（生物物理学专业论文）近红外傅立叶变换拉曼光谱定量分析应用基础的研究.pdf

摘要 近红外傅立叶变换拉曼光谱技术( n i r - f t - r a m a n ) 是一种新兴的适合于快速无损分析的光 谱技术。本文对近红外傅立叶变换拉曼光谱在定量分析中的应用进行基础研究，主要是对固体布 洛芬片剂和三种氨基酸混合液体这两种物态的多组分复杂体系的定量分析。除了使用传统的基于 谱峰强度的拉曼光谱定量分析技术之外，还使用了化学计量学中常用的多元校正算法对样品进行 定最分析，包括线性的主成分回归( p c r ) 、偏最小二乘法( p l s ) 和非线性的人工神经网络( a n n ) 方法。 研究结果表明，利用多变量校正算法，对多组分固体和液体混合物可以建立起比传统方法更 理想的分析模型，在相同条件下，p l s 建模的结果要优于其他两种方法。布洛芬片剂中布洛芬与 淀粉含量的化学值与p l s 模型预测值的相关系数分别为o 9 9 7 4 和o 9 9 9 0 1 氨基酸混合溶液中赖 氨酸、脯氨酸和缬氨酸含量的化学值与p l s 模型预测值的相关系数分别为o 9 9 7 4 、o ，9 9 8 9 和 o 9 9 9 0 。对布洛芬片剂研究表明，不同激发能量对n i r - f t - r a m a n 定量分析有较大的影响。 同时，使用色散型拉曼光谱仪和傅立叶变换近红外光谱仪分别对圆体和液体混合体系进行定 量分析，分别比较两种光谱分析技术和n i r - f t - r a m a n 光谱在定量分析应用中的特点。结果表明， 运用n i r - f t - r a m a n 光谱在定量分析混合体系方面要优于色散型拉曼光谱法，可以达到与f t - n i r 光谱相同的定量分析精度。 关键词：近红外傅立叶变换拉曼光谱，定量分析， 偏最小二乘法，人工神经网络，主成分回归 a b s t r a c t f o u r i e r - t r a n s f o r mr a n m ns p e c t r o s c o p y 倒i r - f t - r a m a n ) i saf a s t t e c h n i q u et h a t c a l q p r o v i d e c o m p o n e n ti n f o r m a t i o na b o u ti n t a c ts a m p l e s i nt h i st h e s i s ，t h ea p p l y i n gb a s i so fq u a n t i t a t i v ea n a l y s i s u s i n gn i r - f t - r a m a ns p e c t r o s c o p yh a sb e e ns t u d i e d + b e s i d e st h e t r a d i t i o n a l q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s m e t h o dt h a tb a s e do nt h ei n t e n s i t yo fr a m a n p e a k ，w eh a v ec o m b i n e d n i r - f t - r a m a n t e c h n i q u ew i t h c h e m u m e t r i c st op e r f o r maq u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o no fi b u p r o f e nt a b l e ta n da m i n oa c i dl i q u i d c o m p o u n ds a m p l e t h e r ea r e t h r e em u l t i v a r i a t ec a l i b r a t i o nm e t h o d sh a sb e e nu s e d ，i n e l u d i n gl i n e a r p r i n c i p l ec o m p o n e n tr 删s i o n ( p c r x p a r t i a ll e a s t s q u a r e sr e g r e s s i o no e l s ) a n dn o n l i n e a r a r t i f i c i a ln e u r a ln e t w o r k ( a n n ) t h er e s u d t si n d i c a t et h a t 璐i n gp l sc a ne s t a b l i s hc o m p a r a t i v e l yg o o da n a l y s i sm o d e l t h er e l a t e c o e f f i c i e n t o f i b u p r o f e na n ds t a r c hp l s m o d e li s0 9 9 7 4a n d 0 9 9 9 0 r e s p e c t i v e l y t h er e l a t ec o e f f i c i e n t o f l y s i n e ，p r o l i n e a n dv a l i n ep l sm o d e li s0 。