（应用化学专业论文）芯片式薄层电解池毛细管电泳联用技术研究.pdf

合肥工业大学 本论文经答辩委员会全体委员审查，确认符合合肥工业大学 硕士论文质量要求。 答辩委员会签名： 揣( 主觯位他球专帼缎碍彩者灸 委员：殄刑知洲铲江暇 导师： 炙戈趴钒嘶觇 t 一 、 ，。鲰惫 j 琴 f 二器： 膏 ，；雌泓 一 崞梦 “。夕 ，肾菸 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及所取得的研究成果。据我 所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含为获得 金胆王些太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示感谢。 学位论文作者签名：镪仗瑶签字日期：如前年p 月留日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解金胆王些塞堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权金胆工些太堂可 以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复印手 段保存、编入学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 馈斑谁 签字日期：如f 1 年牛, e j 搭e l 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名： 佰赳虬 签字日期劾l f 年中月巧诌 电话： 邮编： 芯片式薄层电解池毛细管电泳联用技术研究 摘要 针对复杂电化学反应研究的需要，本文设计一种芯片式薄层电解池毛细管 电泳联用装置，以方便实现电化学复杂反应产物的在线快速分离检测。该装置 为芯片实验室混合反应单元增添“电化学反应”这一新成员，拓展芯片实验室及 毛细管电泳技术的应用范畴，对推动复杂有机电化学反应机理和动力学研究及 相关应用领域的发展具有重要意义。 利用毛细管连接通道和薄层池与芯片微加工、微制作技术的兼容性，开展 毛细管电泳柱前微流控芯片薄层电解池的设计和微制作，选用紫外光谱法为毛 细管柱后检测手段，建立芯片薄层池毛细管电泳仪联用的测试技术。以类黄酮 天然产物儿茶素作为反应物，其广泛存在于茶叶、中药材和许多植物中，是一 种天然抗氧化剂。儿茶素的3 个碳环上带有5 个不同电活性的羟基，产生多种 氧化产物，是典型的复杂电化学反应体系。 尝试设计了多种结构的芯片式薄层电解池毛细管电泳在线进样装置，包括 不同的微通道构建方法，其中热压法、激光刻蚀法、注塑法所制得得通道都有 缺陷，不能满足实验的需要；而采用微型不锈钢管用作的通道克服了以上各种 方法的不足。通过反复改进，最后成功制作了一种芯片薄层池毛细管电泳联用 装置，采用该芯片进行电化学和毛细管电泳测试，获得了峰形良好的在线进样 毛细管电泳谱图；此外该芯片具有加工制作简便，实验操作易控，运行稳定， 并可长期反复使用等特点。 关键词：薄层电解池；微流控芯片；电泳；联用技术；在线 c o u p l i n gs t u d y o f c h i pt h i n l a y e re l e c t r o l y t i cc e l la n d c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s a b s t r a c t i ti sa l lu r g e n tn e e di nt h ef i e l do fo r g a n i c b i o l o g i c a le l e c t r o c h e m i s t r yt od e v e l o ps o m e t e c h n i q u e sf o ra c h i e v i n gt h er a p i dt r a n s f o r m a t i o no fe l e c t r o a c t i v er e a c t a n t sf o l l o w e db y o n 1 i n es e p a r a t i o na n dd e t e c t i o nf o rt h er e s u l t i n gp r o d u c t s f o rt h i sp u r p o s e ，d i r e c t c o n n e c t i o no fac h i pt h i n l a y e re l e c t r o l y t i cc e l l ( t e c ) w i t hc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) a p p a r a t u sh a sb e e nf i n i s h e di nt h i st h e s i s 。