（特种经济动物饲养专业论文）Calt2gt激活生物酶对苎麻纤维脱胶工艺的研究.pdf

摘要 本文通过对c a 2 + 激活脱胶、复配酶脱胶后两种酶液活性的测试，发现采用 c a 2 + 激活脱胶后的酶液活性较高，对脱胶后的纤维进行性能测试发现：纤维线密 度、强力、白度、残胶率等方面的性能都有较大的提高；同时，采用扫描电镜、 红外光谱、x 射线衍射及热重分析等方法对脱胶前后的苎麻纤维进行性能表征， 初步揭示了c a 2 + 激活生物酶脱胶的机理，为苎麻纤维的生物酶脱胶提供理论依 据。 首先，针对复配生物酶( 果胶酶半纤维素酶漆酶) 浓度、c a 2 + 浓度、温度 及脱胶时间进行4 因子3 水平正交试验得出：在果胶酶半纤维素酶漆酶浓度取 1 2 4 3 m g m l 一、温度为5 0 、反应时间为4 h 、c 8 2 + 的浓度取4 5g l 时，脱胶 后苎麻纤维的断裂强力3 7 2 c n d t e x ，纤维线密度为5 3 2 d t e x ，残胶率为2 4 5 ， 优于复配酶脱胶后纤维性能，从而表明c a 2 + 激活生物酶脱胶效果较好。 其次，通过对复配酶和c a 2 + 激活生物酶脱胶后酶液活性测试，发现采用c a 2 + 激活生物酶脱胶后的酶液仍保持较高的活性，并且活性的持续时间较长。 再次，通过扫描电镜、红外光谱、x 射线衍射及热重分析对脱胶前后的纤维 进行测试与分析表明：c a 的加入激活了生物酶的部分基团，提高了催化效果， 有效地改善了脱胶的效果；c a 2 + 激活生物酶脱胶后的苎麻纤维表面较为光滑，光 泽好，纤维的并丝率低、残胶率低，纤维的结晶度增加：c a 2 + 激活生物酶脱胶后 的苎麻纤维初始模量、强力增加，但断裂伸长有一定的下降。 最后，c a 2 + 的加入对生物酶产生了激活作用，可能是由于c a 2 + 与酶催化反应 的底物发生了结合，使水解反应向着有利于水解的方向进行，同时ca ；2 + 加入对生 物酶的部分基团产生了激活作用，使酶的活性部位增加，从而增加了酶的活性， 提高了纤维的脱胶效果。 关键词：苎麻；生物酶；脱胶；c a 2 + ；激活；机理 a b s 仃a c t m s p 印e rt e s t st w oo ft h ea c t i v i t yo ft h ee n z y m ew h i c hc o n t a i n sc a a n dn o l w ef o u n dt h a tt h ea c t i v i t yo ft h ee n z y m ew i t hc w a sh i g h e r , a n dd e g u m m i n g e d a f t e rt h ef i b e rp e r f o r m a n c et e s t i n gf o u n d ：f i b e r - d e n s i t y ，b r e a k i n gs t r e n g t h , w h i t e ， r e s i d u e ，a n do t h e ra s p e c t so ft h ep e r f o r m a n c eh a sg r e a t l yi m p r o v e d f i n a l l y ，w et e s t e d t h ec h a r a c t e r i z a t i o no fr a m i ef i b e rb e f o r ea n da f t e rt h ed e g u m m i n gt h r o u g han u m b e r o fm o d e mm e a n sa n dr e v e a l e dac a c t i v a t i o no ft h ee n z y m ed e g u m m i n g m e c h a n i s mf o rt h ee n z y m ed e g u m m i n gp r o v i d eat h e o