（预防兽医学专业论文）免疫磁珠的制备及其初步应用.pdf

i | i i ip i ri f lfflf ii l lliii y 17 9 9 8 0 5 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学l 奇论文 不如需保密，解密时间年月曰 楚否保蜜忉 独创性声明 本人声明所星交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特剔加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农韭大学或其他教育机构的学位或证书 面使用过的材料，指导教师对此避行了审定与我一同工作的问志对本研究所傲的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生始嘛i 衫 帆加，。年6 周7 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，印学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本：学校有权保存提交论文的印剥版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存，汇缡学位 论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( 印涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在铸要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 黼鲐蜍f 耖釉张彩抄 蚴期：狲年6 月7 日瓤矿舻月7 日 注：访将本表馥接装订住学位论文的靡页和目泶之阀 免疫磁珠的制备及其初步应用 目录 摘要兽1 a b s t r a c t 2 缩略词表4 第一章文献综述5 1 免疫磁珠的研究进展5 1 1 免疫磁珠的结构及特性5 1 2 免疫磁珠分离技术的基本原理5 1 3 磁性微球的基本特征6 1 4 磁性微粒的制备原理与方法6 1 4 1 磁性微粒的化学制备方法6 1 4 2 磁性微粒的物理制备方法7 1 5 磁性微粒的表面修饰及其应用8 1 6 磁性微粒在生物医学领域中的应用1 0 1 6 1用于靶向载药1 0 1 6 2 用于细胞分离1 l 1 6 3 用于蛋白质的分离与纯化1 1 1 6 4 用于核酸分离纯化1 2 1 6 5 用于免疫检测1 2 1 6 6 细菌分离的应用1 3 1 6 7 其它方面的应用1 4 2 小肠结肠炎耶尔森氏菌的研究进展1 4 2 1 小肠结肠炎耶尔森氏菌的流行与危害1 4 2 2 小肠结肠炎耶尔森氏菌检测方法的研究进展。1 6 2 2 1 微生物学检验1 6 2 2 2 胶体金免疫层析法18 2 2 3 p c r 方法18 2 2 4 随机引物扩增多态d n a ( r a p d ) 技术19 2 2 5 基因芯片技术2 0 2 2 6 环介导等温扩增技术( l a m p ) 2 0 第二章兔抗小肠结肠炎耶尔森氏菌多抗的制备2 2 1 研究的目的和意义2 2 2 实验材料与方法2 2 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 h 免疫磁珠的制各及其初步应用 2 2 5 兔抗y ei g g 包被磁珠反应条件的确定3 3 2 2 6 兔抗y ei g g 包被后磁珠富集小肠结肠炎耶尔森氏菌方法的建立3 4 3 结果与分析3 6 3 1 纳米级f e 3 0 4 磁性微粒的合成3 6 3 2 兔抗y ei g g 包被磁珠反应条件的确定3 6 3 2 1 兔抗y ei g g 包被磁珠反应介质的选择。3 6 3 2 2 兔抗y ei g g 包被磁珠最佳温度的确定3 7 3 2 3 兔抗y ei g g 包被磁珠最佳时间的确定3 7 3 2 4 兔抗y ei g g 包被后磁珠的封闭效果测定3 7 3 3 兔抗y el o g 包被后磁珠富集小肠结肠炎耶尔森氏菌方法的建立3 7 3 3 1 兔抗y ei g g 包被磁珠的最佳浓度的确定3 7 3 3 2 兔抗y ei g g 包被后的磁珠富集y e 最佳用量的确定3 8 3 3 3 兔抗y ei g g 包被后的磁珠与茵液最佳反应时间的确定3 8 3 3 4 兔抗y ei g g 包被后的磁珠富集y e 的敏感性测定3 9 3 3 5 兔抗y ei g g 包被后的磁珠富集y e 的特异性测定3 9 4 讨论4 0 5 结论4 l 参考文献一4 2 致 射4 9 i i i 免疫磁珠的制备及其初步应用 摘要 免疫磁珠( i m m u n o m a g n e t i c b e a d s ，i m b ) ，是由载体微球和免疫配基结合而成的 一种纳米级材料。