（动物学专业论文）中国水生半翅目部分昆虫线粒体cytb基因的分子进化与系统学研究.pdf

中国水生半翅目部分昆虫线粒体c y t b 基因的分子 进化与系统学研究 摘要水生昆虫在自然界中扮演着必不可少的重要作用，而水生半翅目昆虫是 水生昆虫中的一大类。水生半翅目昆虫与人类的生产生活有着密切的关系。首先， 在生态系统水生生境中，半翅目昆虫大多扮演着一级消费者和分解者的的双重角 色。水生的半翅目昆虫大多为捕食性昆虫，以水生的小型动物为食。水中浮游植 物和微型、小型动物密度是衡量水质一个主要指标。所以水生半翅目昆虫与水生 生境的稳定有着紧密地联系。我国淡水资源较为紧张，而且分布不均，加之近代 的盲目开发和严重的污染。使得可用资源少之又少。所以我国对水资源的合理利 用、污染水体的净化非常重视。近年来，有关利用水生昆虫监测水质、改造和重 塑水环境等研究已成为水生昆虫研究的热点。其次，水生半翅昆虫中的某些大型 种类( 如蝎蝽科、螳蝽科等) 可捕食鱼苗或以半寄生的方式危害多种鱼类，有些 还可传播鱼类疾病。这都给渔业带来了一定的程度的危害。再次，在水生半翅昆 虫中也有不少可作为食用、药用、渔业饲料的资源。深入、系统地对水生半翅目 昆虫进行研究，这对人类更加客观的探索、认识、利用和改造水生昆虫资源、维 系水生生境的稳定、研究物种的起源、进化和相对演化关系都有重要意义。 线粒体蛋白质编码基因细胞色素b ( c y t b ) 是动物分子系统学应用最广泛的分子 标记之一。本研究从分子生物学角度入手，采用c y t b 作为分子标记，通过p c r 和 测序技术，共获得水生半翅目昆虫6 科1 1 种1 4 个体的4 8 5 b pc y t 6 部分序列。运 用分子生物学软件对所获c y t b 基因序列进行分子进化与系统发育分析。通过构建 分子进化树，从分子水平上对水生半翅目昆虫部分种类进行科问、属间及属内种 间的系统进化研究，得到系统进化树，对结果进行分析讨论，得到以下几点结论： 1 对无水乙醇浸泡的标本和多年保存的干标本，均可提取出一定量的d n a 模 板，并可满足p c r 扩增和测序的要求。但在d n a 的提取时，应注意温度和机械 损伤有可能造成模板的降解。 2 通过对所得的c y tb 基因4 8 5 b p ( 含引物部分) 序列片段的分析，知该片段 序列中富含a 、t 碱基，这与原有的结论相符合。序列变异位点集中在第三位点和 第二位点，序列的两两比对所得转换和颠换值随分歧时间的先后而逐渐减小。同 一科内的物种间转换值比颠换值要高，不同科间的转换值比颠换值低。所测基因 共编码1 4 4 个氨基酸，其中有7 5 个发生变异，占5 2 0 8 。 3 应用c y tb 基因标记水生半翅目昆虫部分种类的系统关系，由结果得知同 属内的种间以很高的置信度优先聚一枝，同科内的不同属问表现为单系性。且枝 间分歧小于枝内分歧。在黾蝽科内，a q u a r i u m 属是最为原始，在进化中最先分化。 l i m n o g o n u s 属与p o t a m o m e t r a 属进化阶元较低。 4 在黾蝽科中，大多种具有多种生活型，如长翅型、短翅型、无翅型，且常 常不同生活型之间有较大的形态差异。这都给形态分类工作带来了很大的难度。 但是应用分子系统学的方法，能高效而准确区分不同种，同种不同生活型。 5 在蝎蝽次目之中，负子蝽和小螳蝎蝽两者聚为一姐妹群，结合形态进化可 知，负子蝽科和蝎蝽科分化时间大致相同，两科为姐妹群。形态和分子系统学结 论一致。负子蝽科和蝎蝽科系统进化阶元高于划蝽科，仲蝽科系统进化阶元最低， 和形态学结果一致。 6 本论文应用单一基因标记，进行分子系统进化分析，结果表明c ：y t b 基因对 科下物种的系统分析更为适合。所得系统关系与传统的分类学基本一致。科问的 系统，还有待迸一步的研究 关键词：水生半翅目昆虫线粒体d n ac y t t , 基因分子进化 i i m o l e c u l a re v o l u t i o na n dp h y l o g e n yo fs o m e s p e c i e s o f c h i n a a q u a t i c sh e m i p t e r a b a s e do i lc y t bg e n e l ig a n g a b s t r a c t w i 血n e a r l y3 7 3 8s p e c i e sg r o u p e di n2 3f a m i l i e s a q u a t i c sh e m i p t e r a i n s e c t sp l a yas i g n i f i c a n t r o l ei nt h e n a t u r e t h e ya c t a se l e m e n t a r yc u s t o m e r so r d e c o m p o s e r si nw a t e re c o l o g y m o s to f t h e m a r ep r e d a c i o u st om a n ys m a l lc r e a t u r e si n t h ew a t e r a