（化学工艺专业论文）寡聚乳酸改性葡聚糖的合成及其在双水相体系中成球的研究.pdf

ab s tr act abs tract l - l a c t i d e w a s s y n t h e s i z e d f r o m l - l a c t i c a c id , l - l a c t i d e f o r m e d o l i g - l - l a c t i c a c i d ( o l l ) b y r i n g o p e n in g p o l y m e r i z a t i o n . a s e r ie s o f o l l m o d i f i e d d e x t r a n ( d e x o l l ) w e r e p r e p a r e d a n d u s e d t o f o r m a q u e o u s t w o - p h a s e s y s t e m s ( a t p s ) w i t h p o l y ( e t h y l e n e g l y c o l ) ( p e g ) . e ff e c t s o f d e x o l l s p r o p e rt i e s o n p h a s e s e p a r a t i o n b e h a v io r s a n d o n t h e p a r t i t i o n o f b o v in e s e r u m a lb u m i n ( b s a ) i n a t p s w e re i n v e s t i g a t e d . t h e m e c h a n i s m f o r p r e p a r a t i o n o f d e x o l l m i c r o s p h e r e in d e x o l l / p e g a t p s w a s d i s c u s s e d i n i t i a l l y , a n d t h e p u r i f i c a t i o n t e c h n o l o g y o f t h i s m i c r o s p h e r e w a s d e v e l o p e d . t h e r e s u l t s w e r e a s f o ll o w s : ( 1 ) t h e o b t a i n e d l - l a c t i d e c o u l d b e p u r i f i e d 勿r e c ry s t a l iz a t i o n , o l u s d e gr e e o f p o l y m e r i z a t i o n ( d p ) c o u l d b e c o n t r o l l e d i n a s p e c i f i c t e m p e r a t u r e , p r e s s u r e a n d w i t h s t a n n o u s o c t o a t e a s c a t a l y z e r . t w o d i ff e r e n t s t r a t e g i e s 。d e v e l o p e d t o gr a ft o l l t o d e x t r a n ( d e x ) a n d o b t a i n e d d e x o l l , r o u t e i , o l l g r a ft e d t o d e x t r a n v i a i t s t e r m i n a l a c t i v a t e d - h y d r o x y l gr o u p ; r o u t e 1 1 , o l l g r a ft e d t o d e x v i a i t s t e r m i n a l c a r b o x y l i c a c i d gr o u p a f t e r t h e h y d r o x y l gr o u p o f d e x w a s a c t i v a t e d . u n d e r g i v e n m o l a r r a t i o o f o l l a n d d e x , t h e y i e l d o f t h e g r a ft e d d e x i n c r e a s e d w i t h t h e i n c r e a s e d r e a c ti o n t i m e i n r o u t e i , w h i le a l m o s t c o n s t a n t y i e l d w as o b s e r v e d u n d e r v a r i o u s r e a c t i o n t im e in r o u t e i