免疫磁珠分离技术是以高均一性的磁性微球为固相支持物，将免疫 配基( 如抗体，抗原等) 通过功能基团结合到磁性载体上形成免疫磁性微球，利用特异 性的免疫学反应，在磁力作用下，发生力学移动，从混合溶液中分离出特异性的靶 物质。具有分离速度快，效率高，可重复性好，操作简单，不需要昂贵的仪器设备 等优点。 本实验采用化学共沉淀的方法合成了纳米级f e 3 0 4 磁性微粒，具有颗粒均一程 度高，悬浮稳定性好，超顺磁性等特点，经固体物含量的测定及其粒径的测定，磁 珠的浓度约为7 9 m g m l ，粒径约为3 0 - 1 0 0 r i m 左右，对其悬浮液加入烷基化试剂 和醛基化试剂进行表面修饰，提高了磁性微粒的性能。 小肠结肠炎耶尔森氏菌是急性胃肠炎型食物中毒的病原菌，属于重要的食源性 致病菌，很多国家都已将该菌列为进出口食品的常规检测项目。本研究对小肠结肠炎 耶尔森氏菌复苏及扩大培养后进行抗原的制备，通过平板计数，测定其浓度约为 2 3 x1 0 1 0 c f u m l ，以此菌液作为免疫原制备兔抗血清，采用饱和硫酸铵法粗提、葡 聚糖凝胶g 2 0 0 过柱纯化i g g ，用提纯的i g g 包被免疫磁珠，确定了i g g 包被磁珠 的最佳偶联条件( 包括最佳反应介质，最佳温度，最佳时间) 。建立了利用免疫磁珠 技术富集小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，确定了多克隆抗体包被磁珠最佳浓度，免 疫磁珠最佳工作浓度，免疫磁珠与菌液最佳作用时间，免疫磁珠技术的敏感性等， 其灵敏度约为7 0 c f u m l 。抗体i g g 包被磁珠的最佳浓度为1 0 0 t g m l ，通过最佳反 应条件的摸索，降低了免疫磁珠在富集小肠结肠炎耶尔森氏菌过程中的非特异性反 应。结果表明，利用免疫磁珠技术的富集细菌过程具有快速、简便、高效等特点。 本实验的研究结果为小肠结肠炎耶尔森氏菌快速检验方法的研究奠定了基础。 关键词：免疫磁珠：小肠结肠炎耶尔森氏菌；富集 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 a b s t r a c t i m m u n o m a g n e t i cb e a d s ( i m m u n o m a g n e t i cb e a d s ，i m b ) a r eu n i f o r m , p o l y m e r m i c r o s p h e r e sc o a t e dw i t hl i g a n dn a n o s c a l em a t e r i a l s i m m u n o m a g n e t i cb e a ds e p a r a t i o n t e c h n o l o g yi sb a s e do nt h eh i g hu n i f o r m i t yo fm a g n e t i cm i c r o s p h e r e sp r o v i d eb o t ha s m o o t hh y d r o p h o b i cs u r f a c et of a c i l i t a t ep h y s i c a la b s o r p t i o no fm o l e c u l e s ，s u c ha s a n t i b o d i e s ，a n t i g e n s ，e t c m a ta l l o wi m m u n eb i n d i n go ft a r g e tm a t e r i a l s b yt h em a g n e t i c e f f e c t ，s p e c i f i ct a r g e tm a t e r i a la r es e p a r a t e df r o mt h em i x t u r e i m m u n o m a g n e t i cb e a d s e p a r a t i o nt e c h n o l o g yi sat e c h n o l o g yc h a r a c t e r i z e db yh i g he f f i c i e n c y , g o o dr e p e a t a b i l i t y , s i m p l em a n i p u l a t i o na n dc h e a pc o s t i nt h i ss t u d yt h ec h e m i c a lc o p r e c i p i t a t i o nm e t h o di su s e df o rt h es y n t h e s i so fn a n o f e 3 0 4m a g n e t i cp a r t i c l e sw i t hah i g hd e g r e eo fp a r t i c l eh o m o g e n e i t y , s u s p e n