tp r e s e n t ，i tb e c o m e sah o tp o i n tt ou t i l i z ea q u a t i ci n s e c t st os u p e r v i s ea n d t r a n s f o r mw a t e re n v i r o n m e n t o nt h eo t h e rh a n d ，s o m eo ft h es p e c i e s ( s u c ha sn e p i d a e ， b e l o s t o m a t i d a e ) a r ep e s t so ff i s h s o ，t h e y h a v er e c e i v e dw i d ea t t e n t i o nf r o m e n t o m o l o g i s t s c y t o e h r o m eb ( c y t 6 ) i s o n eo ft h em o s t w i d e l yu s e dm o l e c u l a rm a r k e r s i na n i m a lm o l e c u l a r p h y l o g e n c t i e s t u d i e s t h i sp a p e rd e a l sw i t l lt h em o l e c u l a rs y s t e mo f 11 s p e c i e s1 4 s a m p l e s f r o m6 f a m i l i e s 4 8 5 b pc y t bg e n e w a s a m p l i f i e d a n d s e q u e n c e d d n as e q u e n c e s w e r e a l i g n e du s i n gc l u s t a l x a n di m p o s e di n t o m e g a 2 1f o r p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 s p e c i m e n sb o t hs o k e d i ne t h a n o la n d d r y l yp r e s e r v e d f o rm a n y y e a r sc a n b eu s e d t oe x t r a c td n aa n d a m p l i f i e ds p e c i f i cg e n e h o w e v e r , t e m p e r a t u r es h o u l db ef o c u s e d o n d u r i n g t h ee x t r a c t i n g ，a n dp h y s i c a ld a m a g es h o u l d b ea v o i d e d ，f o rt h e s ef a c t o r sw i l l l e a dt od n a d e c o m p o s i n g 2 t h e r eh a sas t r o n ga tb i a si nc y t bg e n e t h i sc o o r d i n a t e st ot h ep r e v i o n s r e p o r t s m u t a t i o n sm o s t l yo c c u r r e di n3 r dp o s i t i o n sa n d2 n dp o s i t i o n s t h er a t i o so ft r a n s i t i o n a n dt r a n s v e r s i o nd i m i n i s h e dg r a d u a l l yc o r r e s p o n d i n gt ot h ed i v e r g e n tt i m e a m o n g f a m i l yt r a n s i t i o n sa r eh i g h e rt h a nt r a n s v e r s i o n si n t e r s p e e i e s ，w h i l ei t i sc o n t r a s tw i t h i n f a m i l i e s t h eg e n es e q u e n c e sc o d e d1 4 4a m i o na c i d a n d5 2 8 o ft h e m ( n a m e l y7 5 a m i o n a c i d ) s u b j e c t e d t om u t a t i o n s 3 t h ep h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p so fh e m i p t e r ai n f e r r e df r o m c y t b g e n ed a t a i n d i c a t e dt h a