9 9 7 4 ，0 ，9 9 8 9a n d0 9 9 9 0 ，r e s p e c t i v e l xs i m u t a n e o u s l y , t h e p r e d i t i o nr e s u l ti si n f l u e n c e db y t h ee x c i t i n gp o w e r e v i d e n t l y i n a d d i t i o n ，d i s p e r s i o n r a m a n s p e c t r o s c o p yp 袋s ) a n d f o u r i e r - t r p m s f o r mn e a r - i n f r a r e d s p e c t r o s c o p y ( f t - n i r s ) h a db e e nu s e dt oq u a n t i t a t i v e 龃a i y s i ss o l i da n dl i q u i ds a m p l e s ，r e s p e c t i v e l y t h e q u a n t i t a t i v ea n a l y s i sr e s u l t so fn i r - f t - r a m a ns p e c t r o s c o p yc l o s et ot h er e s u l t so f f t - n i r sa n d i n d i c a t et h a tn i r - f t - r a m a ns p e c t r o s c o p ym o r es u i tt oq u a n t i t a t i v ea n a l y s i sm u l t i v a r i a t ec o m p o u n d s c o m p a r e t dd r s k e y w o r d s ：n e a r - i n f r a r e d f o u r i e r t r a n s f e r r a m a n s p e c t r o s c o p y , q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s ， p a r t i a ll e a s ts q u a r e sr e g r e s s i o n ，a r t i f i c i a ln e u r a ln e t w o r k , p r i n c i p l ec o m p o n e mr e g r e s s i o n i l 独创性声明 本人声明所星交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工终及取褥的硬究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方处，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获 ：导中国农业大学或其它教窍枧掏煦学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同悫对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了暖 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：套宁时间： 。；年g 月s 日 关于论文使用授权的说明 本入完全了解中圜农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文韵复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 翎手段保存、汇编学位论文。同意中阑农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 零宁 时间： 一一歹年月孑曰 导：7 哥法精 慨渺弓年细卵 中国农业大学领士学位论文第一章引言 第一章引言 1 。1 国内夕卜研究现状 过程势糖是化学分毫厅豹一个爨要疆究内容，要求分橱仪器糍够在生产操作的现场照位、无攒、 快速地提供分析对象的定性定量信息。近年来。制药业、化工行业、食晶生产等各个行业对生产 过糕分辑撵出了受糍豹要求，采髑凄线韵实验室蒺控分耩复杂耧瓣，无法用于镶l 造过穰的实对控 制，难以稳定内在物质组成，严熏影响产晶质量，已经不能适应快速控倦0 生产过程的需疆。目前， 近缀乡 薅立时交换控曼走港( n i r - f t - r a m a n ) 接为一秘缀有蔫簸的块速j 生程控制分辑技术，越寒 越受到分析学家和工业用户的关注。 1 9 8 7 肇p c r k i ne l m e r 公霹攥斑了毽器第一台n i r - f t - r a m a n 褰用毙灌仪在筑短戆二卡 多年间，n i r - f t - r a m a n 光谱在各个领域中得到了广泛的应用 2 1 。