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浙江大学研究生学位论文 季铵化水解小麦蛋白的合成 摘要 季铵化水解蛋白质既具有蛋白质等天然类物的调理性，又具有季铵盐的吸附 性，在发用化妆品中应用前景十分广泛。 本文以小麦蛋白粉为起始原料，经过酶水解制得水溶性小分子小麦蛋白质 ( 相对分子量1 5 0 0 d 1 0 0 0 0 d ，d 一道尔顿) ，再季铵化引入季铵盐阳离子两个步骤 合成季铵化水解小麦蛋白。 对酶水解制取水溶性小分予小麦蛋白质，本文分别考察了中性蛋白酶、碱性 蛋白酶和胰蛋白酶的反应进程和产物，确定了各自的最佳反应条件，并且通过测 定和比较产物水溶性小分子小麦蛋白质的分子量分布，确定碱性蛋白酶制得的产 物更加符合季铵化的要求。 季铵化反应分成三步进行，本文讨论并确定了每步反应的条件：第步反应 季铵盐中间体的合成，物料比例为n ( h c l ) ：n ( 十二烷基二甲基叔胺) ：n ( 环氧氯丙烷) = 1 ：1 ：0 9 5 ，合适的反应温度5 0 。c ，反应3 小时左右；第二步反应季铵盐中羟基闭 环反应，适合的反应p h 值为1 0 ，室温下反应约2 小时；第三步反应水解小麦蛋 白质的季铵化，物料比例为n ( 季铵盐中间体) ：n ( 水解小麦蛋白质) = 1 1 ：1 ，合适反 应温度7 0 。c ，p h 值为l o ，反应2 小时。 最后对产品的发泡力，泡沫稳定性和吸附性进行了初步性能测试。 关键词：季铵化水解小麦蛋白质，水解蛋白质，季铵化，蛋白酶 浙江大学研究生学位论文季铵化水解小麦蛋白的合成 a b s t r a c t t h eq u a t e m i z e dw h e a tp r o t e i nh y d r o l y z a t e sh a v ec a r i n gf u n c t i o na sn a t u r a l p r o t e i na n dc a ne a s i l yb ea d s o r b e da sq u a t e r n a r ya m m o n i u ms a l t i tc a n b ew i d e l yu s e d i nt h ec o s m e t i c t h eq u a t e m i z e dw h e a tp r o t e i nh y d r o l y z a t e sw e r es y n t h e s i z e df r o mr a ww h e a t p r o t e i n t h er a ww h e a tp r o t e i nw a sh y d r o l y z e db yt h ee n z y m e s t og e tt h e p o l y p e p t i d e sw h i c hc o u l dd i s s o l v ei nt h ew a t e ra n dh a dm o l e c u l a rw e i g h t f r o m l 5 0 0 d 1 0 0 0 0 d t h ep o l y p e p t i d e sw e r eq u a t e m i z e dt og e tt h eq u a t e r n i z e d w h e a tp r o t e i n i no r d e rt of i n das u i t a b l er o u t i n ef o rt h i ss y n t h e s i s ，v a d o u sd i f f e r e n t f a c t o r sw e r ec o n s i d e r e ds u c ha st h ec a t e g o r yo fc a t a l y s t s ，r e a c t i o nt e m p e r a t u r e ， r e a c t i o nt i m e ，r a wm a t e r i a lt o o lr a t i o f o rt h eh y d r o l y z a t i o n ，t h r e ek i n d so ft h ee n z y m e s ，n e u t r a lp r o t e i n a s e ，a l k a l i n e p m t e i n a s e ，t r y p s i nw e r ec o m p a r e da n dg o tb e s tc o n d i t i o n f o ra l lt h e p r o t e a s e - t h e s u i t a b l ep r o t e i nh y d r o l y z a t e sw e r eg o tb ya l k a l i n ep r o t e i n a s ea f t e rt e s t i n gt h ed h a n d m o l e c u l a rw e i g h to ft h ep r o t e i nh y d r o l y z