（分析化学专业论文）拟南芥中与蓝光受体cry2相互作用蛋白的生化分析.pdf

硕上学位论文 摘要 隐花色素c r y 2 ( c r y p t o c h r o m e2 ) 是植物感受蓝光的光受体之一，它介导了 蓝光调节植物的光形态建成反应，如抑制下胚轴的伸长、调节昼夜节律、激活基 因转录和调节开花等。c a s h m o r e 等人1 9 9 3 年就确定c r y 2 是植物的蓝光受体，但是 直到现在，在蓝光受体c r y 2 信号传导方面的研究一直没有重大突破；因此，首先 有必要通过各种分子生物学与遗传学的方法找到与蓝光受体c r y 2 相互作用的蛋 白，为进一步研究c r y 2 介导的信号传导途径奠定基础。 本研究首先构建了酵母双杂交载体p b r i d g e c r y 2 ，然后以p b r i d g e c r y 2 作为 b a i t 对构建在p r e y 载体p a c t l 中的酵母双杂交文库进行了筛选。通过筛选酵母双杂 交文库发现蓝光下c r y 2 可能与多种蛋白发生相互作用。其中包括生物钟核心振荡 器组分蛋白l h y 与c c a l ，翻译起始因子e i f 4 e ，磷酸酶a t 3 g 5 13 7 0 ，以及激酶 c k a 2 和c k i 。 本课题重点对c r y 与生物钟相关蛋白的相互作用进行了深入研究。通过 r t - p c r 克隆了c k a 2 ，日】，c c a l 基因，并成功构建了p g a d t 7 c k a 2 ， p g a d t 7 l h y ，p g a d t 7 c c a l 载体。我们通过营养缺陷型培养试验，滤纸显色 反应和液相显色反应检测了在蓝光和黑暗条件下p b r i d g e c r y 2 与 p g a d t 7 c k a 2 ，p g a d t 7 l h y ，p g a d t 7 c c a l 在酵母体内的相互作用。结果 发现：c r y 2 蛋白在蓝光条件下与c k a 2 有较强的相互作用，而与l h y ，c c a l 的相互作用较弱，而且c r y 2 与c k a 2 ，l h y ，c c a l 的相互作用强度与蓝光光 强呈正相关；而在黑暗条件下c r y 2 与所检测蛋白均无相互作用。 成功构建了p c o l d t f c k a 2 ，p c o l d t f l h y ，p c o l d t f c c a l 原核表达载体， 并采用大肠杆菌b l 2 1 表达得到了可溶的重组蛋白。然后，利用免疫共沉淀的方 法检测了c r y 2 蛋白与c k a 2 ，l h y ，c c a l 蛋白之间的体外相互作用。结果表 明拟南芥体内的c r y 2 蛋白能够与原核表达的重组蛋白c k a 2 ，l h y ，c c a l 在 体外相互作用。 采用裂解荧光素酶互补分析系统进一步研究了c r y 2 蛋白与c k a 2 ，l h y ， c c a l 蛋白在植物细胞体内的相互作用。实验构建了c r y 2 n l u c 质粒， c k a 2 c l u c 质粒，l h y - c l u c 质粒和c c a l c l u c 质粒。试验结果表明：c k a 2 与c r y 2 蛋白之间的相互作用较强，约为对照组c r y 2 与c o p l 蛋白之间作用强 度的一半；而c r y 2 与l h y ，c c a l 的作用强度较弱，约为对照组c r y 2 与c o p l 蛋白作用强度的1 3 。 关键词：拟南芥；隐花色素2 ；酵母双杂交；裂解荧光素酶互补分析； 拟南芥中与蓝光受体c r y 2 相互作用蛋白的生化分析 a b s t r a c t c r y p t o c h r o m e sa r eb l u el i g h tp h o t o r e c e p t o r sf o u n di np l a n t s ，b a c t e r i a ，a n d a n i m a l s i na r a b i d o p s i s ，e r y p t o c h r o m e2 ( c r y 2 ) i sp r i m a r i l yi n v o l v e di nt h ec o n t r o l o fb l u el i g h tr e g u l a t i o no fp l a n tp h o t o m o r p h o g e n i cr e s p o n s e s ，s u c ha si n h i b i t i n g h y p o c o t y le l o n g a t i o n ，r e g u l a t i n gc i r c a d i a nr h y t h m ，a c t i v a t i n gg e n et r a n s c r i p t i o na n d r e g u l a t i n go ff l o w e r i n ga n ds oo n c a s h m o r ee ta lf o u n dt h a tc r y 2i sab l