（发育生物学专业论文）尼古丁暴露对成年昆明小鼠大脑内app和presenilin+1表达的影响.pdf

嬲 目录 一、中文摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要4 二、英文缩略语8 三、论文 前言b oo go od o doqo 9 刖吾9 资料来源与研究方法1 1 研究结果与讨论1 7 结论与建议2 3 四、本研究创新型自我评价2 4 五、参考文献2 5 六、附录 综述2 9 在学期间科研成绩4 0 致谢4 1 个人简介4 2 内a p p 和p r e s e n i l i n1 背景及目的 阿尔茨海默病( a l z h e i m e r sd i s e a s e ，a d ) 是一种进行性中枢神经系统退行 性疾病，其主要临床表现为记忆减退、认知障碍及人格改变等，常发生于老年和 老年前期。a d 的主要病理学特征为淀粉样前体蛋白( 1 3 - a m y l o i d p r e c u r s o r p r o t e i n ， a p p ) 裂解生成的淀粉样蛋白( p a m y l o i dp e p t i d e ，a p ) 沉积于脑内形成的老年斑 ( s e n i l ep l a q u e ，s p ) 、脑血管内淀粉样沉淀和大量神经原纤维缠结( n e u r o f i b r i l l a r y t a n g l e s ，n f t ) 并伴随神经元数量减少，大多学者认为a d 与脑内a b 的沉积有密 切联系，但详细发病机制仍不清楚。a d 有家族性和散发性两种，到目前为止已确 定与a d 有关的基因共有4 个，分别是载脂蛋白e ( a p o l i p o p r o t e i ne ，a p o e ) 、淀 粉样前体蛋白( a p p ) 、早老素l ( p r e s e n i l i n1 ，p s l ) 和早老素2 ( p r e s e n i l i n2 ， p s 2 ) 基因，其中a p p 和p s l 是目前认为与a b 产生直接相关的两个蛋白，a p p 是a p 产生的“原材料 ，p s l 是组成切割a p p 的丫分泌酶的核心活性成分。近年 来，有学者经临床病例及动物实验研究发现a d 患者都存在a p p 和p s l 的过表达， 并且对敲除p s l 基因的小鼠进一步研究发现其脑内丫分泌酶活性降低8 0 ，a p 含量大大降低。 目前，临床上广泛使用中枢神经系统胆碱酯酶抑制剂对a d 患者进行治疗以 延缓患者因脑中大量胆碱能神经元缺失而出现的各种症状，但这只是一种治标不 治本的疗法。所以，研究人员根据a p 在a d 发生过程中的主轴作用及a p 的产生 过程提出在对a d 的预防与治疗方面，应以干预a p 的产生为根本目的，因而提出 了包括抑制a b 的聚集及毒性，加速a 1 3 的代谢，抑制a p p 的表达，调节a p p 的 酶解通路以减少a p 形成( 如上调a 分泌酶活性，降低丫分泌酶活性) 等多种方 案，从已有的研究结果看，下调a p p 的表达和降低y 分泌酶活性是当前研究的热 点也最具治疗应用前景，但相关抑制剂的过度抑制也一直困扰着研究人员，所以 寻找适度的抑制剂成了主要的任务。 尼古丁( n i c o t i n e ) ，又名烟碱，是烟草中的主要生物碱，流行病学家发现吸 烟人群中a d 的发生率显著低于正常人群，尼古丁是降低a d 发病率的主要成份， 并且已有研究还发现尼古丁暴露可以降低a p p 转基因小鼠脑内和脑血管a b 的沉 积。因此，本研究建立在尼古丁暴露小鼠动物模型的基础之上来研究尼古丁暴露 对小鼠脑内a p p 和p s l 表达是否有抑制作用。 材料和方法 一、动物分组与尼古丁暴露小鼠模型的制备 s p f 级雄性成年昆明种小鼠6 0 只，体重3 0 - a ：5 9 ，由中国医科大学实验动物中 心提供，随机分为对照( c o n ) ，生理盐水( s a l ) 、实验一( t e s l ) ，实验二( t e s 2 ) 和实验三( t e s 3 ) 5 组，中国医科大学发育生物学教研室s p f 级动物房饲养。实 验组每天背部皮下注射生理盐水稀释的尼古丁溶液0 1 m l ( s i g m a ) ，尼古丁注射总 量为3 m g k g ，c o n 正常饲养，s a l 组每日同时注射等量生理盐水，t l 给药1 0 天， t 2 给药2 0 天，t 3 给药4 0 天，建立尼古丁暴露模型。实验各组及生理盐水组分 别在给药结束当天处死6 只取脑，无菌0 0 1 mp b s 冲洗后7 0 。c 冻存；另外6 只经 灌流后取脑，经固定、脱水、透化后石蜡包埋并连续切片。 二、检测成年昆明小鼠大脑内a p p 和p s l 表达的变化 1 、r t - p c r 方法检测小鼠大脑内a p p 和p s lm r n a 表达情况。 2 、蛋白质免疫印迹( w e s t e r n - b l o t ) 方法检测小鼠大脑内a p p 和p s l 表达情况。 