r e t i c a lb a s i s f i r s to fa l l ，i nt h eo r t h o g o n a lt e s to nt h eb a s i st h a tc a pc o n c e n t r a t i o n ，t e m p e r a t u r e ， c o m p l e xb i o l o g i c a le n z y m e ( p e c t i n a s e s e m i - c e l l u l o s e l a c c a s e ) c o n c e n t r a t i o na n d c o m p l e xe n z y m ed e g u m m i n gt i m ef o r t h et r i a lo ft h ee s t a b l i s h m e n to f4 - 3o r t h o g o n a l d r a w ：p e c t i n a s e s e m i c e l l u l o s e l a c c a s e c o n c e n t r a t i o nf r o m 1 2 4 3 m g m l t e m p e r a t u r eo f5 0 c ，t h er e a c t i o nt i m ew a s4 h ，c 一十c o n c e n t r a t i o nf r o m4 5 l ， u n g l u e da f t e rt h eb r e a k i n gs t r e n g t ho fr a m i ef i b e r3 7 2c n d t e x ，f i b e rl i n ed e n s i t yo f 5 3 2 d t e x ，g l u er e s i d u er a t eo f 2 4 5p e r c e n t , b e r e tt h a nc o m p l e xe n z y m ed e g u m m i n g e d a f t e rt h ef i b e rp e r f o r m a n c e ，t h e r e b yd e m o n s t r a t i n gc a e + - a c t i v a t e de n z y m er e t t i n g e f f e c t i v e s e c o n d l y ，t h r o u g ht h ec o m b i n a t i o no fb i o l o g i c a la n dc a 2 + a c t i v a t i o no ft h e a c t i v i t yo fe n z y m e sd e g u m m i n g e da r e rt h et e s ts h o w e dt h a tt h ea p p l i c a t i o no fc a p + d e g u m m i n g e da f t e rt h ea c t i v a t i o no ft h ee n z y m eo nt h ea c t i v i t yr e m a i n e dh i g h ，a n d a c t i v i t yo fl o n g e rd u r a t i o n o n c ea g a i n , t h r o u g ht h ec a m e r a , s c a n n i n ge l e c t r o n m i c r o s c o p y ，i n f r a r e d s p e c t r o s c o p y ，x - r a yd i f f r a c t i o n , a n dt h e r m a la n a l y s i so ft h ed e g u m m i n g e db e