i . a ft e r c h a r a c t e r iz i n g th e p r o d u c t b y 1 h n m r , b t , u v , it is r e v e a l e d t h a t d e x t a n c o u l d b e m o d i f ie d b y o l l a n d t h e d e g r e e o f s u b s t it u t i o n ( d s , t h e n u m b e r o f o l i g o m e r s p e r 1 0 0 g l u c o p y r a n o s e u n i t s o f d e x ) c o u l d b e e ff e c t i v e l y c o n t r o l l e d b y m o l a r r a t i o o f t h e r e a c t a n t s . ( 2 ) t h e c h a n g e o f d e x o l l s w a t e r - s o l u b i l i ty r e v e a l s t h e m o d i f i e d d e x c o m b i n e d t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f o l l a n d d e x . i t s w a t e r - s o l u b i l i ty d e c r e a s e d as t h e d p o f o l l a n d i t s d s o n d e x i n c r e a s e d , b u t i t w as m u c h e asi e r t o f o r m a t p s w i t h p e qa n d t h e b s a f o l l o w e d t h e o b v i o u s t e n d e n c y t o p a r t i t i o n i n t o t h e d e x o l l - r i c h b o tt o m p h a s e . i n c o n s i d e r a t i o n o f t h e w a te r - s o l u b i l i ty a n d p h a s e - f o r m i n g a b i l i ty o f d e x o l l , c o n t r o l l i n g p e g s m o l a r m a s s a n d m a s s c o n c e n t r a t i o n m e a n w h i l e , t h e o p t i m a l s y s t e m f o r b s a p a rt i t i o n i n d e x o l l p h a s e c o u l d b e o b t a i n e d as f o l l o w s : d p o f d e x o l l w as 9 a n d d s i s 3 . 2 , t h e mo l a r mass o f p e g w as 6 0 0 0 a n d c o n c e n t r a t i o n abs t r ac t wa s 1 5 %. ( 3 ) d e x o l l m i c r o s p h e r e s f o r m e d i n d e x o l l / p e g a t p s h a v e b e e n o b s e r v e d u s in g m i c r o s c o p e . t h e p r i n c i p a l r e a s o n s f o r f o r m a t i o n o f d e x o l l m i c r o s p h e r e i n d e x o l l / p e g a t p s w e r e t h e m u t u al r e p u l s i o n b e t w e e n p e g m o l e c u l e s a n d d e x o l l m o l e c u l e s a n d t h e f o r m a t i o n o f n e t w o r k l i k e m i c e l l a r d u e t o t h e a m p h i p h i l i c s t r u c t u r e o f d e x o l l ; t h e a p p l i c a t i o n o f d e e p f r e e z e t e c h n o l o g y c o u l d i n c r e a s e t h e s t a b i l i t y o f d e