（林木遗传育种专业论文）白桦愈伤组织再生系统的体细胞无性系变异研究.pdf

东北林业大学碟士学位论文 摘要 本文以白桦( b e t u l ap l a t y p h a l l a ) 5 个优良无性系为研究材料，取叶片作为外植体，用 l s 附加不同浓度的b a 作为培养基，对白桦愈伤组织再生途径的快繁系统进行了研究；同 时对愈伤组织及其再生植株的染色体数目变异进行了研究，对基因组d n a 变异进行了 a f l p 分析，结果如下： l 筛选出i s + ( 3 5 m e g l ) b a + 0 5 m g lk t + 2 蔗糖是诱导白桦愈伤组织繁殖的最优培养 基，诱导率达到8 0 以上：诱导产生的愈伤组织，在i s + 0 4m g lb a + 2 蔗糖分化培养基 中出芽率高达9 0 以上。 2 建立了白桦叶片直接出芽的再生系统：即在i s + ( 1 0 0 1 5 0 r a g l b a + 0 5 m g lk t + 2 蔗糖诱导2 0 天，然后在i s + 0 4 m g lb a + 2 蔗糖分化培养基中培养1 5 天能达到直接出 芽，每片叶片的丛生芽多达2 0 3 0 个，质量较高。 3 体细胞无性系的染色体数目变异模式：利用b a 诱导的愈伤组织及其再生植株的染色体 数目均发生不同程度的变异，随着b a 浓度的增加，再生植株二倍体细胞比例由5 0 * 0 逐 渐下降到3 9 7 5 ；由5 0 m g l b a 诱导的愈伤组织再生植株与对照相比染色体数目变异较 小，变异率为4 0 7 5 ；另外，随着继代培养时间的增加，再生植株二倍体细胞比例由 5 7 0 , 4 剧减到3 0 。 4 体细胞无性系的d n a 水平变异模式：随着b a 浓度的提高，再生植株的d n a 多态性片 段的比例明显提高，由b a 低浓度时的3 8 7 3 上升到高浓度时的6 1 3 3 ；继代1 5 次 的再生植株多态性片段比例依次为6 1 7 8 、7 4 9 1 、7 6 1 3 、7 2 5 1 和7 8 8 1 ，这表明 随着继代次数的增加，再生植株的d n a 多态性片段比例逐渐上升，变异逐渐加大。 5 通过细胞学观察和d n a 水平分析，确定高浓度激素和继代次数的增加是导致白桦体细胞 无性系变异产生的重要原因。 6 完善了适合于自桦总d n a 多态性分析的a f l p 技术，筛选出适合于白桦a f l p 分析的 1 3 对引物组合。 7 选出i s + 5 0 m g lb a + 0 5 m e g lk t + 2 蔗糖是使自桦快速繁殖，再生植株变异较小的培养 基，其再生植株继代培养应控制在5 代以内。 8 建立了白桦愈伤组织染色体制片技术：即取培养一周的愈伤组织，用o 2 的秋水仙素预 处理1 5 2 h ，固定后用1 n 。h c l 在室温1 8 2 0 1 解离1 0 1 5 m i n 或室温下用2 纤维素 酶和果胶酶混合液酶解3 0 m i n ，压片后易获得分散、染色效果好的细胞分裂中期染色体图 象。 9 初步建立了白桦愈伤组织化学诱变技术：在高浓度e m s 短时间处理和低浓度e m s 长时 间处理条件下可获得到叶柄、叶片愈伤组织的半致死剂量：通过观察半致死剂量下愈伤组 织细胞的染色体数目发现，诱变后细胞中单倍体、非整倍体及多倍体细胞比例均显著高于 对照，总变异率由诱变前6 0 。4 提高到8 9 9 3 ，这说明e m s 对自桦愈伤组织的诱变作用是 显著的。 关键词白桦：愈伤组织；体细胞无性系变异：a f l p i nt h i sp a p e r , t h el e a v e so f5c l o n e so fb e t u l ap l a t y p h a l l aw 鼬a 出：t i 】r e do b i sn 姚 s u p p l e m e n t e dw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f b a am p i dr e g e n e r a t i o ns y s t e mw a sd e v e l o p e dv i a t h ee s t a b l i s h m e n to fc a l l u s n 把p l o i d yo fr e g e n e r a t e dp l a n t l e t sf r o mc a l l u sw a ss m v e y e d ；a n dt h e a f l pp o l y m o r p h i s mo fg e n o m e 亡i n ao f t h er e g e n e r a t e dp l a n f l e t s 自o mc a l l u sw a sp e r f o r m e c l1 1 l e c o n c l u s i o n sw e r ea sf o l l o w s ： 1 1 1 1 em e d i u mi s + ( 3 5 m g l ) b a + 0 5 m g lk t + 2 s u c r o s ew a st h