t h ei m p l e m e n t a t i o no ft h i sc h i pd e v e l o p e d e l e c t r o c h e m i c a lr e a c t i o n a san e w m e m b e ro ft h er e a c t i o nm i x i n gc e l l si n l a bo n a c h i p ， e x t e n d i n gt h ea p p l i c a t i o ns c o p eo fb o t h l a bo nac h i p a n dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s t e c h n o l o g ya n dp r o m o t i n gt h e s t u d i e s o fc o m p l e x o r g a n i c e l e c t r o c h e m i c a lr e a c t i o n m e c h a n i s ma n dk i n e t i c sa n dr e l a t e da p p l i c a t i o na r e a s t h i sw o r kf o c u s e do nt h ed e s i g na n dm i c r o - m a c h i n i n go fam i c r o f l u i d i c - c h i pt e c w i t l l c a p i l l a r y c h a n n e ll e a d i n gt h e e l e c t r o l y t i cp r o d u c t s t ot h ec e ，b a s e do nt h e c o m p a t i b i l i t yo ft h et e c ( a n dc a p i l l a r yc h a n n e l ) w i t hc h i pm i c r o m a c h i n i n gt e c h n o l o g y n a t u r a lf l a v o n o i dc a t e c h i nw a ss e l e c t e da st h em o d e lc o m p o u n d sb e c a u s eo ft h e i rc o m p l e x e l e c t r o o x i d a t i o np r o d u c t s c a t e c h i n sa r ew i d e l yd i s t r i b u t e di nt e a s ，a n dp l a n t s ，a n dt h e ya r e p a r t i c u l a r l ya t t r a c t e da t t e n t i o nb e c a u s eo ft h e i rr e l a t i v eh i 曲a n t i o x i d a n tc a p a c i t y u v - v i s s p e c t r o p h o t o m e t r yw a su s e da st h ep o s t - c o l u m nd e t e c t i o nm e t h o do fc e c h a n g e si nt h e c o n c e n t r a t i o no fe a c hc o m p o n e n tw i me l e c t r o l y s i st i m ew o u l db eo b t a i n e df r o mo n - l i n e e l e c t r o p h o r e t i cp e a ka r e a , h e l p i n gt h ei n f e r e n c eo fr e a c t i o nm e c h a n i s ma n dt h ec a l c u l a t i o n o fk i n e t i cp a r a m e t e r s s e v e r a ld e s i g n so ft h ec h i pd e v i c ew e r