u el i g h t r e c e p t o ri np l a n t si n 19 9 3 ，b u tt od a t e ，t h e r ei sn ob r e a k t h r o u g ho nt h ec r y 2b l u e l i g h tr e c e p t o rs i g n a lt r a n s d u c t i o nr e s e a r c h ；i ti sn e c e s s a r yt oa d o p tm o l e c u l a rb i o l o g y a n dg e n e t i c sm e t h o dt of i n dt h ep r o t e i n sw h i c hi n t e r a c t i o nw i t hc r y 2p r o t e i n ，s ot h a t w ec a ng e ts o m eb r e a k t h r o u g ho nt h es t u d i n go fc r y 2 m e d i a t e ds i g n a lt r a n s d u c t i o n p a t h w a y f i r s t l y ，w ec o n s t r u c t e day e a s tt w o - h y b r i dv e c t o rp b r i d g e c r y 2 ，a n dt h e nu s e d p b r i d g e - c r y 2a sb a i tt os c r e e nt h el i b a r a yw h i c hc o n s t r u c t e di nt h ep r e yv e c t o r p a c t 1 b ys c r e e n i n gy e a s tt w o h y b r i dl i b r a r yu n d e rt h eb l u el i g h t ，i tw a sf o u n dt h a t c r y 2m a yi n t e r a c tw i t hav a r i e t yo fp r o t e i n s ，i n c l u d i n gt h ec o r ec l o c ko s c i l l a t o r c o m p o n e n tp r o t e i nl h ya n dc c a1 ，t r a n s l a t i o ni n i t i a t i o nf a c t o re i f 4 e ，p h o s p h a t a s e p r o t e i na t 3 g 5137 0 ，a sw e l la st h ek i n a s ep r o t e i n sc k a 2a n dc k i w ec o n d u c t e df u r t h e r s t u d y o nt h e s c r e e n i n g o u tp r o t e i n s w h i c hw e r e c l o c k - r e l a t e d t h r o u g hr t - p c rw ec l o n e dc k a 2 ，l h y ，c c a 1g e n e ，a n dc o n s t r u c t e d p g a d t 7 一c k a 2 ，p g a d t 7 - l h y ，p g a d t 7 一c c a lv e c t o r s t h r o u g ha u x o t r o p h i c c u l t u r ee x p e r i m e n t s ，b e t ag a lf i l t e ra s s a ya n db e t ag a ll i q u i da s s a yi nt h e b l u e - l i g h ta n dd a r kc o n d i t i o n s ，w ea n a l y z e dt h ei n t e r a c t i nb e t w e e np b r i d g e - c r y 2a n d p g a d t 7 - c k a 2 ，p g a d t 7 - l h y ，p g a d t 7 - c c a li n v i t r oa n di nv i v o t h er e s u l t s s h o w e dt h a t ：i nb l u el i g h tc o n d i t i o n s ，c r y 2h a v es t r o n g e ri n t e r a c t i o nw i t hl h y ， c c a lt h a nw i t ht h ec k a 2 ，a n dt h ei n t e r a c t i o ns t r e n g t hb e t e w e e nc r y 2a n dc k a 2 ， l h y ，c c a 1w e r