em o s ts u i t a b l e m e d i u mf o rt h ei n d u c t i o no fc a l l u so fb e t u ap l a t y p h a l l a ；n 圯i n d u c t i o nr a t ee x c e e d s8 0 a d v e n t i t i o u sb u d sc o u l df o r mf r o mc a l l u sc u l t u r e do ni s + b a0 4 m 4 ；l + 2 s u e r o s em e d i u m ；t h e d i f f e l e n t i a f i o nr a t ee x c e e d s9 0 2 1e a f e x p t a n t so f b e t u l a p l a t y p h a l l af f t m c t l yf o r m e da d v e n t i t i o u ss h o o t sf r o mw o u n d 他蛐 w i t h i nlm o n t h ；w h e nc u l t u r e do ni s + ( 1 0 o 1 5 0 r e # l ) b a + 0 5 m e d lk t + 2 s u c r o s ef o r2 0 d a y sa n dt h e n t r a n s f e r r e dt oi s + 0 4 r a g & b a + 2 s u c r o s em e d i u mf o r1 0d a y s 3 t h ep e r c e n t a g eo f d i p l o i dc e l l si nr e g e n e r a t e dp l a n t sd e c r e a s e dr a p i d l yw i t ht h ei n c r e a s eo f b ac o n c e n t r a t i o na n dc u l t u r et i m e ；t h ev a r i a t i o no fc h r o m o s o m en u m b e ro fr e g e n e r a t e dp l a n t s w h i c hi n d u c e db y5 0 m f lb aw a ss m a l l e rt h a no t h e r so ft h i se x p e r i m e n t ；t h ev a r i a t i o nr a t ew a s o n l y4 0 7 5 4 n l ep e r c e n t a g eo fp o l y m o r p h i s mf r a g m e n t so fg e n o m i cd n ai n c r e a s e do b v i o u s l yf o r m 3 8 7 3 t 06 1 3 3 w i t ht h ei 1 1 c 穗笛eo fb ac o n c e n l r a t i o n ；t h ep e t c e n t a g e so fp o l y m o r p h i s m f r a g m e n t so fr e g e n e r a t e dp l a n t sw h i c h $ t 1 b e t l l 删f o r1 5t i m e s 哪6 1 7 8 、7 4 9 1 、 7 6 1 3 、7 2 5 1 a n d7 8 8 1 r e s p e c t i v e l y ；n d si n d i c a t e dt h ev a r i a t i o no f g e n o mw a se x a c e r b a t e d w i t ht h ec n 既l o f s u b c u l t u r et i m e 5 1 h em a i nr e a s o n sb e m l a p l a t y p h a l l as o m a e l o n a lv a r i a t i o no c c u r r e dw e r eh i 吐c o n c e n t r a t i o n b a a n ds u b c u l t u r et i m eb yt h eg e n e t i cv a r i a t i o na n a l y s i so nc y t o l o g ya n dd n al e v e l 6 1 3p a i r so fp r i m e rw e r es c r e e n e df o ra f l po fb e t u l ap l a t y p h a l l ag e n o m i cd n a a f l p t e c h n i q u ew a si m p r o v e dt om a k ei ts u i t a b l ef o rp o l y m o r