（生物化学与分子生物学专业论文）拟南芥转录因子基因atmyb59功能的初步研究.pdf

藕瑟 m i t 基因家族是拟商务蘩因组中最太的转景因予超家族，这个家族参与了穰多的生物学过 瓣。奉实验室已鼗褥麓磷究菇柒表骥，m f b 象壤蕊瓣a t m y b 5 9 及篡在毅枣莽中魏弱漂基鞭 a t m y b 4 及在水稻中的两个嗣源基冈o s m y b a s l 年f 】o s m y b a s 2 ，都进行保守的可变翦接，预示 这豫个越丽可戡谯植物的生瓯发育过麟巾起羲踅嚣佟趣。 本实验室究成_ r 拟商莽和承稻的全部m y b 转录蹰子耥系统进化分析，并预测了1 0 0 个可 能舞i 寄生耱举动蘸沟蓦露。避一步分梅袭弱，a t m y b 5 9 及葵弱源蛋鑫震莛翔拥蠢懿誊一个缳 寄熬矮岛基黪w y - m d d i w ，在撼露芬转疑鬟予中，还毒缝在毅枣菸藐爨窑孛姆努裘这趋转 秉鞫予，也含宵这个保守基序，这其中辘包括先前报道过的a t m y b 2 1 、p s m y b 2 6 、a m m y b 3 0 5 和a m m y b 3 4 0 蒋转录闻子。我们藉爝簿蹲单杂交系统研究了a t m y b 5 9 和a t m y b 2 1 麓转录激 滔滔髌，发褒虽然w y - m d d i w 这个稼守戆基痔本身不蕤擞嚣壤告基麓鹃裘速，健跫它霹数搬 大的健进临避区域的转潦激活活性。 我们对a t m y b 5 9 郓a t m y b 4 8 的g u s 转基瞄撼物幼苗进行光培处蠼，精果表明，a t m y b 5 9 和a t m y b 4 8 的表达筠受戮蠢躺调节，鼹掰者在黑雅书有较高麓褒迭萋，说鹳先对遮两个基因黪 袭达具有抑制穆用，避一步详缌地对上述转基嚣幼蕊避孝亍光下与黑暗定黠处理，缎g u s 染色分 据，a t m y b 5 9 秘a t m y b 4 8 在转基因撼物幼篷予 鞠f 胚辘枣憋表达受到巍的调啦，搬程擞中 剐麓缀碱蘩表遮模式。除岛光辨，蘸毙、红毙、落艇先等不阕波长毙辩上述甄个罄蹰瓣表达键 爨毒调控律羽。a t m y b 5 9 瓣裘选还受剩搜凑莽必掰态建或斑囊调控嚣子h y 5 的搀划。出予在 a t m y b 5 9 熬寤渤予区域禽露一个典溅的霹与h y 5 黠套的使点g - b o x ，对越用醭母攀聚交瓣方法， 初步检验a t m y b 5 9 的窟渤予怒否具有矗接结合h y 5 的能力。 关键词；转录翻子，m y b 蒙旅，光形惑建成，酵母单杂交 a b s t r a c t m f bf a m i l yo f t r a n s c r i p t i o nf a c t o r sc o m p r i s e st h el a r g e s tt r a n s c r i p t i o nf a c t o rf a m i l yi n a r a b i d o p s i s ，a n dp l a y si m p o r t a n tr o l e s i nm u l t i p l ed e v e l o p m e n t a lp r o c e s s e s ap r e v i o u ss t u d y r e v e a l e dt h a tam e m b e ri nm y bg e n ef a m i l y , a t m y b 5 9 ，a n do n eo fi t s h o m o l o gi na r a b i d o p s i s ， a t m y b 4 8 ，a n dt w oh o m o l o g si nr i c e ，o s m y b a s la n do s m y b a s 2 ，u n d e r g oh i g h l yc o n s e r v e d a l t e r n a t i v es p l i c i n go fas i m i l a rp a t t e r n ，s u g g e s t i n gt h a tt h e ym a yp l a yc o n s e r v e da n di m p o r t a n tr o l e s i np l a n t s o u rl a b o r a t o r yh a ss y s t e m a t i c a l l ya n a l y z e dt h ep h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i po fa l lt h em y b p r o t e i n s i na r a b i d o p s i sa n dr i c e ，a n di d e n t i f i e dn e a r l y1 0 0p u t a t i v ef u n c t i o n a lm o t i f s f u r t h e rs t u d ys u g g e s t e d t h a to n em o t i f , w y - m d d i w , i