x o l l m i c r o s p h e r e s . k e y w o r d s : m o d i fi e d d e x t r a n ; a q u e o u s t w o p h a s e ; p r o t e i n p a r ti t i o n ; m i c r o s p h e r e 学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已 经发表或撰写过的 研究 成果， 也不包含为 获得 南昌大檬 或 其他教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学 位 论 文 作 者 签 “ (手 “ ，:阵 潺签 字 日 期 : 场 尸 年 乙 月 (s fi 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了 解南昌大檬 有关保留、 使用学 位论文的规定 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅 和借阅。 本人授权 南昌大学 可以 将学位论文的 全部或部分内 容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学 位 论 文 作 者 签 名 ( 手 写 ): 阵卜 尾 签 字 日 期 -;a年 月 is 导师签名 ( 手写) 签字日期: 叫年0 s 日 学位论文作者毕业后去向: 工作单位: 通讯地址: 电话: 邮编: 第 1 章 绪论 第1 章 绪论 ， . ，引言 药用生物材料的选择及新技术的开发是现代药剂学的一项重要内容， 控释、 缓释及靶向等新剂型的发展对材料性能提出很高的要求。以往的药用辅料很多 是天然高分子，由于本身性能不能满足现代很多药物剂型的要求，使其应用受 限。因而越来越多的合成高分子作为辅料在提高药物制剂质量及研究开发新剂 型 方面发挥了 极为 重要的 作用 川 。 当 今广为 研 究的 一些 合成 及半合成 高 分子材料 如聚酷， 聚酸 醉， 聚乙 二醇 ( p e g ) 等因 其生物相容 性好， 可生 物降 解等 优点已 得 到广泛应用2 1 . 近年来， 蛋白 质及多 肤类药物随着生物技术的 发展不断涌现， 其 活性好，疗效高， 但口 服首过效应大，生物利用度低， 注射给药体内 半衰期短， 需反复 给药 才能 起到治 疗作用 3 ; 另 外， 作为 生 物大 分子， 蛋白 质药 物对载体的 材料和成型技术要求极为特殊， 现行的一些生物材料及制剂技术不能满足蛋白 多肤类药物传递系统的发展要求，因此发展控缓释蛋白质药物传递系统是国内 外医药界关注的重大课题。微球载体技术为实现蛋白质药物控缓释开拓了新空 间4 1 . 一方面 ， 它具有 控缓释制剂的 基本优势如维持血药浓度平稳， 避免或减小 峰谷现象，减少药物总剂量等。另一方面，微球基质与微球膜可以保护药物在 口 服途径中不被降解. ，且控制粒径可以使药物在肠道内 被吸收5 。因此开发用 于此类药物系统的相容性好，生物可降解，释药速率可调的生物材料，寻找温 和不破坏蛋白活性的制剂新技术成为蛋白多肤类药物传递系统发展的研究热 点。 1 . 2药用载体材料的发展现状及趋势 1 . 2 . 1药用高分子材料及生物相容性 药用载体材料主要为高 分子材料，高分子材料是由 相对分子质量较高的 化 合物构成的材料。 我们接触的很多天然材料通常是高分子材料组成的，如 天然 橡胶、棉花、人体 器官等。 人工合成的化学纤维、塑料和橡胶等也是如此。药 用高 分子材料指在药物制剂中应用的高分子材料。 第 1 章 绪论 生物相容性指生物材料与生物体间的相互作用结果以及生物体对这种结果 的忍受程度。 药用高分子材料应该对人体无毒性、无致敏性、无刺激性、无遗传毒性和 致癌性，对人体组织、 血液、免疫等系统不产生不良 的作用。 1 . 2 . 2药用高分子类别及简介 药用高 分子材料按其来源可分为天然高分子材料和半合成高分子材料6 . 天然高分子材料易得，且生物相容性好、能大量分离和纯化、具有己知的 结 构及物化 特性，主 要包 括明 胶7 1淀粉 1 、 海藻酸盐 1 0 、 松香、 石蜡、 壳 聚 糖 1 1- 12 等。 这类分 子成膜性能 好、 稳定 性强， 但原 料不稳 定。 其中 胶原蛋白由 于其在体内肿胀而体积变大、弹性较低、强度差、在体内常常被作为抗原物质 加以识别，及由于应用醛类作为交联剂可能对机体有一定的影响等原因而限制 了其进一步应用。而一些非胶原蛋白 例如白 蛋白、明胶、酪蛋白、硅酮等制成 微球或纳米囊应用的前景较好。如白蛋白 微球作为评估器官功能以及经不同系 统进行传递时检测循环功能己经在核医学科得到广泛应用。明胶与药物的结合 性低，微球制备技术简单， 抗原性低，所以 在药物传递中也具有明 显的优点。 半合成高分子聚合物具有很好的生物组织相容性，可控的生物降解速率、 本身性状、混合比例及已商品化等诸多优点。半合成高分子主要有。 - 经基酸、 交 链聚 酬1 3 - 1 4 1 、聚 原 酸配、 聚 醉 1 5 、多 肤 及聚 醋 1 6 - 2 0 及 对天 然高 分子进行改 性等 2 1 1 。 此类高 分子粘 度大、 成盐后 溶解度 加大 ， 但 其耐酸 性 差、 易 水解， 且 对 蛋白 类物质有一定破坏。其可通过 4个变量控制自 身的各种特性:单体立体化 学、共聚物单体比例、多聚物链的线性以 及聚合物分子量。可见半合成高分子 聚合物是比 较容易被识别和加以应用的，因此成为目前药物剂型中所采用的主 要原材料。 现在研究较为广泛的蛋白 药物载体材料为可降解性水凝胶， 水凝胶中的亲 水基团使其在生理条件下可吸水膨胀1 0 % - -9 8 %， 因此可促进疏水性药物的溶解， 而且可以 通过控制凝胶的网络结构更好的调节其降解性， 此外它还具有生物相 容性 好， 多 效能， 多 用途等 优点6 。 水 凝 胶 有天然 材料如果 胶， 藻酸盐 等， 合成 材料如p e g等，改性材料如改性壳聚 糖，改 性葡聚糖等。葡聚糖及其改性产品 因 其较好的亲水性及其对药物溶解渗透的可控性而更适用于活性蛋白 药物的传 递系统。 第 1 章 绪论 1 . 3葡聚糖及聚乳酸的性能特点 1 . 3 . 1葡聚箱的结构及特点 葡聚 糖( d e x ) 又称右旋糖醉， 是利用蔗糖分 子中的 葡萄糖单 元经肠 膜明串 珠 菌 ( l e u c o n o s t o c m e s e n t e r o i d e s ) 发 酵， 使葡萄 糖 单元 脱水聚合而 成的 一种高 分子葡 萄糖聚合物， 完全由。 - d - 毗喃葡萄糖单体构成， 其糖昔键的 类型和每种类型的数 量随不同的葡聚糖而变化，即d 为 右旋毗喃型葡萄糖的 聚合物， 其相邻葡萄 糖残基的碳1 , 2 , 3 , 4 , 6 的 半缩醛氧之间以 葡糖 昔键连接构成骨架， 有 。和 0 位两种结构形式:0 - d e x 是自 然合成的多聚搪， 由 右旋葡萄糖以ti 一 构型连接而 构成的多聚物， 也可精制为各种主链为 r - 1 , 4 糖昔键或 r - 1 , 6 糖昔键等连接 的d e x 。本文所用的d e x 为 0 - 1 , 6 糖普键连接的 链状高分子，其结构式为: 。 - oo h ,( h o o h h o o h h d i o d e x 为白 色颗粒性粉末， 无臭无味， 不溶于乙 醇， 溶于水。 其具有高亲水性、 无凝血效应，粘度和渗透压与血液相近，能在人体内降解但又必须维持一定的 时间，因而是目前世界公认的一种优良的血浆代用品。不同分子量的d e x具有 不同的临床应用和疗效，如免疫抗痛作用，预防高血压、动脉硬化，有助于减 肥， 在食品 工业、 石油 化工等 领域中 也有广泛的 应用如 凝胶 过滤剂、 优 质凝胶、 食用 低热d e x 添加剂、 化 妆品、 石油 助剂 、 b t 杀 虫剂的 增效 剂等2 2 1 。 一般在医 药方面用的是 ii 型的d e x . d e x 在医药方面主要有如下高活性特点: ( 1 ) 活化并增强人体免疫系统， 快速调节免疫， 抑制肿瘤。 d e x 具有卓越的 调节免 疫力的 功能。 哈佛大 学c z a p教 授说， d e x 使 人体的 免 疫细 胞成为“ 防卫 的兵工厂”。 它可有效激活宿主的免疫系统， 快速调节免疫.同时其已 被证明 能提升抗生素的效力。 许多研究也已 经表明， 颗粒d e x 除了 影响网状内皮系统和 第 1 章 绪论 免疫应答外， 体内 给药能增强 宿主对各种由 细菌、真菌病毒 和寄生虫引 起的 感 染性疾病的抵抗能力。d e x 被称为肿瘤细胞的“ 追捕者”。 致癌基因可能以休 眠状态存在于个体的 所有细胞中，当 癌细胞第一次出 现时，如果免疫系统不能 活化 来 除 去 它， 就tit 能 产 生 癌 症. b 一 ( 1 - 3 ) - d e x的 促有 丝 分 裂 活 性可 导 致几 种 免 疫应答。 它们包括增加天然杀 伤细胞的 活性和t 细胞介导 的 细胞毒性。 刺激释放 白 细 胞 介 素 如干 扰素 i f n 和内白 细 胞 介 素 i l ) 以 及 诱 导 嗜中 性粒 细 胞 的 吞 噬 作 用。d e x 的抗肿瘤活性与吞噬细胞的功能有很大关系。 吞噬细胞功能增强时，抑 瘤活 性高: 吞 噬 细 胞功能 降 低时， 抑瘤活 性 低。 因 此认为0 一 ( 1 - 3 ) - d e x的 抑瘤活 性是 通 过免 疫系 统实 现的。 0 一 ( 1 - 3 ) - d e x的 抗 肿 瘤活 性不 仅与 结构有关， 而 且与 给药时间 和 途径 有关 系。 来自 酵 母( 真 菌) 的0 一 ( 1 - 3 ) - d e x通常具 有 9 5 % 以 上的 肿瘤抑制率。它在保护正 常细胞的同时，能够进一步锁定休眠期、耐药性及亚 临床病灶的“ 残存肿瘤细胞”， 进行靶向 抑瘤。对于长期接受放疗的患者，更 能增强病人的抵抗力。 ( 2 )抗辐射作用。 d e x 的 促进造血机能 有良 好的 抗辐射作用。 