3 、应用免疫组织化学染色方法检i 贝i j p s l 在小鼠大脑内分布的部位。 结果 一、r t p c r 方法检测结果 t e s l 组、t e s 2 组、t e s 3 组中p s lm r n a 表达水平与对照组相比显著降低 ( p 0 0 5 ) ；t e s l 组、t e s 2 组、t e s 3 组中a p pm r n a 的表达水平与对照组相比未见 2 显著差异。 二、w e s t e r nb l o t 方法检测结果 t e s l 组、t e s 2 组、t e s 3 组中p s i 表达水平与对照组相比明显降低( p 0 0 5 ) ； t e s l 组、t e s 2 组、t e s 3 组中a p p 的表达水平与对照组相比未见显著差异。 三、免疫组织化学染色结果 在对照组中可见大量p s i 阳性细胞分布于大脑皮层、海马齿状回内板和齿状回 多形层及两者之间的神经纤维也有成团块状的阳性物分布、海马的细胞层也可见 有呈棕褐色着色的阳性细胞分布，第三脑室周围的下丘脑弓状核、结节乳头体腹 侧核、乳头体外侧核、乳头体前核和乳头体内核也有许多阳性细胞分布；实验组 仅见第三脑室周围的下丘脑弓状核、结节乳头体腹侧核、乳头体外侧核、乳头体 前核和乳头体内核部位有p s l 阳性细胞分布。 结论 1 、尼古丁暴露对成年昆明小鼠大脑内a p p 的表达未见有影响。 2 、尼古丁暴露可以抑制成年昆明小鼠大脑皮层、海马细胞层、海马齿状回内 板和齿状回多形层及两者之间纤维区域中p s l 的表达。 3 、尼古丁暴露对第三脑室周围的下丘脑弓状核、结节乳头体腹侧核、乳头体 外侧核、乳头体前核和乳头体内核等部位p s i 的表达未见有影响。 关键词 尼古丁大脑a p pp r e s e n i l i n1 小鼠 3 英文论著摘要 t h ee f f e c to fn i c o t i n ee x p o s u r et ot h ee x p r e s s i o no f a p pa n dp r e s e n i l i n1i nt h ec e r e b r u m o fa d u l t k u n m i n gm i c e b a c k g r o u n d a n d p u r p o s e a l z h e i m e r sd i s e a s e ( a d ) i st h ep r o g r e s s i v ed e g e n e r a t i v ed i s e a s eo fc e n t r a l n e r v o u ss y s t e m ，w h o s em a i nc l i n i c a lm a n i f e s t a t i o n si sm e m o r yi m p a i r m e n t ，c o g n i t i v e i m p a i r m e n ta n dp e r s o n a l i t yc h a n g e se t c i to f t e no c c u r si nt h ep r e a g e do rd d e f ly t h e m a i np a t h o l o g i c a lf e a t u r e so fa da r et h ef o r m a t i o no ft h e s e n i l ep l a q u ew h i c hi s c o n s t i t u t e db yt h ed e p o s i t i o no f1 3 - a m y l o i dp e p t i d ei nt h eb r a i nw h i c hi sd e r i v e df r o m t h ec l e a v a g eo ft h ea m y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i n ，t h ea m y l o i dd e p o s i t i o ni nt h ec e r e b r a l v e s s e l sa n dt h ed e c r e a s eo ft h en u m b e ro fn e u r o n sw h i c h d u et ot o om u c h n e u r o f i b r i l l a r yt a n g l e sf o r m e di nt h en e u r o n s t h em e c h a n i s mo ft h ep a t h o g e n e s yi sn o t v e r yc l e a rs of a r m o s to ft h ei n v e s t i g a t o r st h i n kt h a ti ti sc o r r e l a t e dw i t ht h ed e p o s i t i o n o fa 3c l o s e l y t h e r ea r et w ok i n d sa l z h e