（光学工程专业论文）生物细胞三维光学显微成像实验研究.pdf

摘要 摘要 三维光学显微术是一种具有三维空间分辨能力的现代光学显微技术， 在生命科学研究领域中有着重要的应用价值，本文围绕三维光学显微术做了 以下几个方面的研究工作： 1 本文概述了三维光学显微术的发展过程及研究现状，并重点论述了该 成像技术在生物医学研究领域的应用。 2 在傅立叶光学和菲涅耳衍射理论基础上重点对共焦扫描显微术和多 光予荧光显微术的基本成像原理进行了理论分析，结果表明共焦显微系统的 有效点扩散函数是照明物镜点扩散函数与探测物镜点扩散函数的乘积，这一 特性使得系统的分辨率高于相同条件下的普通光学显微系统，同时还具有了 独特的层析能力。由于多光子激发这一非线性光学效应的作用，使得多光子 显微系统可以不采用共焦针孔也能具备层析能力。 3 介绍了三维光学显微成像实验系统，包括显微光学系统、探测系统、 扫描控制系统、计算机数据采集及处理系统，给出了相应的参数。通过实验 获取了生物细胞单光子和双光子的图像，比较了二者的成像能力。结果表明， 双光子荧光显微术的纵向成像能力优于共焦显微术的纵向成像能力。 4 为去除生物图像噪声，重点研究了稀疏编码收缩法，该方法有效地减 弱了高斯噪声对成像质量的影响，给出了相应的实验结果。 本文的研究内容包括阐述三维光学显微术的基本原理，概括单光子和多 光子成像特性，介绍三维光学显微实验系统以及图像获取过程，在此基础上 深入研究生物细胞图像去噪处理算法的原理分析和实验实现。目的是通过对 原理的探讨，寻找提高生物细胞成像质量的有效方法。 关键词：共焦显微术；双光子荧光显微术；细胞；图像；噪声 a b s t 髓c t a b s t r a c t t l l r e e - d i m e n s i o n a l ( 3 d ) o p t i c a lm i c r o s c o p yi s o n eo fm o d e mo p t i c a l m i c r o s c o p y ， w h i c hh o i d st t l r e e - d i m e n s i o n a lr e s o l u t i o n b e c a u s eo ft h i s r e m a r k a b l ef b a t u r e ，3 do p t i c a lm i c r o s c o p yc 锄b e 讥d e l ya p p l i e di nt l l ed o m a i n o fl i f es c i e n c e s t h em a i nw o r kd e s c r i b e d 硒f o l l o w s ： 1 t h ed e v e l o p m e mo f3 do p t i c a lm i c r o s c o p yi ss u m m 捌z e d t h em a i n a p p l i c a t i o no f3 do p t i c a lm i c r o s c o p yt ol i f es c i e n c e si si m r o d u c e d 2 b a s e do nd i f f t i o nt h e o r y ；t h ep r i n c i p i 啪so fc o n f o c a lm i c r o s c o p ya n d t w o p h o t o nn u o r e s c e n c em i c r o s c o p ya r ea n a l y z e d t h er e s u l t ss h o wt h a tt h e t m n s v e r s ef e s o l u t i o no f3 do p t i c a l m i c r o s c o p yj s1 l i g h e r t h a nt h a to f c o n v e m i o n a lo p t i c a lm i c f o s c o p yu n d e rt h es a m ec o n d i t i o i l s a tt h es a m et i m e ，i t h a st h ei l n i q u ed e p t hd i s c r i m i n a t i o n b e c a u s em ep h e n o m e n o no f 伽o - p h o t o n n u o 托s c e n c ei sn o n l i n e a r ，t w o - p h o t o nf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p yp o s s e s sd e p t h d i s c r i m i n a t i o n 砒h o mc o n f o c a lp i i l l l o l e 3 n l ei a b o f a t o r i a li m a g i n gs y s t e mo f3 do p t i c a lm