tt h es a l l l eg e n u sf i r s t l ya s s e m b l e dt oo n eb r a n c h d i f f e r e n tg e n u sf r o mo n e f a m i l ys h o w e dm o n o p h y l e t i c t h ea m o u n to fs e q u e n c ed i v e r g e n c eb e t w e e nc l a d e sw a s g r e a t e r t h a nw i t h i nc l a d e s i nt h e g e r r i d a e ，a q u a r i u m i st h em o s ta n c i e n ta n d e a r l i e s t d i v e r g e n c i n go n e l i m n o g o n u sa n dp o t a m o m e t r aa r et w oo r d e r si ne v o l u t i o n h i s t o r y 1 l i 4 t h e r ea r ev a r i o u sl i f ef o r m so fi n s e c t si ng e r r i d a e ( s u c ha sl o n gw i n gp a r e m ， s h o r tw i n gp a r e me t ) ，w h i c hl e a dt om o r ed i f f i c u l t i e si nm o r p h o l o g i c a lt a x o n o m y w h i l e u t i l i m n g m o l e c u l a rm e t h o dc a n e f f e c t i v e l y d e t e r m i n a t e s p e c i e s ，a s w e l la s d i s t i n g u i s h d i f f e r e n tl i f ef o r m s i n t m - s p e c i e s 5 r e c o n s t r u c t e dg e n et r e et o p o l o g i e sp r o v e dt h a td i p l o n y c h u se s a k i ia n dr a n a t r a u n i c o l o rf o r m e ds i s t e rg r o u p a c c o r d i n gt om o r p h o l o g i c a le v o l u t i o n ，t h e i rd i v e r g e n c e o c c u r r e da tt h es a m et i m e p h y l o g e n e t i ch i s t o r yo fb e l o s t o m a t i d a ea n dn e p i d a ea r e l o n g e rt h a nc o r i x i d a e t h ee v o l u t i o n a lh i s t o r yo f n o t o n e c t i d a ei st h es h o r t e s t a l lt h i s r e s u l t sa r ec o n g r u e n tw i t h m o r p h o l o g i ca n a l y s e 。 6 t h ep h y l o g e n e f i ca n a l y s i si nt h i sp a p e rb a s e do nas i n g l eg e n e t h er e s u l t ss h o w s t h a tc y t bg e n es e q u e n c ei ss u i t a b l ef o rp h y l o g e n e t i cs t u d ya t i n t r a - f a m i l i yl e v e la n d r e m a i n sa m b i g u o u sa ti n t e r - f a m i l yl e v e l k e yw o r d s ：a q u a t i c sh e m i p t e r a m t d n a c y t bg e n e m o l e c u l a re v o l u t i o n 第一部分绪论 1 系统学的概念及发展概况 系统学( s y s t e m a t i c s ) 是生命科学中综合性很强的基础学科。m a y r ( 1 9 6 9 ) 将 系统学定义为探索、描述并解释为生物多样性和演化关系的学科。它建立在形态 学、生理学、生态学和遗传学的基础上。