p h i s ma n a l y s i so fb e m ap l a t y p h a l l a g e n o m i cd n a 7 m e d i u mi ss u p p l e m e n t e dw i t h5 0m g lb a + o 5 m g ck t + 2 s u c m s ew a st h eb e s t m e d i u mf o rr a p i di n o p a g a t i o no f b e t u l a p l a t y p h a l l aw i t hs m a l lv a r i a t i o ni nt i s s u ec u l t u r e 8 1 1 他r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ec a l l u s w h i c hw e t ec u l t u r e df o ro n ew e e kw a st h eb e s tm a t e r i a l f o ro b s e r v e dc h r o m o s o m e i tw a se a s i e rt 0o b t a i ni d e a ld i v i s i o nc e l l sb yt h em e t h o dt h a tc a l l u sw e r e t r e a t e dw i t h0 2 c o l c h i c i n ef o r1 5 2 1 1 1 1 l co p t i m u mh y d r o l y z ec o n d i t i o nv c a st h a tt h ec a l l u sw a s s o a k e d i n l n h c l f o r l 0 1 5 m i n o r i n 揣p e c t i n a s e a n d c e l l u l a s e f o r 3 0 m i n a t r o o m t e m p e r a t u r e 9 1 1 1 er e s u l t si n d i c a t e dt h a tv a r i o u sc o n c e n t r a t i o n se m sa n di n d u c i n gt i m eh a di m p o r t a n t e f f e c to nt h es u r v i v a lr a t eo fc a l l u s h i g hc o n c e n t r a t i o ne m s ( t r e a t e df o rlh r o r2h r ) o rl o w c o n c e n t r a t i o ne m s ( t r e a t e df o r5h ro r6h r ) c a l ll e a dt oh a l f d e a t ho f c a l l u s v a r i a t i o n si nn u m b e ro f c h r o m o s o m e si nc a l l u sb ym u t a t i o nt r c a a n e n tw e l eo b s e r v e d i tw a sf o u n dt h a tt h er a t i oo f d i p l o i d 、 1 1 耋j ：茎垩銮耋至圭：筌兰兰 a n e u p l o i da n dp o l y p l o i do fi n d u e 蜘c a l l u sw e r eh i g h e rt h a nt h ec o n l y 0 1 t h ep e f c 印啪o f a b n o r m a lc e l l si n c r e a s e df r o m6 0 t o8 9 9 3 e m se x a c e r b a t e dt h ev a r i a t i o ni nt h ec a l l u sc e l l s k e y w o r d sb e t u l ap l a t y p h a l l a ；, c a l l u s ；s o m a d o n a l v a r i a t i o n ；a m p l i f i e df i a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ( a f l p ) 1 1 1 l 前言 ! _ _ _ _ - - _ l j l _ _ - - _ _ - i l _ _ _ _ e i _ _ i - _ e _ _ 自l l i _ _ i i i _ j 自自目_ l 目e _ l - - i _ _ - l l i - _ - - - 1 前言 1 1 白桦简介 白桦【”( b e t u l ap l a t y p h a l l a ) 属于桦木科，桦木属，高1 5 2 0 m ，胸径达5 0 c m 。