a t e s t h eq u a t e m i z a t i o nw a sd i v i d e di n t ot h r e es t e p s w ed i s c u s s e dt h eb e s tc o n d i t i o n f o ra l lt h es t e p s f h a a l l y , t h ep r o d u c t sw e r et e s t e df o rc o m p a r i n g t h ef u n c t i o n sw i t ht h ew h e a t p r o t e i nh y d r o l y z a t e s k e y w o r d ：q u a t e r n i z e dw h e a tp r o t e i nh y d r o l y z a t e s ，p r o t e i n h y d r o l y z a t e s ，q u a t e r n i z a t i o “， p r o t e a s e i 】 浙扛大学研究生学位论文 季铵化水解小麦蛋白的合成 第一章前言 人的皮肤、毛发均是有蛋白质构成，皮肤为胶原，毛发为角朊。而水解蛋白 是由各类蛋白质经酸、碱或者酶水解制成，组成成分都为氨基酸，因此与皮肤和 毛发有很好的亲和作用，且性质温和无刺激。因此在很久以前，就有人用开始利 用天然蛋白及牛奶、蛋清等洗澡、洗脸、洗发。蛋白质有亲和性，能透过皮肤和 头发表层，并有成膜性和保湿性，它们是有益的天然物质，有缓解刺激的作用。 用于发用品时，有改善头发的可处理性、质地、可梳性、光泽和组织，并可减轻 头发因各种处理而受到的损伤，且有修复开裂发端的作用，亦可改善头发的保湿 性和染料渗透性。 1 9 3 0 年初，德国已广泛使用水解蛋白作为纤维工业的油剂【“。1 9 4 5 年国外 美容市场开始出现头发调理剂【“。事实证明，阳离子对头发的附着性和护理性能 较好，因此，阳离子表面活性剂得到较大发展，相继出现于各种调理列中，其中 以酰胺基胺盐和季铵盐两类化合物尤为突出。1 9 6 8 年，国际化妆品会议 d r d e n a v a r r e 认为：它是最有发展前途的原料之一，能使皮肤、毛皮保持良好的 感觉。七十年代，简单的水解蛋白开始应用于扩t 发香波【3 】，开发最多的是胶原蛋 白。它在酸、碱或酶的作用下水解f 蛋白质一胨一多肽一二肽一氨基酸) ，在未彻 底水解成氨基酸前，有一系列带有蛋白质性质的中间物质，称之为水解蛋白，其 分子中有带正电或负电的物质，蛋白中氨基酸的组成确定了带电基团类型、符号 及其等电点。 近年来，随着人们生活水平的提高和回归自然的流行，市场上美发护发的产 品品牌层出不穷，各品牌也更趋向采用许多天然成分。因为除了基本的美发护发 目的外，消费者对发用品的要求更加着重于对头发的修护、保湿和滋润等方面的 目的。而同时大部分消费者相信并认同这样一个观点，来源于天然的成分更能有 效地帮助其达到上述美发护发目标。为了迎合这一潮流，目前很多美发护发产品 都宣称其添加了植物成分，其中，植物蛋白精华是最常宣称的。例如舒蕾小麦蛋 白双重护理洗护发系列直接通过产品名称向消费者表明其产品里添加了小麦蛋 白；其他产品如露华浓柔丝洗护系列宣称其含有小麦蛋白及绿茶精华； k e r a n o v e 修护洗发露则宣称产品里含杏仁蛋白：娜宝蕴露洗发香波含大豆蛋 1 浙江大学研究生学位论文 季铵化水解小麦蛋白的合成 白等。通过上述产品不难看出，在产品中添加植物蛋白己被更多的品牌采用，“健 康的头发来源于天然的护理”也已逐步成为新的护发理念。 组成头发的角蛋白，等电点p h = 4 ，而大多数化妆品用水解蛋白等电点为 4 o _ _ 6 0 ，它们只在等电点以下呈阳离子性，p h 值小于等电点蛋白质带正电， p h 值大于等电点蛋白质带负电。因此，使用时所带正电荷量很少，并不具有真 正的阳离子性，而且只有当水解蛋白浓度高达4 _ _ 5 时才具有优异的附着性，实 际使用产品中，浓度常# 3 1 - - 2 4 1 ，这样就限制了头发对水解蛋白的吸附量，显 然其调理作用较低。而本文研究的季铵化水解蛋白质既具有蛋白质等天然类物的 调理性，又具有季铵盐的吸附性，在发用化妆品中应用前景十分广泛。 2 浙江大学研究生学付论文 季铵化水解小麦蛋白的合成 第二章文献综述 2 1 小麦蛋白的概述 小麦的主要营养成分是淀粉和蛋白质，其中蛋白质约占小麦干重的1 0 ， 是人类能量和营养的主要来源之一。把小麦粉和水混合搅拌就生成面团，面团中 的蛋白质形成面筋。面块静置一段时间后，在水中搓洗，淀粉渐渐离开面团而悬 浮于水中，最后只剩下一块具有粘性、延伸性和橡胶状的物质，这就是所谓的湿 面筋。湿面筋烘去部分水分，就成为干面筋。据测定，面筋蛋白占小麦蛋白的 8 0 1 5 左右，是小麦蛋白的主体。 面筋蛋白网络是形成面团功能性的基础。小麦面筋蛋白足高度多形化的多肽 混合物，由分子量范围在3 00 0 0 至9 00 0 0 k d 之间的五十多种成分组成。小麦面 筋蛋白按照功能不同可分为两类：麦谷蛋白和麦醇溶蛋白，两者共同形成面团的 弹性和延伸性。