ed i s c u s s e da n dd i f f e r e n tm e t h o d so ff a b r i c a t i n g t h em i c r o c h a n n e l sw e r ea t t e m p t e d t h ec h a n n e l sf a b r i c a t e db yh o tp r e s s i n g ，l a s e re t c h i n g ， a n di n j e c t i o nm o u l d i n gm e t h o dw e r eu n s u i t a b l ef o rt h ed e v i c e h o w e v e r ，s t a i n l e s ss t e e l m i c r o c h a n n e lc a no v e r c o m ea l lo ft h es h o r t c o m i n g sw h i c ha b o v ef o u rm e t h o d se x s i t e d t h e s t r u c t u r eo ft h ef i n a ld e s i g nw a si n t r o d u c e di nd e t a i la n dt h ep e r f o r m a n c eo fd e v i c ew a s e x a m i n e db ye l e c t r o p h o r e s i sa n de l e c t r o c h e m i s t r y e l e c t r o p h e r o g r a m sw i t hw e l l s h a p e d a n dw e l l s e p a r a t e dp e a k sw e r eo b t a i n e d 、) i ，i n lt h i sc h i pd e v i c e a l s o ，t h ed e v i c ec a l lb e c o n v e n i e n t l ym a n u f a c t u r e d ，e a s y - c o n t r o l l e d ，s t a b l yr u n a n dc a l lb er e p e a t l yu s e d k e yw o r d s ：t h i n - l a y e rc e l l ；m i c r o f l u i d i cc h i p ；e l e c t r o p h o r e s i s ；c o u p l i n gt e c h n i q u e ；o n l i n e 致谢 本论文工作是在导师何建波教授的精心指导和悉心关怀下完成的。整个论 文都凝聚着何建波老师的智慧和心血。何建波老师渊博的知识、严谨求实的治 学态度、富于创新的思想、求实求真的科研精神激励着我不断进取、努力探索。 在此，谨表示我最诚挚的敬意和最衷心的感谢。 在此，谨向我的导师、我的家人和所有支持、帮助我的人致以最诚挚的敬 意和最美好的祝福! 作者：陈俊聪 2 0 11 年4 月 目录 摘| 晕i a b s t r a c t i i 插图清单v i 第一章前言1 1 毛细管电泳技术1 1 1 毛细管电泳发展简介1 1 2 毛细管电泳基本理论概述l 1 3 毛细管电泳的分离模式2 1 4 毛细管电泳仪器系统3 1 5 毛细管电泳仪的检测技术4 1 6 毛细管电泳分析特点5 2 微流控芯片简介5 2 1 发展概况5 2 2 基本原理6 2 3 主要特点7 2 4 应用现状8 2 5 微流控芯片材料简介8 3 儿茶素简介8 4 本选题的目的、意义及研究思路1 0 4 1 目的和意义1 0 4 2 研究背景与思路一1 1 第二章薄层电解毛细管电泳分离儿茶素电氧化产物1 4 1 实验部分1 4 1 1 试剂与仪器1 4 1 2 测试方法1 5 2 结果与讨论1 6 2 1 儿茶素在p h9 2 下氧化产物的毛细管电泳分离1 6 2 2 儿茶素在p h1 1 5 下氧化产物的毛细管电泳分离1 7 3 结论18 第三章芯片式联用装置设计及制作尝试1 9 1 初步方案1 9 1 1 方案一1 9 1 2 方案二2 1 2 芯片通道的形成方式选择2 3 2 1 热压法2 3 2 。