分类学( t a x o n o m y ) 是研究生物分类的 原理、方法和实践的学科，包括分类( c l a s s i f i c a t i o n ) 、命名( n o m e n c l a t u r e ) 、 描述( d e s c r i p t i o n ) 、和鉴定( i n d e n t i f i c a t i o n ) 等内容。二者的研究内容不同， 但有一定的重叠。系统学等于分类学加上物种间相互关系( 包括表型关系、分支 关系、遗传关系、系统发育关系、年代关系和地理分布关系) 的总和。 系统学的目的和任务是编织一个通用参考系统，是只能充当生物学的可靠理论 依据，既要具有理论的全部解释性、预见性和启发性，要对生物学中的各种比较 提供坚实的基础，同时分类系统还应是高效能的资料存储系统，这一要求使系统 学成为生物学中最基础而又最有综合性的学科。其基本任务不仅要识别物种鉴定 名称，而且要阐明物种间的亲缘关系和分类系统，进而从种群观点来研究物种的 起源，分布中心及动物进化的可能过程和趋向。 生物系统学作为生命科学中的- - i 基础学科，具有其独特性和不可代替性。 生物学各领域中任何科学研究，首先要正确判明研究材料或对象是何种类，否则 就会丧失客观性，对比性和重复性，因而不具科学价值。这在害虫防治，天敌引 进和饲养释放等方面均有重要意义。经济动物优良种类的选育，亦直接涉及到近 缘种和种下阶元的分类问题，精确可靠的分类鉴别将会带来重要的经济效益。对 于系统发育关系和系统地位的正确认识，以及对物种特征的深入研究将有助于有 关领域的科学思维，推动有关研究的发展。分类理论的变革或进展更将影响到对 整个生命世界的基本认识。 m a y r ( 1 9 6 9 ) 曾以分类工作性质作为动物分类发展历史的划期标准，将其分为 六个发展时期：1 地区性动物区系时期；2 林奈时期：3 经验主义时期；4 达尔 文时期；5 种群分类时期；6 近代分类学时期。但各期的划分之间有重叠或交叉。 到了近代分类学时期，分类学方法与理论发生一系列重要变化和发展，又进 入了一个新的阶段。首先是遗传学等学科的研究进入分子水平后，许多发现对进 化论的若干方面提出补充和修正，引起很多争论，直接影响到分类学的理论基础。 此外，细胞学、血清学、生物化学、电子计算机技术的发展带来一系列新的分类 手段和方法论。因此，由6 0 年代中期开始，分类学领域中出现所谓的四大学派： 即1 _ 传统分类学派，以林奈为主要代表人物。2 支序分类学派，该学派由德国昆 虫分类学家w h e n n i n g 创立，以系统发育系统学为理论基础，故又称其为系统发 育系统学派。3 进化分类学派，以m a y r ，s i m p s o n ，a s h l o c k 等人为代表。这一学 派基本接受支序学派通过支序分析重建系统发育的方法。4 数值分类学派，该学 派起源于本世纪初植物分类学家a d a n s o n 的工作，由s o k a l 和s n e a t h 二人加以发 展，借助电子计算机的运算实现分类的目的。 目前，随着生化技术和现代分子生物学的迅猛发展，很多分类学家尝试将这 些新技术应用于分类学，再加上染色体技术的发展与运用，使分类学向更加完善， 更加综合，更加科学的方向发展。运用多种分类手段，如从生理、生态、内部结 构、外部形态、生物学特性等着手的综合分类成为如今分类学的发展方向。昆虫 系统学也随之发展成为一门多学科相互渗透的综合性学科。 2 水生昆虫和水生半翅目昆虫概述及研究现状 在我国对于水生昆虫的记录最早见于3 0 0 0 年前的殷墟甲骨文中。诗经中 也有对水生昆虫的较为生动地描述。近代，我国对水生昆虫进行系统研究的奠基 人是胡经甫先生。2 0 世纪2 0 年代至3 0 年代是我国水生昆虫研究事业有了一个良 好的开端。3 0 6 0 年代我国学者在毛翅目、蜻蜒且、水生鞘翅目、蜉蝣目等进行了 较为系统的研究。8 0 年代至今我国的水生昆虫研究事业进入了突飞猛进的阶段。 对水生的1 3 目3 0 余科昆虫进行了深入而系统的研究。在水生半翅目方面，陈萍 萍、刘国卿、任树芝等人做出了突出的贡献。在应用方面，利用水生昆虫监测水 质、环境分析走在最前沿。 水生昆虫，顾名思义是指栖居在水域生态系统中的类昆虫，与陆生昆虫相对 而言。其中半翅目下所涉及的水生昆虫有2 3 科3 7 3 9 种，由于水生生态系统可分 为淡水和咸水生态系统，所以水生昆虫有包括海洋水生昆虫和淡水水生昆虫。从昆 虫发展进化的过程来看，现代的水生昆虫都是次生性水生动物，其中能聚居在海 洋中的种类极少，真正属于海洋的昆虫只有水黾科( 或黾蝽科) 中的4 0 种，无翅 的海水黾( e a l o b a t e s ) 。在淡水生态系统中生活的水生昆虫基本上可以分为两类： 第一类可说是真正水生，即昆虫在各个生活史中的各虫期，全部生活在水中。最 主要的有：蝎蝽科、划蝽科、仰蝽科、负子蝽科、黾蝽科等。第二类属于半水生 活两栖类，即在生活史中，幼虫期为水生，而成虫期为陆生。在半翅目中也有一 些种类，但此类不再研究对象之中。 目前，对水生昆虫的研究内容相当广泛，包括生理、生态、生殖、生化、生物 物理、行为、毒理、害虫防治、进化、分子遗传、分类学等方面。由于水生昆虫 有某些种类生活隐蔽，身体微小、软弱、难以发现或收集，因此分类学的研究仅 处于初步阶段。或者说水生昆虫中大量的类群仅处于发现、描述种类阶段。