花 期5 月份，果熟期7 月份。东北三省均有分布，主要分布在东北地区的北部，产于大小 兴安岭、完达山等林区。在东北的张广才岭、老爷岭等山区则以东北白桦为主。白桦与 东北白桦是东北的乡土树种，姿态优美，树皮光滑洁白，小校红褐色，相映成趣，清雅 美观，作为庭园树、行道树及街心绿地栽培，具独特的观赏价值，在冬季园林面貌、色 彩单调的东北地区更显得珍贵。白桦与东北白桦属强阳性树种，喜光、耐寒、耐水湿， 生长迅速。由于它分布范围广，并有耐瘠寒、生长快、材质优良特点，所以是一个重要 的工业用材树种。大径级自桦是单板、胶合板生产加工原料的首选材料，一度是航空胶 合板面板不可替代的树种；同时又可做工艺材、家具材、纸浆材等，在餐饮业和医药业 中也广为利用。为了扩大繁殖白桦优良品种和类型，保持其优良性状，急需解决白桦无 性繁殖技术。随着组织培养技术在林业上的不断应用，利用组织培养技术获得再生植株 成为快速繁殖白桦优良无性系的先进手段。 1 2 桦木组织培养概述 桦树的组织培养起步于二十世纪五十年代，然而到七十年代后期才有较大的发展， 成年树的繁殖也获得了成功。国外的学者对白桦组织培养的研究较早，尤其在芬兰和日 本，桦树的组织培养得到了很大发展。1 9 7 4 年，芬兰的h u h t i n e n 等首次报道了欧洲白 桦的组织培养。他们通过b p e n d u l a 的茎轴培养获得了桦树离体再生植株。此后， m c c o w n 和a m o s 在1 9 7 9 年对b p l a t y p h y l l av a r s z e c h u a n i c a 的茎端进行培养获得再生植 株。进入八十年代，芬兰和日本等国在桦树的快速繁殖技术上取得了突破性进展，繁殖 系数可观。芬兰的l c e n ar y y n a n e n l 2 1 以水培枝条的腋芽和顶芽为外植体建立了成年美纹 桦( b p e n d u l av a r c a r e l i c a ) 的组培再生系统。日本的井出雄二【3 】建立了用腋芽、种子、 叶柄、叶片及成年树1 年生剥皮茎段等外植体从初代培养、继代培养、继代增殖、生根 到移栽的一系列培养程序。其中用1 5 年生母树的叶柄、茎轴经四个月的培养获得完整 植株，增殖倍数可达1 0 0 2 0 0 倍。此外，c e s a rp e r e z 【4 j 通过接种b c e l t i b e r i c a 种子获得 无菌苗，经过嫩枝增殖获得大量完整植株。到了八十年代末，桦树的组织培养技术大大 改进，芬兰的欧洲白桦组培技术已达到了工厂化水平。1 9 8 9 年春，芬兰的第一批自桦组 培苗投入市场。进入九十年代，有关桦树的组织培养研究内容逐渐系统和深入化，欧洲 白桦和日本白桦已经建了多种外植体、多水平的再生途径，同时在植株的分化和再生机 理等方面也进行了探索 4 1 。 我国对白桦的研究是在白桦被列为我国“八五”林业部重点攻关树种以后，尤 其在“九五”期间白桦组织培养的研究取得了突破性的进展。我国的自桦大多数分 布东北地区，然而在东北地区自桦扦插苗遇到越冬难的问题，无法用于生产。在这种 形势下东北林业大学在国内率先开展了白桦组织培养技术和繁育机理的研究，建立起两 种高效的自桦组培离体再生途径骧芽增殖途径和愈伤组织途径瞪。l 。其中愈伤组织 增殖途径更具有应用前景，它取材种类广泛、繁殖系数高，愈伤组织诱导率达到7 0 1 0 0 ，分化率达9 0 9 9 ，生根率达9 5 1 0 0 ，移栽成活率8 5 以上，具有大规 模工厂化生产的潜力，同时为自桦转基因研究提供有利的组培再生手段。詹亚光等i s 。t o 又迸一步优化了愈伤组织繁殖系统，进行了不定芽和不定根发生的解剖学和自桦转抗虫 基因的研究。 1 3 植物组织培养中的体细胞无性系变异 由于生长索和细胞分裂素的发现及其在植物组织培养中的广泛应用人们已经使 1 0 0 0 多种植物的离体培养物通过器官或胚胎发生形成再生植株。按照德国生理学家 h a b e r l a n d t 提出的细胞全能性学说，植物的每一个体细胞都具有相同的遗传信息，因 此，由它们分化再生的植株应当在遗传上是完全相同的，仍保持母本植秣的遗传稳定 性。随着研究的不断深入，人们逐渐认识到，从外植体直接产生腋芽或不定芽而形成的 再生植株时这一结论是正确的，因而可以通过组织培养技术进行种苗的快速繁殖。然 而，当从愈伤组织中诱导出不定芽时，常常产生一些异常的再生植株。2 0 世纪6 0 年代以 来，越来越多的研究表明，通过愈伤组织再生的植株中不但出现表型的变异，也常常出 现基因型的变异。这些变异现象是研究人员和组培育苗商家面临的一个严重问题因为 组织培养的主要目的是产生表现一致的后代。 植物组培过程中的无性系变异包括组培后代个体、器官或组织中出现的种种变异现 象。s a c i s t a n 年l l m e l c h e r s i i l j 首先注意到长期继代培养的烟草愈伤组织再生植株出现各种形 态学变异，经细胞学检测，变异植株是染色体数目异常的各种非整倍体。植物组培无性 系变异现象则由h e i n z 和m e e 首先提出，他们在对甘蔗进行组织培养研究中发现组培苗有 分蘖过多、生长缓慢现象。