s i o ns t a b i l i t y , s u p e r p a r a m a g n e t i c ，e t c t h ep a r t i c l es i z e sw e r ea b o u t3 0 1 0 0n na n dt h ed e t e r m i n a t i o n o ft h ec o n c e n t r a t i o no fm a g n e t i cb e a d sa b o u t7 9m g n 止，a b o u ts i z eo fa b o u t3 0 lo o n m , w i h i c hc o n t r i b u t et o a l k y l a t i n ga g e n ts u s p e n s i o na n dm o d i f i c a t i o n w i t ha l d e h y d e r e a g e n t s e n h a n c et h e p e r f o r m a n c e o f m a g n e t i cp a r t i c l e s e n t e r o c o l i t i c ap e s t i si st h ep a t h o g e no fa c u t eg a s t r o e n t e r i t i s - t y p ef o o dp o i s o n i n g ， f o o d b o m ep a t h o g e n sa r ei m p o r t a n t ，m a n yc o u n t r i e sh a v ei m p o r ta n de x p o r to ft h e b a c t e r i aa sr o u t i n et e s t i n go ff o o di t e m s t h i ss t u d yy e r s i n i ae n t e r o c o l i t i c a r e c o v e r y a n de x p a n s i o no fa n t i g e na f t e rc u l t u r ep r e p a r a t i o n ，t h r o u g hp l a t ec o u n tt od e t e r m i n et h e c o n c e n t r a t i o no fa b o u t2 3 x1 0 1 0c f u i n l ，t h i sb a c t e r i aa st h ei m m u n o g e np r e p a r a t i o n o fr a b b i ta n t i s e r u m , u s i n gs a t u r a t e dc r u d ea m m o n i u ms u l f a t em e t h o d ，o v e r s e p h a d e x g 一2 0 0 p u r i f i e di g gc o a t e dw i t hp u r i f i e di g gi m m u n o m a g n e t i cb e a d s ，i g g c o a t e db e a d s t od e t e r m i n et h eo p t i m a lc o u p l i n gc o n d i t i o n s ( i n c l u d i n gt h eb e s tr e a c t i o nm e d i u m ，t h e b e s tt e m p e r a t u r e ，t h eb e s tt i m e ) t h ee s t a b l i s h m e n to fe n r i c h m e n tu s i n gi m m u n o m a g n e t i c b e a d st e c h n i q u ey e r s i n i ae n t e r o c o l i t i c am e t h o dt od e t e r m i n et h e o p t i m a la n t i b o d y c o n c e n t r a t i o no fc o a t e d b e a d s ，t h eb e s tw o r k i n gc o n c e n t r a t i o no fi m m u n o m a g n e t i c b e a d s ，i m m u n o m a g n e t i cb e a d sa n dt h eb e s tr o l eo fb a c t e r i at i m e ，t h es e n s i t i v i t yo f i m m u n o m a g n e t i cb e a dt