ss h a r e db ya t m y b 5 9a n di t sh o m o l o g s a m o n gt h et r a n s c r i p t i o n f a c t o r si na r a b i d o p s i s ，t h e r ei sag r o u po ff l o w e r - s p e c i f i cm y bt r a n s c r i p t i o nf a c t o r s ，i n c l u d i n gt h e p r e v i o u s l yr e p o r t e da t m y b 2 1 ，p s m y b 2 6 ，a m m y b 3 0 5a n da m m y b 3 4 0 ，a l s os h a r e st h i sm o t i f w e u t i l i z e dt h ey e a s to n eh y b r i da s s a yt os t u d yt h eu a n s - a c t i v a t i o na c t i v i t yo fa t m y b 5 9a n da t m y b 2 1 ， a n df o u n dt h a tt h ec o n s e r v e dm o t i fw y - m d d i wa l o n ec o u l dn o ta c t i v a t et h et r a n s c r i p t i o no ft h e r e p o r t e rg e n e ，h o w e v e r , i te n h a n c e st h et r a n s a c t i v a t i o na c t i v i t yo ft h en e i g h b o rr e g i o n sg r e a t l y w ea l s ou t i l i z e dl i g h ts h i f te x p e r i m e n to ft h ep r o m o t e r - g u st r a n s g e n i cp l a n t so fa t m y b 5 9 和 a t m y b 4 8 ，a n df o u n dt h a tt h ee x p r e s s i o n so f a t m y b 5 9a n da t m y b 4 8a r er e g u l a t e db yl i g h t ，a n da r e p r e f e r e n t i a l l ye x p r e s s e di nd a r k n e s s ，t h i sr e s u l ts u g g e s t e dt h a tt h e s et w og e n e sa r ea l li n h i b i t e db y l i g h t m o r ed e t a i l e ds h i f te x p e r i m e n t sr e v e a l e dt h a tt h e i re x p r e s s i o n si nc o t y l e d o na n dh y p o c o t y la n r e g u l a t e db yd i f f e r e n tl i g h tq u a l i t y , b u tt h e ys h o w e dac o n s t i t u t i v ee x p r e s s i o np a t t e r ni nr o o t b e s i d e s w h i t el i g h t ，t h et w og e n e sm e n t i o n e da l s oc o n t r o l l e db yb l u el i g h t 、r e dl i g h t 、f a r r e dl i g h t e x p r e s s i o no fa t m y b 5 9i s a l s or e p r e s s e db yh y 5 ，ap o s i t i v et r a n s c r i p t i o nf a c t o ri n v o l v e di n p h o t o m o r p h o g e n e s i s t h e r ei s a t y p i c a lh y 5b i n d i n gs i t e ，g - b o x ，i nt h ep r o m o t e rr e # o no f a t m y b 5 9 w et r i e dt h ey e a s to n eh y b r i da s s a yt od e t e c tw h e t h e rh y 5d i r e c t l yb i n dt h ep r o m o t e ro f a t m v b 5 9 k e y w o r d s ：t r a n s c r i p t i o n a lf a c t o r s ，m y bf a m i l y , p h o t o m o r p h o g e n e s i s ，y e a s to n eh y b r i d 独创性声明 y 9 3 8 3 2 8 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 王岩 时间： 加f 年，月夕一h 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 土岩 时日j ： 讪一舌年弦j 扪 导师签名 时间岛年。