f o r ea n d a f t e rt h ef i b e rf o rt e s t i n ga n da n a l y s i ss h o w e dt h a t ：c a z + , sa c c e s s i o nt oa c t i v a t et h e e n z y m ep a r to ft h eg r o u pa n di m p r o v et h ec a t a l y t i ce f f e c t ，e f f e c t i v et oi m p r o v et h e e f f e c t i v e n e s so ft h ed e g u m m i n g ；c a c t i v a t e de n z y m er a l l l i ea f t e rt h ed e g u m m i n g e d f i b e rs u r f a c ei ss m o o t h ，s h i n ys u r f a c e ，a n ds i l kf i b e r sa n dt h el o wr a t e ，t h el o wr a t eo f r e s i d u a lg l u e ，a ni n c r e a s eo ft h ec r y s t a l l i z a t i o no ff i b e r ，b r e a k i n gs t r e n g t hi n c r e a s e d c 铲十a c t i v a t e de n z y m et h ei n i t i a lm o d u l u so fr a m i ef i b e ra f t e rt h ed e g u m m i n g e di s i n c r e a s i n g ，b u tb r e a k i n ge l o n g a t i o no ft h ed e c l i n et oac e r t a i ne x t e n t f i n a l l y c a z + , sa c c e s s i o nt op r o d u c et h ee n z y m ea c t i v a t i o nm a yb ed u et oc a a n dt h er e a c t i o no ft h es u b s t r a t ei nac o m b i n a t i o no ft h eh y d r o l y s i sr e a c t i o ni s c o n d u c i v et o w a r d st h ed i r e c t i o no fh y d r o l y s i s ，c 矿十t oi o i ns o m eo ft h ee n z y m e ，玎1 e g r o u ph a sa c t i v a t e d ，t h u si n c r e a s i n gt h ea c t i v i t yo fe n z y m e st oi m p r o v et h ee f f e c to f f i b e rd e g u m m i n g e d k e y w o r d s ：r a m i e ；b i o l o g i c a le n z y m e ；d e g u m m i n g ：c a 2 + ；t h ea c t i v a t i o nm e c h a n i s m 2 独创性声明 本人声明所呈的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得安徽农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：窆曼壶鱼 签字日期：口乙唯乡月，6 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文 的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 文件，允许论文被查阅和借阅。