e c h n i q u e ，i t ss e n s i t i v i t y i sa b o u t7 0c f u m l a n t i b o d y i g g c o a t e dm a g n e t i cb e a d st h eb e s tc o n c e n t r a t i o no f10 0 嵋m l ，t h r o u g ht h eo p t i m a l r e a c t i o nc o n d i t i o n sw a s e x p l o r e d ，a n d r e d u c e di m m u n eb e a de n r i c h m e n ty e r s i n i a e n t e r o c o l i t i c ai nt h ep r o c e s so fn o n s p e c i f i cr e s p o n s e t h er e s u l t ss h o wt h a tt h eu s eo f i m m u n o m a g n e t i cb e a de n r i c h m e n to fb a c t e r i ai nt h ep r o c e s st e c h n o l o g yi sa ns i m p l ea n d 2 免疫磁珠的制备及其初步应用 e f f e c t i v et e c h n o l o g y t h i s s t u d yp r o v i d e dt h eb a s i sf o rt h ec o n s t r u c t i o n o fa nr a p i d d e t e c t i o nm e t h o dt oi d e n t i f yy e r s i n i ae n t e r o c o l i t i c a k e yw o r d s ：i m m u n o m a g n e t i cb e a d s ；y e r s i n i ae n t e r o c o l i t i c a ；e n r i c h m e n t r 。1 。 。 一 华中农业大学2 0 | 0 届硕士学位论文 。一一 - ： 缩略词表 塑鱼歪笙一一 英文全称中文全称 m b i m m o n u m a g n e t i cb e a d免疫磁珠 i m s i m m o n u m a g n e t i cb e a d - b a s e d免疫磁珠分离技术 s e p a r a t i o nt e c h n i q u e s e l i s a e n z y m el i n k i n gi m m u n o s o r b e n ta s s a y酶联免疫吸附试验 y e y e r s i n i ae n t e r o c o l i t i c a 小肠结肠炎耶尔森氏菌 s e m s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y扫描电镜 m i n m i n u t e 分钟 i g g i m m u n o g l o b i ng免疫球蛋白g i g m i m m u n o g l o b i nm免疫球蛋白m k d k i l o d a l t o n 千道尔顿 g g r a m 克 r t g m i c r o g r a m微克 m g m i l l i g r a m毫克 a b a n t i b o d y抗体 m m m i l l i m e t e r 毫米 1 t mm i c r o m e t e r 微米 n l n n a n o m e t e r 纳米 h r p h o r s e p e r o x i d a s e辣根过氧化物酶 p b s p h o s p h a t eb u f f e e rs a l i n e磷酸盐缓冲液 o d o p t i c a ld e n s i t y 光密度 h h o u r 小时 r m i n r o t a t i o np e rm i n u t e 每分钟转数 p e g p o l ye t h e l e n eg l y c o l聚乙二醇 s d ss o d i u md o d e c y l s u l p h a t e十二烷基磺酸钠 s d s - p a g e s d s - p o l ya c r y l a m i d eg e ls d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 e l e c t r o p h o r e s i s s e c s e c o n d 秒 “l m i c r o l i t e r 微升 m l m i l l i l i t e r 毫升 4 免疫磁珠的制备及其初步应用 第一章文献综述 1 免疫磁珠的研究进展 1 1 免疫磁珠的结构及特性 免疫磁珠( i m m o n u m a g n e t i cb e a d s ，i m b 简称磁珠) ，由载体微球和免疫配基结合 而成。