l 月嘉n 中国农业人学硕士学位论文 研究背景及文献综述 第一章研究背景及文献综述 1 1 植物的转录因子 1 1 1 转录因子的概念 转录冈子( t r a n s c r i p t i o nf a c t o r ，t f ) 也称反式作j 刳冈子，是一类j “泛存在丁生物体内并且 可以特异性地识别d n a 序列的蛋白质。转录因子作用于目的基因启动子上的特定结合位点，从而 调控目的基因的表达。这种调控既可以是激活调控，也可以是抑制调控【】。 拟南芥有1 5 0 0 余个转录因子基因，约占基因总数的5 9 ，而这些转录因子中约有4 5 是植 物所特有的。在生物体的发育生长过程中，如果一种基因可以和所有细胞种类中的转录因子相结 合，那么这种基冈便能够在所有种类的细胞中呈非特异性地表达；如果一种基因只能在某一种特 定类型的细胞中与转录因子结合，那么该基因也就只能在此种类的细胞中特异性地表达。基冈表 达在转录水平上所受到的调控影响和控制了细胞或者生物体很多方面的生物学过程，比如代谢和 生理的平衡、细胞周期的进程、发育以及对环境的应答。 1 1 2 转录因子的结构 根据蛋白质的结构来划分，转录因子的结构一般是i 妇d n a 结合区、转录调控区( 包括激活区 或抑制区1 、核定位信号以及寡聚化位点这4 个功能区域组成。转录因子通过这些功能区域与启 动子顺式元件作用或与其他转录因子的功能区域相互作用从而调控目的基因的表达“。 d n a 结合区 d n a 结合区( d n a - b i n d i n gd o m a m ) 是指转录因子识别d n a 顺式作用元件并与这个作用元 件相互结合的一段氨基酸序列。植物的转录因子中典型的d n a 结合区有m y b 结构域、b z i p 结 构域、锌指结构域、m a d s 结构域、m y c 结构域、h o m e o 结构域以及a f 2 e r e b p 结构域等。 典型的转录因子一般只有个d n a 结合区，但有的转录因子如拟南芥以r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 和水 稻( o r y z as a t i v a ) 的g t 2 ，拟南芥的a p 2 等均含有两个d n a 结合区。也有少数转录因子不含d n a 结合区。转录因子d n a 结合区的氨基酸序列的保守性决定了它们与顺式作用元件识别及结台的 特异性，相同类型的转录困子d n a 结合区的氨基酸序列是比较保守的。比较常见的d n a 结合结 构域有如r 几种类型： 螺旋转角螺旋结构( h e l i x t u r n h e l i x ) ：e p h t h 结构。螺旋一转角一螺旋是最早发现的d n a 识 别序列。通过对一些具有h t h 蛋白结构的研究，人们发现h t h 结构通常具有以卜- 特征：第一个螺 旋位丁大沟( m a j o r g r o o v e ) 之上，其n 端靠近d n a 骨架；第二个螺旋嵌入大沟之内，其n 端与d n a 骨架距离较近。一般说来，第二个螺旋特异地与要识别的d n a 核心序列相互作用。其中，m y b 转录因子即具有h t h 基序，每个m y b 重复( m y br e p e a t ) 都可以形成一个螺旋一转角一螺旋结 构。 锌指结构( z i n cf i n g e q ：最早是在研究非洲爪蟾( x e n o p u s ) 转- 录n - f r f a i i i 时被发现的一类重 中国农业火学硕士学位论文 研究背景及文献综述 要的蚩白d n a 相互作用的结构。根据所含、r 胱氨酸和组氨酸的数目及位置可将含锌指结构域的 转录冈子分为c 2 h 2 ，c 3 h ，c 2 c 2 ，c 3 h c 4 ，c 2 h c 55 弧类，其中最为常见的一类是c 2 h 2 蛋自。随 着拟南芥基因组的测序完成，人们预测，拟南芥至少含有1 0 0 个以上的c 2 h 2 类型的蛋向p 】。植物 中存在数量繁多的锌指蛋白，但是这些蛋白的功能目前大多是术知的。 碱性亮氨酸拉链( b a s i c l e u c i n ez i p p e o ：h i b z i p 结构。此类蛋白每隔6 个氨基酸就有个亮氨 酸残基山现，使第7 个亮氨酸残基都在螺旋的同一方向出现。由于这类蛋白质都以二聚体的形式 与d n a 相结合，两个蛋白质a 螺旋上的亮氨酸一侧是形成拉链型聚体的基础。