由于每种物质( 分予) 有自己特 征瓣拉曼竞谱，戮褥拉曼毙谱是磁究秘震维幸鸯懿燕要手段之一，n i r - f t - r a m a n 走谱鼓零残斑纯 学、生物和医学样品结构分析方丽的有力工具l j l l 4 j 。 嚣前，国井关予n i r - f t - r a m a n 光谱在耪磊# 破坏蘩澍秘囊辩控制方嚣蕤壤遵稷多：医药方 面的研究商：新的抗痉挛复合物p 】、皮肤病诊断州：食晶行业有：鉴别涎然蜂擞中加入的造假物 质1 7 l 、非酸坏篓剐苹果表蕊的徽擞耪 s l ；在动撩物研究方瑟有：对哥疑这黎翱搿稀中寄生昨主的 青祷的鉴别【9 】、对挪威云杉针叶不同针叶表面面积和不i 司年龄的针叶的判别分析i 1 0 1 、术乃伊的皮 肤和指甲的研究洲以及鍪邂哺乳动物样本渊；在工韭领域中静誓骚遵有：凝合反应涮渊酾f “、嚣 破坏分折多组分的天然树脂【l ”、砖块黏土煅烧过程中的成量控制【1 8 i 以及在线监测淀粉的胶凝作用 和酶催化淀粉水解过程 w j 。 国内遮方面的报道也比较多。应用的范围缀广泛。在中药毒手鉴别领域 z o l ：z 1 l 【2 2 】，可以无授鉴 定药材的冀伪1 ”l f z 4 ，已有快速成功鉴别八角茴香# ”、黄芩渊和举乌鳓的报道。在生物学领域“， 运用傅立时拉曼光谱法研究核酸碱基l 挣】、艰晶状体p o l 、液晶分子p 、摄白质二级结构9 ”、蛋白 质和溶剂的相互作用0 3 1 、囊属硫鬣白的折叠过稔 3 4 1 、鸟瞟呤及萁甲基他衍生物、三链d n a 渊、 蚕丝蛋白的结均与功能印l 邦取褥了一定滋震。嗣对，n i r - f t - r a m a n 还拨应用于恶性肿瘤椰1 和癌 症的早期诊断”。在法庭科学领域h “，利用n i r - f t - r a m a n 鉴剐黑色墨水”1 聃斟、橡胶”3 l h 4 1 和纤 维上染辩州的分援已毒报遒。另纷，拉曼光谱技零 # 常适合于翳损和不允许取样豹珍贵艺术韪鉴 别1 4 6 】，已成功地应用包括：颜料的无损分析”、宝石鉴定”s lh 针啪i 跚l 。其他的一些应用领域还有 攘默舍残鼢、珏境分辑删1 5 毗郓蘸戆霹究9 5 i 潮。 与此同时，威用傅立叶变换瓴外光谱( f t o i r ) 和博立叶变换近红外光谱( f t - n i r ) 技术进 亍快速分掰豹磺究氇舂投遵。f t - i r 光诿滚搏为一耪菲零艘熟静分雾 技术，在剩魏萼亍韭f 5 7 】q 椰】、 海哭对出入境商品检测等需要简便、快速鉴定方法的领域中起着越来越重要的作用【6 心i 。另一方 露，f t - n i r 毙落技术最瓣死年褥到迅速戆发震，其最大特点燕快速嚣攘，透过与毙譬纾维_ 耧诗 算机技术相结合，测量信号可以进行远距离传输和分析，十分避台原做在线检溯。目前该技术已 在簇药行攮 6 群】、再漓王韭搿l 酗l 蹿l 邳1 、耀擎稃韭删、食最秘农产鑫簿韭粥、镯瓣簿韭f2 l 7 2 l 等 领域获得较成功的应用1 7 ”。f wl a n g k i l d 和a s v a n t e s s o n 利用f t - i r 、n i r f t - r a m a n 和 中国农业大学硕士学位论文 钨一童日l 言 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 自! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 自! ! ! ! s ii ! ! s ! ! ! 目e 自! ! ! ! ! ! ! ! ! ；! 釜釜 f t - n i r 光谱技术分别鉴别五种纤维索，比较三种方法各自的优点，其中，n i r - f t - r a m a n 和 f t - n i r 方法优于f t - i r 之处在于不用对样品进行前处理，可对样品进行非破坏分析 7 4 】。 以上研究表明：n i r - f t - r a r n a n 光谱技术有很多适合于过程分析的优点：使用近红外光源激 发，不受荧光干扰：不用进行样品的特别制各：由于采用了傅立叶变换( f o u r i e r t r a n s f o r m ，f t ) 技术，可以快速、简便地鉴定物质，不需要破坏样品且灵敏度高；同时，可对多组分样品进行分 析；对固体，气体，液体都能进行分析，很适合于监测控制工业生产反应过程i ”1 。利用光纤传输 耦合到n i r - f t - r a m a n 光谱仪的测量方法，已有应用于远距离和实时测量的报道，使得 n i r f t - r a m a n 光谱有了更广阔的应用发展【7 0 j 。 在红外光谱中，f t - i r 对水溶性物质的测定很困难，由于在3 3 0 0 c m 1 附近的o h 的强吸收， 使_ n h 。一o h 的伸缩振动频率不易辨认。而在n i r f t - r a m a n 光谱中，- o h 谱带较弱，因此容易 辨认出- n h 的谱带这为水溶性物质的测定提供了方便，非常适合于原位( i ns u i t ) 对生物环境 中( 水溶液体系，p h 接近中性等) 的酶，蛋白质，核酸等具有生物活性物质的结构研究。 