ed e p e n d e n to nb l u e - l i g h ti n t e n s i t y u n d e rd a r kc o n d i t i o n s ，c r y 2 p r o t e i nc a n n o ti n t e r a c tw i t ho t h e rp r o t e i ni nt h et e s t s w ea l s oc o n s t r u c t e d p c o l d t f - c k a 2 ，p c o l d t f - l h y ，p c o l d t f c c a l p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r s u s i n ge c o l ib l 2 1 ，w ee x p r e s s e da n dg o tt h es o l u b l e r e c o m b i n a n tp r o t e i n t h e n ，u s i n gc o - i m m u n o p r e c i p i t a t i o nm e t h o dw ed e t e c t e dt h e i i i 硕士学位论文 i n t e r a c t i o nb e t w e e nc r y 2p r o t e i na n dc k a 2 ，l h y ，c c a lp r o t e i ni nv i t r o t h e r e s u l t ss h o w e dt h a ta r a b i d o p s i sc r y 2p r o t e i nc o u l di n t e r a c tw i t ht h er e c o m b i n a n t p r o t e i nc k a 2 ，l h y ，c c a li nv i t r o u s i n gs p l i t l u c i f e r a s ec o m p l e m e n t a r ya n a l y s i ss y s t e m ，w ep e r f o r m e df u r t h e r s t u d i n gt h e i n t e r a c t i o nb e t w e e nc r y 2p r o t e i na n dc k a 2 ，l h y ，c c a lp r o t e i ni n p l a n tc e l l s ( i nv i v o ) c r y 2 一n l u cp l a s m i d ，c k a 2 - c l u cp l a s m i d ，l h y - c l u c p l a s m i d sa n dc c a i c l u cp l a s m i dw e r ec o n s t r u c t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：t h e i n t e r a c t i o ns t r e n g t hb e t w e e nc k a 2a n dc r y 2p r o t e i nw a sh a l fo ft h ec o n t r o lg r o u p ( c r y 2a n dc o p1 ) ；w h i l et h e r ew a so n l y1 3i n t e r a c t i o ns t r e n g h tb e t w e e nc r y 2a n d l h y c c a lc o m p a r e dt ot h ec o n t r o lg r o u p ( c r y 2a n dc o p l ) k e yw o r d s ：a r a b i d o p s i st h a l i a n a ；c r y p t o c h r o m e2 ：y e a s tt w oh y b r i d ；s p l i tl u c c o m p l e m e n t a r ya s s a y ； 拟南芥中与蓝光受体c r y 2 相互作用蛋白的生化分析 c r y l c r y 2 p h y a p h y b w t c r y 3 p h o t l p h o t 2 p v d f g t p d n t p l h y c c a l c k a 2 c o p l d e t l h y 4 l k p 2 f k f z t l b l u f t o c i e i f 4 e c k l f a d m t h f p h r g u s 隐花素1 隐花素2 光敏素a 光敏素b 野生型 隐花素3 向光素1 向光素2 聚偏二氟乙烯 缩略词 三磷酸鸟苷 三磷酸碱基脱氧核苷酸 延迟伸长下胚轴1 生物钟相关因子1 酪蛋白激酶2 持续光形态建成1 去黄化同源1 长下胚轴4 含l o v 与k e l c h 结构蛋白2 含k e l c h 与f 盒结合黄酮蛋白 