碱性亮氨酸拉链 一般由6 0 培0 个氮基酸残基组成，含有两个不同的结构域：碱性医平亮氨酸拉链结构域。亮氨 并不直接结台d n a ，只有肽链氨基端2 0 3 0 个富含碱性氨基酸的区域才与d n a 结合。 碱性螺旋环螺旋结构( b a s i ch e l i x - l o o p h e l i x ) ：即b h u i 结构。碱性螺旋环螺旋蛋白与b z i p 蛋白的结构有些类似，即都含有一个碱性结构域，现在普遍认为，此碱性结构域是与d n a 结合 的区域；而h l h 结构域同亮氨酸拉链一样，只是负责蛋白质的二聚化。b h l h 类蛋白只有形成同 源二聚体或异源二聚体时，才可以前i d n a 结合。 同源域( h o m e o d o m a i n ) 蛋白：此结构域编码6 0 个保守的氨基酸序列片段。它，泛存在于真 核生物基因组中，由丁最甲j 从果蝇h o m e o t i cl o c i ( 该遗传位点的基因产物决定了躯体发育) 中克 隆得剑而命名。许多含有同源域的蛋白具有转录调控的功能。同源域很可能参与彤成d n a 结合 区。 转录调控区 转录调控区包括转录激活区( t r a n s c r i p t i o na c t i v a t i o nd o m a i n ) 和转录抑制区( t r a n s c r i p t i o n r e p r e s s i o nd o m a i n ) 两种，与此相对应的转录因子的功能也是有差异的。 近年来，高等植物转录因子的转录激活区已经被大量研究，结果表明，典型的植物转录激活区 般具有这些特征，如富含酸性氨基酸脯氨酸或者谷氨酰胺等，g b f ( g - b o xb i n d i n gf a c t o r ) 转录因 子都含有保守的g c b ( g b f - c o n s e r v e db o x ) 结构域。但是，转录激活区如何激活目的基因的表达， 目前的研究结果还不能够清楚解释。 相对于转录激活子而言，转录抑制子研究相对较少。最早鉴定的转录抑制子是果蝇的k r u p p e l f l ( r ) 。是一个锌指蛋白，含有四个串联的锌指基序，它的缺失会导致胚的发育异常。随着研究 的深入，人们在植物中鉴定到了更多的转录抑制因子。如菜豆b z i p 类的r o m 2 转录因子能与 d l e c 2 的增强子结合，抑伟 i p v a l f 对转录的激活。一旦去除r o m 2 的n 端b z i p 结构域，r o m 2 就失去对p v a l f 激活活性的抑制能力。转录因子抑制区的作用方式可能有：( 1 ) 与启动予的相应 位点结合后，从而阻止该启动子与其他转录因子的结合；( 2 ) 通过对其他转录因子的抑制作用而 阻j ：转录；( 3 ) 通过某种方式改变d n a 的高级结构使转录过程不能进行。 寡聚化位点 寡聚化位点( o l i g o m e r i z a t i o ns i t e ) 是指不同转录因子之间发生相互作用的功能区域。它们的氨 基酸序列般都比较保守，大多与d n a 结合区相连并形成一定的空间构象，女, b z i p 类转录因子 的寡聚化区包括1 个拉链结构，而b h l h 型转录因子含有螺旋一环一螺旋结构，m a d s 转录因子的 寡聚化位点则含有两个a 螺旋和两个b 折叠，等等。 2 中国农业人学硕士学位论文 研究背景及文献综述 核定位信号区 核定位信号k ( n u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i g n a l ，n l s ) 是负责转录因子由细胞质到细胞核转运的一 段氨基酸序列，转录因子进入细胞核的过程受该区域控制。n l s 的氨基酸序列并不是十分保守， 但是典型的n l s 应具有一些明显的特征：首先，富含碱性氨基酸a r g y l l l y s ，而不含酸性氨基酸a s p 利g l u 以及一些体积较大的残基如p h e 、 r y r 和t r p ；而且，一般来说，n l s 需要暴露于蛋向质外部， 所以n l s 内也不存在疏水性的氨基酸残基；其次，在n l s 的侧翼常常存在酸性氨基酸和p h e 或g l y ； 最后，n l s 与位置无关，相似的n l s 可以存在于不同蛋白质的不同区域。不过，也有一些入核的 蚩向并不含有典型i 舟n l s ，这可能是它们含有一些特殊的n l s 域者通过与其它含有n l s 的蛋向质 形成复合体而被携带入核。此外，不同转录因子的n l s 序列的数日有所不同，一个转录因子呵以 含有至数个n l s 功能区，它们不规则的分布在转录因子中，有的n l s 序列还存在于其他的功能 阪中。 1 1 3 拟南芥和水稻中的转录因子 拟南芥和水稻全基因组测序完成厉，人们开始在基因组水平研究这两种模式植物的转录因 子。摄近的研究结果表明，在拟南芥中己发现1 5 1 0 个转录因子，而在水稻中共发现1 6 1 1 个转录因 子【4 ，5 】。根据转录因子d n a 结合区的特点，转录因子又可分为不同的家族。