i c r o s c 叩yi si n t r o d u c e d ， i n c l u d i n gm i c r o s c o p e 、s c a n n e r 、d e t e c t o ra i l dd a t ac o l l e c t i o n t o m o g r a p h yi m a g e s a c q u i r e db yt h i si m a g i i 培s y s t e ma r ep r e s e n t e d t h ee x p e r i m e m a lr e s u l t s o b t a i n e db yc o n f o c a lm i c r o s c o p ya i l dt w o - p h o t o nf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p ya r e c o m p a r c d i ts h o w st l l a tt h ea x i a la _ b i l i t yo f t 、o p h o t o nf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y i sb e t t e rt l l 眦t h a to fc o n f o c a lm i c r o s c o p y 4 mo r d e rt od e n o i s ei m a g ed a t a ，w ec e n t e ro nar c c e n tm e t h o d ，s p a r s e c o d es i l k a g e ( s c s ) a i l dt c s t e di to na 1 1i m a g ed a t as e t w eh a v es e e nm a ts c s o u t p e d b m sb a s i cd e n o i s i n gm e t h o d st oc o 咖t e r a c tt l l ei n n u e n c eo fg a u s s i a l l n o i s e t h eb a i s i ct h e o r ) ro ft l l r e e - d i m e n s i o n a l ( 3 d ) o p t i c a lm i c f o s c o p yi s 锄a l y z c ds y s t e m i c a l l yi nt h i sp 印e r w eg e n e m l i z ct h ec h a r a c t e r i s t i co ft 1 1 e c o n f 0 c a lm i c r o o p ya n dt w o - p h o t o nn u o r c s c e n c em i c r o s c o p y f l l n h e m o r e ，w e i n t r o d u c et h ep r o c e s so fi m a g ea c c e s s i n ga n dt 1 1 el a b o m t o 五a li n l a g i n gs y s t e mo f t h r e e d i m e n s i o 越l ( 3 d ) o p t i c a lm i c r o s c o p y m o r e o v e r ，o nt h eb 勰i so f t h ea b o v e ， i i 垒! 塑璺 一 w em a k ei n d e p t hs t u d yo ft h et h e o r ya n dt h ee x p e r i m e ma b o u tm es p a r s ec o d e s i l r i n k a g e ( s c s ) a l g o r i t h m o u rg o a li st of i n d 锄e 虢c t i v em e t h o dt oe 1 1 l l a i l c e m eq u a l i t yo fl i v ec e l l i m a g e k e yw o r d s ：c o n f o c a lm i c r o s c o p y ；撕o - p h o t o nf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y ；c e l l ； i m a g e ；n o i s e n l 第一章绪论 第一章绪论 第一节引言 细胞是生物体的形态结构和生命活动的基本单位。了解生物体生命活 动的规律，必须以研究细胞为基础，探索细胞的生命活动，掌握和控制生、 老、病、死的基本规律。为对细胞进行有效研究，人们发展各种显微探测 技术“删，可以将细胞放大到几十倍，甚至几十万倍进行观测，从而获得有 关细胞的各种有用信息。 以电子显微镜为代表的各种非光学类显微成像技术具有纳米甚至更高 的分辨率。