颗粒d e x 给药 能增强血细胞的生成活性，包括粒细胞的生成、单核白 细胞的生成和红细胞的 生成， 从而促使其更好地从致命剂量的辐射中得到恢复， 研究结果还证明， d e x 的抗肿瘤活性与 其对造血系统的影响是平行的。 ( 3 )帮 助身 体组织结构 再生和 修复， 促 进伤口 愈 合。 临床证明， d e x能供 应多 种细胞生长因子，加速胶原蛋白 和弹力纤维素的合成，消除皱纹，使肌肤 柔嫩白哲有弹性。 ( 4 )润肠通便、调节胃 肠功能、降低胆固 醇。 作为 膳食纤维， d e x可以 刺 激肠道蠕动和促进肠内有益菌的活化，吸收肠内有害物质，从而改善因肠胃 虚 弱引起的消化不良 和便秘;同时具有控制血糖浓度降低胆固醇的生理功能。 1 . 3 . 2聚乳酸的性能及主要应用 乳酸学名为2 - 基丙 酸，为无色或浅 黄色粘稠状液体，无气味， 味微酸， 具有吸湿性，水溶液呈酸性;能与 水、乙醇、甘油或乙醚任意混合;不溶于氯 仿、二硫化碳和石油醚。 乳酸分子中含有轻基和梭基， 分子中 有一个不对称碳原子，具有旋光性， 所以 是化学性质活泼的化合物。 依旋光性可以分为 : l 一乳酸、 d 一乳酸和 d l - 乳酸。 第 1 章 绪论 a乳酸中的 经基具有醇的 特点，可以发生酷化反应， 缩合反应，取代等反 应。 b . 乳酸中的竣基具有狡酸的 特性， 具有一定的酸性， 能 够发生醋化、 取代， 缩合等反应。 c . 乳酸分子有经基和梭基， 可以发生酷化反 应，它们可以 是分子内 部的酷 化反应，也可以是分子之间的发应。 乳酸是一种多用途的精细化学品，可广泛用于食品、 制药、纺织、制革、 环保和农业中。其产品主要表现形式为酸味剂、调味剂、防腐剂、翰制剂、植 物生长调节剂、生物可降解材料和手性药物等。 聚乳酸是由 乳酸或丙交酷聚合而成的一种可生物降解的高分子疏水性材 料，不溶于水，溶于二氯甲烷等有机溶剂。其无毒、无刺激性，具有优良的生 物相容性，可生物分解、吸收，强度高，可塑性好，易加工成型。其结构为: h 聚合物与乳酸相似，具有光学活性，故可分为左旋聚乳酸，右旋聚乳酸和 消旋聚乳酸， 前两种聚乳酸系高结晶性高分子熔点约为1 8 0 c ， 玻璃化温度为6 7 ，消旋聚乳酸系无定型聚合物，玻璃化温度为 5 7 1c .聚乳酸在体内降解成乳 酸，或进一步降解成二氧化碳和水，故聚乳酸具有很高的安全性，降解速度与 其分子量及结晶度有关。分子量越高和结晶度越高降解越慢，左旋聚乳酸的降 解速度低于消旋聚乳酸。 分子量为1 4 0 0 0 的消旋聚乳酸降解5 0 % 的时间 约为1 8 0 天， 而分子量4 8 5 0 0的消旋聚乳酸降 解5 0 % 需 近一倍的时间。 聚合物降 解的另 一特点是， 在降解初期聚合物的重量和形状少有变化，降解主要 发生在分子链 的断裂而不溶解，当降解到一定程度时，重量和外形发生显著变化，降解反应 自 动加速， 材料很 快溶解直到完 全消 失. 控制参加反 应的丙 交酷，引发剂， 催 化剂的量及温度，时间等因素可以聚合得到不同分子量的聚乳酸，其中 较低分 子量，具有少数乳酸单元的聚乳酸为寡聚乳酸 ( o l l ) a 聚乳酸目 前主要应用于医药领域， 其用 途是 药物 控制释放2 ; 1 、 手术缝合线 24 1 、 眼 科材料 2 5 和 骨材 料 2 6 1 等。 药物的 控制释放就是将药物或其他生物活性组织和基材结合在一起，使药 第 1 章 绪论 物通过扩散等方式在一定时间内，以某一种速率释放到环境中。聚乳酸及其共 聚物可以 根据药物的性质、 释放要求及给药途径，制成特定的药物剂型。目前 主要采用溶液成型、热压成片等方法制备一些缓释药物，如胰岛素的聚乳酸 双 层缓释片、 庆大霉素的聚乳酸圆柱体、促生长激素释放激素的块状植入剂、 激 素左炔诺酮的空心聚乳酸纤维剂等，聚乳酸还可以做成一些薄膜、 类乳剂等多 种剂型以 达到控释药物的作用。目前研究热点是制备较为复杂的能有效控释、 能靶向治疗的威力化药物制剂， 如层状微粒、微球、微囊和纳米微粒等。 聚乳酸及其共聚物作为外科手术缝合线，在伤口愈合后能自 动降解并吸收， 术后无需拆除缝合线，己 经广泛应用于各种手术。聚乳酸手术缝合线具有较强 抗张强度、能有效的控制聚合物的降解速度，随着伤口的愈合，缝线自 动缓慢 降解。目前国内各大医院也在使用从国外进口的优异的聚乳酸缝合线。 随着工作和学习压力的逐渐增加，眼科疾病发病率逐渐增加，尤其是视网 膜脱落己 成为常见的眼科疾病之一， 通常手术治疗采用在眼巩膜表面植入填充 物来解决，传统采用硅橡胶和硅胶海绵，这两种物质不能降解，容易引起异物 反应，而利用聚乳酸作为填充材料，可有效的解决上述问题，如有的报道采用 丙交酷在异辛酸亚锡引发下聚合得到的聚乳酸，制成膜片，能过临床表明，这 种膜片在组织中既有一定的降解性，又符合视网膜脱落修复手术对巩膜维持支 撑时间的要求，是一种非常理想的眼科材料。 1 .4 双水相体系介绍 1 . 4 . 1双水相的概念及特点 a l b e rt s s o n 在2 0世纪5 0年代中期首先提出了双水相的概念， 并广泛应用于 生物 分离 领域 2 7 1 。 