现在的研究结果表明， 在拟南芥中存在至少4 5 个转录因子家族，而在水稻中则有3 7 个转录冈子家族n 】。有些转录因子 家族是植物所特异的，比如a p 2 e r e b p ，n a c ，w r k y ，a r f s ，a u x i a a 4 1 与动物和酵母相 比，有些转录网子家族在植物中进行了显著的扩增，比如m y b 家族和m a d s 家族”j 。 其中，拟南芥转录因子中最大的三个家族分别是m y b ( r 1 ) r 2 r 3 、a p 2 e r e b p ( a p e t a l a 2 e t h y l e n er e s p o n s i v ee l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n ) 和b h l hm a s i ch e l i x 1 0 0 p h e l i x ) 家族。而 m y b 转录因子家族是拟南芥基因组中数量最多的转录因子超家族1 4 j 。 3 中国农业大学硕士学位论文 研究背景及文献综述 表l1 拟南芥和水稻中转录因子的数目h f a m i l y r i c e a r a b i d o p s i s 8 f a m i l y r i c e a x a b i d o p s i s m y b 1 8 2 1 8 9 ( 1 9 0 ) t u b 1 41 1f 1 1 ) b h l h1 8 0 1 6 4 ( 1 3 9 ) n i n 1 i k e131 4f 1 5 1 a p 2 e r f1 6 1 1 4 6 ( 1 4 4 )g r f ( c 3 h t y p e2 ) 1 2 9f 1 6 ) n a c1 4 9 1 0 5 ( 1 0 9 ) c p p1 1 8 f 8 1 w r k y1 0 0 7 2 ( 7 2 ) z f - h b1 0 1 4 ( 1 钔 b z i p9 47 6f 8 1 )a l f i n - l i k e 1 07f 7 ) h b8 4 9 0 ( 8 9 )c 3 h - t y p e l 9 1 1 ( 1 7 ) c 2 c 28 0 8 7 ( 1 0 4 ) e 2 f p 9 8 ( 8 ) m a d s7 71 0 6f 8 2 )r a v - i i k e97 c 2 h 2f e p t o7 76 60 0 5 )a b l 3 v p l7 6 ( 1 4 ) g a r p5 6 5 3 ( 5 6 ) e 1 l7 6 f 6 ) g r a s5 43 20 2 )n t l i m l 4 1 k e6 6 c c a p 汀3 73 6 f 3 6 1s r s51 0 t r i h e l i x3 2 3 8 ( 2 8 ) s 1 f a 1 i k e23 a r f2 92 3 佗3 ) p b f - 2 4 i k e 23 h s f2 72 3 ( 2 6 ) h r t - l i k e12 t c p2 4 2 3 f 2 5 1 l f y l1 r e m2 33 8n z 五，s p l0l s b p1 7 1 6 ( 1 6 1 t o t a l1 6 1 11 5 1 0 注：3 括号内的数字表示r i e c h m a n ne ta 1 2 0 0 0 ) 1 1 1 发现的各家族转录因子的数目 1 2 植物中的m y b 转录因子家族 1 2 1m y b 家族的概况与发展 第一个被确定的m y b 基因是原癌基因v - m y b ，这是从鸟类成髓细胞性白血病病毒( a v i a n m y e l o b l a s t o s i sv i r u s ，a m v ) 中分离出来的1 6 j 。随后，研究发现，在许多脊椎动物中存在着三个与 v 胁6 相关的基因：c - m y b ，a - m y b 和b - m y b ，它们参与调控细胞的增殖、分化以及凋亡过程。 人们也在昆虫、酵母和粘液菌中发现了类似的基因p 1 。而后随着研究的深入，许多其它真核生物 尤其是植物的m y b 基因得到了克隆。玉米中的a 基因是植物中最早被克隆的m 瞪基因，其编码 一个与哺乳动物转录因子c m y b 结构相似的转录因子，参与调控花青素苷的生物合成过程。这是 人们在植物中发现的第一个m 阳基因j 。 1 2 2m y b 家族的结构特征 m y b 家族的蛋白在结构上的共同特征是，至少具有一段结构保守的d n a 结合域一m y b 结构 域。这个结构域由一般由约5 1 5 3 个氨基酸组成，含有一些不完整的重复，并可结合特异的d n a a 中国农业大学坝士学位论文 研究背景及文献综述 序列。通常，m y b 结构域中每一段不完整重复序列都可形成螺旋转角螺旋的结构，用以嵌入目 标基因d n a x y 螺旋结构的大沟中 9 】。此家族晟具代表性的特征是它具有互个在空间上规则排列的 色氨酸残基( w ) ，参与空间结构中疏水核心的形成。在动物转录冈子c m y b 中，m y b 结构域通常 由三个重复序j u r l 、r 2 乖i r 3 组成【”。 