麦醇溶蛋白是单体分子，分子量相对较d x ( 3 00 0 0 7 5 0 0 0 k d ) ， 分子呈球形，二硫键都分布于分子内部，分子为非极性；而麦谷蛋白是由分子间 二硫键形成的大的多聚体，其分子量大于1 千万，是自然界中存在的分子量最大 的蛋白质之一。麦谷蛋白又呵分为低分子亚基( l m w g s ) 组和高分子业基组 ( h m w g s ) ，其中麦谷蛋白的高分子致基( 分子量在6 5 0 0 0 9 0 0 0 0k d 之间) 约 占小麦干重的0 5 ，但它可以通过影响面团的粘弹性而对面团的品质产生很 大的影响，因而得到广泛的重视【“。麦谷蛋白除了分子内二硫键外，还有许多亚 基通过分子间二硫键形成纤维状的大分子，且极性大，使麦谷蛋白不易流动，故 延伸性小。麦醇溶蛋白没有这种联结，所以具有延伸性。一般来说，面筋的弹性 归因于麦谷蛋白组分，面筋的粘性和延伸性则来自于醇溶蛋白成分【7 】a 小麦蛋白是由许多相对分子质量和品质不同的蛋白质分子组成的混合物，其 溶解性的热力学分析较为复杂。小麦蛋白在水中的溶解过程可以用吉布斯自由 能公式表达如下燃 g = h t a s 其中g 是溶质和溶剂组成体系的g i b b s 自由能变化； a h 是恒压下溶质溶于溶剂的溶解热； 3 浙江大学研究生学位论文 季铵化水解小麦蛋白的合成 甜是溶解过程中混乱度的变化( 熵变) ； 丁为绝对温度。 因蛋白质的氨基酸残基和水作用的途径不同，所以溶解焓不仅与蛋白分子的 构象相关，还取决于氨基酸残基的类型湘似相溶原则在此也适用。如，尿素和蛋白 肽链结构相似，因此面筋蛋白易被尿素提取、极性氨基酸残基易与水作用等但是 面筋蛋白与其它蛋白相比离解程度低( 1 0 ) ，而非极性氨基酸的含量高( 3 0 4 0 ) ，易形成疏水作用，谷氨酰胺侧链含量高易形成氢键所以溶解面筋蛋白大分 子时必须破坏疏水作用和氢键，使得ah 0 在纯水中，水分子间是通过氢键相互 作用的。溶质进入水分子体系时，氢键遭到破坏，水分子体系表面形成空穴，极性溶 质易形成新的氢键，而疏水性溶质则进入空穴，水分子体系必须调整结构以生成新 的氢键，这样该体系的有序度比纯水高，那么as 0 。因此，面筋蛋白的溶解过程在能量上是不利的，难以进行。 小麦蛋白的上述特性对于制作食品是非常适合的，但对于制作发用调理剂而 言，由于其含有较多的疏水性氨基酸，分子内疏水作用区域较大，溶解性较低， 而其它功能性如乳化性、起泡性等是以溶解性为基础的，溶解性差影响了其它功 能性，这限制了小麦蛋白在化妆品中的利用范围。 2 2 季铵化水解蛋白的性质以及应用机理 应用于美发护发化妆品中的蛋白质一般为两种，蛋白质的水解物或水解物的 衍生物。水解蛋白可以通过酶水解或酸水解等不同方法加工而成，水解蛋白的衍 生物一般是通过化学改性，在水解蛋白侧链或末端引入其他基团制备而成，例如 本文介绍的季铵化水解小麦蛋白。 2 。2 1 水解蛋白 蛋白在酸或酶的作用下水解生成蛋白质一肽一多肽一二肽一氨基酸，在未 彻底水解成氨基酸之前，有一系列带有蛋白质性质的中间产物，称为水解蛋白。 水解小麦蛋白相对分子质量大约在10 0 0 d 3 00 0 0 d ，彻底水解的产物为氨基酸， 在发用化妆品中常用的分子质量约为4 0 0 d 7 0 0 d 。 头发中含有大量的角蛋白，约占头发的6 5 9 5 ，许多天然活性蛋白对头 4 浙江大学研究生学位论文 季铵化水解小麦蛋白的合成 发有很高的亲和性，易为毛发吸收，具有营养、成膜作用，是优良的发用调理剂。 蛋白质在调理方面的功能是和其本身的结构组成和分子质量有紧密联系的，关 键在于它和头发中的角蛋白形成氢键，水溶性蛋白尤其对受损发质具有一定的 修复作用。这是由于受损头发的毛小皮损伤，使得蛋白质裸露，头发的亲水性增加 易与水溶性蛋白质结合，形成_ 层蛋白质膜，使头发易于梳理并具有光泽。 市售水解植物蛋白中，高分子质量的水解小麦蛋白修复作用尤其显著。水解小麦 蛋白长链的每个链上有很多半胱氨酸，可和头发中半胱氨酸交链结合，形成复杂 的季铵化键，此过程类似烫发( 见图2 1 ) 。 天然鼹发二雅键黼开头麓熏缀零镀纯键澎成 陋割譬制一s h 到h s - - 一巨吾一n 图2 i蛋白质与头发的成键机理 用三丙醇胺类的解键剂可解开胱氨酸的二硫键，水解蛋白和头发中的硫键会 形成共价键。另外，胱氨酸在和双氧化物溶液发生氧化反应时也会形成双硫共价 键，达到持久调理和修护头发的目的。美国专利4 2 7 9 9 6 9 号和4 3 9 0 5 2 5 号中说 明了半胱氨酸的角蛋白的应用【9 10 1 。这些在碱性条件下生成的半胱氨酸残基在 烫发过程中与头发连接，使头发具有较好的触感。1 9 8 6 年巴赛罗纳的1 4 屈i f s c c 大会上报道，该调理方法已经过核射线测试有效，证明可增进头发的光亮度、质 感和顺服性。由于水解小麦蛋白这种优异特性对于调理和保护发质具有重要意义 它广泛用于修复香波、冷烫液、染发剂和护发素等美发护发用品中，欧莱雅染后 维它洗发香波中就用到了活性水解小麦蛋白。 2 2 2 季铵化水解蛋白 蛋白质分于中尽管各个氨基酸之间通过肽键相互连接，但其分子表面仍带有 许多可解离的基团，如酚羟基、氨基、羧基、眯唑基等因此蛋白质是两性电解质， 既可与酸，又可与碱相互作用。