双 水 相体系 ( a t p s ) 是指不同 种类聚 合 物溶 液混合或 聚合 物 水溶液和盐 溶液混合且当 聚合物和盐 浓度达到一定值， 混合液静置后分层产生两 液 相 或多 液 相 系 统 2 9 - 2 9 1 。 生 物 大 分 子 ( 如 蛋白 质 ) 进入 双 水 相 体系 后 受到 氢 键 、 疏 水作用、离子键等各种作用力而 选择性分配，且 a t p s 中聚合物的多元醇结构 对 生物分子具有保护作用，含水量高达7 0%以上，具有上下相密度差小、分相时 间短、系统可直线放大 4 0 0 0 0倍等优点，因此a t p s法作为一种新兴纯化生物 大 分 子 方 法 而 受 到 广 泛 关 注 3 0 - 3 11 第 1 章 绪论 1 . 4 . 2双水相相图说明 图1 . 1 双水相相图 说明 f i g 1 . 1 e x p l a n a t i o n o f p h a s e d i a g r a m o f a q u e o u s - t w o- p h a s e s y s t e m 如图 1 . 1为两组分与水形成的 a t p s的相图 ， 当体系 组成处于双结点曲 线 t c b的上方时如u i 点， 体系分为两相二上相 轻相) 的 组成用t表示，组分2 在此相富集;下相( 重相) 的组成用b表示， 组分1 在此相富集。当 体系的总组 成由m 变到m , 时， 则体系的组成为t 1 和b 3 两 相。 t i , b , 相间的差别比t , b 相间的差别要小， 进一步改变体系的组成，分相时形成的相间差别进一步变小， 达到 c点时，则无成相现象，即双结点曲线 t c b下方体系中，由于不满足成 相条件而呈单相。 在两相区t b 或t i b i 的长度为结线长度 ( t l l ) , t il l 不同， 相组成不同。对于给定的体系总组成如m点，形成两相的上相与下相体积比等 于m b的长度比上m t的长度。 不同的a t p s 相图不同， 故若要开发新的双水相 萃取系统，需要首先研究它的相图，才能进一步了 解此双水相的性质，从而加 以开发利用。 1 . 4 . 3双水相苹取过程的理论基础 双水相萃取过程的理论基础 ( 分配理论)如下: ( 1 )表面自 由能的影响 当蛋白 质进入双水相体系后，在上下相间 进行选择性分配服从n e m s t 分配 定律. 即: k = c t / c b ( c t , c b 分别 代 表上下 相中 溶质的 浓度) 。当 相 系 统固 定 时， k为常数， 与溶质浓度无关， 只取决于蛋白质本身的性质和特定的 双水相体系的 第 1 章 绪论 性质。根据两相平 衡时 化学位相等的原则，从b r o w n s t e d t 方程式1 . 1 求得分配 系数，即: 1 n k = ae / k t = m x / k t ( 1 . 1 ) 式中， m 一 物质分子量; t温度 a - 系统的表面 特性系数 k 一 波尔兹曼常数 显然由于蛋白 质的m值很大， 人 的微小改变也会引起分配系数很大的变化。 因此，利用不同的表面 性质 ( 表面自由能) ，可以 达到分离蛋白 质的目的。 ( 2 ) 表面电 荷的影响 如果粒子带有电荷，并在两相中分配不相等时，就会在相间产生道南电位， 见式1 . 2 所示: 巾 = u 2 - u , = r t / ( z - z ) f i n k b z -/ k a z 十( 1 . 2 ) 式中， u 2 . u , 一 分别表示两相的电位 z . z - 分别表示一种盐的正、负离子价 k a z . k b z 一 分别表示当正负离 子不带电时在两相间的分配系数 f 一 法拉弟常数 r - 气体常数 t - 温度 由此可知当 一种盐的正 不等时，就会产生电位差。 化。 ( 3 )综合考 虑 综合以上两种主要因素 、负离子对两相有不同的亲和力，即k a z 十 与k b z 口 随着电位差的改变，蛋白质的分配系数就会发生变 ，分配系数可用g e r s o n 提出的式1 . 3 表示: - 1 g k = a ,lr + s 巾 十 日 ( 1 . 3 ) 式中，a - 表面积 卜 两相表面自由能之差 6 一 电荷数 。 一 电位差 第 1 章 绪论 p 一 由 标准化学位和活度系数等组成的常数 从上式可知，分配系数和表面自由能及电位差成指数关系。但是目 前尚不 能定量的关联分配系数，也不能独立测定蛋白质的一些分子性质之间的关系， 因此只能靠实验来得到最佳条件。 1 . 4 . 4双水相的 研究现状及应用 近年来， 一种新型萃取体系基于水溶性高聚物的双水相萃取受到人们 极 大关 注3 2 1 。 该 类双水 相体系多 为p e g / d e x 和p e g / 无机盐 两种 ， 已 有效 地用于 蛋白 质及金属离 子的 萃 取分离。 王 志华3 3 等人 研究了 基于与 水互溶的 有机溶剂 和盐 水相的双水相体系，其具有价廉，低毒， 较易挥发，无需反萃取且粘度低 等特点。肖 进新3 4 1等人研究了正负离子表面活性剂双水相体系，其可以 改善单 一高 聚 物双水相体系， 使其适用于非水溶性蛋白 质的分离。 