载体微球的核心部分为金属小颗粒( f e 3 0 4 ，f e 2 0 3 ) ，是一种磁性高且较稳定 的磁性材料，核心外包裹一层高分子材料( 如聚氯乙烯，聚苯乙烯，聚乙烯亚胺) ， 最外层是功能基层，如羟基( o h ) ，氨基( n h 2 ) ，醛基( - c h o ) ，羧基( 一c o o h ) 。由 于载体微球表现物理性质不同，可共价结合不同的免疫配基( 如酶、细胞、抗体、抗 原、d n a 、r n a 等生物活性物质。 理想的免疫磁珠为一般粒径较小，均匀的球形，具有保护性壳及超顺磁性的粒 子，其结构为：核心为磁性材料，核心外层包裹高分子材料，最外层为免疫配基。 形成免疫磁珠的关键是磁性载体，按照其结构的不同可分为三种：( 1 ) 壳一核结 构，即将高分子材料作为核，外面包裹磁性材料。( 2 ) 壳核壳结构，中间为磁性 材料，内层和外层为高分子材料。( 3 ) 核壳结构，磁性材料为核外面包裹高分子材 料。 作为免疫磁珠载体的磁性微球主要是核壳式结构为最多。磁性材料多为f e ， n i ，c o 等过渡金属特定晶型的氧化物。目前应用最广泛的是铁及其氧化物( f e ，f e 3 0 4 ， f e 2 0 3 等) 。磁性微球是内部含有纳米磁性颗粒、外部为高分子壳层作为载体的复合 材料，其广泛应用于生物分子固定化和有机固相合成，在生物工程和生物医学的研 究和实践中，固定化的生物分子通常用做亲和分析的配基，也可作为生物反应的催 化剂或药物( 赵慧君等，2 0 0 3 ) 。 1 2 免疫磁珠分离技术的基本原理 随着科学技术特别是分子生物学的发展，抗体制备技术取得了重大突破，促进 了免疫磁珠的出现。免疫磁珠分离技术( i m m u n o m a g n e t i cb e a d b a s e ds e p a r a t i o n ，i m s ) 是一种免疫学检测和分离技术，它是以高均一性的磁性微球为固相支持物，免疫配 基( 如抗体，抗原等) 通过功能基团结合到磁性载体上形成免疫磁性微球，利用特异 性的免疫学反应，在磁力作用下，发生力学移动，从混合溶液中分离检测靶物质。 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 1 3 磁性微球的基本特征 磁性微球主要有以下特性： ( 1 ) 粒径小，均一程度高，磁性微粒粒径( 直径) 范围在3 0 1 0 0 r i m 之间，且粒 径分布单分散，使微球具有很强的磁响应性，又不会因粒径太大而发生沉降，具有 较大的比表面积，偶联容量大。 ( 2 ) 悬浮稳定性好，以便高效地与目标产物进行偶联，具有丰富的表面活性基 团，以便磁性微球与具有生物活性的物质，如生物酶，蛋白质等，同时也可在其表 面结合特异性靶向分子，如各种特异性抗体等，表面标记生物分子进而应用于酶的 固定化，免疫检测，细胞分选，肿瘤的靶向治疗，药物载体及核酸的纯化与分离等 生物和医学领域。 ( 3 ) 具有超顺磁性：在外加磁场的存在下，磁性微粒有较好的响应性，能迅速聚 集，当撤去外加磁场时，磁性微粒无磁性记忆，能够均匀分散，不出现聚集现象。 ( 4 ) 操作简便，在外磁场的作用下便可进行磁粒的反复分离，分离过程十分简 单，可省去离心，过滤等繁琐操作，节约时间，与目前已有的医学与生物相关方法 相比，具有较好的优势。 ( 5 ) 磁性微球应用在生物工程，尤其是在生物医学工程时，必须具有良好的生 物相容性。这些生物高分子如脂类、多聚糖、蛋白质具有良好的生物相容性，它们 在机体内安全无毒，可降解，不与人体组织器官产生免疫抗原性。同时，磁性微粒 可方便迅速地通过机体自然排出，而不会影响机体的健康，这种性质在靶向药物中 尤其重要。不影响被分离细胞或其它生物材料的生物学性状和功能。 ( 6 ) 磁性微粒具有一定的机械强度和化学稳定性，能耐受一定浓度的酸碱溶液 和微生物的降解，其结构内的磁性物质不易被氧化，磁性微粒的这种物理化学性质 稳定特点，使其磁性能不易下降。 1 4 磁性微粒的制备原理与方法 按研究磁性微粒的学科分类，可将其分为物理、化学以及其他一些特殊的制备 方法。 1 4 1 磁性微粒的化学制备方法 1 4 1 1 化学共沉淀法 用化学共沉淀法合成超顺磁流体，该法指二价与三价铁离子在碱性条件下生成 沉淀，或利用氧化还原反应生成f e 3 0 4 。共沉淀反应原理方程式如下：f e 2 + + 2 f e 3 + + 8 0 h = f e 3 0 4 + 4 h 2 0 ，在合成过程中，条件的选择至关重要，物料比，碱用量，温 6 免疫磁珠的制各及其初步应用 度，晶化温度，搅拌速度，反应时间，时间等因素均会影响最终产物纳米级f e 3 0 4 的生成和性质。