后来，s k i r v i n 在他的研究中也发现了类似现象。丽体细胞 无性系变异这一术语，则是由l 溅n 和s c o w c r o b l 在深入分析前人有关植物组织培养变 异研究成果的基础上提出的，即植物组织培养后代中所表现出的各种变异现象。 1 4 体细胞无性系变异的细胞遗传学基础 1 4 1 细胞的全能性 植物组织培养的理论基础是细胞的全能性( t o t i p o t e n e y ) ，即被分离的组织( 细胞) 在 一定的条件下具有分化形成新植物体的功能。植物组织培养过程的实质是细胞全能性的 表达过程。为实现这一过程，植物已分化形成的细胞组织( e x p l a n t ) 先经逆分化 ( d e d i f f e r e n f i a t i o n ) 产生愈伤组织( c a l l u s ) ，然后愈伤组织进行再分化( r e d i f f e r e n f i a 6 0 r d 产 生植物器官并发育成新的植物体。 1 4 2 体细胞无性系变异与愈伤组织和不定芽的关系 植物组织培养中体缅胞无性系变异与愈伤组织的形成和不定芽的分化有密切关系。 植物织培过程中的器官再生( o r g a n o g e n c s i s ) 需经两个发育阶段，这两个阶段的主要区别 在于是否形成愈伤组织。新生器官由愈伤组织诱导产生的阶段称为阃接器官再生，即由 植物组织( e x p l a n t ) 一愈伤组织( c a l l u s ) 一拟分生组织( m e r i s t e m o i d ) 一器官原基( o r g a n p r i m o r d i u m ) 。在这种由愈伤组织到器官再生的过程中，增加了细胞内染色体变异的机 率，从而导致无性系变异产生。而由植物组织一拟分生组织一器官原基的直接器官再生 过程，未经愈伤组织而直接由体细胞分化成器官，则可降低无性系变异机率。由于植物 愈伤组织细胞处于多变、未定型的阶段，可分化形成不同的器官原基，因此分化形成的 后代也就极易出现无性系变异【l “。 1 4 3 体细胞胚胎再生 体细胞胚胎再生是高等植物的重要特性。植物的韧皮部、木质薄壁组织等部位的细 胞都可形成体细胞胚胎，进而分化形成不定芽( a d v a a t i t i o u ss h o o o 。不同部位的体细胞 分化形成的组培后代的变异程度也不同，如e v a n s ”j 在进行n i c o t i a n aa l a t a 叶片直接再生 的组培过程- 中其后代在叶形、花形及高生长等方面都出现了不同程度的变异。另有研 究表明，在植物细胞胚胎的发育过程中，由胚前限定细胞( p r e e m b r y o g e n i cd e t e m i n e d c e i l s ) 直接发育成的体细胞胚胎一般可产生相对一致的无性系，即体细胞无性系变异机 率较小，而由诱导胚胎限定细胞( i n d u c e de m b r y o g c n i cd e t e m i n e dc e l l s ) 发育成的胚胎细胞 常会产生较高的体细胞无性系变异。 1 。4 4 细胞的异常分裂机制 有丝分裂发生异常则会直接引起子细胞中染色体的变异。在胡萝h 、烟草、大蒜等 许多植物的组织培养中都观察到有丝分裂的异常现象，主要表现在：产生多极纺锤丝 及其它纺锤体异常；有丝分裂中期染色体不能排列到赤道板上，后期出现落后染色体 和染色体桥：染色体断裂、染色体融合，即出现多着丝点染色体和染色体片段：体 细胞配对，即在愈伤组织细胞的有丝分裂中同源染色体配对，姐妹染色单体交换和易位 等。这些有丝分裂的异常必然造成子细胞中染色体数目和结构的变异。 少数研究学者i i ”根据细胞动力学和放射性标记的结果认为：有些植物能以无丝分裂 的方式启动，这是培养细胞中产生单倍体数目减少的主要方式之一。 1 5 体细胞无性系的细胞学变异 无性系再生植株的缅胞学变异，包括染色体数日和染色体结构变异两个方面。染色 体数目变异又包括倍性变异和非整倍体变异。张恩让等1 6 1 对5 个大蒜品种再生植株分析 发现，通过愈伤组织培养诱导再分化形成的再生植株，其细胞染色体数目发生了不同程 度的变异，5 5 - 品种的体细胞无性系二倍体率分别为5 2 、6 4 、5 8 、5 4 和6 2 ，其 余为多倍体、超倍体和亚倍体细胞。张谦等【1 7 】对长城l 号和埃斯基红豆草( 0 ，加6 ，c h i s v m m e f o t f as c o p ) 在组织培养和原生质体培养中形成的愈伤组织及分化的芽细胞学研究表 明，在上述材料中均存在染色体数目的变异，其变化范围为7 1 1 2 ，主要变异类型是以 7 为基数的整倍性增减，非整倍性变化的较少。杜捷等l i8 l 在兰州百合品种( l i l i u n d a v i d i l v a r u m c o l o r ( h o n g ) c o t t o n ) 愈伤组织细胞中，观察到了亚单倍体、单倍体、亚 二倍体、超二倍体等多中变异形式，说明愈伤组织中细胞组成的遗传多态性。周朝鸿【l 别 发现了淡黄花百合( l i l i u ms u l p h u r e u mb a k e r ) 、通江百合乜。