本人授权安徽农业大学可以将学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，收录到中国学位论 文全文数据库，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编 学位论文，向社会公众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适 用本授权书) 。 学位论文作者签名：监 签字日期：扩年6 月7 l ，日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通信地址： 指导教师签名： 杠蚴 签字日期：扯斛月铂 电话： 邮编： 1文献综述 1 1 苎麻纤维的结构和性能 苎麻( b o e h me r i an i v e a l g u a d ) 系荨麻科苎麻属，为多年生宿根性草本植 物，又称“中国草 ，是中国特有的以纺织为主要用途的农作物。早在四千年 前，我国古民就利用苎麻通过手工纺纱织布。 苎麻适宜种植在温带及亚热带地区，土壤以土层深厚、疏松、有机质含量高、 保水、保肥、排水性好、p h 值在5 5 - - - 6 5 为宜。我国主要产地分布在北纬1 9 度至3 9 度之间，南起海南省，北至陕西省均有种植苎麻的历史，一般划分为长 江流域麻区( 包括湖南、四川、湖北、江西、安徽等省) 、华南麻区( 包括广西、 广东、福建、云南、台湾等省、自治区) 、黄河流域麻区( 包括陕西、河南等省 及山东省的南部) 。其中长江流域麻区是我国的主要产麻区，其栽培面积及产量 占全国总栽培面积及总产量的9 0 以上。苎麻一般每年收获3 次，生长周期约为 5 0 - 9 0 天，这随气候条件不同而异。苎麻纤维的主要成份是纤维素，光照强度 和每天日照时数对纤维产量有很大影响。日照不足，则光全作用减弱，茎秆软弱、 麻皮薄、纤维细胞壁薄、工艺成熟延迟、产量降低。但阳光太强，高温干旱也会 使麻株生长受到抑制张细胞木质化，降低品质和产量船卜嘲。 苎麻纤维主要分布于苎麻茎纤维层，横切面上呈圆形、椭圆形、多边形和不 规则形状：同一纤维细胞胞壁厚薄较均匀，胞壁上具有单纹孔与外界纤维细胞和 薄壁细胞相通；胞腔和纤维细胞一样呈圆形、椭圆形、多边形、不规则形等各种 形状，胞腔部分中空、部分边缘附着细胞质嘲。同时，在同一截面上，不同纤维 细胞的大小、形状、胞壁厚度均存在较大的差异，一般较大的纤维细胞含细胞质 较少或不含细胞质而细胞壁较厚；较小的纤维细胞含细胞质较多而细胞壁较薄。 这说明苎麻植株茎在同一高度或同一层次的纤维成熟度是不同的，即同一纤维的 不同部位成熟度不同，大而壁厚的中部纤维细胞较早形成次生壁而较早成熟，小 而壁薄的尖端纤维细胞较迟成熟。 苎麻纤维呈细丝状，由若干纤维细胞相互连接而成，两端细小，中间较大； 纤维尖端一般呈锐尖、钝尖、半圆形、弯尖、二叉状等各种形状；另外，有些单 纤维顶端弯曲，顶端纤维细胞附加而锐尖。由于单纤维顶端具有二叉状，尖端弯 曲和顶端纤维细胞附加而锐尖，说明苎麻纤维的生长具有顶端插入生长的特性。 单纤维具有节结和节间，节结有的凸出，具有纤维素微纤丝附加，有的微凸，或 平直，或弯曲，是纤维的连接部位。成熟纤维节间中空，一般没有原生质，节结 处的纤维细胞细胞壁端壁较厚，往往具有次生壁，说明节间是由一个或多个纤维 细胞组成，节间是纤维形成和生长的一个基本单位。由于品种不同、纤维细胞长 5 度不同，单纤维部位不同节结和节间距有较大的差异，一般近上部节结较多，节 间较短，中部节结较少，节间距较大。苎麻纤维的组成成分如下表1 - 1 所示。 