共沉淀法得到的磁性微粒通常粒径较小( 1 0 n m - - 1 0 0 r i m ) ，因而具有 较大比表面积和固载量。但由于磁响应性较弱，含磁量低，操作时需要较强的外加 磁场作用。 1 4 1 2 沉淀氧化法 一定浓度的铁盐在碱性条件下生成氢氧化亚铁沉淀，在恒温搅拌情况下，向氢 氧化亚铁沉淀中加入双氧水使其氧化成f e 3 0 4 微粒。其反应式如下： f e 2 + + 2 0 h 。= f e ( o h ) 2 3 f e ( o h ) 2 + o = f e 3 0 4 + 3 h 2 0 采用沉淀氧化法合成f e 3 0 4 磁性微粒，原材料的纯度，反应的碱比，温度，通 气量，氧化时间等各个因素都对磁粒的性能有影响。由于存在着粒度分布不均匀的 问题，还有待于进一步研究解决( 王全胜等，1 9 9 6 ) 。 1 4 1 3 改进共沉淀法 改进共沉淀法是在共沉淀法制备f e 3 0 4 纳米微粒的基础上，对其进行改进，沉 淀物在洗涤、过滤、干燥时易产生团聚现象，一种通过加入表面活性剂，对制得的 纳米f e 3 0 4 微粒进行表面改性，使其具有亲水性或亲油性，最后通过胶溶等方式来 获得磁性液体，另外一种是制得纳米f e 3 0 4 复合粒子，这种纳米f e 3 0 4 复合粒子能在 更大p h 范围内稳定分散。蒋新宇等( 2 0 0 3 ) 先通过化学反应生成f e 3 0 4 微粒，充分 洗涤后对其表面包覆双层表面活性剂，得到具有磁响应性和稳定性强的纳米级f e 3 0 4 磁性粒子。在改性过程中，ph 值、表面活性剂的成分配比和表面活性剂的用量对颗 粒改性效果影响很大，王伟等( 2 0 0 1 ) 通过大量的研究，强碱性和酸性环境不利于改 性，ph 值在8 - - - 1 2 时效果最好，通过理论计算可以得出表面活性剂用量。程海斌等 ( 2 0 0 3 ) 采用改进共沉淀法制得的纳米级f e 3 0 4 复合微粒，在更宽的ph 范围内能稳定 分散。研究表明，ph 值、表面活性剂、芎电位对f e 3 0 4 复合微粒分散性产生很大的 影响。另外，磁性微粒的化学制备方法还有化学还原法、电沉积法、水热合成法等。 1 4 2 磁性微粒的物理制备方法 1 4 2 1 高能球磨法 高能球磨法是一个无外部热能供给和由大晶粒变为小晶粒的高能球磨过程，其 原理是在高能球磨机中将金属粉末长时间运转，金属粉末在接受回转机械能传递后， 在冷态下反复挤压和破碎作用下，成为弥散分布的超细微粒粒。气流磨作为常用的 纳米粉碎技术，其通过热蒸汽能量或者高速气流产生的粒度微细，粒度分布窄、粒 子表面光滑、分散性好、活性大、形状规则、纯度高等优点。 7 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 1 4 2 2 物理气相沉积法 物理气相沉积法是利用真空蒸发、激光加热蒸发、溅射、电子束照射等方法使 原料气化或形成等离子体，接着在介质中急剧冷凝。虽然制得的纳米微粒纯度高， 结晶组织好，易于粒度的控制，但是技术设备相对要求高。根据加热源的不同，目 前用于制备纳米铁微粒的方法可以分为： 1 、热等离子体法，该法是将金属粉末用等离子体熔融、蒸发和冷凝以制得纳米 微粒。所制得的微粒粒度均匀、纯度高。郝春成等( 2 0 0 0 ) 采用心+ h 2 电弧等离 子体方法制备出平均粒径为4 0 r i m 的球形超铁超微粒子。 2 、溅射法，溅射法是替代蒸发利用溅射现象制得的纳米级微粒。该法不仅可 以制备纳米级金属微粒，而且可用于制备纳米金属薄膜。 3 、惰性气体冷凝法，是将纯度高的惰性气体和蒸发物质引入到真空加热蒸发装 置内，经过一系列能量反应，最后通过凝聚作用形成纳米级簇团。刮下聚集在液氮 冷却棒上的粉状微粒，在真空高压装置中制备成厚度为1 0 微米1 毫米、直径为几 毫米的圆片。 1 4 2 3 真空冷冻干燥法 先将湿物料在冷冻剂作用下降温冻结成凝胶或固体，然后将凝胶或固体在低温 低压下真空干燥，使凝胶或固体中的溶剂成分升华除去，从而得到干燥的纳米粒子。 这种方法结合了真空技术和低温技术。采用真空冷冻干燥法制备纳米粒子，具有微 粒形状规则、粒径小且均匀、粒子间无硬团聚、化学纯度高、分散性好、比表面积 高等优点。该技术方法在大规模生产微细粉末时，不仅成本较低，而且操作简便、 可靠，具有广泛的实用价值。另外，磁性微粒的物理制备方法还有聚合法、盐析法、 深度塑性变形法、分子自组装法( s a ) 、l b 膜法等。 1 5 磁性微粒的表面修饰及其应用 通过利用物理、化学方法去改变磁性微粒的表面状态，从而改善和提高其性能， 更好的广泛应用于生物医学等各个领域。 周红梅等( 2 0 0 6 ) 通过磁性微粒的表面改性及分散方式对硅油基磁性液体稳定 性的影响进行了一系列探索，实验结果表明，在f e 3 0 4 微粒粒径大小一定的条件下， 硅油基磁性液体的稳定性主要由f e 3 0 4 微粒、过渡液、表面活性剂三者的用量决定， 使用的分散方式对其也会产生影响。这些条件的摸索对于研制性能稳定的硅油基磁 性液体具有重要意义。