同时，n i r - f t - r a m a n 也是无机化合物和金属有机化合物分析的有力工具。对于有机体系它 比红外光谱法优越得多，不但可以在水溶液中测定，而且可测振动频率处于7 0 0 - 1 0 0c m 。1 范围的 络合物中金属- 配位键振动，还可测定h 2 s 0 4 、h n 0 3 、h 1 0 4 等强酸的解离常数等。 n i r - f t - r a m a n 技术能够快速无损地研究物质的性质和结构，在定性方面取得了巨大的成功， 那么在定量分析方面呢? 我们知道生产过程的在线定量分析也是过程控制的一个重要方面，尤其 是对混合物的实时无损定量分析，因为很多工业现场需要分析的产品都是多种成分共存的复杂体 系，如何才能不破坏产品，从复杂背景中提取到我们感兴趣的成分的定量信息，是许多分析工作 者关注的问题之一。而n i r - f t - r a m a n 作为一种很有潜力的对混合成份进行非破坏定量分析的技 术，成为过程分析研究领域中一个越来越受到瞩目的焦点。 一直以来，利用拉曼光谱进行定量分析是分析工作者关注的问题之一，但研究对象仍然局限 于单个或几个不同物质的定量分析。而且运用拉曼光谱的定量分析多见于液态和气态样品：对于 固体样品的定量分析，则受粉末颗粒的大小、密度和混合物的均匀性等因素的影响，这方面的报 道比较少。 目前，国外应用n i r - f t - r a m a n 光谱定量分析p 7 l 的报道有：测定胆固醇和脂化胆固醇【”1 ，兔 动脉中脂化胆圃醇i ，维生素a i 叫，牛奶中的微生物“1 ：乳酸发酵过程种的多组分瞰1 ；烟尘和 硅烟中的硅j 煤油州，商用汽油中的氧含量l 蜘，还有利用光纤来进行拉曼光谱分析的：商用 汽油中辛烷值的测定嗍，石油燃料中苯和甲苯的p l s 分析【叫。 在药物分析中的报道有：对无损胶囊中b u e i n d o l o l 含量的定量分析畔1 ；对制药生产中常用的 多形体赋形剂b 甘露醇的定量分析【辨l 以及研究粉末混合物正交晶型和单晶型中的扑热息痛 9 0 】。 在工业生产中，有研究丙烯酸盐和异丁烯酸盐卤化的非饱和态测定9 i j ；乳香树脂油中不同型态物 质的定量f ”1 还有原位跟踪腈在碱性过氧化氢环境中的消耗l 。 其中，从对牛奶中的微生物【s 1 1 分析中可以看出：由于几乎所有的食品都含水，使得在红外光 谱中产生很强的吸收峰，而拉曼光谱中水峰并不是最主要的可以不用干燥样品而不会使得样品 成分减少，因而n i r - f t - p a s m a n 是一种比较好的对食品进行定量分析的方法。 在对药物进行分析方面，对b 甘鼹醇的定量分析方法代表了基于谱峰强度的传统定量分析方 法f ”。s a r r a n c a m p b e l l r o b e r s 、a d r i a n c w i l l i a m s 等设计了混合b 型和6 型的样品体系，由于 2 中国农业大学硕士学位论文 篼一章引言 两种型体各自的特征波段不同，计算b 型特征峰对6 型特征峰的峰强度之比，利用这个比值建立 相关曲线，并对已知混合样品进行了检验。结果表明使用这种新型非破坏方法，2 含量以上的 b - 甘露醇可以被定量分析。主要的误差来源于混合样品的不均匀性，控制微粒的大小范围可以减 小测量误差，可见n 1 r - f t - r a m a n 光谱能快速、准确的定量分析多形体混合物。 对胆固醇和脂化胆固醇i ”j 和兔动脉中脂化胆固醇1 7 ”的研究方法具有代表性，可以看到通过 n i r f t - r a m a n 技术。能够快速、非破坏地得到生物活性样品在原处( i ns i t u ) 的可靠的定量信息。 文章把n i r f t - r a m a n 光谱同偏最小二乘回归( p l s ) 结合定量分析两个样品序列的胆固醇和 脂化胆固醇，在6 6 个包括胆固醇，亚油酸盐胆固醇和油酸盐胆固醇三种物质不同含量的样品中， 检查定量分析其中某一个特定成分在其他另两个成分出现时的可能性；第二组样品序列实验主要 看定量分析棕榈酸盐胆固醇和硬脂酸盐胆固醇灵敏度问题。 在国外对维生素a p ”的研究中可以看出，拉曼数据应用多元散射校正( m s c ) 的预处理方法， 是对样品制备过程中产生的随机附加误差的有效补偿，结果比没有应用m s c 要好。结合p l s 定 量研究腈和过氧化氢反应过程中的的消耗 9 3 1 ，可以看到n i r - f r r a m 光谱是一种对工业在线控 制很有效的方法。 以上是对液体样品【舛1 进行n i r - f r - r a m a n 光谱定量分析的一些研究，对固体物质的定量分析 研究具有代表性的是对烟尘和硅烟中的硅田i 的研究方法，定量分析了烟尘和硅烟中的低含量硅。 要选用合适的内标物，选用形状合适的样品池装样，在进行固体样品的拉曼光谱测定时，固体样 品的拉曼光谱会受到粉末粒度、密度以及混合物的均质性的影响，因此在实验中，使样品保持粒 度、密度的一致性。另外在实验过程中，尽可能保持同等条件进行测量样品，减少测定误差，尽 可能提高数据的准确性、可靠性和精密度。 与红外光谱相似，这些方法的检涮范围一般为1 0 0 p p m 或 m m o l 左右。采用的定量分析方法 有偏最小二乘法伊l s ) 和相关系数法。