对于c - m y b 结构的研究表明：r 2 和r 3 保守匿均能与d n a 序列特异性结合，其中，每一段重 复序列的c 端的螺旋在与d n a 结合时可被特异性地识别。重复序列中有规则间隔排列的色氨酸 ( 每个重复序列中有三个) 参与形成疏水簇，协助蛋白与d n a 的特异性结合。一般来说，r 3 区 域中的可识别螺旋结构能够与目的序列的核心部分发生特异性的相h 作刚，而r 2 区域只能与日 的序列的核心周围的核营酸发生一种较弱的相互作用。但是只有一个m y b 结构域的m y b 蛋白结 合d n a 的方式与前者不同，通过对人类端粒蛋白h t r f l 的研究发现，该蛋白c 端的螺旋较k = ，其 与d n a 结合的机制更类似于同源域蛋白和二聚体。 1 2 3 植物中m y b 蛋白的分类 根据m y b 结构域中m y b 重复序列的数目，植物m y b 蛋白一般分为三类：只具有一个重复序 列的m y b 相关的转录因子，r 2 r 3m y b 转录因子，以及具有三个重复序列的r 1 r 2 r 3m y b 转录 因子p ，1 “。 一、m y b 相关的转录因子 尽管近年来人们对r 2 r 3 类的m y b 转录因子进行了系统的分类和研究，但是对m y b 相关的转 录因子的研究却很缺乏。人们对m y b 相关蛋白的每一个重复序列进行分析后，叉对m y b 相关的 转录因子进行了系统的分类( 9 l 。结果发现含有两个不相连m y b 重复( 即所i w r - r 类m y b ) 的第一 个m y b 重复与1 b o xl i k e 进化枝在一起，第二个m y b 重复与c c a l - l i k e 进化枝在一起。所以人们将 m y b 相关的蛋白分为5 个亚家族，其中4 个_ 砸家族分别以研究过的基因名命名：c c a l 1 i k e ， c p c d i k e ， i - b o xl i k e ，t b p l i k e ，第5 个亚家族就是r r 。 二、r 2 r 3m y b 转录因子 因为此类转录因子的两个m y b 重复序列与动物的c - m y b e e 的第二和第三个重复序列具有较 高的相似性，以此命名为r 2 r 3m y b 转录因子。由r 2 和r 3 组成的m y b 结构域通常位于蛋白的n 端。这个结构域的r 2 重复区一般由5 3 个氨基酸残基组成，而i l 3 重复区一般由5 1 个氨基酸残基组 成。r 2 r 3m y b 转录因子尽管m y bd n a 结合结构域非常保守，但是它们的c 端序列差异很大。 到目前为止，人们只在植物中发现t r 2 r 3m y b 转录因子，其中，在拟南芥中已经发现1 2 5 个r 2 r 3m y b 转录因子( 系统命名为灿m y b 0 a t m y b l 2 4 ) 【1 0 l ，在水稻中已发现1 0 9 个r 2 r 3m y b 转录因子巴而在玉米中发现有超过8 0 个r 2 r 3m y b 转录因子【1 2 】。 r 2 r 3m y b 基冈在植物中是数目最多、研究最为广泛和深入的一类m y b 基因。人们广泛而 且深入地研究t r 2 r 3 类m y b 基因的功能。作为植物中庞人的转录因子家族，m y b 蛋白担负着多 种重要的功能，并且涉及广泛。 1 、参与植物次生代谢的调节 5 中国农业大学硕十学位论文 研究背景及文献综述 植物中主要存在着三条次生代谢途径，现在研究比较集中的是参与苯丙烷类代谢途径的 r 2 r 3m y b 蛋白。拟南芥中主要存在三种类黄酮物质，即花青素( a n t h o c y a n i n ) 、黄酮醇( f l a v o n o l s l 和原花色素( p r o a n t h o c y a n i d i n s ) ，这三种类黄酮物质直接决定着植物颜色的形成羊l | 改变，它们也是 苯丙烷类物质代谢途径的主要终产物。苯丙烷类代日t 途径从苯丙氨酸开始，先经过几个共同步骤， 包括开始时苯丙氨酸解氨酶p h e n y l a l a n i n ea m m o n i a - l y a s e ，p a l ) 催化苯丙氨酸形成肉桂酸以及儿 步反应后的产物在查尔酮合酶( c h s ，c h a l c o n es y n t h a s e ) 的催化f 生成成查尔酮，然屙分成三个 分支途径，最后分别生成上述三种类黄酮物质。很多研究表明植物中种不同的类黄酮终产物的 特异性积累是由不同类别的调节因子严格控制的，而m y b 家族的转录因子在其中起着重要的作 用。 最早得到鉴定的植物m y b 基因c 1 1 t 1 参与调控花青素的合成，它直接与一些合成途径的酶类 基因的启动子结合，激活花青素合成途径l l 。拟南芥中，许多参与苯丙烷类代谢途径的m y b 基 因得到了鉴定。如1 r 2 1 1 4 、p a p i i p a p 2 ”1 等，这些基因分别在代谢途径中的不同位置影响下游 的合成酶类，调控色素的合成。 2 、参与多种防御机制 另外，m y b 家族蛋白还参与多种防御机制，以应对各种生物胁迫( 如各种病原体和昆虫的 侵害等) 或者非生物胁迫( 如干旱、高盐或低氧环境等) 的影响，保护生物体。