s a r g e n t i a ew i l s o n ) 、百合( 三 s p ) 3 种百合再生植株体细胞均不同程度地发生了染色体数量变异，变异包括倍性变异和 非倍性变异。m a a s a r un a k a n o 等【2 。j 发现百子莲( a g a p a n t h u sp r a e c o xs s p o r i e n t a l i s ( l e i g h t o n ) l e i g h t o n ) 愈伤组织再生植株中同时存在二倍体和四倍体植株。h i s a t o k 删掘k e 等【2 i l 燃( a s p a r a g u so f f l c i n a l i sl ) 再生植株中观察到了单倍体、二倍体、三 倍体和四倍体植株。 体细胞再生植株和愈伤组织细胞染色体数的非整倍体性和结构变异也有不少报道。 p s a n a lk u m a r 【8 1 等在豌豆( p i s u ms a t i v u ml ) 发现愈伤组织细胞中存在二倍体、四倍 体及非整倍体，而且四倍体细胞的频率高于非整倍体细胞，同时还观察到了染色体片段 和染色体桥等染色体结构变异。李雪等 2 3 1 对兰州百合( l i l i u md a y 触fv a t u n i c o l o r ) 小孢 子母细胞减数分裂异常进行了研究，发现存在不等二价体、同源染色体早分离、染色体 桥、不均等分离、滞后染色体、核外染色体、微核等。染色体结构变异主要是由于染色 体断裂后经过修复和重新连结所形成的易位、倒位、缺失和重复。在无性系再生植株 中，染色数目和结构变异越多，其受的代谢损伤就越严重，生长势越弱，在育种中的实 际应用价值就越低。而且，在马铃薯、甘蔗、小麦和水稻的众多表型发生变异的无性系 中，它们的染色体数目和结构并未发生变化 2 4 1 。说明细胞学的变异只能解释少数较极端 的无性系变异，而更多的无性系变异则可能是d n a 水平上的变异。 1 6 体细胞无性系变异的分子遗传学基础及表现 如上所述，在体细胞无性系实验中能普遍观察到许多染色体异常和倍性的变化，但 是也有许多文献报道，当体细胞无性系变异是以简单盂德尔方式遗传时，很少或没有观 察到染色体的变异。显然，除了染色体变异以外，体细胞无性系变异中包括了d n a 分 子和基因水平的变异。随着分子生物学和生物化学技术的发展，特别是核酸限制性片段长 度多态性( r f l p ，r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m s ) 分析技术和随机扩增多态 d n a ( r a p d ，r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ) 分析技术以及核酸随机片段长度多 态。陛( a f l p ，r a n d o mf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m s ) 应用于体细胞无性系变异的研究， 现己发现，体细胞无性系在d n a 分子水平上可发生基因突变、d n a 甲基化变化、 d n a 总量变异、转座因子的激活、细胞器d n a 的修饰，以及r f l p 和r a p d 多态性 变异等现象，这些研究为认识无性系变异的机理提供了分子生物学基础。 1 。6 。1 基因突变 基因突变是指d n a 序列中碱基发生了改变，导致由一种遗传状态转变为另一种遗传 4 状态，基因突变被认为是体细胞无性系变异的重要来源之一。 植物组织培养和细胞经离体培养后，经过愈伤组织的脱分化和再分化过程，常常会 弓l 起高频率的基因突变。单基因突变在许多作物上已经表现出来，并且大多数是稳定遗 传的。对玉米、烟草、水稻等已有的实验数据推测，单基因突交的再生植株后代，表现 出典型的盂德尔隐性遗传。近年来，随着分子生物学的迅速发展，分子生物学技术被用 来检测体细胞无性系变异是否发生基因突变。b r e t t e l l 等【2 5 j 从6 4 5 株玉米杂种胚培养的 再生植株中发现了一个表现稳定的a a h l ( 玉米乙醇脱氢酶) 位点变异体。对变异基因 克隆并进行序列分析发现，第七外显子中，一个编码谷氨酸的三联体密码g a g 中的a 转换为t ，使肽链中原来的谷氨酸转变为缬氨酸，从而使其减少了一个负电荷，进而导 致在电泳时移动速度变慢。此后，d e n n i s 等1 2 6 又从组织培养再生系中分离出a d h l 2 s 酶缺 失突变体，研究发现也是由一个碱基的变化引起。编码该酶的第1 0 6 氨基酸的a a g 三联 体密码，转变为t a g 无义密码，使该多肽不能合成。由于这两个突变体是从2 1 8 个胚外 植体经愈伤组织形成的1 3 8 2 个再生植株中发现的，其突变率大大高于自然条件下的自发 突变率，所以认为组织培养可引起高频率的基因突变。目前，单基因突变可以用分子生 物学技术检测，但对于多基因突变是比较难以达到的，而植物的许多品质、产量等性状 都是由多基因控制的，所以用分子生物学检测无性系突变有待于进一步研究。 1 6 2d n a 总量的变化 d n a 总量的变化主要是通过基因扩增和基因丢失实现的。