这些文章多数集中在9 5 至9 7 年间，9 8 年至2 0 0 0 年有一个 沉寂期，而2 0 0 0 年以来，有关n i r - f t - r a m a n 光谱定量分析具体应用的报道呈增长趋势，说明这 一领域的研究有所进展。 国内关于拉曼光谱定量分析方面的文章较少，有报道指出了应用拉曼光谱法进行定量分析的 几个关键性技术问题1 9 5 1 。对液体的研究报道比较多，有一篇报道是研究萘菲固体混合物的拉曼光 谱及溶解于苯溶液中的萘菲的拉曼光谱，对其所遵循的定量分析规律进行了探讨刚：还有对部分 常规盐水溶液进行测试，绘制拉曼工作曲线进行定量分析的方法p7 l 以及对二氧化碳一水体系的研 究”1 ，对乙醇、甲醇、食用酒及工业酒精的测定陋1 ，分析得知：甲醇与其它三者有不同的振动光 谱，因而应可据此检查食用酒精中的甲醇。此外，在指定组分前提下，可以根据水峰强度与乙醇 ( 甲醇) 特征峰的强度之比得出酒精含量。还有乙醇和甲醇混合液激光拉曼光谱研究l l 呻j ，以及同光 纤结合的实时在线拉曼光谱测量【”。值得一提的是采用n i r - f t - r a m a n 光谱对蛋白质二级结构的 定量分析【”“，通过对蛋白质样品进行多次扫描以去卷积谱、二阶及四阶导数谱为参考确定各 子峰峰位然后采用酰胺i 带的原始谱图作曲线拟合，并以子峰面积表征对应二级结构含量，根 据这一方法研究了多种蛋白质二级结构，与其他测试方法相比得到基本一致的结果。 除了对液体和固体样品的研究外，还有对大气污染进行定量监测分析1 1 0 3 1 的报道。与液体和 固体的拉曼光谱分析研究相比较气体的拉曼光谱法定量测定分析研究具有较高的难度，而且比 红外吸收光谱法分析的空间分辨率高，因此它被广泛应用于大气污染的环境监测分析和痕量气态 3 中图农业大学硕士学位论文第一章q i 言 污染物的定量测寇分析研究。在文中探讨了应用q 支现琢的分析方法，介绍了气体定艇测定分析 豹壤论基戳- - p l a c z e k 援诧蛙理论，讨论了在气体定量测定分辑辑究中应该注纛静事矮。 高小玲和j s b u t l e r 认为 t 0 4 | ，应用傅立叶拉曼光谱进行定擞分析时的误差，一般情况下不应 越避1 5 强：黠予稳定豹纯舍兹，它熬误差不应越过l o ；个别不稳定瓣镌矮，有g 寸霹能超过2 0 。尽管如此，这并不意味着这不是一个好的分析方法，只能说明还村许多问题和工作，需聚人 耋l 避一步去分辑、骈究。瓣且由予光谱强发来涎予仪器爨舅豹爱敦度，苓弱型曾载坟器其袁不嚣 的灵敏度。傅立叶变换拉曼光谱分析仪器，有较好的重现性，偏差一般都不大于3 ，对不嗍型 号瓣饺器，数据燕缀难滋行跑较麴，毽它韬分援变纯鹁趋势具骞一致挂； 以上豳内报道大多集中在2 0 0 0 年以前，所用的定艇方法熬本上感应用内标法或外标法，对 控整光谱遴行积分。并没有运弱纯学计蘩学方法瓣竞灌羧据遴符处理，困魏n t r - f t - r a m a n 定量 分析技术与国外水平相比，还有很大差距。 1 2 研究目的和意义 根据以上分析，n i r f t - r a m a n 已经被应用于对多种物质的定量分析，但由于种种原因。相 眈其他实验技术。n i r - f t - r a m a n 光谱定量分析技术有定难度，这璜技术还不成熟，各方两的 工作还处于基础磺究阶段，需要进一步的探讨。很有必要进行这一方黼的理论研究。 首先，就其方法本身来说，上面已经提到裔很多伉点，僵为何在采际应用中很难，是一个值 得探讨的姆题，聪且国内关于n i r - f t - r a m a n 光谱定量分析方疆的工作远远薄后于国步卜，最j 黩几 年国外关于这方蘸的报道也很少，所以从研究n i r - f t - r a m a n 光谱定赣方法来说，进行这方面的 工作是绲商意义豹。其次，实黪王捧中大量器簧检测的样品都是水溶渡，丽n i r - f t - r a m a n 光谱 抗水的干扰性比红外光谱强，可直接对生物环境中( 水溶液体系，p h 接近中性等) 的酶，瑕白 震，核酸簿具有嫩媲活投豹物震进行研究，可提供活性样品在水辐体羝中的事富信息，所以在实 际应用中。急待解决这一定量分析技术。 本顼究正是姨这个麓度出发，巍塌最菠豹i 琏红， 傅立时交换拉曼党谱杖，扶对固体弱液体混 合物的定镀分析出发。研究n i r - f t - r a m a n 光谱定量分析的应用基础；同时利用现有的多种多元 绕谤算法瓣露嚣粒液嚣嚣耱薅系分裂遴簿分摄，对不躏鞭处理穷法、鑫静统谤算法对定量分砉野的 影响进行比较。方面为近红外傅立叶变换拉照光谱定量分析技术提供应用熬础方面的积累，另 一方瑟菊纯学计豢学算法在这一镶壤豹废拜l 捧探索性嫒究。 通过n i r - f t - r a m a n 光谱分析混合样品有两个主要的问题，一方顾，样品中多种成分的混和 会导致羹控曼兔谱静复杂性，这样，不容易获数特定缎分戆籀关穰息；男一蠢嚣，籀榘疆究豹组 分有非常相近的结构，其拉曼光谱会有重复的波段( 比如长饱和的c - h 链) ，使定量分析很困难。 遮样，毽掰谱蜂强菠蓿纛来势瓣静经葵豹定量淹谱分辑方法裁不够耩确，要憨褥到好躬定量分辑 结果，只有利用基于多变量的统计方法才能获得混合物中某一成分的较好的定量信息。 另井，应用n i r - f t - r a m a n 光谱法进行定薰分析辩，最使入感到豳难的怒分袄麴线产生豹菲 线性。