溶液中蛋白质的带电情况，与它所处环境的p h 有关。调节溶液的p h ，可以使一个蛋白质带正电或带负电或不带电；z 年g - p h 5 浙江犬学研究生学位论文 季铵化水解小麦噩白的台成 发有很高的亲和性，易为毛发吸收，具有营养、成膜作用，是优良的发用调理剂。 蛋白质在调理方面的功能是和其本身的结构组成和分子质量有紧密联系的，关 键在于它和头发中的角蛋白形成氢键，水溶性蛋白尤其对受损发质具有一定的 修复作用。这是由于受损头发的毛小皮损伤，使得蛋白质裸露，头发的亲水性增加 易与水溶性蛋白质结合，形成_ 层蛋白质膜，使头发易于梳理并具有光泽。 市售水解植物蛋白中，高分子质量的水解小麦蛋白修复作用尤其显著。水解小麦 蛋白长链的每个链上有很多半胱氨酸可和头发中半咣氨酸交链结合，形成复杂 的季铵化键，此过程类似烫发( 见图2 1 1 。 天然强发 卜s s q t - s t s l i 离誊一巨p m l e i n阿别 e 图21蛋白质与头发的成键机理 用三丙醇胺类的解键剂可解开胱氨酸的二硫键，水解蛋白和头发中的硫键会 形成共价键。另外，胱氢酸在和烈氧化物溶液发生氧化反应时也会形成双硫共价 键，达到持久调理和修护头发的甘的，美国专利4 2 7 9 9 6 9 号和4 3 9 0 5 2 5 号中说 明了半胱氨酸的角蛋白的应用【9 ”】。这些在碱性条竹下生成的半胱氨酸残基在 烫发过程中与头发连接使头发具有较好的触感。1 9 8 6 年巴赛罗纳的1 4 届i f s c c 大会r 报道，该调弹方法已经过核射线测试有效，汪明可增进头发的光亮度、质 感和顺服性。由于水解小麦蛋白这种优异特性对于调理和保护发质具有熏要意义 它广泛用于修复香波、冷烫液、染发剂和护发素等美发护发用品中，欧莱雅染后 维它洗发香波中就用到了活性水解小麦蛋白。 2 2 。2 季铵化水解蛋白 蛋白质分于中尽管各个氨基酸之间通过肽键相互连接，但其分子表面仍带有 许多可解离的基团，如酚羟基、氨基、羧基、眯唑基等因此蛋白质是两性电解质， 既可与酸，又可与碱相互作用。溶液中蛋白质的带电情况，与它所处环境的p h 有关。调节溶液的p h ，丌j 以使个蛋白质带正电或带负电或不带电；在某一p h 有关。调节溶液的p h ，可以使一个蛋白质带正电或带负电或不带电；在某一p h 5 浙江大学研究生学位论文 季铵化水解小麦蛋白的合成 时蛋白质分子中所带的正电荷数目与负电菏数相等即静电荷为零，在电场中不 移动，此时溶液的p h 即为该种蛋白质的等电点。不同蛋白覆由于氨基酸组成不 同，等电点不同，在同一p h 条件下所带净电荷不同，在同一电场中移动的方向、 速度不同因此可以相互分离。在等电状态的蛋白质分子，其物理性质有所改变， 但最显著的是溶解度最小。 在头发中的氨基酸组成结构使头发表层的等电点达n 3 8 ，在等电点以上， 头发带有负电荷。而大多数化妆品用水解蛋白等电点为4 o 6 0 ，它们只在等 电点以下呈阳离子性。这样，在实际使用时水解蛋白并不具有真正的阳离子性， 这就限制了头发对水解蛋白的吸附量。水解蛋白季铵化后，被置换的氨基保留阳 离子性，蛋白质正电荷成倍增加，其等电点也增高。女l l c r o q u a t s o y a ( 季铵化豆类 蛋白) 等电点约为1 0 。用辐射示踪法f “1 可证明季铵化蛋白的附着性优于母体蛋自， 所以季铵化蛋白可提供比水解蛋白更强的调理能力，对于改善静电积聚。头发顺 滑等方面的效果更加明显。提高蛋白质的等电点可增加蛋白质对头发的吸附性， 通常通过与阳离子的复合物共价结合的方式( 如季铵化衍生物) 实现。如图2 2 所 示，r 这个烷基可以变化，如甲基、月桂基或硬脂基，碳链越长，所产生的季铵 化蛋白越具有表面活性。季铵化的蛋白质与其他阳离子调理剂相比，具有刺激性 低，能与阴离子配伍的特性。 譬静 r 1 3 一氆群一巍j 3 一n h , - - a c 蓍鼍j 图2 2 季胺盐水解蛋白结构 其中a 是水解蛋白多肽基团，r 。2 是至少含有一个c 1 2 - - c n 链的亲油基幽， r 1 3 是c l c 6 的表卤代醇基团。物质分子量是1 5 0 0 d - - 1 0 0 0 0 d ，最佳控制在2 0 0 0 d 5 0 0 0 d 。 比较成熟的产品如下： c r o q u a tl ：平均分子量大约2 5 0 0 d 左右，含有一个c 1 2 的氨基。 c r o q u a tm ：平均分子量大约2 5 0 0 d 左右，含有一个c 1 0 - - c 1 8 的氨基。 c r o q u a t s ：平均分子量大约2 7 0 0 d 左右，含有一个c l s 氨基。 c r o q u a tq ：平均分子量大约1 2 0 0 0 d 左右，含有至少一个c 1 - - c 1 8 的氨基。 6 浙江大学研究生学位论文 季铵化水解小麦蛋白的合成 理想的应用于化妆品的中的季铵化水解蛋白，既具有蛋白质和天然类物的调 理剂，又具有季铵化的吸附性，能同类脂物相联，补充了头发蛋白质和类脂物的 损失，也由于它们具有阳离子的属性和庭好稳定的水溶性以形成乳液，并且具有 表面活性使得无需在化妆品中添加发泡剂作为辅助。 