i m e r sd i s e a s e ，f a m i l i a la n ds p o r a d i c ，t h e ya l l c o r r e l a t ew i t ht h eg e n e t i c s s of a r , w eh a v ec o n f i r m e d4g e n e sw h i c ha r ec o r r e l a t e d w i t ha d t h e ya r et h ea p o l i p o p r o t e i ne ( a p oe ) ， 3 - a m y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i n ( a p p ) ， p r e s e n i l i n i ( p s l ) a n dp r e s e n i l i n2 ( p s 2 ) g e n e sr e s p e c t i v e l y t h e r e a r ed i r e c t c o r r e l a t i o n sb e t w e e na p p , p s1a n dt h ea d a p pi st h er a wm a t e r i a lo fa 1 3 ，a n dt h ep si i st h ec o r ec o m p o n e to ft h e 丫- s e c r e t a s ew h o s em a i nf u n c t i o ni st oc u ta p pa n dg e n e r a t e t h ea p r e c e n t l y , s o m er e s e a r c h e rd e e mt h a tt h e r ei so v e r e x p r e s s i o no ft h ea p pa n d p s1i nt h ea dv i at h er e s e a r c ho ft h ec l i n i c a lc a s e sa n dt h ee x p e r i m e n t a la n i m a ls t u d y , m o r e o v e r , t h e r ei se n z y m i ca c t i v i t yd e c r e a s eo ft h e7 - s e c r e t a s eb y8 0 a n dam a g n i t u d e d e c r e a s eo f t h ea m o u n to f a l bi nt h eb r a i no f t h ep s lg e n ek n o c k - o u tm i c e s ot h e r ei sa p o p u l a rv i e ww h i c hc o n s i d e rt h a ta dm a yb er e l a t e dt ot h ea b n o r m a le x p r e s s i o no f 4 a g g r e g a t i o na n dt o x i c i t y , t os p e e du pt h em e t a b o l i s mo fa 1 3 ，t oi n h i b i tt h ee x p r e s s i o no f a p pa n dt h er e g u l a t i o no fa p p e n z y m a t i cp a t h w a y si no r d e rt or e d u c ea bf o r m a t i o n ( s u c ha sr a i s i n gt h e0 【一s e c r e t o r ya c t i v i t y , a n dr e d u c e da c t i v i t yo f7 一s e c r e t a s e ) e t c f r o m t h er e s e a r c hr e s u l t s ，r e d u c i n gt h ee x p r e s s i o no fa p pa n dr e d u c i n gy - s e c r e t a s ea c t i v i t yi s t h em o s td i r e c ta n de f f e c t i v ew a ya n da l s oi st h eh o t s p o ti nt h ec u r r e n ts t u d y , b u tt h e e x c e s s i v ei n h i b i t i o no ft h ei n h i b i t o r sh a sp e r p l e x e dr e s e a r c h e r s ，f i n d i n ga na p p r o p r i a t e i n h i b i t o r sh a v eb e c