衡量磁性液体性能的关键指标是磁性液体的稳定性即磁性液 体中磁微粒抗聚沉的能力，对其磁性能和使用寿命产生直接影响。影响稳定性的主 要因素包括：( 1 ) 磁性液体的基体材料即磁性微粒粒径的大小：( 2 ) 磁微粒经过 8 免疫磁珠的制各及其初步应用 表面活性剂包覆后在载液中的分散状态如何，即磁性微粒的形式存在是以单个粒子 还是以聚团的形式存在。( 3 ) 用表面活性剂进行改性可以降低磁粒子的比表面能， 有效阻止磁粒子聚团；载液与表面活性剂的亲和性。 杨旭等( 2 0 0 6 ) 通过自由基聚合包裹f e 3 0 4 后制备的高分子磁性微粒，抗机械振 荡的能力更强，稳定性更好。在外磁场作用下，含氨基的磁性高分子微粒，携带功 能基氨基定向移动，有广泛的用途：氨基可结合一些生物活性物质( 蛋白质、氨基酸 等) ，是一种良好的生物酶载体；通过氨基与羰基之间化学的有效结合，可以检测 和处理废水、污水中含醛酮羰基的有机化合物。通过与具有空轨道的金属离子结合 形成稳定的配位化合物，对检测和处理废水中的金属离子具有重要作用。随着壳聚糖 脱乙酰技术的成熟，采用像聚氨基酸、明胶和脱乙酰壳聚糖等这类多糖包裹制备磁性 高分子微粒的研究越来越多。但这类高分子包裹率低、包裹的稳定性差，抗机械振荡 能力差，且脱乙酰壳聚糖上存在着空间位阻大、氨基比羟基少的不足，对磁性高分子 微粒的应用有着的直接影响。可将不具有聚合功能的胺类小分子引入到高分子磁性 微粒的表面，得到稳定性好、含如氨基这类单一功能基的磁性高分子微粒。c h a n g 等 ( 2 0 0 5 ) 制备了用于除去c u 2 + 的壳聚糖结合f e 3 0 4 磁性纳米微粒。 。 邱广亮等( 1 9 9 9 ) 利用磁性聚乙二醇载体固定化葡萄糖淀粉酶，能最大限度的 保留酶活性。丁丽俐等( 2 0 0 1 ) 利用氨基末端磁性载体固定化中性蛋白酶进行了研 究，氨基末端磁微粒为载体的基础上，用交联剂( 戊二醛) 共价交联结合法固定化 a s l 3 9 8 中性蛋白酶，制备出活力达5 60 0 0u g 磁性固定化酶。磁性固定化酶的储 存稳定性、热稳定性、操作稳定性及该载体对中性蛋白酶的最适固定化条件进行了 摸索，确定了固定化磁性酶的催化特性( 最适温度为6 0 ，最适p h 为7 6 ) ，及 该载体对酶的固载能力大于3 0 0m e , g ( 载体) 。 共价结合法固载酶往往会引起酶蛋白高级结构变化，对部分活性中心造成破坏， 会影响磁性固定化酶的活力。氨基末端磁微粒是良好的蛋白质载体之一，磁性氧化 铁微粒外包被氨基基团后，将载体与酶通过共价键结合起来。酶与载体结合牢固， 而且固定化酶稳定性好，可多次使用，不会因有盐离子存在或因底物浓度高而轻易 脱落。载体对蛋白质的固载量很大( 3 0 0m g g ) 、磁响应性强，通过外磁场作用极 易将酶从反应体系中分离出来。磁性固定化酶活力和活力稳定性等方面都具有一定 的优势。 9 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 1 6 磁性微粒在生物医学领域中的应用 1 6 1 用于靶向载药 传统的给药系统虽然有较好的药理作用，严重的不良反应及毒副作用造成其使 用范围受限，药物的靶向性是指经特殊加工后药物能高选择性地分布于作用对象即 组织和器官周围，从而增强药物治疗的效果，减少药物的毒副作用。纳米粒子可作 为药物载体，优点是比细胞还小，易被组织细胞吸收，纳米给药系统是指药物与药 用材料一起形成的粒径为1 0 1 0 0 0 纳米的纳米级药物输送系统，由于纳米尺度下的纳 米级药物输送系统及其所用材料的性质、表面修饰等，纳米给药系统在实现靶向给 药、缓释药物、提高多肽药物与难溶性药物的生物利用度、提高其在体内输送过程 中的稳定性、降低药物的毒副作用等方面表现出良好的应用前景。纳米给药系统的 出现为更好地发挥这类药的作用和解决了靶向定位的问题带来了新的希望。 随着磁控靶向放射治疗技术的不断成熟，在生物医学领域也得到了广泛的应用。 放射性核素一纳米铁的平均粒径小于10 0 r i m ，具有放射性活度、超顺磁性和较好的 磁导向功能，可按预期的方式有效地定位于靶区。用磁性纳米铁作为载体与抗肿瘤 物质结合，通过肿瘤区域定位于磁场中，通过这种磁控靶向方式就能有效地控制载 体在机体内分布，达到化疗药物靶向运输的目的。 周平红等( 2 0 0 3 ) 进行了磁性阿霉素脂质体靶向治疗裸鼠大肠癌的实验研究， 应用逆向蒸发法制备磁性阿霉素脂质体，磁性阿霉素脂质体平均粒径2 3 0i l r l l ，磁性 颗粒均匀分布于脂质体中，进行体内靶向定位实验，测定其对裸鼠大肠癌的瘤重抑 制率和肿瘤细胞凋亡率。通过磁性阿霉素脂质体外加磁场给药，可以使肿瘤靶区的 化疗药物浓度增加，在大肠癌肿瘤组织中磁场的作用下，磁性阿霉素脂质体显著抑制 肿瘤组织的生长。尾静脉注射磁性阿霉素脂质体，瘤重抑瘤率高达5 3 。作为化疗 药物的新型载体，磁性阿霉素脂质体的这种良好的磁靶向定位作用和明显的抑瘤作 用，为一种新型化疗药物载体进一步应用于临床肿瘤治疗奠定了基础。 