2 激光刻蚀法2 4 2 3 注塑法2 5 2 4 用a b 胶制作通道3 2 2 5 不锈钢管做通道3 4 3 结论3 6 第四章一种芯片薄层池毛细管电泳联用装置的结构及测试3 7 1 装置结构及运行原理3 7 2 装置表征4 0 2 1 基线测试一4 0 2 2 进样测试4 1 2 3 薄层电解池循环伏安测试4 1 2 4 薄层电解毛细管电泳测试4 2 3 结论4 3 第五章总结一4 5 参考文献4 6 研究生期间发表的论文5 1 插图清单 图1 1 经典的电泳芯片系统装置示意图7 图1 2 儿茶素类化合物的4 种主要成分的分子结构9 图1 3 茶黄素的4 种主要成分的分子结构1 0 图2 1 自制薄层电解池及与毛细管电泳仪联接装置1 5 图2 2 儿茶素电氧化( a ) 和自然氧化0 3 ) 所得产物的毛细管电泳图1 6 图2 3 儿茶素电氧化( a ) 和自然氧化0 3 ) 所得产物的毛细管电泳图l8 图3 1 芯片原理示意图1 9 图3 2 芯片具体设计图( 单位：m m ) 2 0 图3 3 芯片原理示意图。2 2 图3 4 芯片原理示意图。2 2 图3 5 热压法制作芯片。2 3 图3 6 热压通道轮廓2 4 图3 7 激光刻蚀通道轮廓o 2 5 图3 8 芯片原理示意图2 6 图3 9 铝合金模具结构示意图。2 7 图3 1 0p m m a 模具结构示意图2 8 图3 1 1 硅橡胶芯片基线2 9 图3 1 2 槲皮素芯片毛细管电泳图2 9 图3 13 槲皮素毛细管电泳图。3 0 图3 1 4 茶氨酸芯片毛细管电泳图3 1 图3 1 5 茶氨酸毛细管电泳图3 1 图3 1 6 茶氨酸毛细管电泳图( 芯片进样，一般电泳) 3 2 图3 1 7 芯片原理示意图3 3 图3 1 8 含a b 胶通道的芯片基线3 3 图3 1 9 不锈钢通道的芯片基线3 4 图3 2 0 儿茶素芯片毛细管电泳图( a ) ( b ) 3 5 图4 1 芯片薄层电解池微流控毛细管电泳进样装置的盖片面板。3 8 图4 2 是图4 1 中截面a a 的剖面图。3 8 图4 3 是图4 1 中截面b b 的剖面图3 9 图4 4 是图4 1 中截面c c 的剖面图3 9 图4 5 是图4 4 中截面d d 的剖面图( 毛细管处于进样位置) 3 9 图4 6 是图4 4 中截面d d 的剖面图( 毛细管处于电泳运行位置) 4 0 图4 7 芯片基线4 0 图4 8 儿茶素芯片毛细管电泳图。4 l 图4 9 薄层电解池儿茶素循环伏安图4 2 图4 1 0 薄层电解池儿茶素循环伏安图4 2 图4 1 l 儿茶素电解前毛细管电泳图4 3 图4 1 2 儿茶素电氧化产物毛细管电泳分离图4 3 第一章前言 1 毛细管电泳技术 1 1 毛细管电泳发展简介 毛细管电泳的发展历史可以追溯到上世纪6 0 年代甚至更远。1 9 8 1 年 j o r g e n s e n 和l u c k a c s 1 】在前人的基础上，首先采用7 5p m 熔融石英毛细管为分 离通道，对氨基酸实现了快速、高效分离，在3 0k v 下产生超过4 1 0 5 片m 的效率，借用色谱理论解释了毛细管区带电泳中的谱带分散过程，同时对分离 的机理、高电场和柱内径对柱效得影响进行了研究，创立了现代毛细管电泳， 成为毛细管电泳发展史上一个重要里程碑。1 9 8 3 1 9 8 5 年h j e r t e n 又先后提出 毛细管凝胶电泳( c a p i l l a r ye l e l e c t r o p h o r e s i s ，c g e ) 2 j 和毛细管等电聚焦法 ( c a p i l l a r yi s o e l e c t r i cf o c u s i n g ，c i e f ) t 3 1 ，不仅大幅度提高分辨效率，而且实现了 自动化操作，便于定性、定量工作。1 9 8 4 年t e r a b e 4 】建立了胶束电动毛细管色 谱( m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc h r o m a t o g r a p h y , m e c c ) ，以分离中性组分，扩大了毛 细管电泳的应用范围。这些研究成果，实现了毛细管电泳向多种分离模式发展， 其他模式还有毛细管等速电泳( c a p i l l a r yi s o t a c h o p o r e s i s ，c i t p ) 、毛细管电色谱 ( c a p i l l a r ye l e c t e oc h r o m a t o g r a p h y ，c e c ) 等。随着毛细管电泳技术的不断发展， 毛细管电泳分析仪器也不断完善，1 9 8 8 1 9 8 9 年间第一台商品h p c e 仪的面世 是毛细管电泳技术走向应用时期的重要标志；1 9 8 9 年第一届国际毛细管电泳会 议召开，标志着一门新分支学科的产生，毛细管电技术在各个领域开始突飞猛 进地发展，“毛细管电泳”为主题词的公开发表的文献呈指数增长【5 j 。