z e i t l u p e 蛋白 结合f a d 的蓝光受体 控制c a b 节律表达1 真核翻译起始因子4 e 酪蛋白激酶1 黄素腺嘌呤二核苷酸 四氢叶酸 光解酶类似序列 p 一葡聚糖酸醛苷酶 v i i c r y p t o c h r o m e1 c r y p t o c h r o m e2 p h y t o c h r o m ea p h y t o c h r o m eb w i l dt y p e c r y p t o c h r o m e3 p h o t o t r o p i n1 p h o t o t r o p i n2 p o l y v i n y l i d e n e d i f l u o r i d e m e m b r a n e g u a n o s i n et r i p h o s p h a t e d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e l a t ee l o n g a t e dh y p o c o t y l c i r c a d i a nc l o c k a s s o c i a t e d1 c a s e i nk i n a s ei i c o n s t i t u t i v ep h o t o m o r p h o g e n i c1 d e e t i o l a t e dh o m o l o g1 l o n gh y p o c o t y l s4 l o vk e l c hp r o t e i n2 f l a v i nb i n d i n gk e l c hr e p e a tf - b o x z e i t l u p e b l u el i g h tr e c e p t o ru s i n gf a d t i m i n go fc a be x p r e s s i o n1 e u k a r y o t i c t r a n s l a t i o ni n i t i a t i o n f a c t o r4 e c a s e i nk i n a s e1 f l a v i na d e n i n ed i n u c l e o t i d e m e t h y l t e t r a h y d r o f o l a t e p h o t o l y a s eh o m o l o g yr e g i o n b e t sg l u c u r o n i d a s e 硕士学位论文 g f p h i s l e u t r p i p t g 绿色荧光蛋白 组氨酸 亮氨酸 色氨酸 g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n h i s t i d i n e l e u c i n e t r y p t o p h a n 异丙基一p d 一硫代半乳糖i s o p r o p y l 苷道p d1t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e c r y 2 o xc r y 2 过表达 p b s c d n a 磷酸缓冲液 互补d n a r t - p c r逆转录聚合酶链式反应 p a g e e d t a e g t a 聚丙烯酰胺凝胶电泳 乙二胺四乙酸 乙二醇二乙醚二胺四乙酸 t e m e d四甲基二乙胺 a p s d s p m s f p e g m l x m m m s h m l n m l p l 高氯酸铵 十二烷基硫酸钠 苯甲基磺酰氟 聚乙二醇 摩尔 微摩尔 毫摩尔 秒 小时 分钟 毫升 微升一 v i i i c r y 2o v e r e x p r e s s p h o s p h a t eb u f f e rs a l i n e c o m p l e m e n t a r yd n a r e v e r s - t r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s e c h a i na c t i o n p o l ya c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d e t h y l e n eg l y c o lt e t r a a c e t i ca c i d t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e a m m o n i u mp e r c h l o r a t e d o d e c y ls u l f a t e ，s o d i u ms a l t p h e n y l m e t h a n e s u l f o n y lf l u o r i d e p o l y e t h y l e n eg l y c o l m o l e m i e r o m o l e m i l l i m o l e s e c o n d h o u r m i n u t e m i l l i l i t r e m i c r 0 1 i t r e 硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 植物蓝光受体分类与分子结构特征 1 1 1 隐花色素的分类与分子结构 隐花色素是通过吸收蓝光( 4 0 0 - - 5 0 0a m ) 和近紫外光( 3 2 0 , - - - 4 0 0r i m ) 从而调节 植物形态及新陈代谢变化和向光性反应的一类光敏受体。