o m et h em a i nt a s k n i c o t i n ei st h em a j o ra l k a l o i di nt o b a c c o ，e p i d e m i o l o g i s t sf o u n dt h a ts m o k e r si n t h ei n c i d e n c eo fa dw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h en o r m a lp o p u l a t i o n ，a n dt h e n i c o t i n ei st h em a i nf u n c t i o n a lm a t e r i a lt or e d u c et h ei n c i d e n c eo f a d a n o t h e rs t u d y h a sf o u n dt h a tn i c o t i n ee x p o s u r ec a nr e d u c et h ea pd e p o s i t i o ni nt h eb r a i na n dc e r e b r a l v a s c u l a ri nt h ea p pt r a n s g e n i cm o u s e ，b u ti t sd e t a i lm e c h a n i s m sa r es t i l lu n c l e a r s o ， t h i ss t u d yb a s e so nt h em i c e m o d e l so fn i c o t i n ee x p o s u r et oi n v e s t i g a t ew h e t h e rt h e r ei s e f f e c to fn i c o t i n et or e d u c et h ee x p r e s s i o no f a p pa n dp s1 m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 1 a n i m a l sg r o u pa n dt h ep r e p a r a t i o no f m i c em o d e l so fn i c o t i n ee x p o s u r e 6 0s p fl e v e lm a l ea d u l tk u n m i n g m i c e ，w e i g h t3 04 - 5 9 ，s u p p l yb yt h el a b r o t o r y a n i m a lc e n t e ro fc h i n am e d i c a lu n i v e r s i t y , d i v i d e di n t oc o n t r o l ( c o n ) ，s a l i n e ( s a l ) ， e x p e r i m e n t1 ( t e s1 ) ，e x p e r i m e n t2 ( t e s 2 ) a n de x p e r i m e n t3 ( t e s 3 ) 5g r o u p sr a n d o m l y , t h e ya r eb r e e d e di nt h es p fl e v e la n i m a lb r e e d i n gr o o mo fd e p a r t m e n to f d e v e l o p m e n t a lb i o l o g y , c h i n am e d i c a lu n i v e r s i t y e x p e r i m e n t a lg r o u p sw e r ei n j e c t e d o fn i c o t i n es o l u t i o n0 1m l ( s i g m a ) ，t o t a lv o l u m ed o s ei s3 m g k gw h i c hw a sd i l u t e dw i t h n o r m a ls a l i n ed a i l y c o n t r o lw a sn o r m a l l y f e e d i n g ，s a l i n eg r o u pw e r ed a i l yi n j e c t e dt h e s a m ev o l u m eo fn o r m a ls a l i n e ，t1a d m i n i s t e r e df o r10d a y s ，t 2a d m i n i s t e r e df o r2 0 d a y sa n dt 3a d m i n i s t e r e d4 0d a y st oe s t a b l i s hm o d e l so fn i c o t i n ee x p o s u r e s i xm i