文禹 撷3 5 1 等人 还考 察了 将金属亲和配 基结合 在成相聚 合物上形成的 双水相的 制备及 优 化。 李 屏等 3 6 1 人研究了温度诱导双水相分离纯化细胞素的工艺条件与优化，综上所述，双水 相主要应用于物质的萃取分离方面: ( 1 )生物工程技术中 物质的提取与纯化 双水相萃取分离技术已 应用于蛋白质、生物酶、菌体、细胞、细胞器和亲 水性生物大分子以及氨基酸、抗生素等生物小分子物质的分离、纯化。生物酶 类在双水相的分离和纯化中，部分已 经实现了工业化。如工业化分离甲酸脱氢 酶处理 量达到5 0 k g 湿细胞 规模， 萃取收率在9 0 % 以 上， 纯 化因 子为1 _ 8 3 7 1 。 在 细胞、蛋白 质、 病毒、 抗生素等物质的分离方面，文献陆续报道，如用p e g / 无 机盐体系分离含胆碱受体的 细胞3 9 1 ; 用双水相体系从牛奶中 纯化蛋白 3 9 1 ; 用 p e g / n a d s a t p s 对 脊 髓病毒 和线病毒 进行纯 化4 0 1 : 用p e g / k 2 h p 0 4 a t p s 处 理 青 霉素g发 酵液等等的回 收率、 分 配系数均达到 较大值 4 11 ( 2 )中草药有效成 分的提取 中草药是我国的国宝，已 有几千年的应用历史，但是有关中草药有效成分 的确定和提取技术在国内 发展一直比较缓慢，这无疑限制了中药药理学的发展、 深化以及中药现代化。近几年来，有关双水相萃取技术提取中草药有效成分的 文献开始报道， 尽管数量不多，但是已 有的实例充分表明其有良 好的应用前景。 以乙 醉 ( e t o h ) / 磷酸氢二钾 狡h p 0 4 ) a t p s 萃取甘草有效成分， 在最佳条件 下， 分配系数( k ) 达到1 2 . 8 0 , 收率高 达9 8 .3 % 4 2 1 。 用 双水相萃取体系 富 集分离 第 1 章 绪论 银杏叶 浸取 液的 研究， 也表 现良 好的 分配 系数 和分离 效果 4 3 1 ( 3 )双水相萃取分析 常规的检测生物物质的技术既繁琐又费时，很难及时满足现代生化生产分 析的要求，因而开发一种快速、方便、准确的生物活性物质的检测技术是必要 的。基于液一 液体系或界面性质而开发的分析检测技术是一 项潜在的有应用价值 的生化检测分析技术。这一技术已成功地应用于 免疫分析、生物分子间相互作 用力的测定和细胞数的测定。如强心药物异羚基毛地黄毒昔 ( 简称黄毒昔)的 免 疫 测定 4 0 1 ， 双 水 相 体系 检 测 螺 旋 霉 素的 电 化 学方 法 都 是 利 用 生 物 物 质 在a t p s 中的分配系数的不同为基础进行的分析。 ( 4 )稀有金属 / 贵金属分离 传统的稀有金属/ 贵金属溶剂萃取方法存在着溶剂污染环境，对人体有害， 运行成本高，工艺复杂等缺点。双水相萃取技术引入到该领域，无疑是金属分 离的一种新技术。 在p e g 2 0 0 0 / 硫酸馁 / 偶氮肿 ( ii i ) a t p s中，可以 实现t i ( i v ) 与z r ( iv ) 的 分离 4 4 1 : 在p e g 2 0 0 0 /酸 钠 硫氰酸 钾a t p s 中 ， 实 现t c 0 0 1 ) , n i ( i i ) . m o ( v i ) 等金属离子的定量分离4 5 1 . 随着基因工程、蛋白质工程、细胞培养工程、代谢工程等高新技术研究工 作的广泛开展，各种高附加值的生化新产品不断涌现，蛋白质、酶、核酸等生 物大分子的分离纯化方面受到广泛重视。在蛋白质的分离纯化中，常用的a t p s 是p e g / d e x 和p e g / 磷酸盐两类体系。目前对蛋白 质分配性质的研究逐渐深入， 采 用 不同 的p e g / 盐 体 系， 通 过改 变 体系 的p h值， 加 入 表面 活 性剂、 水 溶 性 有 机溶剂及中性盐可达到头抱霉素c与脱乙酞基头抱霉素c的有效分离;研究蛋 白质总浓度对分配特性的影响，对蛋白质进行化学修饰如引入亲和配基等可以 改善蛋白 质的分离 特性;调节双水相中聚合物的分子量及亲/ 疏水性，改变加入 离子的种类等都可以改善有助于大分子的分离，从而突显双水相萃取分离的优 势。 与传统溶剂萃取相比，双水相萃取最大的优势在于双水相体系可为生物活 性物质提供一个温和的环境，在萃取过程中保持生物物质的活性及构象，而且 双水相萃取还有收率高、成本低、可连续化操作等优点，因此在蛋白 类药物的 制备中选择双水相体系进行研究是很有必要的。 第 1 章 绪论 1 . 5葡聚糖及改性葡聚糖在药物传递系统中的主要应用 1 . 5 . 1药物传递系统发展现状 9 0年代以来，药物新剂型与新技术已 进入了一个新的阶段。这一阶段的特 点是理论发展和工艺 研究已 经趋于成熟， 新型的药 物传递系统 ( d r u g d e l i v e ry s y s t e m , d d s ) 已 经 开始 在临 床 广 泛的 使用。 其中 缓释， 控释d d s ， 不需要频 繁 给药，能在较长时间内维持体内 药物有效浓度。