其作用光谱的特征是在 蓝紫光区有3 个吸收峰( 通常在4 5 0 姗，4 2 0r i m 和4 8 0n m 左右) ，在近紫外光区有一 个峰( 通常在3 7 0 - - 3 8 0r i m ) ，不能吸收大于5 0 0r i m 波长的光，不同植物对蓝光效应 的作用光谱稍有差异【l l 。 1 1 1 1 隐花色素的种类 隐花色素在单子叶植物、双子叶植物、蕨类、藓类和藻类中都存在【2 9 】。多数 植物中存在两种以上的隐花色素。2 0 世纪末许多生物学家和遗传学家都以拟南芥 为模式生物，筛选到了一些光形态建成相关的光受体缺陷突变体，并已在拟南芥 中鉴定出隐花色素家族的3 个成员：c r y l 10 1 、c r y 2 1 1 1 和c r y 3 12 1 ，人们利用这些 突变体且根据光谱反应将隐花色素界定为一种类d n a 光裂解酶的蓝光受体。大量 的研究表明隐花色素是类光解酶( p h o t o l y a s e 1 i k e ) 的黄素蛋白多存在于核中且其结 构具有两个可识别区域：与光解酶有同源序列的n 端p h r ( p h o t o l y a s er e l a t e d ) 结构 域和与已知蛋白质不完全相似的但发挥隐花色素功能的c 端结构域【1 2 , 1 5 】，且p h r 区域非共价结合初级发色集团f a d ( 黄素腺嘌呤二核苷酸) 和次级光吸收集团。它 们的蛋白结构见图1 1 。番茄和大麦都有至少3 种隐花色素基因，c y r l a 、c y r l b 和c y r 2 1 3 1 。蕨类和藓类分别有5 种和至少2 种隐花色素基因【2 ，6 ，7 1 。 多数植物隐花色素除了n 末端的p h r 结构域外，还有c 末端的延长，c 末端结 构域对于拟南芥c r y l 和c r y 2 基因的功能发挥是必需的，l 引。然而，不同隐花色素 的c 末端的长度变化相当大，藻类有3 8 0 个氨基酸，拟南芥的c r y l 和c r y 2 分别有 1 9 0 个氨基酸和1 2 0 个氨基酸，而白芥菜的s h p h r 和铁线蕨的a c c r y 5 几乎没有c 末端的延长【l5 1 。隐花色素在p h r 区域比c 末端区域表现出更高的序列相似性 2 , 1 3 , 1 6 】。例如拟南芥c r y l 和c r y 2 在p h r 区域有5 8 同源性，但在c 末端区域的同 源性仅1 4 ，比e c o l i 光复活酶的p h r 区域同源性( 3 0 ) 更低p ，l 引。 1 1 1 2 隐花色素c r y l 1 9 世纪8 0 年代蓝光受体首先从模式植物拟南芥中鉴定出来，随后一批拟南 芥光形态建成的突变体被相继分离出来，h y 4 突变体就是其中之一。研究发现在 蓝光下，虽然b y 4 突变体下胚轴伸长生长的抑制反应减弱，但查尔酮生物合成酶 拟南芥中与蓝光受体c r y 2 相互作用蛋白的生化分析 l 西j p 一一一高_ 算；一q o 哪，蠹嘲 一一之胃二，熏禽一，粕黼二：一_ 。，；： 图1 1 植物隐花色素的功能域结构。图示的为三个拟南芥中鉴定出来的隐花色素，其中高度 保守的区域为p h r 功能域，约5 0 0 b p ，能非共价地结合f a d 与m t h f 。c r y l 与c r y 2 有一个额 外的c c t 功能域。c c t 功能域包含有3 个保守的模体，其在陆地植物中存在一定的保守性， 统称为d a s 功能域【14 1 。 f i g u r e1 1 d o m a i ns t r u c t u r eo fp l a n tc r y p t o c h r o m e s t h et h r e ec r y p t o c h r o m e si d e n t i f i e di n a r a b i d o p s i sa n dt h e i rc o f a c t o r sa r es h o w ns c h e m a t i c a l l y t h eh i g h e s te o n s e r v m i o na m o n gt h e p r o t e i ns e q u e n c e si sf o u n di nt h ep h o t o l y a s eh o m o l o g yr e g i o n ( p h r ，c e n t r a lp a n ) t h i sr e g i o ni s a b o u t5 0 0a m i n oa c i d