c eo f t h ee x p e r i m e n t a lg r o u p sa n ds a l i n eg r o u pw e r es a c r i f i c e di nt h ee n do ft h e a d m i n i s t r a t i o nd a y , c e r e b r u m sw e r er e m o v e da n da f t e rw a s h e dw i t ht h es t e r i l e0 01m p b sa n d - 7 0 c r y o p r e s e r v a t i o n ；a n o t h e rs i xw e r e p e r f u s e dw i t h4 p a r a f o r m a l d e h y d e ，c e r e b r u mw a sr e m o v e da f t e rf i x a t i o n ，d e h y d r a t i o n ，b u r i e dw i t h p a r a f f i nt h o r o u g h l ya n dc o n s e c u t i v es l i c e s 2 d e t e c t i o nt h ee x p r e s s i o nc h a n g e so ft h ea p pa n dp s1i n k u n m i n gm i c e ( 1 ) r t - p c rt od e t e c tt h em r n ae x p r e s s i o no f a p pa n dp si ( 2 ) w e s t e r nb l o tw a su s e dt od e t e c tt h ee x p r e s s i o no f a p pa n dp s1 ( 3 ) i m m u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n gt oo b s e r v et h ee x p r e s s i o no fp s1i nm o u s e c e r e b r u md i s t r i b u t i o n r e s u l t s 1 w i t ht h em e t h o do f r t - p c r ，t h em r n ao f p s li sd e c r e a s e 0 0 5 ) i nt h et 1 ， t 2a n dt 3c o n t r a s tt ot h ec o n t r o l ，a n dt h e r ei sn od i f f e r e n c eo ft h ee x p r e s s i o no fa p p m r n a 2 t h ee x p r e s s i o no fp s1i sr e d u c t i o nq 0 0 5 ) i nt h et 1 ，t 2a n dt 3c o n t r a s tt ot h e c o n t r o l ，a n dt h e r ei sn od i f f e r e n c eo ft h ee x p r e s s i o no f a p pb yw e s t e mb l o t 3 i nt h ec o n t r o l ，t h e r ei sal o to fp s1p o s i t i v es u b s t a n c ed i s t r i b u t i n gi nt h ec o d e x ， i b1 ，p o d ga n dt h ed o m a i nb e t w e e ni b1a n dp o d gw h i c hp o s s i b l yl o c a t ei nt h en e r v e f i b e r s ，c e l ll a y e ro ft h eh i p p o c a m p u sa n dt h ed o m a i no fa r c m p , v t m ，l m ，p m da n d m li nt h ep e r i p h e r yo ft h em i r dv e n t r i c l e ；w h e r e a st h e r ei sp s 1p o s i t i v ec e l l si nt h e d o m a i no fa r c m p , v t m ，l m ，p m da n dm li nt h ep e r i p h e r yo ft h et m r dv e n t r i c l ei n t h et e s tg r o u p so n l y 6 c o n c l u s i o n 1 t h e r ei sn oe f f e c to ft h en i c o t i n ee x p o s u r et ot h ee x p r e s