1 9 9 2 年后， 毛细管电泳在国内受到重视，发展很快，1 9 9 3 年在北京定期召开了第一届全国 毛细管电泳学术讨论文。 1 2 毛细管电泳基本理论概述 电泳即带电粒子在电解质中，在电场作用下以不同的速度向其所带电荷相 反方向迁移的现象，粒子在单位电场下的电泳速度称为淌度。淌度与粒子所带 电荷数及体积大小相关，因此不同的粒子由于淌度不同从而实现电泳分离1 6 j 。 但是传统电泳技术无法克服高压产生的焦耳热现象，从而限制了高压的使用， 无法提高分离速度和分离效率。毛细管电泳则采用毛细管作为分离通道，毛细 管的表面积体积比大，因而散热快，可以承受高电场( 10 0 10 0 0v e r a ) 。毛细 管电泳电泳基本原理就是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，根据样 品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的1 7j 。在c e 中，粒子除 了受到电场作用外，同时还受到电渗( e l e c t r o o s m o t i e ) 的作用。粒子在毛细管内 电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流( e l e c t r o o s m t i cf l o w , e o f ) 两种速度的矢 量和。假设溶质纵向扩散是区带展宽的唯一影响因素，忽略温度效应的影响， 那么可以通过增大分离高压和缩短毛细管来提高速度，同时兼顾分离效率。但 在分离电压增大和毛细管长度缩短时，除了扩散外，温度效应，即毛细管的焦 耳热问题对于柱效的影响是c e 中不可忽略的因素。焦耳热随着分离高压增大 和毛细管的缩短而增大、焦耳热过大会造成峰扩展、变形。 综上所诉，要在维持高效情况下加快c e 的分析速度，可以采用以下几种 方法：( 1 ) 短而窄内径的毛细管；( 2 ) 高分离电压；( 3 ) 高电渗流。 另外，对于带负电荷的分析物，通常在缓冲溶液中加入阳离子表面活性剂， 通过改变e o f 的方向来提高分析速度。 对于阳离子来说，其电泳方向和e o f 方向一致，所以最先流出毛细管：中 性粒子不受电场力作用，只是在e o f 作用下向负极迁移；而阴离子的电泳方向 和e o f 方向相反，但是e o f 速度一般大于电泳流速度，所以最终也能流出， 三种粒子的流出顺序为：阳离子、中性粒子、阴离子。对于带同种电荷的粒子， 由于电荷数和粒子大小不同，电泳速度不同，也能实现分离。以上是h p c e 技 术中最基本的分离模式c z e 的分离原理。显然易见，c z e 技术不能实现中性微 粒间的相互分离，需要借助其他h p c e 分离模式在c z e 基础上引入不同的色谱 分离机理而实现分离的。 电渗流现象是h p c e 技术中基本现象之一，电渗流具有平面流型，在缩短 分析时间的同时不引起样品去带的额外展宽，因而可以获得高分离度。z e t a 电 势是影响e o f 的直接原因，而z e t a 电势于毛细管表面特性、缓冲溶液性质密切 相关，因此缓冲溶液的组成、p h 、温度以及毛细管内表面的状态称为影响电渗 流的间接因素。 有效地控制e o f ，对改善分离度、提高重现性具有重要的意义。根据影响 e o f 的各种因素，可以考虑采用下列方法来控制e o f ：( 1 ) 改变缓冲溶液成分和 浓度；( 2 ) 改变缓冲溶液的p h ；( 3 ) 力1 1 入添加剂：( 4 ) 毛细管内壁改性；( 5 ) 改变温 度；( 6 ) 夕j , ；l j i l 径向电场。以上均是在理论上能够控制e o f 的各种方法。刘学良j 等提出了采用有机溶剂的碱性溶液对毛细管柱进行预处理，可以产生稳定的电 渗流，实现对强极性、高活性有机化合物的c z e 分析。朱英【9 】等设计科一种使 用单电源的可控电渗的毛细管电泳装置，并利用此装置成功地实现了对蛋白质 分离效率和分离速度的调控【l 。 1 3 毛细管电泳的分离模式 1 3 1 毛细管区带电泳( c z e ) c z e 是毛细管电泳中使用最为广泛的一种电泳技术。它是基于在充满电解 质溶液的毛细管中，具有不同荷质比的组分在电场作用下迁移速度的不同而进 行分离分析的方法。其分离基础是淌度的差别。因中性物质的淌度差为零，所 以不能分离中性物质。c z e 的c e 中最简单、应用最广的一种操作模式，是其 它操作模式的基础。 2 1 3 2 胶束电动毛细管电泳( m e c c ) 在胶束电动毛细管电泳( m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc a p i l l a r ye l e e t r o p h o r e s i s ， m e c c ) 中，通常把离子型表面活性剂加到运行缓冲液中，当浓度超过临界胶束 浓度，表面活性剂的单体就结合在一起，形成胶束( 假固定相) 。