然而这些不用光波作为信息载体的显微术，在实际应用中存在 很多局限性，比如有的要对样品进行切片和采取冷冻，有的要求样品不能 是绝缘体和溶液，有的要求真空等。例如在进行电镜分析时，必须对生物 样品进行干燥、固定等处理，这也就意味着电镜下无法观察到活细胞的生 命现象。 与其它显微技术相比较，光学显微术在对活性生物样品进行观测方面 有着独特优势，并通过开发光的偏振特性、谐波和光谱特性，可以实时、 动态和高灵敏度地监测样品内分子的相互作用，进一步获得样品更丰富、 更精细、更本质的微观信息。 三维光学显微成像技术就是这样一种功能强大的光学显微成像工具， 它具有其它显微术所无法比拟的层析能力，能够不需要进行切片而对厚样 品进行三维成像。三维光学显微术的出现是现代光、机、电一体化高度发 展的结果，也是光学显微术与激光技术、电子技术、图像分析技术、荧光 染料标识技术、三维数据可视化等多种技术相结合的产物。三维光学显微 术利用其自身独特的成像结构和机理，有效地排除焦点以外杂散光的干扰， 能够对样品深层结构进行探测，实现高分辨率的二维光学断层扫描成像， 并通过三维重建使样品结构得以完整显示，这对于实时观测活性生物样品 的活动有着不可比拟的优势，人们可以方便地研究细胞结构和组织行为、 细胞骨架、细胞c a “活动、核基因结构、生物芯片等重要生物学问题。 第一章绪论 第二节三维光学显微术的发展概况 三维光学显微术包括共焦扫描显微术以及利用各种非线性光学效应的 光学显微成像技术，如多光子荧光显微术和高次谐波显微术。其中，共焦 扫描显微术和双光子荧光显微术是目i ；i 相对而言应用最广的两种三维光学 显微术，本论文就是围绕这两种显微技术展开研究工作。下面对这两种显 微技术的发展概况进行全面的综述。 1 2 1 扫描共焦显微术 三维光学显微术的发展首先开始于激光共焦显微成像技术的出现。二 十世纪五十年代m i n s k y 嘲为了消除普通光学显微镜在探测样品时产生的多 种散射光对成像质量的影响，提出共焦显微术的基本概念，并获得美国专 利，但限于当时的技术水平而无法实现。虽然6 0 年代的一些研究者已经报 道了利用该系统突破成像分辨率的限制，但是没有引起人们的重视。7 0 年 代人们对共焦成像给予了更细致的研究。首先阐明了它的横向分辨率是相 同孔焦比的普通显微镜的1 4 倍。这种分辨率的改进是利用减小显微镜的 视场来获得的，人们很快就认识到共焦显微术具有很强的纵向深度的分辨 能力；探测到焦点外的信号强度比在焦点内的信号强度要弱得多，正是这 些焦外的信息使普通显微镜的成像变得模糊。1 9 8 5 年，w i n a e d t sv a n r e s a i n t 第一次成功演示了用荧光探针标记的生物材料的光学截面，充分证 明共聚焦荧光显微镜具有摈弃离焦光线，获取生物样品的三维数掘的能力。 同年，v a a d e rv o o r t 全面描述了激光扫描共焦显微镜。他认为一套高质量 的激光扫描共聚焦显微镜必须包括：标准消像差和色差的光学透镜、高灵 敏度的探测器、产生特定波长的功率不太小的激光器、高速大容量的微机 系统和扫描控制装置。在接下来的两年罩，o x f o r d s h i r e 公司，也就是现在 的b i o r a d 公司生产出第台商业的激光扫描共聚焦显微镜。 共焦显微术的基本原理如图1 1 所示，共焦显微镜采用共轭焦点技术， 使光源，被照物点和探测器处在彼此对应的共焦位置，光源经物镜在样品 表面上聚焦成衍射限制的斑点，其反射光或透射光再次通过物镜或聚光镜 通过共焦针孔被探测器接收。由于焦面以外的光线在针孔静和针孔后聚焦， 2 第一章绪论 在探测面上形成弥散斑，此时通过针孔被探测器接收到的光能量很少，使 得焦面以外的光信号大大地抑制，探测到的离焦信号强度远远低于焦点信 号强度。对离焦信号的摈弃使共焦成像术可以在三维空日j 上精确定位被测 样品。由于共焦显微镜具有很好的层析能力，采用适当地图像处理技术， 对样品纵向连续层析，再将二维图像进行重构，可以得到物体的三维图像。 层析技术也可以用来研究物体的表面形状。 共焦针孔 分 焦平面 光源针孔 i i 光源 焦点内光线 。焦点外光线 图1 1 共焦显微术的基本原理图 激光扫描共聚焦显微镜与普通光学显微镜相比有如下特点： 第一，散射背景光对成像质量的影响小，图像信噪比高。特别适于对 生物样品进行观察，如大脑组织中神经细胞之间的细微联系。如果采用常 规光学显微镜观察，使用场光源照明时，照明光束照射整个样品，位于系 统焦平面以外的样品构成离焦图像叠加在有效图像上，降低了成像系统的 成像质量。而在扫描共焦显微镜中，由于共焦针孔的作用，在焦平面上下 部分产生的杂散光被有效阻挡，提高了图像信噪比。 第二，可进行三维扫描成像。它用计算机控制成像系统对体样品进行 分断层、逐行、逐点的三维扫描，同时图像数据将采集存入计算机存储系 统。根据研究需要可以很方便的计算机图像系统显示任选的二维断层图像 第一章绪论 或三维透视图，使其在许多科学领域中都具有重要的现实意义。例如，利 用普通显微镜观察生物组织，通常需要将样品做成切片，而在切片过程中 由于变形而破坏了原有结构，造成位置错位，表面形态变形等。另外此外， 切制过程时间周期长且操作复杂。