慕容( 2 0 0 5 ) 通过载阿霉素磁性壳聚糖毫微球靶向治疗大鼠移植性肝癌进行了 大量研究，考察了磁性壳聚糖毫微球的吸附，释放药物的性能，及其免疫原性和体 外磁场响应性，并观察了磁性壳聚糖毫微球在肝癌大鼠体内的生物分布和靶向给药 对肝癌大鼠生存期的影响。阿霉素磁性壳聚糖毫微球治疗大鼠移植性肝癌可以部分 抑制对骨髓干细胞的损伤作用。使用阿霉素磁性壳聚糖毫微球经门静脉给药治疗大 鼠移植性肝癌，对减轻骨髓抑制毒性产生明显效果，显著延长了荷瘤动物的寿命。 磁性壳聚糖毫微球由于在体外体内具有良好的磁场响应性，通过外加磁场的作用方 式给药，阿霉素可以有效地聚集到靶区，显著提高靶区阿霉素的浓度，降低心脏、 1 0 免疫磁珠的制备及其初步应用 肾脏组织中药物浓度。磁性壳聚糖毫微球作为的阿霉素有效载体，通过加磁场的给 药方式，有望成为肿瘤靶向治疗的新途径。 1 6 2 用于细胞分离 与常用的细胞分离方法相比，利用免疫磁性微球技术进行细胞分离具有简单、快 捷、高效和安全等特点。免疫磁性微球技术可用来分离人类各种细胞，如红细胞、造 血细胞、神经干细胞、t 淋巴细胞、外周血嗜酸碱性粒细胞及多种肿瘤细胞等。 u g e l s t a d 等( 1 9 8 3 ) 提出用磁性微粒用于细胞分离，o r e k h o v a 等( 1 9 9 0 ) 利用磁性微 球在骨髓移植过程中对骨髓中的t 淋巴细胞成功地进行了提纯，然后应用于进一步的 分类及功能研究等。马东初等( 1 9 9 2 ) 用g p i i b i i i a 血小板单克隆抗体结合磁珠分离 人骨中的巨核细胞，其纯度达8 6 8 9 5 7 ，且6 0 的巨核细胞具有生物活性，磁性分 离后的巨核细胞超微结构保持完整，对巨核细胞的分子生物学和细胞生物学等方面 的研究起到重要作用。s a k a i 等( 1 9 9 4 ) 应用多抗修饰的磁性微球对人体骨髓干细胞 ( c d 3 4 ) 、t 辅助细胞( c d 4 ) 等免疫细胞成功地进行了分离，分离效率达9 9 8 以上。 w r i w a t z 等( 1 9 9 5 ) 首次报道了应用磁性激活细胞分选技术在恶性肿瘤患者的外周血 中分离出单个肿瘤细胞，认为该技术是较好分离靶细胞的分选方法。曹文俊等( 2 0 0 2 ) 利用免疫磁珠分离法白血病转基因鼠骨髓造血干细胞。秦超等( 2 0 0 4 ) 利用免疫磁 珠法分离和纯化重症肌无力患者骨髓c d 3 4 + 造血干细胞，用流式细胞仪对其进行评 估并检测纯化后细胞活力，研究结果表明，采用免疫磁珠法可有效地分选重症肌无 力患者骨髓c d 3 4 + 造血干细胞，分选前后细胞活力保持良好状态，用于临床造血干 细胞移植和干细胞基因治疗有重要意义。 1 6 3 用于蛋白质的分离与纯化 传统蛋白质分离方法有：有机溶剂沉淀法、盐析、层析技术和膜分离技术等，传 统蛋白质分离方法存在着操作过程繁琐、耗能、对目的蛋白质的损失很大的不足。 由于磁性微球的粒径小，表面含有活性基团，比表面积大，故偶联容量大，共价结合能 被目标蛋白质识别和可逆结合的配基，含有目标蛋白质的混合溶液中，将磁性微球 与待目标蛋白质密结合后，在外加磁场的作用下进行分离。含有目标蛋白质的混合 溶液中，将磁性微球与待目标蛋白质密结合后，在外加磁场的作用下进行，这种蛋 白质磁分离技术具有快速、高纯、高收率等优点。 丁小斌等( 2 0 0 0 ) 通过热敏性高分子磁性微球的合成对人血清白蛋白的吸附解 吸进行了研究，这种高分子磁性微球的磁分离特性简便快捷。余艺华等( 2 0 0 0 ) 通 过以壳聚糖为包裹材料包埋自制的一种壳聚糖亲和磁性毫微粒，这种亲和磁性微球 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 有较窄的粒径分布、形状规整，以牛血清白蛋白和溶菌酶为目标蛋白，显示出较高 的吸附性能，而且亲和磁性微球的重复使用性能是良好的。 1 6 4 用于核酸分离纯化 含有沉淀，离心等过程的传统的核酸分离技术，步骤繁锁、费时长、回收效率低， 很难实现自动化操作，而磁性载体微球分离技术能够实现样品地快速、高效制备， 未来核酸纯化方法的发展具有重要作用。 o s t e r 等( 2 0 0 1 ) 采用聚乙烯醇磁性微球快速、高效地分离特定和非特定序列 的核酸，在不同地血样中成功地提取了基因组d n a ，具有快速、高得率和高纯度等 特点。x i e 等( 2 0 0 4 ) 将表面带羧基的超顺纳米级磁性微粒，应用于从人全血分离 基因组d n a ，不仅产量高，损失小，而且不需要离心过程操作简便，极具发展前景 m i y a e h i 等( 1 9 9 9 ) 用它作为被提取物h c v r n a 的磁性探针，进行分离后将h c v r n a 用于p c r 扩增，具有很好的效果。有学者用偶联在磁性微粒上的1 7 8 b p 的基因特异性 探针对鼠血管舒缓素结合蛋白的e d n a 进行捕获，可进行各种固定于磁性微粒上探针 的特异c d n a 的制备。 b o s e 等( 1 9 9 7 ) 经卵磷脂包裹后的磁性微粒表面偶联亲和