溶质分子则在 胶束和运行缓冲液间形成平衡，在电渗流和胶束电泳流的共同作用下而分离， 是电泳技术与色谱技术的巧妙结合。这使得中性物质的分离成为可能，拓宽了 毛细管电泳的应用范围。 1 3 3 毛细管凝胶电泳法( c g e ) c g e 法是分离效率最高的一种毛细管电泳模式，主要由于毛细管内填充中 凝胶，而凝胶粘度大，抗对流，能减少溶质的扩散，因此能限制谱带的展宽， 所得的峰型尖锐，柱效极高，并且溶质和凝胶( 或加在凝胶基质中的添加剂) 生成络合物，又能使分离度增加，同时凝胶又可防止溶质在毛细管壁的吸附并 减少电渗流。但是c g e 的柱制备较困难，且寿命较短。 1 3 4 毛细管等电聚焦电泳法( c i e f ) c i e f 是依据样品组分( 主要是两性化合物) 等电点不同而实现分离；毛细 管的等电聚焦是将一种两性电介质的混合物作为载体注入毛细管中产生p h 值 梯度，使有不同等电点的分子分别聚焦在不同的位置上，不作迁移而彼此分离。 c l e f 具有极高的分辨率，通常可以分离等电点差值小于o 0 1p h 值单位的两种 蛋白质。在毛细管电泳中，如果缓冲液的p h 高于硅胶表面的p k a 值，则会在 带电的硅胶表面形成一个双电层并导致电渗。在c i e f 中，电渗流在环境稳定 的聚焦区带，目前多采用将亲水性聚合物键合到毛细管管壁表面来减少电渗流， 同时还能除去管壁上可能造成蛋白质吸附的活性点。 1 3 5 毛细管等速电泳( c i t p ) 其分离模式也是依据样品组分电泳淌度的不同来进行分离。它使用两种电 解质，一种为前导电解质，含有比所有样品组分电泳淌度都大的前导离子；另 一种为尾随电解质，含有比所有样品组分电泳淌度都笑的尾随离子，样品组分 加在两种电解质的界面。施加电压后，样品组分夹在前导离子和尾随离子之间 移动，并逐步分离。当达到电泳稳定时，各组分按其电泳淌度的大小依次相连， 并都以于前导离子相同的速度迁移。 1 3 6 毛细管电色谱法( c e c ) 毛细管电色谱法是把毛细管电泳和毛细管液相色谱相结合的一种分离技 术。它在毛细管中填充了液相色谱用的固定相载体，使被分离组分在这些固定 相载体上进行保留和分配，它与液相色谱技术的区别在于前者以电渗力为驱动 力，后者以压力为驱动力。 1 4 毛细管电泳仪器系统 毛细管电泳仪器装置其结构包括高压电源、进样系统、毛细管柱、检测器 3 及信号记录系统。其电源要求采用连续可调的0 3 0k v 直流高压电源，电压输 出要求稳定。毛细管电泳进样系统最小进样量可达纳升级，满足了微量试样分 析的要求。目前最常用的定量进样方式是流动力学进样和电迁移进样，其中流 动力学进样有虹吸进样法、毛细管两端加压进样法和毛细管尾端抽真空进样法 三种形式，其局限性在于对粘度高的样品和电泳缓冲溶液不适用；而电迁移进 样最大的不足在于进样时存在组分歧视。由电动力进样扩展而来的场放大进样 技术可以对含量极小的组分进行浓缩富集，提高分析的灵敏度。毛细管柱是毛 细管管电泳分离的核心部件，目前最常用的是圆管形弹性熔融石英毛细管，通 常在外壁涂聚酞亚胺使毛细管富有弹性。从散热效果来看，孔径越小越好，已 有用内径只有2p m 的毛细管作毛细管电泳的报道【l 。但是孔径太小，样品负 载小，增加了检测难度，同时也给进样、清洗等操作带来困难，综合考虑散热 效率和检测灵敏度的因素，一般选用柱内径为2 5 一1 0 0 m 之间。毛细管电泳 对柱长的选择视情况而定，最常用的有效柱长为3 0 一5 0c m 。前文已述及通过毛 细管内壁改性的方法来控制e o f ，此外通过涂层的方法还可以减少蛋白质对毛 细管内壁的吸附，提高c e 法分离蛋白质的重现性。常见的内壁改性方法有物 理吸附法和化学键合法，王志欣【1 2 】等通过化学键和的方法制备了杯芳烃涂层毛 细管，实验表明杯芳烃涂层毛细管具有特殊的分离选择性、较好的稳定性和较 高的灵敏度。毛细管电泳中电解质通常由缓冲溶液组成，必要时加入一些特定 的添加剂以改善分离效果。c e 对缓冲溶液的具体要求如下：( 1 ) 有一定的p h 调 节范围，并且具有足够的缓冲容量，确保分离过程中p h 值恒定；( 2 ) 尽可能选 择浓度高而产生电流小的缓冲溶液，高浓度的缓冲溶液可以提高分离度：( 3 ) 缓 冲溶液的表观淌度接近样品溶液的淌度，避免区带发散。( 4 ) 可以通过加入适当 的添加剂来改善分离效果。在c e 中常用的缓冲溶液体系有磷酸盐溶液、硼砂 等。 