表卜1 苎麻纤维中的成分及其含量( ) t a b l 1 t h ec h e m i c a ic o r l p o s i t i o no fr a m i e 苎麻杆表皮可加工制作纺织用苎麻纤维，其纤维的结晶度高，纤维的强度大； 单纤维的长度较长，断裂强力大，由于其高结晶度的特点，其初始模量大，纤维 的刚性大，断裂伸长小；纤维的中间有沟状空腔，管壁多孔隙，并且细长、坚韧、 质地轻、吸湿散湿快，因而透气性比棉纤维高三倍左右，同时苎麻纤维含有叮咛、 嘧啶、嘌呤等元素，对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌等都有不同程度的 抑制效果，具有防腐、防菌、防霉等功能和卫生保健功能，因此苎麻纤维具有良 好的穿着服用性能，是一种优良的纺织原料，被公认为“天然纤维之王 。苎麻 织物具有粗犷、挺括、典雅、轻盈、凉爽、透气、抗菌等优点，其优越性与独特 风格是别的纤维无法比拟的。它与棉、丝、毛或化纤进行混纺、交织，可以弥补 上述四大纤维的缺陷，达到最佳织物功效 6 - 9 。 1 2 苎麻纤维脱胶的研究概括 在麻类作物的韧皮中，除含有纤维素外，还含有一些胶质，主要是半纤维素、 果胶和木质素等，苎麻原麻纤维主要化学成分如表1 所示。这些胶杂质大都包围 在纤维的外表，使纤维胶结在一起而呈坚固的片条状物质，即统称的原麻。这一 组成结构使得麻纤维不能直接用来纺纱。此外，在麻类作物的生长过程中，又时 常受到病、虫等自然灾害的破坏，而在韧皮上留下各种疵点，如；病斑、风斑等。 由于收获、剥制工作的不良使一些麻屑、皮壳等留存在大麻的韧皮中，这些斑疵 的存在都不利于纺纱的进行，因而在纺纱之前必须将韧皮中的胶质去除，并使纤 维相互分离，这一过程就称“脱胶”【1 0 1 。目前国内外麻类脱胶主要采用四种方法： 天然沤麻、化学脱胶法、人工接种微生物脱胶法和生物酶脱胶法。 1 2 1 天然沤麻法 天然沤麻法是最古老的麻脱胶方法，它主要经历三个阶段【i ! 】：物理作用阶段、 生化作用阶段和机械后整理阶段。物理作用阶段是将原生麻扎把装笼，然后浸渍， 6 麻韧皮中可溶性物质溶解，麻皮组织膨胀、爆破；生化作用阶段是使用生产菌对 苎麻进行接种，微生物的大量繁殖，从好氧作用到厌氧作用，这是麻脱胶的主要 作用阶段；机械后整理阶段是洗麻机洗麻，对麻进行敲打，使纤维松散分离。使 用微生物脱胶仍有少量的胶质残留在纤维上，后道可采用稀碱液进行精炼，精练 后的精干麻残胶率可稳定在2 - 3 ，较常规化学脱胶低。 这种方法是微生物脱胶的一种简单形式，在我国甚至目前欧洲不少麻生产国 家在对麻类进行脱胶时，仍多采用这一方法。但脱胶效果依赖于自然气候条件， 脱胶效果较差，后加工难度较大，且劳动强度大，耗用时间长，成本高，易引起 环境问题【。 1 2 2 化学脱胶 化学脱胶就是利用麻中的胶质和纤维素对酸、碱、氧化物作用性质不同，通 过煮炼、水洗等化学、物理机械手段使胶质与纤维分离。我国目前的麻纺织企业 大多采用化学脱胶工艺，视原麻品质和纺纱工艺的不同要求，分别在高温或常温 常压下进行【1 3 】，但化学脱胶法在实际生产中尚存在一些问题：首先木质素对无机 酸作用的稳定性相当高，因此脱胶中浸酸工序对木质素的去除效果不很好，并且 木质素大量存在于麻纤维中，留待煮练工序进行脱胶，将会增加煮练的负担，且 效果也不太理想【1 4 】，这就使后处理中的氧化剂和助剂的量很难控制，同时化学脱 胶工艺生产的大麻纤维会黏附一些化学物质并进入纤维内部，形成“药残”，对我 国的大麻类纺织品的出口产生了不利影响。另外，化学脱胶要消耗大量的化工原 料和能量，生产成本高，处理后的污水中含有有害的化学成分，回收利用不易， 极易污染环境，且化学脱胶时间过长。 1 2 3 人工接种微生物脱胶法 人工接种微生物脱胶法用天然的或人工培养的细菌发酵作用产生酶，酶使胶 质分解，获得分离的纤维束的脱胶方法。其实质就是“胶养菌，菌产酶，酶脱胶 循环的结果。目前人工厌氧微生物脱胶的研究仍在进行之中。此外，多粘芽孢杆 菌( b a c i l l u sp o l y m y x a ) 的脱胶条件要求非常苛刻，很容易受到外界杂菌的污染， 这是当前困扰人工接种微生物脱胶法的最主要难题之一。