使用共焦扫描显微镜就可避免上述问题。 在观察生物活细胞接受药物处理的反应时，激光共焦扫描显微镜可发挥极 为重要的作用，它可以在计算机的控制下每隔一定时间记录下细胞图像， 从而使得工作人员可以在实验后从容地观察和研究细胞受药物作用后的变 化情况。 第三，采用激光光源，成像系统色差小，可比较方便地改造成荧光扫 描共焦显微镜。扫描共焦显微镜要求光源尺度小、亮度高，采用激光光源 是最佳选择。大数值孔径、高放大倍数的显微物镜均不可避免地存在残留 色差，用激光光源可以提高光学系统的分辨能力，尤其具有对厚物体光学 切片成像的能力。 1 2 2 多光子荧光显微术 共焦显微成像系统通过共焦针孔实现了三维成像，利用其它方法也可 以实现这一目的，例如，双光子荧光效应。双光子荧光显微术于1 9 9 0 年由 d e n k 等人提出“1 ，它与共焦显微术的结构相似，不同之处在于利用非线性 光学效应。由于双光子激发要求很高的光子密度，在焦点以外的荧光分子 很难被激发，空间局域性很强，这样在探测处无须采用共焦针孔也能有效 滤除非焦平面杂散光的影响，因此也具有纵向成像的能力。与共焦显微术 相比，双光子荧光显微成像技术具有以下几个优点： ( 1 ) 纵向成像能力强，图像信噪比高。共焦显微术采用短波长光源激 发，例如紫外光，很容易被样品吸收或散射。而双光子荧光显微术通常工 作在红外、近红外波段，在样品中有更强的穿透能力，不易被吸收或吸收， 这样更容易获得样品内部的图像，提高系统的成像质量。图1 2 ”3 给出了两 者之日j 成像能力的比较，图1 2 ( a ) 利用单光子共焦显微术获得的向只葵花 粉颗粒的图像，而图1 2 ( b ) 则是利用双光子荧光显微术获得的。通过对这 两幅图像的比较，可以明显看出双光子荧光显微术获得的图像具有更清晰 的细节，是单光子共焦显微术无法比拟的。 4 第一章绪论 ( b ) 图1 2 问向日葵花粉颗粒的三维图像 ( 2 ) 激发效率与激发光强的平方成正比，双子显微术激发样品局限于焦 点附近，所以对样品和荧光染料的光漂白破坏作用只局限在焦点附近，减 小了光损伤，适合对活体尤其是胚胎进行长时b j 观测。 ( 3 ) 双光子激发波长与样品荧光波长差距很大，在光路上易于实现， 也提高信号收集效率。由于避免了放置滤除杂散光的针孔，可利用荧光多。 因为针孔不仅滤除了焦点附近以外的光，还有可能滤掉了部分来自焦点的 光，使用双光子荧光显微术能提高信号收集的效率。 由于三维光学显微术的独特成像能力，它在材料科学、精密机械、半 导体工业等学科领域得到了广泛应用，并随着应用要求的不断提高以及更 多先进方法和技术的融入，如荧光技术、光纤技术、彩色显微技术和光栅 显微技术等，三维光学显微技术也取得了巨大的发展与进步，不仅表现在 结构形式出现多样化，同时功能及应用领域也在不断拓展。 德国的欧州分子生物学实验室h e l l 领导的研究小组提出了一种高分辨 率的4 p i 共焦显微镜1 ，通过两个对置的显微物镜共焦来增加显微镜的孔 径。激光束经分柬器分为两束平行光，分别进入两侧的显微物镜并聚焦在 一个共用焦平面上，照明荧光物体。这种显微术可以将分辨率提高到 1 0 0 一1 5 0 n m 。h e l l 等人又采用特殊荧光技术提高荧光共焦显微术的分辨率 ”1 ，可以获得3 3 姗的纵向分辨率。 另外，他们还设计了一种多聚焦点多光子显微镜系统，这是一种实时、 5 第一章绪论 可直接观察的多光子荧光显微镜系统0 1 。其基本原理是，首先用一个光束分 束器对扩束后的锁模钛一蓝宝石激光器发出的激发光进行分光，分成一个阵 列的光束，中继光学系统使该光束阵列入射到一高数值孔径物镜上，最终 在样品上形成一汇聚光点阵列，然后进行扫描。用数值孔径为1 4 的油浸 透镜和数值孔径为1 2 的水浸透镜在7 8 0 n m 光的激发下，获得的轴向分辨 率分别为o 8 4 p m 和1 4 p m ，采集到的图像能以视频速度读出，这一特性 对活体细胞的实时三维成像具有独特的潜力。 将光纤元件( 如光纤、光纤耦合器、变折射率透镜或光纤光栅等) 应 用到共焦激光扫描显微镜，可使整个系统紧凑，体积减小，造价低，便于 定位。光纤不仅可为激发光和共焦信号( 荧光或者样品放射光) 提供柔性光 路，避免空气流的扰动以及实现系统优化，同时光纤芯的面积等效空间滤 波器针孔，实际起了共焦针孔的作用，更为重要的是这种结构的显微成像 系统能适用于一些空间受限的应用领域。例如，为能早期诊断癌症，可将 共焦显微成像系统和单模成像光纤结合起来形成新型共焦技术9 1 ，克服共焦 显微成像系统不能对体内组织、细胞进行在体成像的缺点，作为光信息传 输介质的光纤具有很强的信号传输能力以及很好的柔韧性和小尺寸等优 点，可将光导人体内进行共焦成像。 研究人员还发展多种实时共焦成像系统，如采用n i p k o w 盘的扫描共焦 显微镜“”、透镜一针孔阵列共焦显微镜“”、双缝扫描共焦显微镜“日。将低 相干干涉仪与共焦扫描显微术结合在一起则产生了光学相干层析成像技术 “”，能够对生物内部组织等高散射介质逐层进行光的相干性以及传播方向 的滤波，实现毫米深度的微米级高分辨层析成像。 