带正电的季铵化水解蛋白类与带负电头发发生强烈作用，其亲水基吸附在头 发表面，疏水基远离头发表面，在整个头发表面定向排列，形成保护膜，使头发 电荷降低，并赋予头发光泽和光滑，不缠结易梳理。 季铵化水解蛋白类具有较高的等电点，相对于一般水解蛋白有如下优点： 容易湿梳理 光泽良好 改善头发质地 定型效果好 修复断根的损伤头发 能与多种表面活性剂配伍 在目前的美发及护发产品的研发过程中，由于产品成本的限制，水解蛋白的 衍生物在产品配方中使用量受到一定限制，仅作为一种活性添加物使用，而植物 蛋白衍生物也只能应用于高档美发护发化妆品中。由于植物蛋白具有动物蛋白多 方面的特性且来源更加丰富，所以随着植物水解工艺的成熟和蛋白质化学科学 的进展，应用于美发护发化妆品中的水解植物蛋白的种类和衍生物将会越来越 多。 本文选用小麦蛋白作为原料合成季铵化水解小麦蛋白具有成本低廉易得、低 刺激、低毒性及高附着性的特点，符合消费者对安全、营养和天然产品的倾向心 理，并可望得到高调理性和多功能的洗发护发产品如综合蛋白的营养性、植物蛋 白的药用性和氨基酸的保湿性等。 2 3 季铵化水解小麦蛋白的合成概述 2 3 1 小麦蛋白的水解 水解法是最早生产氨基酸的方法。它是以蛋白质为原料，经酸、碱或蛋白水 解酶水解后，得到各种氨基酸或多肽( 部分水解) 的工艺过程。利用水解作用将 7 浙江大学研究生学位论文 季铵化水解小麦蛋白的合成 大的蛋白质分子降解成小的多肽分子和氨基酸，就可以大大提高蛋白的利用率。 同时还可改善蛋白的许多性质，如酸溶解性，粘度，发泡性，乳化性等，因此采 用水解工艺，能开拓蛋白质的应用范围，提高其利用效果。 水解法主要有酸水解法、碱水解法和酶水解法三种。 酸水解易于控制，但所用酸较多；碱水解操作困难，但所用碱量较少，从经 济角度分析考察，酸碱水解反应存在的主要问题是得率较低。众所周知，面筋是 由麦谷蛋白与麦醇蛋白二种性质相差较大的分子组成，其中麦各蛋白为高分子 量，不溶于水与乙醇，麦醇溶蛋白分子量相对较小，溶于7 0 乙醇，数量各占 面筋的一半左右，这样酸、碱部分水解使蛋白可溶解时，一部分分子已成等电点 可溶的小分子或多肽，使一部分物质在制作过程中先损失掉。总之化学水解在一 定程度上能改善小麦蛋白的功能特性，但也存在很大的局限性。并且化学方法是 利用酸或碱水解蛋白质，虽然方法简单、成本低廉，可是反应条件剧烈，生成过 程中氨基酸受损严重，破坏了氨基酸的构形，使l _ 氨基酸变成d 氨基酸，并能 形成象赖氨酸一丙氨酸等有毒副作用的物质，而且很难按规定的水解程度控制水 解；而酶解能在温和的条件下进行，并且可以在特定的条件下进行定位水解，分 裂产生特定的肽，水解的程度易于控制。 蛋白质是由氨基酸以肽链连接而成的长链高分子，各种蛋白质由于其肽链中 亲水氨基酸与亲油氨基酸组成比例、氨基酸分布位置、分子量大小等不同，乳化 性也不同，决定蛋白质的乳化性的因素还包括：溶解度、扩散到界面的速率、疏 水性、分子间相互作用，解除卷折结构的速率、表面电荷和水合度。一般植物蛋 白的乳化性低于动物蛋白。而采用适当的变性方法与变性条件，就可使一些蛋白 质的乳化性得到充分发挥，研制出高乳化性的蛋白质。小麦蛋白质具有独特的组 成只要对其进行适当的变性就可开发出具有高乳化性的产品。 2 3 1 1 酸法水解蛋白质 酸法水解蛋白质是最早用来制取水解蛋白中的方法。自i - i r i t t h a u s e n 博士 f 1 8 6 6 ) 用h 2 s 0 4 水解面筋，分离得到谷氨酸，氨基酸的分离、提纯，分析采用酸 法降解蛋白质延续了许多年。 酸法水解蛋白质是在比较温和的条件下进行的。酸性条件下，蛋白质发生去 8 渐江大学研究生学位论文 季铵化承解小麦蛋白的合成 酰胺反应。去酰胺反应是直接水解蛋白质酰胺键中的氨，脱氨形成羧酸进行的。 去酰胺面筋蛋白具有很好的溶解性、乳化性以及起泡性。但酸去酰胺由于温度高， 不仅在酸的催化下肽键水解控制不好，蛋白质也部分变性。 酸法水解蛋白质通常采用盐酸溶液，因为盐酸价格相对低廉，并且中和时产 生的n a c l 对人体无害。但是酸水解酸消耗量太大，常常超过1 ：l 的量，并且 后处理中为了获得水解产物必需消耗大量能量蒸发掉大量的水，不经济，如果用 盐酸水解还会产生氯代醇有害物质。 为了避免消耗大量酸和能量，b i 0 1 p h a r m 的b u l l 1 2 】采用气体h c l 在5 0 。c 催 化水含量低于2 0 的蛋白质。 j a m c b e m s o c t l 3 1 刊登文章上提出用s 0 2 或者亚硫酸钠催化水解蛋白质， 可以避免代醇有害物质的生成，而且催化物s 0 2 可以通过加热析出除去。 2 3 1 。2 碱法水解蛋白质 碱催化去酰胺改性，速度快，相对于酸性水解来说，产物更均衡更具选择性。 但对蛋白质中的赖氨酸有破坏，形成赖氨酸丙氨酸，毒理研究表明对小鼠肾有毒 害作用。而且文献报道【1 4 】碱会破坏面筋蛋白中的2 s 键，形成少量h 2 s 。常用的催 化剂可以是n a o h 、k o h 、碱石灰或c a ( o h ) 2 。 根据f j c l e v e l a n d & c o m p a n y 的研究【1 5 1 ，n a o h 或者k o h 会使得脂 肪酸皂化形成细小的残余物，使得过滤等后处理变得困难。