靶向d d s 将药物浓集于病变的 靶器官，靶组织， 靶细胞，提高 疗效并降低全身毒副作用， 还有反映时辰生物 学技术与生理节律同步的脉冲式给药，及根据所接受的反馈信息自 动调节释放 药量的自 调式给药，即在发病高峰期在体内自动释药的给药系统可以认为是最 先进的药物剂型。在这些较新的剂型中微球是常用的一种。微球是指药物溶解 和 ( 或)分散在高分子材料中形成的球状体，其粒径在微米级，粒径在纳米级 的为纳米球。药物制成微球后主 要特点一是缓释长效，二是靶向作用。微球的 材料多为生物降解材料， 如糖类， 合成聚酷类等。 d e x 及其改性产品因其较好的 亲水性及其对药物溶解释放的可控性而更适用于药物微球的传递系统。它在水 中容易形成的水凝胶微球避免了 有机溶剂的使用， 且凝胶为多孔结构，杂质很 易通过透析等手段除去成为蛋白 药物载体的首选。 1 .5 .2 葡聚糖结晶 形成的 凝胶微球i46 i d e x 虽然易溶于水，但最近研究发现低分子量的d e x ( d e x 6 0 0 0 )的浓水溶 液会有结晶现象出 现，控制结晶时间可以形成凝胶或微球，较高的溶液浓度， 盐的存在或搅拌都会促进凝胶形成，此凝胶在室温下不溶，而在沸水或二甲亚 矾中可溶; 研究认为结晶是由高 浓度d e x与相对较少的水分子之间通过氢键结 合形成的。高分子量的d e x( 如d e x 4 0 0 0 0 和d e x 2 2 0 0 0 0 )则没有这种性质。 1 . 5 .3化学交联型改性葡聚精微球 ( 1 )材料 甲 基丙 烯酸 经乙 酷 ( h e m a ) 通过拨基二咪哇活 化终端 经基法接枝到 d e x得 到d e x h e m a t4 71 ， 甲 基 丙 烯 酸 缩 水 甘 油 r e ( g m a ) 和甲 基 丙 烯 酸( m a ) 在 亲 核 试 剂二甲胺毗睫及催化剂三乙胺的存在下分别接枝到 d e x得到 d e x g m a l4 s l 和 d e x m a 4 9 1 . 上 述丙 烯酸基 在d e x 上的 取代 度都 通 过n m r测得， 通过调 节反 应 物配比可得到不同取代度的改性 d e x . 第 1 章 绪论 1 . 7 本课题研究内 容 聚乳酸具有生物相容性好、生物降解性可调等优点;同时， 聚合度一定且 手性相反的聚乳酸分子在水溶液中可立构复合形成物理型水凝胶，从而有效避 免 有毒试剂的 使用， 进而提高 药剂制 备过程中药 物的 稳定性 5 4 1 。 然而，高 分 子 聚乳酸链的亲水性有限，且由于包埋药物所需熔融温度高而不宜作热敏性生物 大分子药物的给药载体5 5 。改性葡聚糖是一 类广为应用的高 分子水凝胶材料 5 ( - 5 7 。 利用具有一定 疏 水性的 o l l 改性 d e x ， 实 现光 学纯度聚 乳酸分子与 d e x 的 交联，可以实现材料的优势互补。本课题依据此种材料的性质，再利用a t p s 可 以 将蛋白 质分离纯化技术与其微球制备技术相结合的特性， 通过控制接在d e x 上 的o l l 的链长及其在d e x 上的取代度的来调节材料的疏水性，建立改性d e x 与 p e g 的 双水相体系( d e x o l l / p e g a t p s ) ，同时考察牛血清清蛋白( b s a ) 在此 a t p s 中的分配， 旨 在使模型蛋白 b s a 在d e x o l l 相的分配率最大， 从而为利用双 水相中 制备d e x o l l 载药微球奠定工艺及理论基础。 又由于双水相体系很容易规 模放大， 所以 建立起合适的此种体系，也会为 工业化莫定 切实可行的基础。为 此，本文研究内容主要分三部分: ( 1 )从l 一 乳酸水溶液出发，先合成l - 丙交酷，l丙交酷开环聚合得到o l l 后，开发两条o l l 改性d e x 得到d e x o l l 的工艺路线， 并研究了 温度， 反应时间， 催化剂等条件对合成过程中产率及产品性能的影响。 ( 2 )研究了 d e x o l l 的水溶性及其与p e g 所成的a t p s 的性质， 以 b s a 为模 型蛋白 考察其 在d e x o l l / p e g a t p s 中的分配系数， 寻找适合 b s a 在d e x o l l 富集 相分配的最佳条件，为蛋白 分离提供理论基础. ( 3 )初步探讨d e x o l l 利用双水相技术成球的机理并开发制备此微球的新 工艺。 第2章 实验部分 第2 章 实验部分 2 . 1实验原料及仪器 2 . 1 . 1实验主要试剂与原料 实验所需主要原料的规格、产地等说明列入表2 . 1 所示 表2 . 1 主要原料及试剂 t a b l e 2 . l ma i n r a w m a t e ri a l s a n d a g e n t s o f e x p e ri m e n t s 原料名称产地 备注 l - 乳酸 辛酸亚锡 ( s n ( o c t ) z ) 二乙二醇甲醚 ( me e ) p d / c 葡聚糖 ( d e x t 4 0 ) 聚乙二醇 ( p e g) n,n - -甲胺毗咤 ( d ma p ) n,n ， 二环己基碳-v-胺( d c c ) 四氢吠