第三节三维光学显微术在生物医学领域的应用 随着三维光学显微技术的系统结构以及成像功能的不断发展和强大， 它在医学、生物学、生命科学、材料科学、精密机械、半导体工业等学科 领域的应用也越来越广泛，下面主要介绍这种成像技术在生物医学研究领 域的应用。 1 细胞c a ”的研究” c a 2 + 是重要的第二信使，对于调节细胞的生理反应具有重要作用，对它 6 第一章绪论 的研究是当今生命科学研究领域的一大热点。由于以| j i 探测技术的局限性， 无法对活细胞内的c a 2 + 信号进行动态观察，不能对同一个细胞或同一组细胞 的不同生长阶段进行观察，缺乏对比性，也大大降低了可信度，并给研究 工作带来了困难。共焦显微术不需要进行切片就能对样品观察，可以保持 细胞的活性，动态观察荧光探针标记的细胞内( c a 2 + ) 的时间和空间的荧光 图像变化，还可观察细胞某一层面或局部的( c 矿) 荧光图像和变化。荧光 图像经光电倍增管等探测器，以数字方式输到计算机，计算出细胞或某一 区域c a 2 + 信号的时间和空间变化，具有快速准确、自动化程度高的优点，是 研究细胞内c a 2 + 及其它参数的理想工具。通过对单细胞的c a 2 + 研究发现，c a ” 不仅在细胞局部区域问的分布是不均匀的，而且细胞内部不同深度或层次 间也存在不同程度的c a 梯差，即所谓空间c a 2 + 梯差。细胞在受到外界刺激 时，c a ”荧光信号强度会发生很大的变化，随着刺激时间的增长，即使刺激 物继续存在，细胞c 矿荧光信号不但不会继续增强，反而会慢慢减弱，直至 回复到未加刺激物时的水平。在其它一些生理过程如细胞分裂、胞吐作用 等，c a ”荧光信号强度也会发生很显著的变化。 2 光活化技术 许多重要的生命活性物质和化合物均可形成笼锁化合物，笼锁化合物全 称为光致不稳定笼锁化合物，系用掩蔽基团修饰生物活性分子人工合成，以 惰性前体存在，一旦被近紫外光照射，两者间的共价键即解离而释放出活性 分子，这一光解作用称为解笼锁。由于光化学过程反应快，以及生物活性分 子不经弥散过程而直接在光解部位发挥作用，当与激光扫描共焦显微镜联合 应用时，就具备了极灵敏的时间和空间分辨率；加之活性分子的释放易于调 节，这就为调控和研究生命过程提供了强有力的工具。激光扫描共焦显微镜 具有光活化测定功能，可以控制使笼锁探针分解的瞬间光波长和照射时间， 从而人为地控制多种生物活性产物及其它化合物发挥作用的时问和空间。随 着激光共焦显微技术的发展，如聚焦解锁笼技术以及双光子激光共焦显微技 术的出现，将显著的改进视野的深度，减少光动力学损伤，达到最佳三维空 间定位，获得神经环路的。光活化电流图像”，并反应单细胞和亚细胞水平 特定受体分布。 一 3 植物发育学u ” 在植物胚囊的研究方法中，常规技术是利用石蜡切片结合显微镜观察 7 第一章绪论 近年来，人们利用发育中的胚囊能够产生自发荧光的特点，借助共焦显微技 术观察植物胚囊的发生和发育过程，张华华等用共焦显微技术直接观察经透 明处理的水稻子房，研究加倍的基因剂量对于四倍体水稻的胚囊形成与发育 的影响，发现广陆矮4 号四倍体大部分的胚囊形成与发育过程基本是正常 的，成熟胚囊时期异常频率为1 0 6 1 ，l 2 0 2 四倍体的异常频率较高，成熟 胚囊时期异常频率达4 5 6 5 。任宏等将水稻子房经固定和脱水，用冬青油 整体透明及丁香封片，利用共聚焦扫描显微镜检术，观察到发育中的胚囊产 生自发荧光，可分辨出胚囊内部结构，用4 戊二醛固定液效果更好，这为 研究植物胚胎发育提供了指导。郭向荣等采用d n a 特异荧光染料结合激光共 聚焦扫描显微镜技术观察了大麦直接游离小抱子培养中最初的有丝分裂前 的脱分化启动以及启动后的胚胎发生过程中的细胞学特征。 4 荧光能量共振转移“” 利用激光扫描共焦显微镜检测荧光能量共振转移可以在细胞水平原位 研究大分子构象的改变，蛋白质与蛋白质的相互作用，如：受体与配体之间 的相互作用或受体之间的相互作用或受体的二聚化等。荧光标记的方法可以 是免疫荧光标记，也可以是荧光蛋白标记的融合蛋白的表达。荧光能量共振 转移既可用于固定样品的检测，也可以用于活细胞的检测。用于活细胞检测 的样品通常应采用双色荧光蛋白转染的方法。检测时应采用光谱转移的方 法，即只开启激发供体的激光，而检测受体的发射光强。检测中一定要排除 光谱交叉和背景光的干扰。 5 代谢过程研究 多光子技术可以用来对标记物质的代谢过程进行监测，记录代谢物的分 布、代谢速度，从而突破传统的生物化学分析方法，从单个细胞的层次实时 研究代谢过程，己应用于药物、糖类等物质的代谢研究。例如，细胞内 n a d ( p ) h 水平反映了葡萄糖的代谢水平：哺乳动物组织中的葡萄糖代谢时间 经历数小时，而且n a d ( p ) h 酶的自荧光激发需要3 6 0 硼的紫外光，多光子 技术就可很容易地解决这一问题。p i s t o n 利用双光子技术观察了不同细胞 中的n a d ( p ) h 自荧光变化。 6 单分子探测 自隧道显微镜、x 一衍射技术等应用以来，人们己能对结晶状态的单种 分子进行观察；纳米技术的出现，也对单分子的结构有了新的认识。但是在 8 第一章绪论 活体条件下( 活细胞、整体) 对单个分子的活动进行研究，是从未有过的。 