分类 主要以形态分类为主，很少运用现代生物技术来进行分类。当前对水生昆虫进行 研究多集中在欧洲：西班牙、英国、德国、法国、瑞典、瑞士、丹麦、意大利、 波兰、挪威、前苏联等。美洲主要有：美国、加拿大、墨西哥、巴西等。亚洲主 要有：日本、印度、中国等。其中最主要的研究国家有：美国、英国、加拿大、 西班牙、墨西哥。同时各个国家研究水平和深入程度也不相同。 m o r s e 等( 1 9 8 0 ) 对美国本土内涤溪流的上游及南卡洛莱纳靠近a i k e n 处的 s a v a n n a hr i v e r 的水生昆虫区系进行了研究。对其中水生半翅目进行了定的论 述。d eq u i r a s 等( 1 9 8 6 ) 对西班牙北部的a s t u r i a s 地区的水生和半水生异翅目 进行了系统学研究，对2 8 种进行了分类，并对首次采集到的1 4 种进行了纪录。 指出：这些分属于水黾科、仰蝽科、潜春科、划蝽科。我国的水生半翅目研究起 步较晚，目前国内尚无一专著介绍水生半翅目昆虫。因此尚有大量的门类处于空 白状态，但已有不少分类学者开始注重该领域，并投入其中开展了初步的研究。 例如杨明旭( 1 9 8 2 ) 对南昌地区六种水生蝽类的各虫期形态进行了初步的研究并 探讨了生物学特征，1 9 8 3 年对5 种水生半水生半翅目昆虫进行了初步的研究。王 助引( 1 9 8 9 ) 对广西三种宽黾蝽进行了识别和初步观察。徐亚军( 1 9 8 9 ) 对池沼、 稻田中常见的半翅目水生昆虫列出了分类检索表。照日格图和齐宝瑛等对我国内 蒙古部分水生和半水生半翅目昆虫进行了研究。 传统分类学中，许多有意义的结果是从形态、生活史、生理资料中的得出， 但在昆虫纲中，由于其数量庞大，形态多样，往往许多中具有不同的生活型，而 且同种中的形态又常因生活环境的不同、食性的不同、不同的生理期，有较大的 变异，这都给传统的分类学带来了较大困难。近年随着分子系统学的发展，这些 缺憾都有了很大程度的缓解。研究生物的进化历程，确定物种间的进化关系等方 面，d n a 序列具有益于分析，含有丰富的进化信息和易于获得等优点。 3 m t d n a 在分子系统学中的应用 线粒体是一种具有半自主性的细胞器，是细胞进行呼吸活动、产生能量的重 要场所。m t d n a ( 直i 图) 广泛存在昆虫体内富含线粒体的飞行肌和卵内，昆虫的m t d n a 大小一般为1 5 4 1 6 3 k b ，包括1 2 或1 3 个编码蛋白质的基因，以高拷贝数目存在 于线粒体内。其中包含1 2s 和1 6s 两个核糖体基因( r i b o s o m a lr n ag e n e r r n a ) ，2 2 个转运r n a 基因( t r a n s f e rr n ag e n e ，t r n a ) ，1 3 个蛋白质编码基因 ( p r o t e i nc o d i n gg e n e s ) 及1 个包含复制起点的控制区( c o n t r o lr e g i o n ) ，称为 a + t r i c h 区。l3 个蛋白质编码基因是1 个细胞色素b ，2 个a t p 酶亚基基因( 6 和8 ) ，3 个细胞色素氧化酶亚基基因( c o i ，c o i l ，c o i i i ) ，7 个n a d h 降解酶 基因( n d l 6 及n d 4 l ) 。( 如下图) 图1 果蝇( d # 昭h i hv d t u h l d n 备基因的 相对位置和转录方向 f 倡t r t i - i t di o c - 1 1 0 1 1 l - n dlr n ，cr i p l i o n d ir c i l o no f * i d n o fdr 洲- a ， i h v4k u h 相对于核线粒体d n a 来说，m t d n a 是一个封闭的环状双链，核酸序列和组成比 较保守，以它作为模板制作的p c r 反应引物的通用性比较强，对进化过程中不同 生物的d n a 序列的核苷酸替换率比较研究发现，m t n d a 基因组的替换率比核d n a 高 5 1 0 倍。m t d n a 基因组中不含间隔区和内含子，无重复序列和不等交换，在遗传 过程中不发生基因重组、倒位、异位更突变，并且遵守严格的母系遗传方式，可 以简单的人为m t d n a 是克隆型，是理想的物种鉴定的遗传标记物质之一。用m t d n a 作为标记已广泛用于昆虫系统学研究，目前已对两种果蝇o r o s o p h i j ay a k u b a 和 盈n e l a n o g a s t o r 、冈比亚蚊、意大利蜜蜂和i sm e l l i f e r a 和飞蝗l o c u s t a m i g r a t o r i a 等昆虫的线粒体d n a 作了全序列测定。 在对线粒体的研究中发现：进化快的基因和碱基位点适于亲缘关系较近类群 的系统学研究，进化慢的则适于远缘类群的系统学研究。1 2 sr d n a 和1 6 sr d n a 可以很方便地用保守引物( c o n s e r v e dp r i m e r ) 或通用引物定位并进行p c r 扩增， 所以对其测序较多。