多粘芽孢杆菌( b a c i l l u s p o l y m y x a ) 一旦受到杂菌的污染，脱胶速度将会大为降低，因此人工接种微生物 脱胶法还有待进一步深入研究【1 5 】。 7 1 2 4 生物酶脱胶法 酶脱胶就是在麻类脱胶过程中加入酶制剂，脱去原麻胶质的方法。一般采用 半纤维素酶和果胶酶对原麻进行脱胶处理。 将脱胶菌培养到菌生长的衰老期后，首先通过透析的方法，使提取液中的酶 和其他蛋白质分子与提取液中的各种小分子物质分离开来。其次通过高速离心使 酶和其他蛋白质分子沉降。在高速离心的情况下，酶和其他蛋白质分子虽然都会 发生沉降，但是沉降的速度因各自相对分子质量的不同而不同。利用这一原理就 可以达到分离纯化酶的目的，从而得到的粗酶液，或者将粗酶液提纯、浓缩为液 剂，也可将该浓缩液干燥成为粉剂。酶脱胶法的基本原理为：麻纤维在半纤维素 酶和果胶酶的催化水解下，半纤维素大分子链断裂产生较小的分子链；同时把不 溶性的果胶转化为可溶性果胶，切断果胶分子中的甲氧键、酯键、a 1 4 苷键，形 成游离小分子，引起麻纤维表面剥皮效应，减小果胶、半纤维素的含量，使麻纤 维结晶度、取向度降低，改善麻纤维的模量、刚度、韧性和抱合力，达到满意的 纺织工艺要求。使用时将液剂稀释或将粉剂溶于水，把原麻浸渍在酶稀释液中， 在酶的催化作用下，苎麻中的果胶质、木质素、半纤维素都会发生不同程度的分 解，从而完成酶解脱胶【1 6 1 t 2 0 l 。 1 3 苎麻纤维微生物脱胶方法存在的问题 苎麻的微生物脱胶最早是利用天然微生物的作用即天然沤制法，来实现从苎 麻麻茎秆上分离纤维。沤制方法很多，有冷水浸、热水浸、露浸、雪浸、堆积发 酵、青茎晒法等。我国各地麻区盛行冷水浸渍法，少数采用堆积发酵法或青茎晒 制。苏联、美国、法国盛行露浸法，意大利盛行冷水浸渍法，日本盛行热水浸渍 法。但天然沤制法存在着很大的缺点，主要是占用水面大，脱胶时间长，脱胶质 量不稳定，受环境影响较大，而且容易造成环境污染。 法国、西德、意大利、前苏联等国家用费地芽孢梭菌进行苎麻脱胶，不但能 缩短脱胶时间，还可提高纤维品质。p a v e l k a ( 1 9 6 1 ) 报道【2 1 ( z 2 l ，用镰刀霉及根酶( 比 例4 ：1 ) 接种，进行苎麻浸渍，保持温度2 5 3 0 和相对湿度9 0 - - 9 5 ，3 6 4 0 小时完成脱胶过程。在浸渍液中加入l 硫酸铵( 对麻重) ，能缩短浸渍时间， 但该法由于设备比较复杂，投资较大，在生产应用上还不多。 苎麻微生物脱胶的研究工作虽取得一定的成果，但还存在以下问题：在菌株 的培养方面，筛选出的菌株的产酶能力不强、产量不高、产出的酶的活力还不够 高，菌株的适应性差，抗杂菌能弱，脱胶中的助剂、温度、水质、水流速度、通 气情况等都对酶的活性影响很大；在脱胶机理及脱胶工艺方面，虽然使用微生物 和酶法脱胶都取得了不错的效果，但是成熟的脱胶原理和过程还没有很清楚的研 8 究，在脱胶工艺设计上还存在着很多问题如：工艺时间长、占地面积大、离工业 化生产还有很大距离，脱胶和后道的纺纱等工序还没有形成有机的统一；在残胶 率的控制方面，如何控制脱胶后苎麻的残胶量，提高苎麻纤维的可纺性能也是今 后亟待解决的问题。 1 4 苎麻生物酶脱胶常用的生物酶种类 ( 1 ) 果胶酶 果胶酶是分解果胶的多种酶的总称，广泛存在于植物的果实和微生物 中，它能使果胶或果胶脂酸的甲氧基脱掉产生果胶酸，该酶属水解酶，广泛分布 与高等植物和微生物中，酶活最适p h 、对盐的激活反应、对各种酶抑制因子敏感 性随酶的来源和测定条件而异c 2 3 】闭。 ( 2 ) 半纤维素酶 半纤维素酶是水解由戊糖或果糖以外的己糖聚合成的多糖( 半纤维素) 的 酶的总称。半纤维素酶中能水解木聚糖、阿拉伯聚糖和甘露聚糖的分别称为木聚 糖酶、阿拉伯聚糖酶和甘露聚糖酶，所以，半纤维素酶也是一种多酶混合物。由 于半纤维素酶对纤维素纤维的主体成分一纤维素没有作用，因而半纤维素酶对 纤维的强度是没有损伤的。研究认为，半纤维素酶是使麻纤维变柔软的主要原因 【2 刀【2 9 】。 ( 3 ) 漆酶 漆酶( e c l 1 0 3 2 ，l a c ) 是含酮的多酚氧化酶，按其来源分为漆树漆酶和真 菌漆酶两大类。由于l a c 的含糖量较高，难以得到x 射线衍射构想图，所以它 的三维结构尚不清楚，但已证实，l a c 中的铜离子在催化反应中起决定作用，可 以催化芳香环c a c b 键断裂，并能将酚类氧化成醌【3 0 】【3 3 1 。 1 5 苎麻生物酶脱胶的降解机理 1 5 1 果胶的酶降解 果胶物质的分解在整个脱胶加工中处于十分重要的地位，在酶法脱胶过程 中，果胶质的分解主要由果胶酶来完成。果胶是结构复杂的一类物质，因此，果 胶质的催化水解需要不同的果胶酶来完成，果胶酶是多组分酶体系的总称。不同 的果胶酶对果胶质的催化水解方式不同，按照果胶酶对胶质的作用方式不同，主 要可分为聚甲基半乳糖醛酸酶( p m g ) ，聚甲基半乳糖醛酸裂解酶( p m g l ) ，聚半乳 糖醛酸酶( p g ) ，聚半乳糖醛酸裂解酶( p g l ) 和果胶酯酶( p e ) 。并且每一种酶都存在 内切和外切两种作用方式，内切是无规则地切断果胶分子a - 1 ，4 糖苷键主链，外 切是顺序切断果胶分子非还原性末端a - 1 ，4 糖苷键【3 4 1 1 3 5 1 。 9 1 5 2 半纤维素的酶降解 半纤维素是一群复合聚糖的总称，它包括聚木糖类，聚甘露糖类等。半纤维 素的复杂结构决定了半纤维素的酶降解需要多种酶的协同作用。半纤维素酶也分 为内切和外切两种作用方式吲。内切酶使聚糖分子主链的昔键随机断裂，急速的 低分子化。外切酶只能断裂聚糖分子非还原性末端基的苷键，只有与游离羧基相 邻近的糖苷键才会被外切酶所断裂，游离出单糖或寡糖。聚木糖要实现完全酶水 解需要多种酶协同作用。首先，由内切l ，4 d 聚木糖酶随机断裂聚木糖骨架，产 生寡木糖，降低聚合度，然后由外切酶木糖苷酶将木寡糖和木二糖分解为木糖， 枝链糖基的存在能阻抑聚木糖酶的作用，因此，需要不同的糖苷酶水解木糖基和 枝链糖基之间的糖苷键，女n a - l 阿拉伯糖酶，a - d 葡萄糖醛酸酶、乙酞酯和阿魏 酸酯酶等。这些特异性糖苷键酶能以协同方式与内切聚木糖酶和木糖苷酶一起高 效降解聚木糖。内切1 ，4 pd 聚木糖酶也存在酶组分的多样性。另外，一些聚木 糖酶具有双重功能，可同时有效水解聚木糖和纤维素大分子中的l ，4 0 糖苷键。 半纤维素中的聚甘露糖的降解需要内切1 ，4 0d 聚聚甘露糖酶和皿d 甘露糖苷 酶协同完成【3 7 】。 1 5 3 木质素降解的机理 一般认为，l i p 、m n p 和l a c 和h 2 0 2 产生系统构成降解木质素的主要成分【4 1 1 。 l i p 氧化非酚型化合物，引起c 旺- - c p 芳香环断裂，l a c 氧化酚型化合物，m n p 既 可以氧化酚型结构也可以氧化非酚型结构。通过l i p 、m p 、l a c 以及活性氧的产 生系统，引起芳香离子的自由基的产生，c a - - c p 的断裂以及c 8 氧化，芳香环开 裂，单甲氧基芳香物氧化，醌、氢醌的形成，这些产物再经过不同的代谢途径代 谢形成c 0 2 ，其途径入下图1 1 所示。 图1 - 1 木质素的代谢途径 f i g l _ 1 l i g n i nm e l ：a b o ii s mp a t h w a y 1 0 ii聚 1 6 酶的动力学原理及金属离子对其反应的影响 1 6 1 酶反应的动力学原理 酶的反应动力学原理主要有以下几种【4 2 】：酶作用在于降低反应活化能；酶 能显著地降低反应活化能，故表现为高度的催化效率；中间络合物学说：酶的催 化反应过程是先通过其活性中心与底物形成中间络合物，随后再分解成产物，并 放出酶。酶的活性部位( a c t i v es i t e ) 是它结合底物和将底物转化为产物的区域， 通常是整个酶分子相当小的一部分，它是由线性多肽中可能相隔很远的氨基酸残 基形成的三维实体。