而使用碱石灰能避免 这些问题，并且碱石灰能大量吸收类胡萝h 素，淡化产品颜色，后处理时通入 s 0 2 就够方便除去产物中的金属钙离子，并且也能除去生成的h 2 s 。 2 3 1 3 酶法水解蛋白质 酶法水解蛋白质是采用蛋白酶对蛋白质进行酶解，酶解后其结构和功能性质 都有改变。蛋白质在酶的催化下可水解产生具有一定功能性质的肽段，而这些肽 与原有蛋白质的区别在于它们的分子相对小些，并且水解通常伴有重大的结构重 排，导致一些原来包埋在蛋白质分子内部的疏水区外露在溶剂中，因此而产生的 多肽不同于原来的蛋白质，它们可以具有新的营养、功能及生物特性。 水解酶一般分为蛋白酶和肽酶。蛋白酶的作用是断开蛋白中间的肽键a 而肽 9 浙江大学研究生学位论文 季铵化水解小麦蛋白的合成 酶多除去多肽末端的单个氨基酸或者水解到二肽和单氨基酸。关于酶法水解蛋白 质的文献很多，根据不同的酶有不同的路线和条件。例如：齐军茹等【1 6 1 采用中 性蛋白酶控制酶解小麦蛋白；栾广忠等【1 7 】采用碱性蛋白酶来水解小麦蛋白；武 彦文【1 8 1 采用胰蛋白酶制取小麦蛋白水解产物。 表2 1 几种水解蛋白工艺方法比较 方法氨基酸损失状况水解率成本优点缺点 酸 a 色氨酸破坏a 水解度高 低 成本低酸消耗量大，耗 b 丝氨酸部分破b 专一性技术成熟能大，难控制， 坏 差，不规 会产生氯代醇 c 色氨酸中吲哚则水解有害物质 环在水解时形 成甲酸，腐蚀性 碱a 消旋a 水解率低低速度快毒害作用 b 产生尿素b 专一性产品均衡硫化氢生成 c 有丝氨酸脱氨差，不规 d 胱、半胱氨酸破则水解 坏 酶a 水解率低较高条件温和工艺控制复杂 b 专一性强副反应少成本高 能耗低 2 3 2 酶水解小麦蛋白质的机理 水解酶般分为蛋白酶和肽酶。蛋白酶的作用是断开蛋白中间的肽键。而肽 酶多除去多肽末端的单个氨基酸或者水解到二：肽和单氨基酸。蛋白酶解的核心是 酶活性的发挥，寻求酶的最佳反应条件。 2 。3 。2 1 酶的催化特性 酶具有般催化剂的特征1 1 9 】，如用量少而催化效率高：能加快化学反应的 速度而其本身在反应前后没有结构和性质的改变；催化剂只能缩短反应达到平衡 所需的时问而不能改变反应的平衡点，酶亦如此。然而酶是生物大分子具有其自 身的如下特性。 1 、催化效率高 1 0 浙江大学研究生学位论文 季铵化水解小麦蛋白的合成 酶催化反应的速率比非酶催化反应速速率高1 0 8 1 0 2 0 ，比一般催化剂高1 0 7 - 1 0 9 。酶能高效催化是因为酶和其他催化剂一样，能使反应的活化能降低。 2 、酶的催化活性易受环境变化的影响 一般催化剂在一定的条件下会中毒而失去催化能力，而酶是生物大分子对环 境的变化更敏感。 3 、酶的催化活性可被调节控制 酶的种类很多，不同的酶调控方式不同。酶的调控方式多种多样，十分严密 十分灵巧，这是一般催化剂所不具有的特征。 4 、具高度专一性 被酶作用的物质称为酶的底物、作用物或基质。酶作用的专一性，是指酶对 它所催化的反应或反应物有严格的选择性，酶住住只能催化一种或一类反应，作 用于一种或一类物质。这是酶与非酶催化剂最重要的区别之一。如果没有这种专 一性，生命本身有序的代谢活动就不存在，生命也就下复存在。 酶的底物专一性是指酶对它所作用的物质有严格的选择性；一种酶只能作用 于某一种或某一类特定的物质，这种对底物的选择性称为酶的特异性或作用的专 一性。如蛋白质、脂肪和淀粉，均可被定浓度的酸、碱水解为其组成成分。但 若用酶水解，蛋白酶只能水解蛋白质，脂肪酶只能水解脂肪，而淀粉酶只能作用 于淀粉。根据专一性程度的下同，酶的底物专一性，可分为结构专一陛和立体异 构专一性两种主要的类型。 ( 1 ) 结构专一性恨据下同酶对不同结构底物专一性程度的下同，又可分为绝 对专一性和相对专一性。 绝对专一性具绝对专一性的酶只作用于种底物，底物分子上任何细微 的改变酶都不能作用。 相对专一性对底物结构的要求不是十分严格，可作用于一种以上的底物。 有些具相对专一性的酶作用于底物时，对所作用的化学键两端的基团要求的程度 不同，对其中一个要求严格，而对另一个则要求不严裕，这称为基团专一性( 族 专一性) 。如a d 葡萄糖苷酶，不仅要求水解a 糖苷键，且a 糖苷键的一端 必须是葡萄糖。具有这种结构的物质有果糖、麦芽糖。有些具相对专一性的酶只 要求作用于一定的化学键，面对键两端的基团并无严格的要求。如蛋白酶只水解 肽健，酯酶只水解酯键等这称为键专一性。 浙江大学研究生学位论文 季铵化水解小麦蛋白的合成 ( 2 ) 立体异构专一性当底物具有立体异构体时，酶只作用于其中的个。如 l 一氨基酸氧化酶只催化l 一氨基酸的氧化脱氨基作用，对d 一氨基酸无作用。延 胡索酸酶可催化延胡索酸加水生成苹果酸但不能催化顺丁烯二酸加水。 2 a 2 2 蛋白酶专一性对酶促反应的影响 由于蛋白酶种类与来源不同，其作用的氨基酸残基也有较大差异。以动物消 化道内胰腺分泌的胰蛋白酶家族为例，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶是 三种氨基酸序列相近、三维空间结构相似、活性部位氨基酸组成相同的酶类，它 们的催化机制也相近。胰蛋白酶的袋穴较深，在其底部由于a s p l 8 9 丽有一个负 电荷，可用来接受长而带正电的碱性侧链，例如赖氨酸或精氨酸。