由于拉曼光是散射光，与吸收光不同，不能应用l a m b e r t b e e r 定律进行定量分析a 产生非 线性的主簧原因。一是分析样舔对散射光产生了部分嗷收瓒氟：二燕激光巍滋发羹圣强发不稳定， 许旁拉曼光谱仪普遍存谯这个问题；三是来源于样品本身，在样品分析测定过程中- 上一个样品 中鬻农盐大学颈士学位论文第一章0 言 与下一个样晶存在着一定蔫异，虽然这个差异不大，但拽曼光谱对组分浓度的变化产生的结果很 敏感。这三个因索引发了拉曼强度( 级坐标) 和样黼浓度( 横坐标) 之间产生非线性现象。般 应蹋内标法帮外标法对光谱进行校正采解决j # 线性蠲蘧，还可班_ 鳟l 萋予定标内部波段鹩定量方法 秘在分接之翦对建谱进行标准纯帮多嚣散射较委( m s c ) 处理，蒜零l 用逡当黥拢学 + 曩学方法( 懿 p l s 、p c r 翘a n n 等) 搬以校正。克赧其棼线性才齄得到好的定量分桁绒果。 同时，在n i r - f t - r a m a n 定量分析中。始终器注意标准化整个光谱内的强度变化，有很多种 原因会引起误差，包括由于样品放置位置的不致，样品厚度的变化等引起的检测样品体积的变 化，都会产生非线性。所以在实验过程中，尽可能保持同等条件进行测量样品，减少测定误麓， 提高数据的准确健、可靠住和精密度。尤其是在进行固体样酩的拉曼光谱测定时更要小心，圜为 西体祥赫韵拉曼先谱会受到粉末粒度、密度豁覆混合耪静均震性静影确，馥叠乏在实验牵，尽蛩使 样菇保持粒鏖秘密度灼一致蛙。 n i p - f f - r a m a n 光谱进褥定量分攒时，光踺系统对光谱的影响报重要，如傍提裹控曼光避强 度以及忧化各种测试条件是一个非常关键的问题。对n i r f t - r a m a n 光谱仪来说，分析响应值的 校正比较简单，因为波数读出值的误差较小，一般都小于0 0 5 c m _ 1 i l “，只要对光调准线( o p t i c a l a l i g n m e n t ) 进行校正，并使宦在然个测定过程中保持不变。蒇可以得到一个准确的测定数据。 只有选择各种最佳实验参数才能得到最佳的拉蔓谱图才能褥到可靠准确的分析结莱。需要 确定的最佳参数包括：激光功率、扫耩次数、扫描遗度、仪器分辨率和仅器的最佳透光托径等。 在这些参数警中，最短著静是激光功率1 9 2 1 。掰鞋我稍设计对嗣一擞样晶分g 采霸嚣静不穰的激光 功率激发获褥秀组拉聂光谱，运避一组数撼建立驰定量分蜒模型去预测另一缒拉曼光谱，由预测 嬗与真窿值之闻触偏差来看这个区别对定量结蒙的影响蠢多大。 i 3 研究方法和内容 基本研究恿路是：使用n i r - f t - r a m a n 光谱仅获得淘体和液体混台物在宽渡数区域的拉曼光 谱胬，在获褥可靠拉蹙光谱静基础上，对露俸帮液体混合样豁势澍进行拉曼定豢分析，盛角不同 的定量分析技术黠拽璺数据避行鲑理。 所斑用豹定蹙分辑方法包括：对按曼光谱特征谱峰谶行毅癸的媸绞定燮分考莲方法：基于饯学 计爨学的线性多露校正方法圭成分分攒法( p c r ) 、偏最小二乘法( p l s ) 朝非线性的人工神经网 络( a n n ) 。比较这三种方法对样品进行定量分析时结果的区别。 同时，使用色散型拉曼光谱仪和傅立叶变换近红外( f t - n | r ) 光谱仪分别对固体混含样晶和 液体混合样品进行拉曼光谱信号采集，比较运用n i r - f t - r a m a n 光谱法与这两种光谱方法在定量 分析方面的特点。 其中，在算法方面偏重予偏最夺二乘法的研究，因为它是一耱广溅应簏置定量分析结果较好 匏多元校正方法。透过选择苓霆静强熊理缀合方法，臻究各种颈处理条传下，n i p - f t - r a m a n 光 氆定量分板结果她变化。分别比较；( 1 ) 对拉曼光谶进行乎潴及不进撑平滑处理的比较；( 2 ) 运 过多元散射校正( m u l t i v a r i a t es c a t t e rc a l i b r a t i o n ，m s c ) 进行预处理及不用m s c 进行预处理的 比较；( 3 ) 通过标准归一变缴( s t a n d a r dn o r m a lv a r i a t e 。s n v ) 进行预处理及不用s n v 进行预 处理的比较；( 4 ) 使用不同的光谱均值中心化( s p e c t r a ls c a l i n g ) 和化学值均值中心化( p r o p e r t y 5 中国教监大学豫士学位论文 第一苹； 富 s c a t i n g ) 方法斡 较；( 5 ) 采_ | ； l 不网光谱范围( s p e c t r a lr a n g e ) 魄魄铰。 我们还感兴趣的一个方面是：激光能鳋的波动对拉曼光谱定壤结果的影响。对同一批固体混 台撵晶分别疑瘸嚣 不嗣熊激光功率( 3 0 0 m w 帮4 0 0 r o w ) 激发获褥蘧缌拉曼巍谱，逶过一缀数 据建立的定凝分析模型去 ：燹测另一组拉曼光谱，由预测值与真实值之问的偏差身毛看这个区别对定 量结累戆影镝有多大。 6 第二章理论蒸础 2 ，1 拉曼光谱学基磁 印度秘谨学家c v 翘爨于1 9 2 8 年磺究苯的光散射甜发现，在散射光中除了有与入射巍撷率 相同盼谱线外，还柯与入射光频率发生位穆( 频攀增加或减少) 且强度极弱的谱线。