基因扩增是细胞内某些特 定基因的拷贝数专一性地大量增加的现象，是细胞在短期内为满足某种需要而产生足够 的基因产物的一种调控手段。较高等器官在分化或在环境胁迫的组织培养条件下，植物 基因组就会发生扩增和丢失。御v i c o t i a n as y l v e s t r i s 和n i c o t i a n at a b a c u m 的无性系再生 植株中，以及n t a b a c u m 。n g l a u c a 和土豆等的愈伤组织中都观测到了细胞中d n a 总量的 变异口。在水稻中，用d n a 重复序列迸行的研究发现，一些重复序列在组织培养中有 显著的选择性扩增，愈伤组织的d n a 重复序列与叶片相比有5 - - 7 0 倍的拷贝数差异，而 不同品种的叶片间的差异只有2 3 倍。在亚麻的卫星d n a 和小麦的r d n a 研究中也观察 到了类似的结果耻”。在土豆和六倍体小黑麦的r d n a 分析中，还观察到经组织培养而造 成拷贝数的下降。 基因丢失是指在细胞分化过程中通过丢失掉某些碱基序列而失去基因活性。就目前 的研究面言，体细胞无性系中核糖体d n a ( r d n a ) f l t 其间隔序列以及一些重复序列，比 较容易发生d n a 序列的丢失。b r e t t e l l 等 2 8 1 观察到小黑麦( t r i t i c a l e ) 再生植株1 r 染色体上 间隔区序列减少8 0 ，b r c i m a n 等在小麦品种n d 7 5 3 2 的再生植株中观察到r d n a 间隔数目 减少，并且进一步试验表明这种变异与离体培养有关，但并未检测到n d 7 5 3 2 再生植株 籽粒麦谷蛋白和醇溶蛋白谱带的变化。所以，目前还不清楚细胞无性系中d n a 序列减少 对细胞分化、再分化及植株再生究竟有何生物学意义。 1 6 3d n a 甲基化变化与体细胞无性系变异 分子生物学研究已证盟，d n a 基化变化是基因表达调控的一种方式，而且植物 d n a 是高度甲基化的。对d n a 甲基化变化的研究，一般是以h p a i 和m s pi 两种甲基化 敏感的核酸限制性内切酶的比较来进行的。n u r h a i m i 2 9 1 以a f l p 分析的结果表明，油棕 橱体绍胞无性系出现绪覆膜果的变异与脆质基函韵突变有关；而r i v a l 等印j 对m r n a 及核 基因组进行遗传分析的结果显示，基因组甲基化是导致这一变异的主要原因。草莓品种 “p o c a h o n t a s ”再生植株在表型及r a p d 多态性上无差异，但甲基化分析的结果表明部 分再生植株的r d n a 发生了甲基化，说明组织培养的确引起了d n a 甲基化变化】。 j a l i g o t 等e 3 2 用高压液相色谱( h p l c ，h i g h p e i f o n n a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ) 及s s s l m a a ( s s s i m e t h y l a s ea c c e p t i n ga s s a y ) 技术分析的结果表明，油棕榈变异株叶片中总d n a 的甲 基化水平比正常株降低2 左右；而来自愈伤组织的基因组d n a ，其变异株的甲基化水 平比正常株降低了4 5 。 1 6 4 植物转座子活化与体细胞无性系变异 由m c c l i n t o c k 在4 0 年代末5 0 年代初创立的转座因子理论，已证实是许多不稳定遗传 ( 突变) 现象的起因。现在发现的转座因子根据它们转座的机理不同可分为两类，即转座 子( t r a n s p o s o n s ) 和逆转座子( r e 位a n s p o s o n s ) ，其中逆转座子又称为反转录转座子。 研究表明，两类转座子在组织培养中能够被激活，发生转座和插入，弓【起变异。 转座子是经典意义上的转座因子，包括玉米a c d s 、s p m 、m u 因子和金鱼草的t a m 因子等，它们的转座是从d n a 到d n a ，在转座酶的作用下从原位置解离，并在新的位 置整合而达到转座的目的。1 9 8 1 年，l a r k i n 和s c o w c r o r 首先提出，转座因子的活化可 能是无性系变异的原因之一。以后一些学者对这一观点进行了更为深入的推断。我国学 者朱至清【2 4 1 提出，也可能首先是转座因子受组织培养中理化因素的诱导而被激活，然后 由转座子的转座引起染色体断裂和结构变异、以及结构基因的活化与失活等。 支持转座子引起体细胞无性系变异的证据来自p c s c h k c 等对玉米a c 转座子的研究 r 2 s 。利用无a c 活性的玉米为材料，在经组织培养形成的无性再生植株中，发现3 植株 的a c 被活化，而对照的a c 则未被活化。从a c 被活化的植株后代中，他们进一步分离出 了与a c 活性共分离的s s ti2 3 0k b 和b g l i l 2 1 0k 5 两个a c 同源限制性片段，并认为其中包 含经组织培养活化的a c 因子。