在细胞生物学及分子生物学范围内，有关分子转位、移动，分子与分子日j 的 相互作用，分子的“功能”状态，等等，虽然有了大量的理论上的结论，但 这些都是根据集群平均而得出的。当这些结论对解释分子现象发生矛盾或困 难时，例如一个离子通道分子的激活、失活，一个受体分子的激活或脱敏， 不得不提出种种解释。而证明这些解释，在集团平均的水平上，将是非常困 难的。单个分子的研究将有可能从一个新的角度提出细胞内的分子活动的规 律性认识。利用三维光学显微术对活细胞进行单分子检测，有以下特殊优越 性：第一，该探测技术具有层析功能，这样可以深入到活细胞内部进行无损 伤性生物活体探测；第二，激发体积很小，有利于削减背景噪音的影响；第 三，它可以在空日】成像的同时给出反映生物分子结构的光谱信息，并具有时 间分辨特性，可以给出时间分辨的图像和光谱。 7 眼科学研究 人眼相当于一个精密的成像光学仪器，它是人类观察客观世界的重要器 官。同时，人眼又是一个生物组织，容易受到多种疾病的影响，使得人眼的 分辨能力急剧下降。例如，与年龄有关的黄斑变性是严重威胁老年人视功能 的眼底病变，在西方国家是5 0 岁以上的患者不可逆性的严重视力损害的最 主要的原因。同时，各种眼科手术也日益增加，为了解病变情况以及术后状 况，需要获得高质量的人眼内部图像。光学方法具有非接触、无损伤的特点， 而相比于传统光学成像方法，三维光学显微成像技术可以非常有效地减小散 射光对图像质量的影响，在三维空间、实时、活体的条件下对人眼组织进行 无损伤的光学断层扫描成像“”，同时还可以结合其它技术进一步提高成像质 量。 第四节本论文研究内容及意义 本文的研究内容包括阐述三维光学显微术的基本原理，概括单光子和 多光子成像特性，介绍三维光学显微实验系统以及图像获取过程，在此基础 上深入研究生物细胞图像去噪处理算法的原理分析和实验实现。目的是通过 对原理的探讨，寻找提高生物细胞成像质量的有效方法。 第一章，本文概述了三维光学显微术的技术背景，发展过程以及研究现 9 第一章绪论 状，并介绍了对当前主要的三维显微术进行了概括性描述，重点讲述了激光 扫描共焦显微术在生物医学方面的应用。 第二章在傅立叶光学和菲涅耳衍射理论基础上重点阐述了共焦扫描显 微术和多光子成像的基本原理，对反射式共焦扫描显微镜的系统结构做了阐 述，并对其成像特性，包括横纵向分辨率进行了深入的理论探讨。详述了影 响系统成像质量的各个参数和指标。说明了系统有效点扩散函数是照明系统 和探测系统各自的点扩散函数。探讨了多光子成像系统的成像特性。 第三章介绍了实验室三维光学显微实验系统，包括显微光学系统、探测 系统、扫描控制系统、计算机数据采集及处理系统，给出了相应的参数，通 过实验获取了生物细胞单光子和双光子的图像，比较了二者的不同。 第四章针对生物细胞激光共焦扫描图像噪声产生的机理，重点讨论了稀 疏编码收缩法及其实现的各种算法，利用f a s t i c a 算法进行仿真和实验，证 明了该方法可有效地减弱高斯噪声对成像质量的影响。 第五章为总结与展望 0 第二章三维光学显微术成像原理 第二章三维光学显微术成像原理 本章将从一般的光路图出发，在傅立叶光学和菲涅耳衍射理论基础上 对三维光学显微系统的成像原理进行详细地分析，说明其三维分辨能力的产 生机理，并比较了共焦显微术与双光子荧光显微术这两种三维光学显微术的 共性与区别。 7 ae 第一节透镜的三维点扩散函数 图2 1 透镜成像系统示意图 设有一个薄的振幅透过率为u o ( 勒，如) 的平面物体放在一个正透镜前 面处，照射物体的光波为单色平面波a ，如图2 1 所示，图中o 面称为物平 面。u i o ) 表示透镜之后距离为西的平面上的像场分布网： 拈等躲掣j 融彬腆川 e x p 轰。一寺) 】 q ” e x p - 等瞰+ 州) ，。+ 溅咖。出咖 工一y 是薄透镜面上的坐标，p ( x 是透镜的瞳函数。公式( 2 1 ) 给出了一个 在知处的薄物体，在像场z ，处的像。如果物体是一个有限厚度的物体，此 第二章三维光学显微术成像原理 时，每个物场的垂互横截回酃在像场z l 处彤厩一个像，l f 征五处阴思像功是 以上各个横截面所成像的叠加。这时，一个有限厚度的物体所成的像，即一 个3 d 物体的像，是公式( 2 1 ) 在动轴上的积分： 以) = 业铲j j 缈珊 ) p ( ) 酬酢，q 0 ) 】e x p 轰( ，) ( z 。一寺) 】 e x p 一尝瞰x 。+ 争+ y ( y 。+ ) 出。砂。出。螂 ( 2 2 ) 假设， m 朋加- 弛川e x p 番( 川 e x p 一善( z 2 工+ ) ，2 y ) 】撕 ( 2 3 ) 口1 则公瓦l z z ) 父为o 棋一) = 掣篙产舡伊栅啡包) 】 x 而( + 吾，y 。+ 鲁，z 。一云- ) 出。砂。沈。 ( 2 4 ) 假设物体是位于( 珈枷痢) 的一个6 函数( 点光源) ，其在& 。拂# ，) 的像场为： y 一弘盟氅等盟 e x p ( 池舯( 寺，鲁，一寺) ( 2 5 ) 点脉冲的像场强度为： “，z ，) = l 向( 音音，一寺) l o ) 因此厅伍，弘z ) 的物理意义是成像系统对单个物点所形成的像场分布r 根掘线 桦磊缩理诊官昔县桑缔的= 雅振幅占扩散甬粒。 