胰凝乳蛋白酶 的袋穴比较宽，并且完全由疏水侧链排列而成，因而对庞大的芳香基团提供了有 效的接受窗口。弹性蛋白酶的袋穴，由于开口处氨基酸残基的不同而袋穴开口较 小，任何稍大的侧链都不能结合在酶的表面上。这就说明，即使蛋白酶的来源与 结构相似，每种蛋白酶也都具有一定的专一性，如胰凝乳蛋白酶主要进攻芳香族 氨基酸残基，与其它种类氨基酸残基的结合速度和反应速度均慢很多。同样，酶 一产物复合物的解离速率常数也受到碳链基团r 的影响，r 为芳香基时的解离速 率比r 是其它基团时要快的多。由此可见，由于蛋白酶的专一性，不同底物与酶 的结合速度及产物的生成速度有很大的区别。 2 3 2 3 酶能高效降低反应活化能的原因 ( 1 ) 酶能与底物形成中间复合物6 0 年代的诱导契合学说( i n d u c e d f i tt h e o r y ) 来解释酶底物复合物形成的机制。该学说认为，酶催化某一酶促反应时，首先 酶与底物结合形成酶一底物复合物而后使底物转变成产物并释放出酶。 此反应可以下式表示： e + s ，e s ，e + p e s 的形成改变了原来化学反应的途径，从而大幅度地降低酶促反应所需的 活化能，使化学反应速度加快。 ( 2 ) 趋近效应与定向作用酶能与底物相互靠近，使底物进入酶的活性中心， 这就是趋近效应。趋近效应使酶活性中心处的底物浓度急剧增高，从而增加底物 1 2 浙江大学研究生学位论文 季铵化水解小麦蛋白的台成 分子的有效碰撞。酶还能使靠近活性中心的底物分子的反应基团与酶的催化基团 取得正确定向，这就是定向作用。定向作用提高了酶与底物反应的适宜时机，从 而降低了反应活化能，加快了反应速度。 图2 3 中a 、b 分别代表两个底物，当它们进入活性中心后，从不易起反应的 i 位，定向转位到最易起反应的i 位。 i 书耩舞的攀 幂蓬谯纳澄佼 h 逮套瓣靠琢 第适舟目绞搬 鞭 糍豹黎嚣 套蠛耪黛槛 图2 3 趋近效应与定向作用 ( 3 ) 变形与契合酶与底物接触后，酶在底物的诱导下其空间构象发生变化， 另一方面底物也因某些敏感键受力而发生变形。酶构象的改变与底物的变形，使 两者彼此互补契台( 图2 4 ) ，导致底物分子内部产生张力，受牵拉力影u 向底物 化学键易断裂，容易反应。 图2 4 酶一底物“变形”与“契合”示意图 f 4 ) 酸碱催化作用酸碱催化作用是有机反应中最普遍最有效的催化机制。酶 活性中心上存在许多酸碱功能基团( 如氨基、羧基、酚羟基、琉基和咪唑基等) ， 它们在体液条件下，既能作为质子供体，又能作为质子受体，极有利于进行酸碱 催化作用从而提高酶的催化效能。 ( 5 1 共价催化作用共价催化作用是指某些酶能与底物形成反应活性很高的 1 3 浙江大学研究生学位论文 季铵化水解小麦蛋白的合成 共价中间物，这种极不稳定的共价中间物极易变成过渡态，从而降低反应的活化 能，加速化学反应速度。 2 3 2 4 酶切断肽键方式 目前由蛋白质制取功能肽，主要工作是选择酶。利用各种酶的专一性，切割 特定肽键而制取县有生物活性的肽段。现简述常用酶切断肽键方式。 ( 1 ) 外切酶 氨肽酶水解方式：h 2 n a 一4 一p o l y p e p t i d eh 2 n a c o o h + h 2 n b p o l y p e p t i d e 专一性要求：对n 端第一氨基酸残基a 要求：极性氨基酸、芳香族氨基酸、 非极性氨基酸对三者的水解速度逐个递高。 羧肽酶水解方式：p o l y p e p t i d e - - a l b c o o h p o l y p e p t i d e a c o o h + h 2 n b - - c o o h 常用羧肽酶儿除了c 端是精氨酸、赖氨酸或脯氨酸以外靖水解所有其他c 端 氨基酸。 ( 2 ) 内切酶 水解方式：p o l y p e p t i d e - - a - - i - - b - - p o l y p e p t i d e p o l y p e p t i d e - - a - - c o o h + h z n b - - p o l y p e p t i d e 酶水解蛋白质，随着肽键的断裂发生了系列变化其中三个主要变化影响了 功能特性：( 1 ) 随着肽键的断裂，可离解的基团数目增多，导致离子化基团增加， 亲水性和净电荷数也同时增加；( 2 ) 随着分子体积的下降，抗原性大幅度降低， 多肽链的分子数减少；( 3 ) 分子结构改变导致埋藏的疏水中心暴露到溶液环境中。 这些变化致使水解物功能性改变较大，如水解物的溶解性即使在蛋白质等电点 处，也有大幅度的提高，起泡性明显增加，粘度降低，流变性质改善，乳化能力 下降等。 下面以胰蛋白酶为例简述酶催化多肽水解的过程，胰蛋白酶催化多肽水解的 过程可认为由以下几步组成：( 1 ) 多肽链在溶液中向酶的活性部位扩散；( 2 ) 多肽 链结合到酶的活性部位上，将相应类型的侧链伸入酶专一性袋穴中；( 3 ) 酶上的 三个重要催化基团( a s p l 0 2 ，h i s 5 7 干d s e r l 9 5 ) 通过氢键组成电荷中继系统并与底物 1 4 浙江大学研究生学位论文 季铵化水蜊小麦蛋白的台成 中肽键上的碳原子成键，形成一个酶一底物四面体中间物；( 4 ) 在多肽的n 接受组 氨酸的质子时，n - c 键削弱并最终断裂，半条多肽链以游离胺r n h 2 形式离开， 此时，另外半条链仍然以酞基化的中间物方式共价结合在酶上。