sl o n ga n db i n d st h ef a da n dm t h fc o f a c t o r sn o n - c o v a l e n t l y c r y la n d c r y 2c a r r ya na d d i t i o n a ld o m a i na tt h ec - t e r m i n a le n d ( c c t ) ，t h ec c t sc o n t a i nt h r e em o t i f s c o n s e r v e di na l ll a n dp l a n tc r y p t o c h r o m e sa n dn a m e dt o g e t h e rt h ed a sd o m a i n 0 4 】 基因( c h s ) 表达却受到抑制，此现象表明h y 4 可能是抑制拟南芥下胚轴伸长并 调节相关基因表达的蓝光受体。l i n 等采用分子重组及光化学技术第一次成功地 分离了第一个蓝光受体蛋白h y 4 即c r y l ，他们的研究表明c r y l 开放阅读框编 码6 8 1 个氨基酸，其中n 末端区域( 约5 0 0 个氨基酸) 与微生物d n a 修复酶即 光解酶( d n ap h o t o l y a s e ) 的氨基酸序列的同源性高于3 0 【1 7 , 1 8 】，而c r y l 蛋白 c 末端的1 8 0 个氨基酸结构在大肠杆菌光解酶中却没发现，但这个结构却是光受 体发挥功能所必须的。此外人们的研究还表明，c r y l 蛋白在体外或大肠杆菌细 胞中均无光解酶活性，以上结果表明c r y l 是介导抑制拟南芥下胚轴伸长的蓝光 受体，而不是d n a 光解酶 1 9 , 2 0 j 。 在黑暗下生长的拟南芥转基因植株中，与c r y i 蛋白c 末端区域( g u s 2 c c t l ) 构成的融合蛋白也定位于核中，但是在照光下生长时则定位于细胞质中【2 1 1 。因此 人们认为拟南芥c r y l 蛋白在黑暗或光照条件下可能分别聚集于核或胞质中。 1 1 1 3 隐花色素c r y 2 通过对c r y l 与c r y l c r y 2 的双突变体的研究发现c r y l 突变体对蓝光仅仅是部 分不敏感，它还保留了对蓝光的感应，因此推测有其他的蓝光受体存在。l i n 等 利用拟南芥c r y lc d n a 为探针分离得到的拟南芥中第2 个蓝光受体【2 2 1 ，由于这 个蛋白的n 端与c r y l 的n 端区域序列有5 8 的同源性【2 3 1 ，所以这个基因命名 硕士学位论文 为c r y 2 。通过对c r y l 和c r y 2 蛋白结构研究发现：两者结合生色团的氨基端结 构域同源性高，且在大肠杆菌中过量表达的拟南芥c r y l 和c r y 2 蛋白甚至结合 相同的生色团，但c r y l 和c r y 2 蛋白在羧基端的结构域却几乎没有同源性。有 趣的是，c r y l 和c r y 2 结构域的交换实验表明二者蛋白的所有结构域在功能上 是互换的【2 4 1 。所以人们认为，虽然蓝光受体蛋白的羧基端在序列上存在很大差别， 但他们可能有相同或相似的功能。 l i n 等的研究发现：c r y 2 受蓝光诱导的磷酸化导致构象的改变对光活性是必 需的。为了进一步研究光是怎样激活c r y 2 的，研究人员分析了转基因植物中各种 c r y 2 融合蛋白的生理活性和磷酸化状态。结果显示位于发色团结合功能域p h r 与c 端的8 0 残基模体( n c 8 0 ) 对c r y 2 光受体行使生理功能是必需的。g u s 8 0 融合蛋白在植物中持续激活而未被磷酸化，这意味着蓝光诱导的c r y 2 全蛋白的磷 酸化导致了其构象的改变从而去抑制了n c 8 0 模体。研究还发现g f p c r y 2 需要蓝 光激活磷酸化而c r y 2 g f p 的磷酸化不需要蓝光激活。这个结果证明特定的构象 对c r y 2 的光响应是必需的，而c r y 2 的磷酸化导致了这种特定构象的形成。他们 的发现与c r y 2 的光活性的模型是一致的( 图1 2 ) 。这个模型认为在黑暗条件下 c r y 2 的p h r 功能域与未被磷酸化的c 末端形成了一个闭合的构象从而抑制了 n c 8 0 模体。接收蓝光后，c r y 2 被磷酸化，闭合构象被打开，n c 8 0 模体的抑制被 解除，从而启动信号转导和光形态建成反应【2 5 | 。 i n a c t i v ec r y o l i g o m e r h v l _ _ 船墨 p h o s p h o r y 4 a t e dc r y o l i g o m e r a c t i v ec r y c o m p l e x 图1 2 光诱导c r y 2 蛋白磷酸化导致构象改变从而被激活的模式图。图中的负电荷由磷酸化 导致；x ，y ，z 分别代表与被激活的c r y 2 蛋白的c 端相互作用的其他蛋白【2 5 1 。 