第二章三维光学显微术成像原理 第二节共焦扫描显微术成像原理 实际使用中的共焦显微系统有很多种，如共焦荧光显微系统、共焦明 场显微系统、光纤共焦显微系统、多聚焦点共焦显微系统等。但是，这些系 统的成像本质是相同的，即点光源照明、共焦点探测和扫描成像。下面就以 反射式明场共焦显微系统为例来具体分析共焦显微术的成像原理，这里采用 的方法也可以推广到其它形式的共焦显微成像系统中。 2 2 1 共焦显微系统的点扩散函数 图2 2 反射式明场共焦显微系统原理图 图2 2 给出了反射式共焦扫描显微系统的结构图。照明物镜在样品上 形成一个衍射受限的照明，探测透镜则将样品产生的信号光收集到一个小的 探测器上。其实，实际的共焦系统通常只会用到一个透镜，该透镜即做照明 透镜，又做探测透镜，这罩便于分析而采用了两个透镜。假设入射光的波长 为九，且光源为一个点光源。入射光场经照明透镜聚焦到样品上，样品反射 第二章三维光学显微术成像原理 或散射回来的光被探测透镜汇聚到一个点探测器上。将样品沿着横向和纵向 扫描，就可以得到物体的三维图像。 为分析成像过程，在光源空间、物空间和探测器空问建立三个坐标系， 如图2 2 所示，分别用，o 、，i 和，2 列矢量表示光源、物面、像面的位置坐标 矢量。假设为点光源照明，根据有限厚度物体的三维成像公式可推得样品上 的照明光场【3 】： i 万( ，o ) e x p 腩( z l z o ) 】甄( ，o + m l ，1 ) d ，0 ( 2 7 ) 一 式中 l 是照明透镜的三维振幅点扩散函数，m 表示物镜的放大因子，它是 一个对角矩阵，定义为： 肘l = 、 m l l 懒 1 膨1 ( 2 8 ) 假定物体被扫描到位置列岛加m ) ，则照到物上的光场分布为： 【i 艿( ，o ) e x p 【腑( z 1 一二o ) 】忍i ( ，o + f l ，1 ) d r 0 】口( 一，1 ) ( 2 9 ) 一 再次根据有限厚物体成像公式可以得到探测空日j 的光场分布； 军摹 【，( ，2 ，) = i 【j 万( ，0 ) e x p 【琥( z o z 1 ) 】办l ( ，o + m l ，1 ) d ，0 】o ( 一，1 ) 一一 e x p 【一派( z 2 一z i ) 】 2 ( ，l + m 2 ，2 ) d ，l ( 2 1 0 ) 式中垃是探测透镜的三维振幅点扩散函数，肘i 表示探测透镜的放大因子， 它也是一个对角矩阵： 肘j = 1 尬 1 抛 、 谗2 ( 2 “) 如果点探测器位于，2 0 处，则该处的信号强度为： ，( ，j ) = f p ( ，2 ，) 1 2 万( ，2 一，2 0 ) d ，2 ( 2 1 2 ) 将公式( 2 1 0 ) 代入上式，可得： 一 1 4 第二章三维光学显微术成像原理 ，( ) = 陋。( ) p ，d ( ) 1 2 ( 2 1 3 ) 其中q 表示三维卷积，公式( 2 1 3 ) 表明该共焦系统相当于一个振幅点扩 散函数为下式的成像系统： 办。( ，) = e x p 【一2 勉】矗1 ( mi ，) 矗2 ( ，+ m2 ，2 ) ( 2 - 1 4 ) 公式( 2 1 4 ) 是对于光源在轴上但点探测器具有一定偏移的反射式共焦显微 系统的一般形式。当探测器的偏移为零时，公式( 2 1 4 ) 变为： 矗。( ，) = e x p 【一2 强z 】办l ( f l ，) 矗2 ( ，) ( 2 1 5 ) 对于半径相同的圆形照明透镜和圆形探测透镜，引入极坐标系，使公 式( 2 1 5 ) 归一化，同时考虑探测器位于轴上，可以得到共焦显微系统的三 维点扩散函数： 办。( “，v ) ：矗l ( “，v ) j l z 2 ( “，1 ，) ( 2 1 6 ) 从公式( 2 1 6 ) 可以看出共焦显微系统具有一个重要特性，就是系统 的有效点扩敖函数是照明透镜点扩散函数与探测透镜点扩散函数的乘积。这 是共焦扫描显微术相比于普通显微术的一个非常重要的特性和优点：点扩散 函数的乘积特性可以改善总的点扩散特性，即提高了共焦显微系统的分辨 率。 2 2 2 共焦系统的横向分辨率 首先只考虑共焦显微系统的二维成像特性。对一个半径为口的圆形透 镜，可以采用极坐标形式，则系统的三维振幅点扩散函数变为： 厅( v ，蕾f ) = 尸( p ) e x p ( 一詈p2 ) i ，。( ) p 咖 ( 2 1 7 ) o - 对于采用圆形透镜的普通光学显微镜，点扩散函数在焦平面的强度分布 取v ，“= o ) 为： ，( v ，甜= o ) = 陋( 1 ，“= o ) 1 2 = 瑚j ? ( 1 ，) h 2 ( 2 1 8 ) 而对于理想的共焦显微系统，假设照明物镜与探测物镜为相同的圆形 透镜，则系统的点扩散函数在焦平面的强度分布为： ，( v ，“= o ) = l 厅( v ，甜= o ) 1 4 = c d 凇，? ( ，) v 4 ( 2 1 9 ) 1 5 第二章三维光学显微术成像原理 由公式( 2 1 7 ) 、( 2 1 8 ) 得到的普通光学显微系统以及共焦显微系统 的点扩散函数在焦平面上的分布如图2 3 所示。