在l 的玉米再生植株中，也检测到了另一转座因子s p m 的转座活性。b i n g h a m 等在苜蓿的组织培养后代中，也观察到因转座因子的活化而引起 的花色变异。用转座因子活化理论可以解释无性系变异的一些特点。首先可以解释无性 系变异的频率为什么会很高，到耳前为止在高等植物中已经发现1 0 余种转座子，其活动 可以造成基因的广泛变异；其次，转座子可使不活动的结构基因活化，说明无性系中较 高频率出现的显性突变；第三，转座予还可以使多拷贝的基圜中那些不表达篦拷贝活 化，提高基因的表达强度，即所谓基因放大，进而导致表型变异。 反转录转座子是广泛分布于真核生物中的一类可移动因子，因其转座需经过由r n a 介导的反转录过程而得名。自, 6 - k 1 9 8 4 年第一例植物反转录转座予报道口3 】以来，大多数的 植物中都已发现有反转录转座予的分布【3 4 3 。迄今为止的研究表明，许多反转录转座 予的转录可以被多种生物的和非生物的逆境所激活p 巩，如包括原生质体分离、细胞培 养、外伤、甲基茉莉酮酸酯、c u d 2 和水杨酸等在内的非生物因素都可以大大提高t n t l i 前言 和t t o l 反转录转座子的表达 4 0 叫引。而许多生物因素，如真菌提取物，以及病毒、细菌， 真菌病原物接种也可以使这些反转录转座子的转录活化【4 6 4 ”。而t o s l 7 的转录则只能被 组织培养所诱导 4 s l 。为仟么逆境能够激活反转录转座子的转录，目前还没有科学定论。 其可能原因是逆境条件下，反转录转座子的活动，能够给植物带来夏多的变异，从而为 自然选择提供更多的机会【4 9 l 。最近的研究表明，反转录转座子的转录活性在一定的条件 下被激活，是反转录转座子对寄主基因组的一种适应，其机制是通过进化获得和寄主的 相关逆境诱导基因的启动子相似的启动子，从而在逆境条件下得以表达即】。v i c i e n t 等阱l 发现，在草类基因组中，普遍存在着有活性的反转录转座子。反转录转座子的活动所造 成的基因突变，为作物遗传改良提供了很多的素材【5 2 1 ，可以用反转录转座子插入来解释 体细胞无性系变异的一些现象，如随着组织培养时间延长，体细胞变异频率增加。这可 能是由于长时间培养引起反转录转座子拷贝数增加所致：一些体细胞无性系变异( 如耐盐 突变体) 不稳定，其原因可能是由于反转录转座子增强和启动予失活引起【酆】。 综上所述，有关转座子与体细胞无性系变异的关系，只是认为转座子被激活能引起 变异，但目前这方面的直接证据尚少，许多细节也不清楚，仍需深入研究。 1 6 5 细胞器d n a 的变化 在植物进化过程中，细胞内的叶绿体和线粒体两种细胞质基因组是比较稳定的。在 大多数体细胞无性系突变体中，对升绿体d n a 的研究也发现，叶绿体d n a 是基本稳定 的。但小麦花药培养中经常出现大量的白化苗，对这些白化苗和对照植株叶片叶绿体 d n a 分析，发现叶绿体基因组有大量的丢失( 高达8 0 ) 。线粒体d n a 在再生植株中的变 异也有一些报道。但是对土豆线粒体d n a 变异的研究并没有发现其在体细胞无性系变异 中起作用。这说明有必要进行更多的研究来弄清楚细胞器d n a 的变异在无性系变异中的 作用。 1 7 植物组织培养中无性系变异产生的主要原因 1 7 1 外植体来源及预先存在的变异 茎尖、腋芽等具有分生组织的外植体，其变异率低于叶片、根段和茎段等未分化形 成分生组织的外植体。受伤的外植体比未受伤害的外植体变异率高。倍性高或染色体组 染色体数目较多的外植体发生体细胞变异的频率也较高。不同品种相同外植体、同一品 种的不同外植体及外植体的生理状态也明显影响变异率。 另一个使人感兴趣的问题是【5 4 l ，有些体细胞无性系变异是否发生在组织培养之前， 也就是在接种的外植体中包含了一些已经变异的细胞，这些细胞经过组织培养再生为变 异的植株。以往的研究曾经报道过，在植物的的体细胞分裂分化过程中时常发生体细胞 联会现象，如果该植株是杂种( 如菠萝和甘蔗) ，则由不同体细胞再生的植株便会出现 无性分离( 变异) 现象。同时在植物体细胞中经常出现的多倍性，结果在二倍体植株的 组织中包含一些多倍体细胞和非整倍体细胞，由它们再生出多倍体或非整倍体植株。 1 7 2 培养基中外源激素 许多研究指出。培养基中外源激素是诱导体细胞无性系变异的重要原因之一。 2 ，4 - d 和6 - b a 最容易诱导变异，但它们的作用机制还不是很清楚弘”。张谦等【l7 】对长城 l 号和埃斯基红豆草在组织培养和原生质体培养中形成的愈伤组织及分化的芽进行了细 胞学研究结果表明，在上述材料中均存在染色体数的变异，染色体数的变异程度与愈伤 组织的性质、培养时间的长短、继代培养中激素的累积浓度以及2 ，4 一d 的浓度有着密切 的关系。培养时间越长，激素累积浓度越高，染色体的变异程度越大。在短时间内使用 高浓度的2 ，4 - d 进行培养，也可以引起较大的变异。另外，还观察到了染色体结构的各 种变异和有丝分裂异常。 1 7 3 周期性继代、重复再生和离体保存的时间 d a m a s c o 等【”j 从s c a r 检测的结果中发现，香蕉“c a v e n d i s h ”品种在继代