s i o no fa p pi nt h e c e r e b r u mo ft h ea d u l tk u n m i n gm i c e 2 t h ee f f e c to ft h ee x p o s u r eo fn i c o t i n ei n h i b i t st h ee x p r e s s i o no fp s1i nt h e c o r t e x ，i b1 ，p o d ga n dt h ed o m a i nb e t w e e ni b1a n dp o d ga n dt h ec e l ll a y e ro ft h e h i p p o c a m p u ss e l e c t i v e l y 3 t h e r ei sn oe f f e c to ft h ee x p o s u r eo fn i c o t i n et ot h ee x p r e s s i o no fp s1i nt h e d o m a i no fa r c m p ，v t m ，l m ，p m da n dm li nt h ep e r i p h e r yo ft h et h i r dv e n t r i c l e k e y w o r d s n i c o t i n e ，m o u s e ，c e r e b r u m ，p r e s e n i l i n1 ，a p p 7 英文缩略语 英文缩写英文全称中文全称 a d a l z h e i m c r sd i s e a s e阿尔茨海默病 a p p 1 3 - a m y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i n淀粉样蛋白前体蛋白 a p1 3 - a m y l o i dp e p t i d ep 淀粉样蛋白 s ps e n i l ep l a q u e老年斑 n f t n e u r o f i b r i l l a r yt a n g l e s神经原纤维缠结 a o p ea p o l i p o p r o t e i ne载脂蛋白e p s lp r e s e n i l i nl早老素1 p s 2p r e s e n i l i n2早老素2 8 性疾病，常发生于老年和老年前期。a d 的主要病理学特征为淀粉样前体蛋白 ( p - a m y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i n ，a p p ) 裂解生成的淀粉样蛋白( p a m y l o i dp e p t i d e ， a s ) 沉积脑内形成的老年斑( s e n i l ep l a q u e ，s p ) ，脑血管内淀粉样沉淀和大量神 经原纤维缠结( n e u r o f i b r i l l a r yt a n g l e s ，n f t ) 并伴随神经元数量减少【1 1 。a d 有家 族性和散发性两种，到目前为止已确定与a d 有关的基因有4 个，分别是载脂蛋 白e ( a p o e ) 、淀粉样蛋白前体( a p p ) 、早老素1 ( p r e s e n i l i n1 ) 和早老素2 ( p r e s e n i l i n 2 ) 基因，其中a p p 和p s l 是目前认为与a p 直接相关的两个蛋白，a p p 是a d 产生的“原材料”，p s l 是组成切割a p p 的y 分泌酶的核心活性成分1 2 , 3 】。近年来 经动物实验【4 ，5 1 及r t - p c r 方法【6 7 】的研究发现a d 患者都存在着a p p 和p s i 基因 的过表达，敲除编码p s l 基因的小鼠脑内丫分泌酶的活性降低约8 0 ，a p 含量 大大降低【引。 目前，临床上广泛使用中枢神经系统胆碱酯酶抑制剂对a d 患者进行治疗【9 】 以延缓a d 患者因脑内大量胆碱能神经元缺失而出现的各种症状，但这只是一种 治标不治本的疗法。研究人员根据a s 在a d 发生过程中的作用及a s 产生过程提 出，在对a d 的预防与治疗方面应该以干预a s 的产生为根本目的，因而提出了包 括抑制a s 的聚集及毒性，加速a s 的代谢，抑制a p p 的表达，调节a p p 的酶解 通路以减少a s 形成( 如上调洳分泌酶活性，降低丫分泌酶活性) 等多种方案， 从已有的研究结果看，下调a p p 的表达和降低丫- 分泌酶活性是当前研究的热点也 最具治疗应用前景【1 仉15 1 ，但y 分泌酶作为一种具有广泛作用的天冬氨酰蛋白酶被 完全抑制后必将导致严重后果，寻找适度的1 分泌酶抑制剂成了目前研究a d 防 9 治方法的主要任务之一【1 6 】。 尼古丁( n i c o t i n e ) ，又名烟碱，是烟草中的主要生物碱，流行病学家发现吸烟 人群中a d 的发病率显著低于i f 常人群【1 7 】，因为尼古丁也是一种中枢神经系统胆 碱能神经激活剂，对延缓a d 症状有一定作用【1 8 】，进一步研究发现尼古丁暴露可 以降低a p p 转基因小鼠脑内和脑血管a d 的沉积【19 1 。