1 5 毛细管电泳仪的检测技术 由于毛细管电泳采用微体积进样，所以毛细管电泳要实现广泛应用于深入 发展面临的主要挑战是高灵敏度于多模式检测器的发展。c e 检测方法有光吸收 法、电化学法、电导法及质谱法等，紫外可见光检测器是目前在c e 中应用最 广的检测器，采用柱上检测，透光窗口直接开在毛细管上，不存在因死体积和 组分混合而引起的峰展宽，科提高分离效率；二极管阵列检测器能够得到时间 波长吸收度三维图谱，可方便的用于复杂样品的分离，还科用于峰纯度的鉴定 及未知物的鉴定；激光诱导荧光检测器( 1 a s e r i n d u c e df l u o r e s c e n c e ) 是一类高灵 敏度和高选择性的检测器，但造价昂贵，大多数样品需要衍生。质谱( m a s s s p e c t r o m e t r y , m s ) 检测法灵敏度高，专属性强，能够提供分子结构信息，是一种 非常理想的检测方法，c e 的高效分离与m s 的高鉴定能力相结合，可以实现对 只有纳升级样品进行分子结构分析和分子量的鉴定，是对微量样品进行分离分 4 析的强有力i g , ，c e m s 联用技术越来越受到人们的关注【13 1 。 目前商用c e 仪器多数采用数据工作站来采集和储存信号数据，此外还可 以利用计算机系统来控制仪器运行，优化操作条件，处理数据，打印报告等， 使仪器操作高度自动化。 1 6 毛细管电泳分析特点 由于在c e 中采用毛细管作为分离通道，结合毛细管容积小、散热快的特 点及电渗流的形成特点，c e 具有下列优点： 1 、分辨效率高，c e 效率一般在l0 5 1 0 6 片m 间，c g e 效率可达1 0 7 片 m 以上； 2 、分析时间快，一般可在几十秒至十几分钟内完成一次分离； 3 、样品用量少，进样所需体积可小到1 微升，消耗体积在纳升级； 应用模式多，可以根据分离样品的特点选择不同的分离模式，可实现一机 多用； 5 、使用范围广，从无机离子到整个细胞，都可以实现分析； 6 、运行成本低，污染少，在运行过程中消耗的缓冲溶液仅几毫升，而且缓 冲溶液多为水溶液，对操作人员无危害，对环境污染少； 7 、自动化程度高，作为新型分离技术，c e 具有高度自动化。 综上所述，c e 具有仪器分析技术所要求的高速、快速、样品用量少等最基 本和最优异的特点，此外，c e 还具有自动化程度高、操作简便、溶剂消耗少、 环境污染小等优点，毛细管电泳存在的问题，主要表现为重复性差，今年来各 种不同的方法用来提高c e 的重现性，c e 另一个不足是不能用来制备，这是由 其低进样量决定的，有待进一步解决。 2 微流控芯片简介 微流控芯片又称芯片实验室( l a bo nac h i p ) 是微机电加工技术( m e m s ) 的一 个典型应用，在硅、石英、玻璃或高分子聚合物等基质材料上加工出微管道、 微阀、微泵、微反应器、电极等功能单元，基于分析化学的相关理论和技术， 实现生物或者化学领域所涉及的样品纯化、反应、萃取、分离、检测等一系列 功能的实验装置，以微尺寸效应为基础，以微管道网络为基本特征，以微流体 为核心。 2 1 发展概况 1 9 9 0 年，瑞士c i b a g e i g y 分析实验室的m a n z 和w i d m e r 1 4 1 等人首次共同 提出了微全分析系统( m i n i a t u r i z e dt o t a la n a l y s i ss y s t e m ，p - t a s ) 的概念，意在研 究一种能够集成分析化学所有部件和操作的微型平台，主要强调了系统的“微” 和“全”。1 9 9 1 年，m a n z 等人在普通平板微芯片上进行了电泳实验，进行了分 5 离操作与流动注射分析，为之后数年的微流控芯片的突破性发展奠定了基础。 到了1 9 9 4 年，美国橡树岭国家实验室的r a m s e y 和j a c o b s o n 1 5 1 等人在m a n z 的 研究基础上进行了一系列电泳的实验研究，对进样方法进行了改进，性能与使 用性得到了较大的提高，得到了更为广泛的关注。同年，首届l a b o n - a - c h i po r u t a s 国际会议在荷兰e n e h e d e 举行，对微流控芯片技术的应用进行了很好的 推广。1 9 9 5 年美国加州大学b e r k e l e y 分校m a t h i e s 等人【1 6 】在微流控芯片上实现 了高速d n a 的等速测序，微流控芯片的商业开发价值开始显现，而此时微阵 列生物芯片己进入实质性的商品开发阶段。同年9 月，首家微流控芯片企业 c a l i p e rt e c h n o l o g i e s 在美成立。