例如，当病原茵 侵染植物时，受病原菌侵染的植物细胞会快速发生程序性死亡而形成枯斑，这种反应称为过敏反 应( h y p e r s e n s i t i v er e s p o n s e ，h r ) 。植物通过过敏反应能够有效的将病原菌限制在病菌侵染点， 从而避免了病原菌在植物体内的繁殖和扩散侵害。同时，一些h r 或者抗病相关基因的表达模式 也发生改变 ”1 。其中，a t m y b 3 0 作为超敏反应过程中的一个正调控阏子，发挥着重要的作用f 1 6 1 。 过量表达a t m y b 3 0 可使植株产生类似h r 的发应，增强对病原菌的抵抗能力；反之，降低a t m y b 3 0 的表达则降低h r 细胞死亡的程度。 3 、参与植物激素的信号转导途径 植物激素是调节植物生命活动所必不可少的生物活性物质，研究植物对这些激素的应答反应 及植物体内相关的信号传导途径，一直是植物生理和分子生物学研究的热点。早在1 9 9 8 年k r a n z 等人用乙烯、吲哚乙酸、脱落酸、赤霉素g a 3 h 细胞分裂素分别处理拟南芥，通过“反向n o r t h e r n 印迹”的方法研究了拟南芥中7 4 个r 2 r 3m y b 基因的表达情况，发现每种激素至少能明显诱导数 个r 2 r 3m y b 基因的表达【1 7 】。这些结果初步表明拟南芥中的r 2 r 3m y b 转录因子可能广泛地参与 对植物激素的麻答。这一点在这几年的进展中得到了验证，以f 以脱落酸和赤霉素为例作一个介 绍。 脱落酸a b a 是五类植物激素中唯一的一类植物生长发育抑制物质，可以明显的提高植物的抗 逆性。它是另外一种重要的植物内源激素，调控许多重要的植物生长发育过程，如种子贮藏蛋白 的台成、种子休眠的维持、阻止植物由营养生长到生殖生长的转换，等等同时a b a 介导了多种生 理过程，其中包括对干旱和盐胁迫的应答过程。a b e 和u r a o 等人己初步阐明a t m y b 2 协i i j a t m y c 2 是作为转录激活子参与a b a 的信号转导【1 8 i 。另外，研究发现，a b a 处理拟南芥后也能迅速诱导 a t m y b l 0 2 的表达| ：1 9 1 ，表明a t m y b l 0 2 有可能参与a b a 信号的转导。 6 中周农业大学硕上学位论文 研究背景及文献综述 赤霉素的生理作用包括促进某些植物开花、诱发大麦糊粉层形成a 淀粉酶( 这种生理作用已 被应用到啤酒生产中) 、促进营养生艮等。g u b l e r 等人在大麦g a m y b 的研究中作出了突出的贡献。 1 9 9 5 年g u b l e r 等人通过研究人麦a 淀粉酶基冈启动子从大麦糊粉c d n a 文库中克隆得到一个受 g a 调节的r 2 r 3m y b 基因，称之为h v g a m y b ”j 。在大麦糊粉层细胞中h v g a m y b 单独作用就 可以在转录水平上激活a 淀粉酶基因的表达。过量表达g a m y b ，可以激活下游a 淀粉酶基因的 高效表达，丽如果去除g a m y b 的c 端激活域( 仅仅具有n 端的m y b 结构域) ，g a m y b 则失去激 活能力，同时阻断g a 对a 淀粉酶基冈的诱导作用。这充分说明，g a m y b 在g a 对a 淀粉酶基因 的转录调控中是个中心环节口”。 4 、m y b 基因还可以控制细胞的形态建成，影响细胞的形状和分化 植物m y b 基因在控制表皮细胞的模式建成( e p i d e r m a lc e l lp a t t e r n i n g ) 方面发挥着重要的作 用，这方面的研究取得了很大的成果，而这些成果主要归功于对拟南芥根毛( r o o th a i r ) 和表皮毛 ( t r i c h o m e ) 这两个相似系统的研究。通过研究人们发现，这两个分别位于地下和地上的调控系 统居然使用了基本相同的调控机制。 表1 2 y l j 出了根毛和表皮毛细胞模式建成中涉及的主要基冈。其中涉及的m y b 基因有六个： w e r , g l l ，a t m y b 2 3 , t r y , c p c , i a t m y b l 2 。前三个基因处丁进化树的同一分支，属t r 2 r 3 类 m y b 基因i l o l 后三个属于单重复序列的m y b 基阅。 表卜2 表皮毛和根毛模式建成中涉及的主要基因 基因名称基冈产物功能 h e r m y b 蛋白 抑制根部成毛细胞( h - c e l l ) 的形态发生【2 2 】 g l j m y b 蛋白促进表皮毛形态发生【矧 a t m y b 2 3 m y b 蛋白与g l i 功能部分重叠口4 】 z r l ， m y b 蛋白抑制表皮毛成簇发生，胞间抑制信号【2 5 i c p c m y b 蛋白抑制表皮毛发生，促进根毛发生，胞间抑制信号 【2 卅 一n n 毋三2m y b 蛋自负调节g i 2 表达，抑制表皮毛形成【2 6 】 g l 2h o m e o d o m a i n 蛋白促进表皮毛形成，抑制根毛形成 g 工3 b h l h m y c 蛋白促进表皮毛发生吲 珊 w d - 4 0r e p e a t 蛋白促进表皮毛发生，抑制根毛发生【趔 7 图卜1 拟南芥根毛和囊皮毛细胞横式建成的调控攮型 该图形象的描绘了拟南芥根毛和表皮毛细胞模式建成的分子机制。