前者是己知 的瑞乖j ( r a y l e i g h ) 散射光，称为墙乖j 效藏，两意者是新发现静后来戳发现者拉曼酌名字命名 的拉曼散射光，称为拉曼效应i l ”j 。在散射光谱中，位于瑞利线低频侧的谱线称为斯托克斯 ( s t o k e s ) 线，高频一铡的谱线称为反斯托克巅( a n t i s t o k e s ) 绒，两者统称为拉曼光谱。为藏， c v 拉曼获得了1 9 3 0 年度的诺贝尔物理学奖。 + p 反斯托克斯拉曼散射 毪瑞捌数袈 一a v 薪耗克新拉曼散射 嘲2 1 瑞利散射和拉曼散射 f i g - 2 - 1r 8 y l c i g h r md i s p e r s i o n 控曼党潜出现在可见光区或近红外区，其拉曼位咎一般戈4 0 0 0 - 2 5 e m “f 最低可以测至 1 0 c m ) ，这相当于波长为2 5 1 0 0 i n ( 最长1 0 0 0 l a m ) 的近红外到远红外的光谱频率，即拉照 效皮对应于分子转动能级或振转黥级跃逐。当用吸收光落分析珏重，这秘跃迁就如现在级外光区， 得到的是红外光谱。拉曼光谱是一种散射现象，由分子搬动或转动时的极化率变化( 即分子中电 子云变化) $ l 起的；两红9 搬谱熬吸牧瑗凝，由势子叛动或转动时嚣偶壤矩变他g l 起螅。数终党 谱和拉曼光谱同属分子光谱二者在研究分子结构及振动光谱时是相互补充的，不可缺少的两种 测试手段。 自1 9 6 9 年召开第一届国际拉曼光谱会议( i n t e r n a t i o n a lc o n f e r e n c eo nr a m a ns p e c t r o s c o p y ， 蓰嚣i c o r s ) 鞋采，到2 0 0 2 年莛疆嚣了十，敬l 蝈【”i 。褒这些图嚣控璺光谬学术会议上，充分 反映了拉曼光谱学的理论和实践技术的发展以及怯们在备个领域里的应用”q i 0 9 1 “。当前，拉楚 光游在有撬纯学、毙爨诧学、生黪铑学 l l l l 、整谯、表露佬学、寒分子l l i l 、矿携学、半导体耪瓣 1 1 3 、医学】等研究领域中都有广泛的应用，已缀成为这些学科的重要研究手段。共振拉曼光谱 测童f l l 、袭露增强拉曼敬瓣( s e r s ) 效藏1 i 6 1 和辩润分瓣拄墨竞谱技术湃等都是撞整兜诿镁域 研究的热点。 控曼光谱学成为近钱串国科学家为乏作密鬟夫贡献的少数a 个学科矮臻之一”j ，美大欹先 生在1 9 3 9 年出版的国际上第一本全面总结分子皱构拉熙光谱研究成果的专著多原予分子的振 动落和结构，表稍中国扶开始就对整齐蕴曼光谱学酶发震有霾大贡献 1 9 5 4 年，黄昆先生密 版了与玻恩台著的晶格动力学理论；在八九十年代，中国拉曼光谱举研究的论文数及水平迅 猛上升，尤菸在低续纳来辑料领域，诞生了全面最确嵇遮超菇辂控曼散射镌敲a 们称作黄一条穰塑 ? 中国农业大学硕士学位论文 第二章理论基础 的理论，发表了大量有世界一流水准的论文。 2 1 1 拉曼散射的经典理论 按照经典电磁理论，光是由互相垂直的电场e 和磁场日组成的电磁波，光的传播方向与电 呻 场e 和磁场垂直。电磁波频率，即光的频率。固定不变的光叫单色光。单色光与分子相互作 用所产生的散射现象，可以用光波的电场与分子的相互作用来解释。根据电磁辐射的经典理论， 单色入射光辐照到样品，使分子产生振荡的感生电偶极矩。这个振荡的感生电偶极矩又可视为一 个辐射源，发射出瑞利散射光和拉曼散射光。分子是由处于负电子云中且带正电荷的原子核组成， _ 因此它可以被入射光的电场e 极化而产生感生电偶极矩p 。按照一级近似，当入射光不很强时， 感生偶极矩与分子极化率以及电场强度之间的近似关系为： p = a e公式( 2 - 1 ) 式中，a 是分子的极化率，一般情况下，分子极化率是各向异性的，是原子坐标的函数。因此 需要用一个张量( 口口) ( f ，= x ，y ，z ) 表示，于是上式可以分解写成矩阵形式： 只 只 只 口pa w a 口 口口d 声 a 口a “a 口 e l e y e z 公式( 2 - 2 ) 分子总是在振动，即各原子核在其平衡位置附近振动，因而分子的极化率亦将随之发生变化，所 以极化率的各个分量可以按简正坐标展开成泰勒( t a y l o r ) 级数形式： 旷) o + 莩( 鼍尥+ 三等酝旭9 + a 洲z 哪 式中。( a o ) o 是分子在平衡位置的口值，通常是不变的，g ，9 ，人是分子振动的简正坐标一 般情况下，( 2 3 ) 式中的第三项( 二次项) 及以后的各项( 高次项) 远小于第二项( 一次项) ， 略去二次项及高次项，只考虑一个( 第k 个) 简正振动，则有 = ( ) 。+ ( 西o a # ) 。g 公式( 2 - 4 ) 假定分子的振动是简谐振动。则 g = q oc o s ( 2 n - v i + 坑) 公式( 2 5 ) 式中，姨。是简正坐标的振幅；屹是分子的简正振动频率，以是相位因子。 按照经典电磁理论，单色光的电场可以写成： e = e o c o s 2 x v o t 式中，e o 是单色光电场的振幅，是单色光的频率。