尼古丁暴露是否会对与a d 密切相关的a p p 和p s l 的表达产生影响尚未见报道，为此，本研究建立在尼古丁 暴露小鼠动物模型的基础之上，应用r t - p c r 、蛋白质免疫印迹和免疫组织化学染 色的方法来研究尼古丁暴露是否对小鼠大脑内a p p 和p s l 表达有抑制作用，以阐 明尼古丁在抗a d 过程中的作用机制，为将来的药物研制提供新思路。 资料来源与研究方法 一、资料来源 ( 一) 实验动物来源及分组 s p f 级雄性昆明种小鼠6 0 只，体重3 0 a ：5 9 ，由中国医科大学实验动物中心提 供，随机分为对照( c o n ) ，生理盐水( s a l ) 、实验一( t e s l ) ，实验二( t e s2 ) 和 实验三( t e s3 ) 5 组，中国医科大学发育生物学教研室s p f 级动物房饲养。 ( 二) 主要试剂 尼古丁( s i g m a ) 羊抗 i - a c t i n 多克隆抗体( s a n t ac r u z ) 兔抗p s l 多克隆抗体( 武汉博士德) ； 羊抗兔i g g 二抗，兔抗羊i g g 二抗( 北京中杉金桥) ； s a b c 免疫组化染色试剂盒( 北京中杉金桥) ； d a b 显色试剂盒( 武汉博士德) ； t r i z o l ( i v i t r o g e n ) p m s f ( s i g m a ) r t - p c r 试剂盒( p r o m e g a ) ； r t a q 酶( t a k a r a ) ； 预染蛋白m a r k e r ( p r o m e g a ) ： 1 0 d n am a r k e r ( t a k a r a ) ； e c l 试剂盒( p i e r c e ) ； 引物( 南京金斯特) 其它常规试剂购自沈阳化学试剂采购供应站。 ( 三) 主要仪器设备 小型台式离心机( s i g m a1 1 3 ) 低温高速离心机( s i g m a3 k 3 0 ) 7 2 2 可见光分光光度计 7 0 。c 超低温冰箱( s a n y o ) 电子分析天平( s a r t o r i u s ) 水平摇床( 北京) 紫外分光光度计( 上海) 光学显微镜( o l y m p u s ) 石蜡切片机( l e i c a ) 电热恒温水浴箱( 上海实验仪器厂) 垂直电泳槽( b i o r a d ) 琼脂糖凝胶电泳装置( 北京六一仪器厂) 凝胶成像分析系统( a l p h ai m a g e3 4 0 0 ) 层析冷柜( 北京六一仪器厂) 紫外分光光度计( b i o r a d ) 超纯水装置( m i l l p o r e ) 制冰机( z i g e r a ) p h 计( w t w h l f 0l a b ) 半干转印仪( b i o r a d ) 磁力搅拌器( 中国d s h k 4 ) 涡旋振荡器( v o r t e x 2 g e n e ) p c r 仪( b i o m e t r atg r a d i e n t ) 二、研究方法 0 1 m l ( 尼 盐水，t 1 验各组分 情况 颈椎脱臼法处死小鼠，在冰上迅速切开皮肤剪开头骨取出整个大脑，置于 7 0 冰箱冻存备用。 取半个鼠脑放入高压过的2 m l 离心管中，在加入l m lt r i z o l 后匀浆机中匀 浆l m i n ； 室温静置3 m i n 后加入氯仿2 0 0 1 并剧烈震荡1 5 s ； 室温静置1 0 r a i n 后，1 2 0 0 0r p m4 。c 离心15 m i n ； 吸取水相入新管中，加入5 0 0 1 异丙醇； 室温放置1 0 m i n 后，1 2 0 0 0 0 r p m4 。c 离心1 0 m i n ； 弃上清，加入7 5 7 , 醇，1 2 0 0 0 r p m4 。c 离心1 0 m i n ； 弃上清，室温干燥5 m i n ，用适量高压后d d h 2 0 溶解沉淀，紫外分光光度计 测定o d 2 6 0 值后定量分装，于7 0 。c 保存。 2 、逆转录反应 逆转录反应体系组成： 10 x r tb u f f e r 2 1 d n t pm i x t u r e ( 1 0 m m ) 1 2 5 1 r n a 酶抑制剂( 5 0 u i ) 0 5 1 随机引物 2 1 总r n a 2 g m m l 、，逆转录酶 1 2 5 山 d d h ：2 0 使总体积为2 5 1 1 2 r n a 样品和随机引物混匀后7 0 。c 反应5 m i n ，立即冰上孵育5 m i n ，再加入剩 余成份后2 5 c 保持1 0 m i n ，3 7 c 反应l h ，4 c 终止反应，2 0 保存。 