1 9 9 6 年，m a t h i s 等人【l 7 】又将基因分析中有重要 意义的聚合酶链反应( p c r ) 扩增与毛细管电泳集成在一起，展示了微全分析系 统在试样处理方面的潜力。1 9 9 7 年，他们又实现了微流控芯片上的多通道毛细 管电泳d n a 测序，从而为微流控芯片在基因分析中的实际应用提供了重要基 础。2 0 0 1 年，由英国皇家化学会主编的“l a bo nac h i p ”正式创刊，标志着微流 控芯片已经被学术界认可成为分析化学中的一个独立领域。进入2 1 世纪，我国 学者注意到了微流控芯片的美好前景，在政府各类基金的支持下，从各个角度 切入，也开展了许多卓有成效的工作。2 0 0 1 年5 月召开了专门讨论“t a s 发 展的1 6 5 次香山科学讨论会。到2 0 0 6 年，中国科学家在微流控芯片领域s c i 论文数己跃居世界第- - 1 8 】。2 0 0 9 年起，中国科学院大连化学物理研究所的林炳 成研究员出任l a bo nac h i p 杂志的编委，表明了我国的微流控芯片研究己达到 国际一流水平。 微流控芯片已成为当前化学领域研究的一大热点，产业化前景非常美好， 自然也吸引了世界多个大型仪器企业的涉足。l9 9 9 年9 月美国惠普公司与 c a l i p e r 联合研制的首台微流控芯片商品化仪器“a g l i e m 2 1 0 0 生化分析仪”开始 在欧美市场销售，至2 0 0 1 年8 月已可以提供用于核酸及蛋白质分析的5 6 种 芯片。不久之后，日立公司和岛津公司也有微流控生化分析仪器推出。2 0 0 0 年， 荷兰的m i c r o n i t 公司成立，致力于微流体技术和玻璃芯片的制备技术的研究， 商业化生产简单微流体芯片和微器件。 2 0 0 4 年9 月美国b u s s i n e s s2 0 杂志的封面文章称，微流控芯片是“改变未 来的七种技术”之一。2 0 0 6 年7 月n a t u r e 杂志就l a bo nac h i p 推出了名为“a l i t t l eg o e sal o n gw a y ”的专辑【”】，标志着微流控芯片的发展已经进入一个新的 阶段，微流控芯片所显示出的潜在意义，己从一个更高更广泛的层面向世人展 示。 2 2 基本原理 芯片毛细管电泳( c h i p b a s e dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c c e ) 是基于微流控 芯片平台，以微通道作为分离通道，对样品中的多种目标进行分离分析的技术。 经典的电泳芯片系统装置示意图如图1 1 所示。 6 图1 1 经典的电泳芯片系统装置示意图 电泳分析时，先在进样通道两端施加电压，高压电源在十字交叉口处完成 进样操作，一般迸样距离为1 0 0 2 5 0 “m ，然后在分离通道上进行多组分的分 离，在电渗流的驱动下进入检测区域，由检测器探测信号。其基本原理与常规 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h e r e s i s ，c e ) 类似，根据溶质所带电荷和体积大小 的差异，导致其在电场作用下迁移速率的不同，从而进行分离。二者的不同之 处在于芯片毛细管电泳是由电场力驱动产生的，c c e 流型属于扁平流型，而 c e 是靠外界的压力泵驱动的，流型是属于鸭舌流型的。 相比于传统的c e ，c c e 具有如下优点f 2 0 j ：微流控芯片具有良好的散热性 能( 导热系数为1 4w n a k ) ，使其可以施加高分离场强，并且可以实现小体积、 高度重现的进样，可控制非常短的试样进入分离分析区域，进一步提高了分离 的效率；在芯片有限的面积上可以加工高密度的阵列分离通道，实现高通量的 分析；集成化、便携化、低消耗也进一步拉开了。c c e 与传统c e 的优势；可 以在高聚物材料上加工一次性的毛细管电泳芯片，有利于商品化的开发。 2 3 主要特点 微通道尺度的减小不仅使得分析设备在整体尺寸上的微型化，也带了很多 微米和纳米效应，使其与传统的分析系统相比较，分析性能有了显著的提高。 微流控芯片的主要特点如下： 1 、随着微通道尺寸减小，通道的导热率和传热速率将显著增强，从而可以 实现样品的的快速分析、分离或其他更为复杂的操作。 2 、在微流控装置中，可以通过电动、压力或者重力的方法来驱动微通道内 的流体，其中电动驱动是最常用的方法，它不需要泵、阀等额外装置，只需在 微通道两端施加高压即可完成。 7 3 、微通道尺寸的减小也会使得制作材料消耗很少，满足批量生产后芯片成 本的可控性降低，有利于芯片的商业化。除了以上的特性外，微流控体系还具 有样品和试剂耗量小，通过平行分析可得到极高的单位信息量的特点。 2 4 应用现状 微流控芯片所表现出的整体性和系统