1 2 sr d n a 和1 6 sr d n a 进化较慢，适合远缘种的研究。s i m o n 等( 1 9 9 0 ) 在总结了前人用1 6 sr d n a 对果蝇属( d r o s o p h i l a ) 、伊蚊属( a e d e s ) 、 蜜蜂属( a p i s ) 、飞蝗属( l o c u s t a ) 、虎甲属( c i c i n d e l a ) 等的种间、属间系统学 分析的结果时认为，1 6 sr d n a 适用于种、属水平。c h a p c o 等( 1 9 9 7 ) 对黑蝗属 ( e e l a n o p l u s ) 2 8 个种，作系统学分析。b e c k e n b a c h ( 1 9 9 3 ) 测定了果蝇三个亚群 ( na f f i h i ss u b g r o u p 、口p s e u d o o b s c u r as u b g r o u p 、口o b s o u r as u b g r o u p ) 13 个种c o i i 基因的部分序列，通过使用邻接法与最简约法得出了三个亚群之间的系 统发育关系：口a f f i n i s 和丑p s e u d o o b s c u r a 亚群属于单系群，具有较近的亲缘关 系。h o ( 1 9 9 5 ) 扩增了两种蚊虫( q u i n q u e f a s c i a t u s 和爿a e g y p t i ) 线粒体d n a 的c o i i 基因全序列及侧翼区，与a n o p h e l e s 和d r o s o p h i l a 该基因顺序和转录方向 一致，两种蚊虫c o i i 核苷酸序列显示了8 8 的同源性，t s 和t v 频率相近，氨基酸 序列同源性达9 5 ，多态性分析显示了这两种蚊虫不同的进化率。基于c o i i 基因 全序列的测定和简约性方法的使用，w i l l i s ( 1 9 9 2 ) 研究了五种蜜蜂 ( 爿a n d r e n i f o r m i s 、月c e r a n a 、爿d o r s a t a 、彳f o r e aa n d 爿k o s c h e v n i k o 旧 的系统发育关系，结果显示月d o r s a t a 是最古老的种类，这和目前一些学者认为 爿f o r e a 、爿a n d r e n i f o r m i s 是最古老的种类不相符合。t o u g a r d ( 2 0 0 1 ) 测定了 线粒体d n a l 2 s r r n a 和c y t b 基因全序列，对现存的五种犀牛系统发育关系进行了 分析。另外，基于对c o l 4 0 0 b p 序列的测定，h o w l a n d ( 1 9 9 5 ) 分析了鞘翅目1 5 个科 的系统发育关系，结果发现c o i 基因在1 5 个科中有很高的变异性，同一科内达到 了1 2 1 8 ，不同科之间达到了2 7 。 线粒体d a n ( m t d n a ) 中细胞色素b 的基因是目前结构和功能研究的较为清楚的 基因之一。细胞色素b 基因编码的蛋白质在呼吸链的电子传递过程中起重要作用。 细胞色素b 基因的进化速度适中，适合研究种内甚至种间的系统发育，其中用c y t b 基因进行昆虫系统进化研究国内外已有报道。如m a t t i n 和p a s h l e y ( 1 9 9 2 ) 对凤蝶 总科，s h u r u a d a 等( 1 9 9 2 ) 对双翅目、c h u h ( 1 9 9 2 ) 对半翅目和f u i i w a t a 等( 1 9 9 2 ) 对蚜虫的研究，m a t t i n 和p a s h l e y ( 1 9 9 2 ) 对风蝶总科、s h u r u a - d a 等( 1 9 9 2 ) 对双翅 目、s c h u h ( 1 9 9 2 ) 对半翅目和f u i i w a t a 等( 1 9 9 2 ) 对蚜虫的研究。c h a p c o 等则将 c y t b 基因用于黑蝗属的种间分析。 在n a d h 降解酶基因中，n d 5 进化速度相当快，是相关种群系统发育研究最有 用的基因之一。p a s h l e y 等对鳞翅目4 科5 个种的昆虫n d i 基因、d e s a l l e 等对 果蝇属的n d i 、n d 2 和n d 5 作了测序，发现在种间变异很小，更适用于目、科等 较高的分类阶元。m a k i t a 等将n d 5 应用于虎风蝶属( l u e h d o r f i a ) 的种间研究， 结果显示，l u e h d o r f i a 的种和外群蝴蝶种间n d 5 基因差异较大，同属种间n d 5 基 因差异相对要小。 线粒体d n a 在应用于分子系统学研究的早期，主要用于大型脊椎动物的系统 进化关系上。k o c k e r ( 1 9 8 9 ) 应用保守引物扩增并测得m t d n a 的保守片段，对包 括哺乳动物、两栖类、无脊椎在内的1 0 0 多种动物进行m t d n a 进化的动力学研究。 指出c y t b 区段在进化上使哺乳类快于鸟类和鱼类，同时提出了c y t b 替换模型假 说，并指出该假说在系统发生和种群研究上的重大意义。