从电镜下较大的视野观察，大多数包合物颗粒小于b c d 颗 硕士学位论文药物环糊精超分子体的制各及表征 粒。由于分枝状的晶体更容易相互或与其它颗粒嵌合 2 5 , 2 6 ，推测包合物的可压性 和结合性将明显优于物理混合物或1 3 c d 本身口7 1 。这一特性说明在固体制剂制备 ( 如制粒、压片等) 中应用自术挥发油b c d 包合物粉末具有更好的适应性， 图3 - 4 白术挥发油b c d 物理辊合物( a ) 和包合物( b ) 的扫描电镜图( x1 0 0 0 0 ) f i g , 3 - 4 s e md i a g r a mo f p h y s i c a lm i x t u r e ( a ) a n di n c l u s i o nc o m p l e xc b ) o f v o l a t i l eo i l o f b a i z h i i ，b c db i n a r ys y s t e m ( x1 0 0 0 0 ) 与b c d 或物理混合物相比，更有利于制剂性能的改善。 3 1 2 5 红外光谱分析 测试条件 溴化钾压片法，分辨率4 c m - 1 ，扫描范围4 0 0 0 4 0 0c m l 。 结果与讨论 b c d ( a ) 与白术挥发油b c d 包合物( b ) 红外光谱图见图3 5 。由光谱 图3 51 3 c d ( a ) 、白术挥发油b c d 包合物( b ) 的红外图谱 f i g 3 - 5 i n f r a r e ds p e c t r ao f1 3 - c d ( a ) a n dv o l a t i l eo i lo fb a i z h u b c d i n c l u s i o nc o m l l l e x ( b ) 硕士学位论文药物环糊精超分子体的制备及表征 数据分析，1 3