这个乙酰酶复合 物相当稳定，可分离得到；( 5 ) 水分子向酶靠近攻击乙酰基的羰基碳原予；( 6 1 水 分子提供一个质子给h i s 5 7 形成另一个四面体；( 7 ) 酶上的乙酰键断裂；( 8 ) 多肽 水解的第二个产物脱离，酶恢复到它的原始状态。 2 3 2 5 底物蛋白结构对酶促反应的影响 蛋白质是由二十种氨基酸按照一定顺序通过肽键( c o n h ) 连接起来的大分 子物质。多肽链在三维空间是折叠的，且寻求能量最低的构象。当多肽链较跃时， 在水溶液中，常常是亲水基团暴露在卷曲的多肽链的外表面，而疏水基团倾向于 埋藏在空间结构的内部。因而，在水解过程中，可参与反应的各氨基酸残基与蛋 白酶结合的机会并不均等，暴露在空间结构外部的氨基酸残基与蛋白酶结合的机 会较大，肽链的断裂主要在这些氨基酸残基处发生。埋藏在内部的氨基酸残基有 可能在新生成的肽链中位于空间结构的表面，从而进入下一轮的水解过程。总体 说来，在酶促水解过程中，由于蛋白空间结构的影响，肽链的断裂位点不是随机 的，有一定规律性。 水解过程中底物分子量的大小直接影响反应速度。一般说来，蛋白酶都具有 一定专一性，只与特定氨基酸残基发生作用，与其它种类氨基酸残基的结合速度 和反应速度均慢很多。随水解反应的进行，反应底物分子量越来越小，多肽链上 可发生反应的特定氨基酸残基数也越来越少，即有效底物浓度不断降低，水解反 应速度也就逐渐降低。底物蛋白水解生成的某些多肽分子，在水解体系中同时扮 演着产物和底物的角色，即一个多肽分子既是某一水解过程的产物，同时又可能 是另一水解过底物。而作为水解底物，其生成的产物又可能有多种结构，这是因 为在此多肽链中能与酶发生作用的特定氨基酸残基数可能不只一个，因而其断裂 位点也可能不只一个，水解过程中有平行反应和连串反应共存的现象。 2 3 3 蛋白酶水解工艺 蛋白酶促水解工艺研究可分为以下两方面，一方面是水解操作条件的研究， 1 5 浙江大学研究生学位论文 季铵化水解小麦蛋白的合成 包括水解底物的预处理、蛋白酶的选择和复配、水解产物的分离纯化及水解温度、 反应时间、p h 、底物和酶用量等水解参数的确定；另一方面是水解反应操作流 程的开发，包括传统的间歇搅拌水解。 2 。3 。3 。1 酶促水解反应工艺 水解前对蛋白底物进行预处理如研磨、加熟、酸处理等，可有效提高反应水 解速度。这是因为预处理一方面可增大底物溶解度，另一方面还可部分消除底物 抑制，因为蛋白源中的某些抑制因子，如大豆蛋白中的s t i ，牛乳蛋白中的a 心l t 等在处理过程中将被破坏掉。同时，预处理还可使底物变性，空间折叠结构部分 打开，更易于蛋白酶进攻而利于蛋白的水解。本文在实验中对底物采用酸处理的 方法。 在水解产物的下游处理中，蛋白水解产物提取分离工艺里，活性炭脱苦脱色、 等电点沉淀、盐析或有机溶齐沉淀为常见传统工艺，例如本实验中，在水解液中 加入乙醇使小麦蛋白水解产物沉淀，最后进行过滤分离。新分离工艺中离子交换 吸附、双水相萃取、反胶团萃取己有相应文献报道。目前，最有前途的处理方法 为膜分离，它用超滤膜除去大分子蛋白酶、未水解的底物与不溶性肽【2 1 - 2 5 1 。水解 产物可用不同截留分子量的超滤膜再分级分离，可得到不同分子量大小的目标产 物。 在水解条件的控制上，针对不同的反应体系，由于所用底物蛋白和酶的性质 不同，反应条件包括温度、p h 值、底物用量和酶用量等均有很大的变化，一般 需根据目标产物的产量及生产成本等加以优化。 2 3 3 2 反应操作流程 传统的间歇搅拌仍是蛋白酶促水解领域中应用最广的操作流程之一。其优点 是操作灵活方便，可根据生产需要更换反应体系。但也存在较大的缺点，表现为 产品质量不稳定、酶回收困难、产物后续分离工序复杂和生产成本较高等。本文 实验仍然采用传统的间歇搅拌水解。 1 6 浙江大学研究生学位论文 季铵化水解小麦蛋白的合成 2 3 3 3 用水解度描述宏观水解过程 为了从宏观上表征整个酶促水解反应，a l d e r - n i s s e n 引入了水解度( d h ) 的概 念，即蛋白水解中断裂的肽键数占肽键总数的百分比，其定义式为【2 6 】： d h h 。1 0 0 墼1 0 0 h 。嘶m p 式中，a ：肽键断裂数( m o l g ) ； 纠蛋白中肽键总数( m o l g ) b ：酸或碱的 耗量( l ) ；：酸或碱的浓度( m o t l ) ；a ：口- 氨基酸的平均解离度；m p ：所用蛋 白的质i t ( g ) 。 a 一氨基酸的平均解离度由下式计算【2 7 ： 1 0 r “一p 口2 i + i o p h - p 】( 上式中p k 值受温度的影响很大，但与底物关系不大。不同温度下的p k 值 可用下式计算： p k 一7 8 + 2 9 8 - - - - - - z - t 2 4 0 2 9 8 t a l d e r 。n i s s e n t 2 8 】认为，维持反应体系p h 恒定，