按照瑞利判据，将强度分 布的第一零点位置定义为系统的横向分辨率，则共焦显微系统的横向分辨率 可以表示为： r 例= 等 ( 2 2 0 ) 式中删是物镜的数值孔径。而相同条件下的普通光学显微系统的横向分辨 罕加 r ：业堡 ( 2 2 1 ) a 两者相比，共焦显微系统点扩散函数的乘积特性使得它的横向分辨率优于普 通光学显微系统，横向分辨率提高了大约3 0 。 一c o n v e n t i o n a l c o n f b c a l 图2 3 共焦显微系统以及曾通光学显微 系统中点扩散函数的横向分布 2 2 3 共焦系统的纵向分辨率 在实际使用过程中，通常采用系统对垂直于光轴的反射镜进行纵向扫 描所得的纵向响应曲线的半高全宽( 光强为极大值一半所对应的宽度) 作为 共焦显微系统纵向分辨率的测试基准。如图2 2 所示，被测物是一理想反射 镜，沿光轴方向移动。当反射镜位于焦平面时，反射光束被精确地聚焦在点 探测器上，探测器接受到大量的光能量( 图中实线所示) 。而当反射镜偏离 焦平面时，反射光束被聚焦在点探测器l ； 面或后面的某个位置，探测器只能 接受到一部分光能量( 图中虚线所示) ，即离焦信号比焦点上的弱。显然， 1 6 第二章三维光学显微术成像原理 纵向响应曲线越窄，系统的纵向分辨率越高。 由于反射镜不具有任何的横向结构，其轴向的振幅仅决定于c ( f = o ，“) ， 即c ( 卢o j ) 的傅立叶变换。采用点光源点探测的共焦显微系统的纵向响应为： m ) ：f 掣1 ( 2 2 1 ) “，二 图2 4 即为系统的纵向响应曲线，曲线的半高全宽“l ，2 大约为5 5 6 ，与其 对应的止l ，2 则定义为共焦显微系统的纵向分辨率，它表示为： 4 2 1 ，22 5 5 6 a0 8 9 见 ( 2 2 2 ) 其中m 4 是物镜的数值孔径。显然，物镜的数值孔径越大，系统的纵向分辨 能力或层析能力也就越强。 归 化 光 强 图2 4 采用点光源点探测的反射式共焦 显微系统的纵向响应曲线 第三节多光子激发荧光显微成像理论 2 3 1 多光子过程 在传统的荧光显微技术中，生物学家通常将观察的细胞成份用一定的荧 光分子进行标记，然后通过相应波长的激发光照射对样品进行检测。单光子 激发荧光的过程，就是荧光分子吸收一个光子，从基态跃迁至激发态，经过 能量驰豫后，发射一个长波光子回到基态。这个过程的产生需要一定的能量， 第二章三维光学显微术成像原理 我们知道短波光子比长波光子的能量要高，如果用长波光子去激发荧光分 子，则不会产生荧光。g 叩p e r t m a y e f 证明如果一个光子没有足够的能量去 激发荧光分子，但能在足够短的时间内遇上第二个或多个光子，荧光分子就 可以同时吸收两个或多个光子，每次吸收会产生等同于被吸收光子能量的分 子激发。同样地，分子经过能量弛豫后发出荧光，这就是多光子激发荧光的 过程。 其实早在1 9 3 1 年，g o p p e n m a y e r 就对光子吸收作了理论预断，但由于 受到普通光源发光为弱光的限制，长期以来，无论在理论上还是在实验上均 没有得到重视。直到激光技术出现并得到发展，1 9 6 1 年用脉冲红宝石激光 器激发c a f 2 ：e u 2 + 时才第一次实现双光子吸收。要实现多光子激发，需要 用超快速的激光器，产生高峰密度的光子，聚焦在合适的荧光介质上，以足 够高的几率来诱导多光子跃迁。从基态到激发态n 光子跃迁的几率是： 呒= 吒j 4 ( ) ( 珊广 ( 2 2 3 ) 式中，吒是n 光子吸收截面，( m ) 是频率为m 的激光强度【3 】。因为双 光子激发是一个二阶过程，每分子每单位时问吸收的光子数正比于双光子吸 收截面o2 和入射强度j 的平方。哟表达式可由第n 级微扰计算得到，在可 见光波段内，有j + i ，吒j 1 旷。如果l ，_ l l 珊l 旷吒，那么( n + 1 ) 光 子激发就等于n 光子激发的1 0 击倍，这就要求激光强度l 1 g w c m 2 。上 面的估算表明要实现多光子激发需要高强度的激光，这使双光子激发具有很 高的空问局域的特点。单光子激发的线性过程，在整个激发光路里的样品都 由于激发而发出荧光，而对于双光子激发而言，只有在焦点处的微小区域内 样品才能吸收足够的光子而发出荧光。双光子激发的这一特点可以获得比单 光子共聚焦更清晰的三维荧光图像。另外，在此基础上发展起来的三光子激 发( 荧光探针同时吸收三个光子) 的激光扫描显微镜也越来越显示出其重要 的特点，它具有比双光子显微镜更高的空间局域性，因而具有更高的空间分 辨率【5 1 。 2 3 2 双光子荧光显微成像系统的点扩散函数 为了分析共焦双光子荧光显微系统的三维成像特性，仍采用图2 2 作为 成像系统装置图，只考虑点光源情况，并假设入射光和荧光的波长分别为五 第二章三维光学显微术成像原理 和2 f 。 根据有限厚度物体成像公式可得物空间的照明光强分布为： “栌e 珊瓴确m m 懒1 2 c z z a ， 其中 l 是入射光波长为a 的照明物镜的三维振幅点扩散函数。 因为双光子吸收过程为非线性过程，故荧光辐射强度与照到物体上的光 强的平方成正比，因此，物函数为d “，) 的物体发出的双光子荧光总强度为： ，l ( 吒) = i 而l ( f j ，1 )