f i g1 2am o d e ld e p i c t i n gl i g h t - i n d u c e dp h o s p h o r y l a t i o n ，c o n f o r m a t i o n a lc h a n g e ，a n da c t i v a t i o n o fc r y 2 n e g a t i v ec h a r g e sr e s u l t i n gf r o mp h o s p h o r y l a t i o n ( 一) a n du n i d e n t i f i e dc r y 2 i n t e r a c t i n g p r o t e i n s ( x ，y ，z ) a r ei n d i c a t e d 2 5 1 已有研究表明，照光后拟南芥的光敏素会被运输到细胞核中，但是隐花色素 光照后又会被定位到细胞的哪个部位? 随着研究的深入，人们从随机表达的 g f p c d n a 融合基因的转基因拟南芥植株中，鉴定了一个表达g f p c r y 2 的株系， 其g f p c r y 2 融合蛋白结合在所有的染色体上。另一研究发现c r y 2 g f p 融合蛋 白在黑暗中均匀地积累于转化烟草b y 2 2 原生质体的核中；蓝光诱导c r y 2 g f p 融 拟南芥中与蓝光受体c r y 2 相互作用蛋白的生化分析 合蛋白形成核斑块，当该融合蛋白与p h y b g f p 融合蛋白共同表达时，会共定位 于核斑块中。由于c r y 2 g u s 和c r y 2 g f p 融合蛋白不论在黑暗或光照下均定位 于转基因植物的细胞核中，因此可以认为c r y 2 是核蛋白 2 6 - 2 8 】。 1 1 1 4 隐花色素c r y 3 拟南芥的c r y 3 是最近几年才被鉴定出，他属于c r y d a s h 家族的成员。拟南 芥的c r y 3 有5 2 5 个氨基酸，6 0 7k d ，p o k o r n y 等【2 9 】用x 射线衍射的方法得至i j c r y 3 二聚体不对称单位。研究表明c r y 3 能够结合d n a ，定位在叶绿体和线粒体中1 3 哪； 因此，c r y 3 是第一个被发现定位于细胞质细胞器中的光受体。a z i zs a n c a r 团队的 研究表明：e r y d a s h 家族的一些成员具有d n a 链内环丁烷嘧啶二聚体修复功能， 但是当缺乏u v b 时，它却能够诱导形成d n a 链内环丁烷嘧啶二聚体。 c r y 3 与大多数的隐花色素差别较大，没有c 端延伸区，反而和光裂解酶类似 【3 。这种新类型的隐花色素在其他生物中也陆续被发现，它们在体内或体外没有 或仅有一点d n a 修复活性，因此被认为是隐花色素类，被称为c r y p t o c h r o m e d a s h 3 2 , 3 3 】。之所以叫c r y d a s h ，是为了突出表示在果蝇( d r o s o p h i l a ) 、拟南芥 口r a b i d o p s i s ) 、蓝藻( s y n e c h o c y s t i s ) 和人类( h o m o ) 中发现的这类隐花色素，目前被 认为是光裂解酶隐花色素家族中的一个新的分支，但是c r y d a s h 蛋白的生物学 功能尚不清楚。 最近，研究人员成功获得了c r y 3 蛋白的结晶，并在1 9a 的分辨率下测定了 其晶体结构【3 4 1 。结构显示其分子由同源二聚体构成，其中包含有两个辅助因子 f a d 和m t h f ( 见图1 3 ) 。通过利用吸收和荧光光谱学的方法对c r y 3 的光循环的 研究表明：在c r y 3 蛋白中m t h f f l 邑够向f a d 转移激发的能量，因此，m t h f 起到 了类似d n a 光裂解酶天线辅因子的作用。但是，c r y 3 的m t h f 的结合口袋构象 与d n a 光裂解酶有本质的差异，可能这种差异导致了它们行使了不同的生物学功 能。 1 1 2 向光素的发现与分子结构 向光素是继光敏色素、隐花色素之后发现的一种蓝光受体，分子量1 2 0 k d ， 能够结合黄素单核苷酸( f m n ) 进行自动磷酸化作用，它介导植物向光性运动、叶 绿体移动与气孔开放等反应，在蓝光信号传导反应中它启动生长素载体的运动和 诱导c a 2 + 的流动，从而调节植物细胞相关的反应。 18 8 1 年达尔文报道的蓝光诱导植物的向光性反应是最早的关于向光素的研 究，他观察到稿草( p h a l a r i sc a n a i e n s i s ) 的胚芽鞘在单侧蓝光照射下会发生向光弯 曲。迄今已知的由植物向光素调节的蓝光反应有向光性运动、叶绿体移动和气孔 开放等 3 , 4 1 。 1 9 8 8 年，g a l l a g h e r 等发现了豌豆黄化苗生长区有一种能够被蓝光诱导发生磷 硕士学位论文 图1 3 拟南芥隐花色素c r y 3 的二聚体结构。由红蓝两种颜色分别表示组成二聚体的两个单 体【3 4 】。 f i g u r e1 。