左列和右列的示意图分别描述了根毛和表皮毛 表皮细胞的分化过程，而上排示意图显示的是具有相同发育潜能的细胞发育阶段，下排示意图显示的是已经分化 为特定细胞的发育阶段。 共有两条途径参与了这两个调控过程：一条途径涉及有g l i w e r , g l 3 f o h l i - lt t g 和g l 2 其中，这条途径中的g l 2 具有两种功能，它在根部形成无毛细胞，在叶部和茎部则形成表皮毛： 另一条途径涉及c p c ，r r y ，它和上条途径相互拮抗，在根部形成有毛细胞，在叶部和茎部形成无 毛细胞。细胞最终产生正确的建成模式，就是这两条调控途径共同作用的结果。值得注意的问题 有三点。第一，w e r g l l ( 两个m y b 蛋白) 、g l 3 b h l h ( 两+ b h l h 蛋白) 和t t g ( w d - 4 0r e p e a t 蛋白1 形成复合体调控g l 2 的表达。而这三类蛋白形成复合体行使调控功能的例子已经越来越多， 在上节次生代谢部分的介绍中也已提到这样的组合调控，提示这种组合调控的机制可能是转录因 子参与基因表达调控的重要方式。第二，根毛细胞的形成完全依赖于位置效应，即只有位于皮层 细胞之间的根部表皮细胞才能分化为根毛细胞，而叶部和茎部的表皮毛分布就不依赖内层细胞的 位置。第三，m y b f o h l h f r t g 复合体指导c p c ，n c y 的产生，而c p c ，r r y 是负调节因子，它们抑 制i 隘近细胞m y b f o h l h t t g j 芝合体的产生，这是一个具有反馈作用的平行抑制模型田j 。 l e e 和s c h i e f e l b e i n ( 2 0 0 1 ) 州做了一个很有趣的实验。他们发现分别调控根毛和表皮毛发育 的m y b 基因w e r 和g l l 在功能上是冗余的，可以相互替换的。它们在植物发育过程中发挥不同 的功能是因为它们的顺式调控元件不同。这个实验结果对于研究m y b 基因家族的进化具有重要 价值，也证明在进化过程中，单单通过顺式作用元件的修饰，就可以获得新的功能。 现在人们已经清楚根毛和表皮毛模式建成的调控机制是相同的，但是人们还不清楚它们的上 游调节因子和下游效应因子是否也相同。而且，人们对i g + 调控过程中的一些重要细节还不清楚， 比如c p c t r y 到底是如何起作用的，它们本身运动到邻近细胞还是激活了一个跨细胞的信号转导 途径? 又比如，位置信号到底是什么? 还有，人们还不清楚在拟南芥发育过程中这个调控机制到 8 中国农业大学烦士学位论文 研究背景及文献综述 底使用的有多j l 泛。因为人们还发现拟南芥下胚轴的气孔分布也使用相同的调控机制【2 9 】。 5 、调控植物的昼夜节律 日出日落，昼夜轮同。白天和夜晚有规律的转变是地球上的任何牛物体都要面临的环境变化。 在植物的生命周期中，光的变化也许是对植物的生长和发育展有影响的因素之一。为了感知光的 变化，植物产生了多个光受体( p h o t o r e n e p t o r ) ，包括植物光敏色素( p h y t o c h r o m e ) 和隐花色素 ( c r y p t o c h r o m e ) 。 除了监测光环境的变化外，植物还必须参与光暗周划的变化。冈此，植物必须充分利刚它们 内源的生物钟( c i r c a d i a nc l o c k ) ，以便适时的产生分子和生理应答。人们已经分离到了多个参与 生物钟的组分，包括t o c l ，c c a l ，l h y ；而参与调控生物节律的m y b 基因有c c a l 、l h y 秉i e p r l ， 它们都是只含单个重复序列的m y b 基因。 人f j 很早就发现t c c a l 和工m ，的功能d o 3 1 ，而隙j 是前不久才报道9 “。这三个基因的m y b 结构域相似性达到7 0 。c c 4 j 和叫是早期的光敏色素应答基因，c c a l 可以结合到l 曲基因的 启动子区，调节l h c b 基因的表达。人们随后就证明这两个序列高度相似的基冈都是中央振荡器的 组分，在调节昼夜节律方面的功能是部分冗余的i 3 3 j 。叫盯和c 翻j 的表达量在黎明达到峰值而 与之相反，i d c l 的表达量在黄昏达到峰值，并且l h y 和c c a l 可以直接结合n t o c l 的启动子上， 调节t o c 的表达。t o c l 对= j = l i t y 和c c a l 基因的表达也起正调控作用，促进这两个基因的表达 量在黎明达到峰值。这种互惠的调控机制就构成了中央振荡器的基础p 4 1 。 6 、m y b 基因的其他功能 植物m y b 家族的转录因子数量巨大，功能多样。除了上面重点介绍的五大方面的功能外， m y b 转录因子还参与其它多个生理生化过程