3 、p c r 反应 引物序列： a p p上游5 一g c c a t g t r c t g t g g t a aa 3 下游5 - c a a c t a g g c a a c g g t a a g 3 ( 2 5 6 b p ) p s1上游5 a g c c a a g a a c g g c a g c a g c a g c a t g a c a g g c a g a g 一3 下游5 - t a c t g a a a t c a c a g c c a a g a t g a g c c a t g c 一3 ( 6 7 2 b p ) g a p d h上游5 a c c a c a g t c c a t g c c a t c a c 3 下游5 一t c c a c c a c c c t g t t g c t g t a - 3 ( 4 5 2 b p ) p c r 反应体系( 2 5 1 a i 体系) io x p c rb u f f e r 2 5 i t l d n t pm i x t u r e ( 10 m m ) 0 5 1 x l 上游引物1 1 d 下游引物 1r t l 模板( 逆转录产物) 2 山 t a q 酶o 5 1 a l 灭菌d d h 2 0 1 7 5 肛l p c r 条件：9 4 。c 预变性3 m i n ；9 4 c 变性3 0 s ，6 0 * c 退火3 0 s ，7 2 。c 延伸l m i n ， 2 9 个循环后7 2 延伸1 0 m i n ，4 c 终止。 每个反应取1 0 1 d 样品，进行1 的琼脂糖凝胶电泳，g a p d h 作为内参照。目 的基因的r t - p c r 产物电泳带亮度用b a n ds c a n 软件分析，与g a p d h 表达水平相 比较作直方图。 ( 三) w e s t e r nb l o t 检测大脑内a p p 和p r e s e n i l i n l 蛋白表达情况 1 、取材及样品蛋白质提取 颈椎脱臼法处死小鼠，剪开皮肤，打开颅骨，取出大脑，用预冷的o 0 1 mp b s 洗净后取出放入2 m l 离心管中，并加入r i p a b u f f e r ( 1 n p 4 0 ，0 5 脱氧胆酸钠， 1 3 0 1 s d s ，o 1 p m s f ) ，匀浆机匀浆l m i n ，置于冰上孵育3 0 m i n ，以1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，冰上取上清重复离心一次，分离上清。 2 、考马斯亮蓝蛋白质定量 按照每管加入考马斯亮蓝g 2 5 0 染液( o 4 9 考马斯亮兰g 2 5 0 ，l o o m l9 5 e t h a n o l ，2 0 0 m l8 5 h 3 p 0 4 加去离子水至2 0 0 0 m l ，过滤后用已知浓度的b s a 计算 标准曲线，4 c 保存备用) 3 m l 、2 山样品( 标准对照组为r i p a b u f f e r ) 、9 8 i ，l 1d d h 2 0 配置液体；在7 2 2 分光光度计上测定o d 5 9 5 值，根据测量结果以及标准曲线计算 出样品蛋白含量； 3 、灌制分离胶及浓缩胶 按常规方法灌制聚丙烯酰胺凝胶，分离胶浓度为1 1 ，浓缩胶为4 ； 4 、样品制备及电泳 按照1 0 1 x l 体系、2 0 p g 总蛋白，终浓度1 x r e d u c i n gs a m p l eb u f f e r 5 x r e d u c i n g s a m p l eb u f f e r ：0 3 1 2 m i r i s _ h c l ( p h 6 8 ) ，1 0 s d s ，2 5 1 3 - 巯基乙醇，0 2 5 溴 酚蓝，5 0 甘油 制备电泳样品，不足体积用0 0 1 mp b s 补足，混匀后短暂离心， 沸水浴中保持5 m i n ，1 0 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，微量加样器逐个加样1 0 r t l ，空白泳道 加入1 x r e d u c i n gs a m p l eb u f f e r1 0 i t l ，8 0 v 稳压电泳，当溴酚兰指示剂离开浓缩胶 后，加大电压至1 1 0 v ，根据蛋白m a r k e r 的移动情况，尽量拉长目的蛋白所在的 区域，当达到理想的分离效果后结束电泳。 5 、转膜 将电泳后的胶取出，切去无用的部分，用t r a n s f e r b u f f e r ( t r i s3 0 3 9 ，甘氨酸 1 4 4 9 ，加去离子水8 5 0 m l ，再加1 5 0 m l 甲醇) 浸泡，置摇床平衡3 0 m i n ；戴手套 裁取p v d f 膜和转膜滤纸，使之与胶的大小相同。将p v d f 膜依次浸入甲醇、0 0 1 m p b s 后，于t r a n s f e rb u f f e r 中平衡5 m i n ；在转印前用t r a n s f e rb u f f e r 浸透滤纸，在 湿转的底层电极板上依次铺上滤纸、胶、p v d f 膜、滤纸；接通电源，1 0 0 v 转印 l o o m i n ； 6 、封闭 1 4 入封 封闭 杂交 一抗 冷柜 中