将公式( 2 - 4 ) 、( 2 - 5 ) ( 假定5 k = o ) 代入 公式( 2 1 ) ( 只考虑一个分量) ，得： p = a o e o c o s 2 z v o t + 口：e o g oc o s 2 z v o t c o s 2 n v 公式( 2 6 ) = a o e o c o s 2 z v o f + 口：凰c o s 旺2 z ( v o i ；k + c o s 【2 石( y o + y t ) t b 2 公式( 2 - 6 ) 说明分子的感生偶极矩以三种频率发射辐射。第一项表示感生偶极矩以不变频率辐 射，对应于瑞利散射，第二项和第三项分别表示感生偶极矩以频率y 。一和v o + 也辐射，分别 8 中嗣农业大举硕士学幔论文第二章理论基础 对应于拉爨散射的斯托克斯线和反斯托克斯线。 2 1 2 拉璺散射的量予理论 单色光与分予相互作用所产生的散射现象遥可以用光量子( 粒子) 与分予的碰撞米解释。按 照罐子理论，颓率为静鼙色蠢可戳褪兔其有耱璧为h v o 的巍粒子，h 是普麓燕( p l a n c k ) 誊数。 当光子h 蚝作用于分子时。可能发生弹性和非弹性两种碰撞。在弹性碰撞过程中，光子与分予之 间不发生自量交换，光予仅仅改变箕运动方向，而不改变其频攀。这种弹性散射过程对应于瑞希 散射。在非弹性碰撞过程中，光予与分予之间发生能量变换。光子不仅改变其运动方向，同时还 发艇光子的一部分能量传递给分子，转变为分予的振动渡转动能，或者光子飙分子的振动或转动 得到能量。在这两种过程中，光子的频率都发生变化。光子得到能量的过程对应于频率增加的反 斯托克斯粒曼散射，光予失去能藿的过程对应予频率减小的斯托克斯j 立曼散射 拉曼敝射的凝子理论能级图如图2 _ 2 所示，处于基态巴：o 的分子受入射光子h 的激发丽跃 迁到一个豫激虚态。因为这个受激虚态避不稳定的能级( 实际上是不存在的) ，所以分子立即跃 迁劐基态曩。此过程对应子弹性碰撞，跃迂辐射的频率等于h v o ，为瑞利散射线t 处于虚态的 分子也可能跃迁到激发态e 。，此过程对应于j 弹性硪撞跃迁频率蒋于h ( v o y ) ，光子的部 分戆量传递绘分予，为拉垦教射的颠托竟叛线。类似的避程也可能发生在处于激发态嚣。的分子 受入射光予h v 。的激发蔼跃迁到受激虚杰，同样因为虑态是不稳定的而立即跃迁到激发态层， 戴过程对瘦子弹性碰撞，跃迂频率等于虮o ，为瑞刭散射线。簸于痘拳的分子也可能跃迁到基态 e 。，此过程对戚于非弹性碰攮。光子从分子的振动褥到部分能量。跃迁频率等于h ( v o + y ) t 露 e l 一 h v oh v oh ( v o + 一广一一jl h ( v o 一扛 h v o1r 土 1 ， 攮霹 鼗井碾收控璺教射瑞剥歉射 斯托克斯线 圈2 2 拉曼和瑞利散射的能级围 f i g 2 - 2r a y l c i g h r r n a n c 蝌l e v e l 控受救射 反斯托克斯线 为拉曼散射的反骺托克新线。从圈中可以看出，斯托克撕和反斯托克斯线与瑞制线之问的能量差 分剐为i l ( 一n 螽= - h v 翱h ( v o + y ) 一矗= + h v t 箕数值相等，符蟹糖反。说弱拉整诺 线对称地分布在瑞利线地两侧。同时也可以看出，h v = e 。1 一e 。o 。同红外吸收光谱的能级差 相同。 9 2 1 3 拉曼光谱图 图2 - 3 是四氯化碳散射分子散射光谱的全貌，以四氯化碳为例来说明拉曼光谱。纵坐标是散 射强度，可用任意单位表示：横坐标是拉曼位移，通常用相对于瑞利线的位移表示其数值，单位 为波数( c m 。) 。瑞利线的位置为零。位移为正数的是斯托克斯线，位移为负数的是反斯托克斯线。 由于斯托克斯线与反斯托克斯线是完全对称地分布在瑞利线的两侧，所以一般记录的拉曼光谱只 取斯托克斯线。 撞蔓怔l f 4 c l l r i 囝2 - 3 四氯化碳的拉曼光谱图 f i g2 - 3r a m a ns p e c t r ao f t c t r a c h l o r o c a r b o n 拉曼光谱和红外光谱都源于分子的振动和转动，但产生两种光谱的机理有本质的差别。红外 光谱是分子对红外光源的吸收所产生的光谱，拉曼光谱是分子对可见单色光( 在f t - 拉曼光谱中 用近红外光) 的散射所产生的光谱。 据图2 2 ，红外吸收光谱对应于h v = e 。一e 。= o 的跃迁，落在光谱的红外和近红外区。由 图2 2 可知，瑞利线和拉曼散射线是从激发虚态到振动态e 。l 和z 乙。的跃迁辐射所产生的。但拉 曼光谱的波数位移为h 一h ( v o 士y ) = ( 占d e ) 。可见同一振动模的拉曼位移和红外吸收 光谱的频率是相同的。因此，用相对于瑞利线的位移表示的拉曼光谱波数与红外吸收光谱的波数 相一致，便于两种光谱的比较。 2 2nj r - f t - 拉曼光谱技术 2 2 1nir - f t - 拉曼光谱技术的发展 传统的色散型拉曼光谱仪是以可见光波段的激光作为激发光源，虽然它可以得到比较强的拉 lo 中国农业大学硕士学位论文 第二章理论基础 曼散射，但这种可见激光同时会激发样品产生强烈的荧光，以至于拉曼光谱完全淹没在巨大的荧 光背景z 中。由于荧光的干扰，致使7 0 8 0 的有机化合物得不到理想的拉曼光谱图。激光照 射样品产生的热效应也使得相当数量的有机化合物和生物样品发生