a r n a s o n ( 1 9 9 1 ) 应用p c r 技术对蓝鲸和芬兰鲸杂交种进行分子鉴定。两个种在c y t b 上的不同表明它们的分 歧年代大约为大于3 5 m a 之前。t a b e r l e t ( 1 9 9 2 ) 对比里牛斯山棕熊进行遗传学 研究，并建立系统进化树。l a n y o u ( 1 9 9 2 ) 研究了巢寄生鸟类c o w b i r d ( i c t e r i n a e ) 与2 0 种新世纪b l a c kb i r d s ( i c t e r i n a e ) 的种问系统关系。s m i t h ( 1 9 9 3 ) 对啮齿 目南美a k o d o n t i n e 的c y t b 基因3 6 6 片段分析，指出m t d n a 的变异大于核d n a 。i r w z n ( 1 9 9 1 ) 对哺乳动物c y t b 基因1 1 4 0 b p 全序列进行进化分析，指出有蹄类动物和 海豚、鲸、奇蹄类、大象、人类的系统发生关系和分歧年代。q u i n n ( 1 9 9 1 ) 比较 了夏威夷鹅、加拿大鹅和太平洋黑雁及帝鹅m t d n a 限制性片段及c y t b 基因序列， 分析四种类群间进化关系，指出夏威夷鹅和加拿大鹅起源于共同的祖先，分歧年 代为3 m a 以前，该分歧处于加拿大鹅分歧之前。 m t d n a 在系统学中的应用主要是群体水平和系统发育研究两方面。群体水平上 m t d n a 研究的主要贡献是种内系统发育关系，亦即a r i s e 等( 1 9 8 7 ) 所称的生物的 谱系地理式样( p h y l o g e o g r a p h i cp a t t e r n ) ，它是通过m t d n a 提供的遗传信息来 分析群体间系统发育与群体地理分布之间的关系。d i t c h f i e l d ( 2 0 0 0 ) 曾对新热带 地区无飞行功能的小型哺乳动物与蝙蝠的谱系地理式样作了比较，结果发现在蝙 蝠种内线粒体d n a 模式发生了变异。 在昆虫分子系统学研究上，p i n t o ( 1 9 9 8 ) 对仅能以雄性鸣声鉴别的蝉( c i c a d a o r n i l ) 进行研究，测出不同的葡萄牙种群c i c a d ao r n i l 的c y t b 基因共3 7 5 b p 序 列，结果表明，多数种类的序列变异不明显。b i r u n g i ( 2 0 0 0 ) 以c y t b 基因作为 分子标记，研究白纹伊蚊a e d e sa l b o p y c t u s 种群的遗传结构。为研究澳大利亚干 燥区蚂蚁间巢间迁徙的有关问题，t a g ( 1 9 9 7 ) 运用d g g e 分析了来自7 5 个群落的单 一型工蚁的c y t b 基因。b e l s h o w ( 1 9 9 7 ) 应用c y t b 基因和2 8 s 核糖体亚基等三组数 据联合，分析了蚜茧蜂亚科和茧蜂科其他亚科间的分子系统发生关系，提出了 ( e p h e d r i n i + ( p r a i n i + ( a p h i d i i n i + t r i o x i n i ) ) ) 的进化关系。c h a p c o w ( 1 9 9 7 ) 对 北美斑翅蝗进行分子系统学研究。另外，b a l l a r d ( 1 9 9 8 ) 对隐翅虫科甲虫 s t a p h y l i n o i db e e t l e 的1 2 s r n a 和c y t b d n a 进行过研究。p i r o u n a k i s ( 1 9 9 8 ) 对膜 翅目蜜蜂b o m b u sp a s o u o r u m 进行遗传变异研究，指出其线粒体c y t b 基因较c o l i 序列有更多的变异，并将c y t b 基因序列区分阿尔卑斯地区矗p a s c u o f u m 的地理亚 种。h u a n g ( 2 0 0 0 ) 对北美田间蟋蟀进行系统学研究，应用c y t b 和1 6 s r n a 联合数据 分析了蟋蟀g r y l l u s 属1 1 种1 3 种群2 6 个体的系统演化关系，指出欧洲g r y l l u s 属与北美种属具明显分枝，枝间系列分歧大于枝内分歧。i s s e g h i r ( 2 0 0 0 ) 对一种 吸血沙蝇亚属l a r r o u s s i u s 的线粒体分子钟及种的生态位和生物地理系统发生时 期进行讨论。k o u l i a n o s ( 1 9 9 9 ) 指出膜翅目蜜蜂线粒体d n a 富含a t 碱基现象，对 a p i sm e l l i f e r a6 种基因( a t p a s e 、c o i 、c o i i 、c o i i i 、c y t b 及n d 2 基因) 进行 研究，做出系统发育关系，并推导出m t d n a 的多态性。 国内研究工作者也尝试将m t d n a 应用于分子系统学研究上来。张亚平( 1 9 9 7 ) 应用c y t b 、1 2 s r r n a 、t r n a 等基因对熊超科进行分子系统学研究。