3 o v e r a l ls t r u c t u r eo fa r a b i d o p s i sc r y 3 t h es t r u c t u r es h o w sad i m e r i co r g a n i s a t i o no f c r y 3w i t ht h et w om o n o m e r sp r e s e n t e di nb l u ea n dr e dc o l o u r 3 4 】 酸化作用的1 2 0k d 的质膜蛋白。这种蛋白在离体状态下能发生强烈的蓝光依赖型 的磷酸化作用，而在缺乏向光性的拟南芥突变体j k 2 2 4 中几乎没有这种蛋白。此 后，b r i g g s 等、l i s c u m 和r i g g s 、r e y m o n d 等 3 5 - 3 8 发现拟南芥突变体j k 2 2 4 在基 因位点n p h i ( n o n p h o t o t r o p i eh y p o c o t yz ，现在称为p h o t i ) 发生突变。编码这1 2 0 k d 质膜蛋白的p 剧基因则是从缺乏向光性的拟南芥突变体n p h l ( n o n p h o t o t r o p i e h y p o c o t y l s ) 中克隆出来的。c h r i s t i e 发现在昆虫细胞中表达的重组n p h l ，p h o t l 蛋白能够与f m n 非共价结合，且在体外也能发生蓝光依赖的自动磷酸化【l 。这 种重组蛋白的吸收光谱和荧光激发光谱与拟南芥向光性反应的作用光谱相似。同 时，他们还发现p h o t l 不仅是其自身磷酸化作用的激酶，也是植物向光性反应 的光受体。由于这种蛋白在植物向光性反应中发挥了重要作用，因此被命名为向 光素。 现在研究者已经在拟南芥、水稻、玉米等植物中相继发现了编码向光素的基 因，主要有p h o t l 和p h o t 2 ( 以前称为p 刖和n p l l ) 。向光素的相关蛋白在 植物的各个组织中都有分布，参与了调节诸如光照、氧气以及电位差等环境刺激 诱导的反应。向光素蓝光受体p h o t l 与p h o t 2 都含有两个重要的蛋白功能域【2 , 1 2 , 1 3 】： 一是具有能与f m n 结合的两个l o v ( 1 i g h t ，o x y g e n ，v o l t a g e 对光照、氧气及电 位差敏感区) 的n 末端敏感区域一l o v l 与l o v 2 ；另一是c 末端的s e r t h r 蛋 白激酶区域( 图1 4 ) 。 拟南芥中与蓝光受体c r y 2 相互作用蛋白的生化分析 l o v ll o v 2k i n a s e n h 2 c o o h 图1 4 拟南芥p h o t l 的分子结构 f i g1 4m o l e c u l a rs t r u c t u r eo fa r a b i d o p s i sp h o t l 1 1 3 其他蓝光受体 1 1 3 1 包含b l u f 结构域的蓝光受体 b l u f ( b l u el i g h tu s i n g t h ef a d ) 属于第三类蓝光受体蛋白，大约由1 0 0 个氨基 酸组成，包含有一个黄素发色团。g o m e l s k y 与k a p l a n 3 9 1 宅e 研究浑球红细菌 ( r h o d o b a c t e rs p h a e r o i d e s ) 光合作用相关基因的过程中，在a p p a 蛋白的h 端结 构域中首次发现了b l u f 结构。第二个b l u f 结构是在真核藻类小眼虫 ( p h o t o a c t i v a t e da d e n y l y le y c l a s e ，p a c ) 中发现的，它作为蓝光受体调节小眼虫的 的避光反应。在p a c 单体中，一个但单位的b l u f 环化酶结构域重复连接，进而 可能形成一个异八聚体【4 0 1 。d n a 数据库的搜索结果显示：b l u f 结构存在于很多 细菌中。b l u f 蛋白可以分为两类：一是多结构蛋白，包括a p p a 、p a c 和y c g f ； 另一个是所谓的s h o r t 蛋白，其n 端有b l u f 结构域，c 端则是由4 0 - 5 0 个氨基 酸残基组成【4 。 1 1 3 2 光敏色素p h y 3 此外n o z u e 等4 2 】在铁线蕨( a d i a m t u mc a p i l l a v e n e r i s ) 中也鉴定了一个光敏 受体，其n 端的5 6 6 个氨基酸与光敏色素高度同源，在大肠杆菌中表达的重组蛋 白可与吸收红光远红光的藻蓝素生色团结合而n 端的下游部分却与向光素十分相 似，也含有两个l o v 和一个丝氨酸苏氨酸激酶结构域，因此，这个特殊的色素 蛋白称之为光敏色素3 ( p h y 3 ) 或超级色素( s u p e r c h r o m e ) 。近年来，在转板藻 f m o u g e o t i as c a l a r i s ) r 和也发现了的p h y 3 的同族体【4 3 1 。迄今，尽管在高等植物中 尚未发现此类光敏素受体，也没有证明其与蓝光的相关关系，但此类光敏素受体 与向光素结构的相似性及其自身的特殊结构说明p h y 3 也值得深