李明( 1 9 9 8 ) 利用m t d n a 的c y t b 基因片段序列差异，对马鹿的四个亚科的起源和遗传分化进行 讨论，指出天山马鹿( cbs o n g a r i c u s ) 东西两个种群可能是不同的亚种，分化 时间约在5 4 7 6 万年前，其中最早分化的为天山马鹿。童金荀( 2 0 0 1 ) 对3 种鲤 应用c y t b 和1 6 s r r n a 分析，指出3 种鲤在起源中是独立的一支，且分化较低。w a n g y i q u a n ( 1 9 9 9 ) 对1 2 种游蛇、孔庆鹏( 2 0 0 0 ) 对3 种长臂鳃。崔雨新( 2 0 0 1 ) 对 中国7 个地区的鬣羚、陈永久( 2 0 0 0 ) 对犬科的赤狐等4 个种、李庆伟( 2 0 0 1 ) 对鹰科4 种鸟类等应用c y t b 基因分析，讨论种问的关系，并建立分子进化树。 应用m t d n a 在昆虫系统学上的工作做的不多。邵红光( 1 9 9 9 ) 做过原尾虫d n a 序列变异及无翅类昆虫的系统进化研究，测定了3 种原尾虫和2 种双尾虫约4 5 0 b p 的c y t b 基因序列，计算了种间k i m u r a 双因子遗传距离，并用距离法和简约法构 建分子系统树，讨论了原尾虫等的系统发育和分类地位，指出原尾虫、跳虫和双 尾虫均形成单系群，原尾虫和跳虫为姊妹群，双尾虫则与有翅类亲缘关系相近。 陈永久( 1 9 9 9 ) x c 中国5 种珍稀绢蝶进行非损伤性取样提取m t d n a 序列，得到4 3 3 b p 的c y t b 基因序列，以此构建5 种绢蝶的分子树。结果与形态学研究相吻合。邵志 勇( 2 0 0 2 ) 应用细胞色素b 基因3 5 7 b p 序列，分析了熊蜂属5 亚属1 1 种熊蜂的系 统发生关系。任竹梅( 2 0 0 2 ) 对山稻蝗及相关物种c y t b 基因序列进行遗传关系研 究，获得4 3 2 b p 的序列，以此建立的分子系统树显示：山稻蝗6 个单倍型聚为一 个簇，彼此之间有一定的分歧。并对不同区域日本稻蝗c y t b 基因序列及相互关系 进行讨论，同时对蝗总科8 科1 0 种的m t d n a 的c y t b 基因部分序列测定分析，提 出了8 科的亲缘关系，指出所得结果与传统分类学不完全一致，并对产生不一致 结果的原因进行分析讨论。 4 系统进化树构建方法 通过对核酸序列的分析，不仅可以对物种进行准确的鉴定，更重要的是可以 阐明生物间能接近真实的进化关系，最终构建系统发育树。构建系统进化树的主 要步骤包括比对，建立取代模型，建立进化树以及进化树评估。 4 1 建立数据模型( 比对) 建立一个比对模型的基本步骤包括：选择合适的比对程序；然后从比对结果 中提取系统发育的数据集，至于如何提取有效数据，取决于所选择的建树程序如 何处理容易引起歧义的比对区域和插入删除序列( 即所谓的i n d e l 状态或者空位 状态) 。一个典型的比对过程包括：首先应用c l u s t a l w 程序，然后进行手工比对， 最后提交给一个建树程序。这个过程有如下特征选项：a 部分依赖于计算机( 也 就是说，需要手工调整) ；b 需要一个先验的系统发育标准( 即需要一个前导树) ； c 使用先验评估方法和动态评估方法( 推荐) 对比对参数进行评估；d 对基本结 构( 序列) 进行比对( 对于亲水氨基酸，推荐引入部分二级结构特征) ：e 应用非 统计数学优化。这些特征选项的取舍依赖于系统发育分析方法。 4 2 决定取代模型 取代模型既影响比对，也影响建树；因此需要采用递归方法。对于核酸数据 而言，可以通过取代模型中的两个要素进行计算机评估，但是对于氨基酸和密码 子数据而言，没有什么评估方案。其中一个要素是碱基之间相互取代的模型；另 外一个要素是序列中不同位点的所有取代的相对速率。还没有一种简单的计算机 程序可以对较复杂的变量( 比如，位点特异性或者系统特异性取代模型) 进行评 估，同样，现有的建树软件也不可能理解这些复杂变量。 4 3 建树方法 三种主要的建树方法分别是距离、最大简约( m a x i m u mp a r s i m o n y ，m p ) 和最 大似然( m a x i m u ml i k e l i h o o d ，m l ) 。最大似然方法考察数据组中序列的多重比对 结果，优化出拥有一定拓扑结构和树枝长度的进化树，这个进化树能够以最大的 概率导致考察的多重比对结果。距离树考察数据组中所有序列的两两比对结果， 通过序列两两之间的差异决定进化树的拓扑结构和树枝长度。最大节约方法考察 数据组中序列的多重比对结果，优化出的进化树能够利用最少的离散步骤去解释 多重比对中的碱基差异。 距离方阵方法简单的计算两个序列的差异数量。这个数量被看作进化距离， 而其准确大小依赖于进化模型的选择。然后运行一个聚类算法，从最相似( 也就 是说，两者之间的距离最短) 的序列开始，通过距离值方阵计算出实际的进化树， 或者通过将总的树枝长度最小化而优化出进化树。用最大简约方法搜索进化树的 原理是要求用最小的改变来解释所要研究的分类群之间的观察到的差异。最大似 然方法评估所选定的进化模型能够产生实际观察到的数据的可