在活性部位，底物被多重的、弱的作用力结合( 静电力、氢 键、范氏力、疏水作用等) ，在某些条件下亦可能是由可逆的共价键结合。目前 主要由两种催化理论模型可以说明酶与底物的作用机理。 锁钥模型：在酶催化反应中，酶只有和底物充分靠近或接触才能使反应进行。 酶和底物是如何充分靠近或接触的成为揭开酶催化特性之谜的关键。1 8 9 4 年 e m i lf i s c h e r 提出锁钥模型( 1 0 c k - a n d k e ym o d e l ) 底物的形状和酶的活性部位被 认为彼此相适合，像钥匙能插入它对应的锁一般。两种形状被认为是刚性的 ( r i g i d ) 和固定的( f i x e d ) 当正确组合在一起时，正好互相补充。由此解释了酶 催化反应的专一性。 诱导契合理论：d a n i e le k o s h l a n dj r 在1 9 5 8 年提出的诱导契合模型 ( i n d u c e d - f i tm o d e l ) 来认识。该理论认为，底物的结合在酶的活性部位发生诱 导作用，使分子构象发生变化。酶的活性部位并不是和底物的形状正好相互补的， 而是在酶和底物结合的过程中，底物分子或酶分子，有时是两者的构象同时发生 变化才互补的。这时催化基团的位置正好在所催化底物键的断裂和即将生成键的 适当位置，这个动态的结合过程就称为诱导契合。 1 6 2 金属离子对酶的作用机理 由上述酶反应动力学原理，前人对金属离子是否会影响生物酶催化能力做了 很多试验，现综述如下： 酶溶液中的金属盐、金属离子和许多小分子对酶的活力有的起激活作用，有 的起抑制作用，这些物质称为激活剂或抑制剂。赵玉杰等【4 3 】研究了酶催化动力学 原理、m m 方程及各种影响因素。并导出公式( 1 ) 。 v = = v p 一一詈) ，c 刁、 ( 1 ) 尼肌p ( 1 + 产) + c s k 懈 式中v 为反应净速率，k 唧，k 滩分别为正、逆反应米氏常数，k 为反应平 衡常数。而文飞，陈德兆研究发现n a + 、k + 、m 矿、c a 2 + 、c 0 2 + 、z n 2 + 等离子 能明显激活纤维素酶，但超过有效浓度后会抑制酶的活性。曲涛，徐尔尼等 4 5 】 通过各试管放置在3 7 c 的恒温箱中，6 h 后取出，用纤维蛋白平板法1 4 6 测定各 管中的酶活力，点样量为2 0 此，通过测定比较溶圈大小确定出最佳修饰的金属 离子以及最佳浓度。发现部分金属离子对酶有催化作用。李金花，程远征等f 7 1 人用微量量热法研究了7 种金属离子及几种混合离子对纤维素酶降解纤维素反 应的影响。实验结果表明：在p h = 4 6 0 ，t = 3 1 0 k 时，相同浓度的离子中l i + 、 n a + 、c 、n i 2 + 、z n 2 + 、c 0 2 + 离子均表现出抑制作用，其中l i + 抑制作用显著：c u 2 + 有明显的激活作用。由实验可知，在纤维素酶降解纤维素的实际生产应用中选用 单个金属离子及几种混合离子来作为激活剂是可行的，可以提高生产效率；同时 也为纤维素酶的生产及在其它行业的应用提供了理论依据。赵玉蓉，金宏等【4 8 】 研究了各种不同金属离子对纤维素酶的影响，发现：n a + 、k + 、m 9 2 + 、z n 2 + 、m n 2 + 、 f e 3 + 、c a 2 + 对纤维素酶起激活作用其作用程度除氯化钠和碘化钾以外，均随其离 子浓度的增加而有不同程度的加强。金属离子对木聚糖酶也有不同程度的影响， n a + 、c a 寸、k + 对木聚糖具有激活作用，作用程度随着离子浓度的增加而有所加 强。王海青，孟欣等【4 9 】通过对费氏弧菌p 内切葡聚糖酶基因的研究表明：该酶 的最适反应温度为6 0 c ，最适反应p h 为9 o 。同时研究了6 种金属离子对该酶 活性的影响，结果显示该酶活性依赖金属离子的存在：m 9 2 + 和c a 2 + 对酶有激活 作用m n 2 + 和p b 2 + 贝1 严重抑制该酶的活性。 刘靖，夏文水【5 0 】通过对纤维素酶水解壳聚糖影响因素的探讨，结果表明： m n 2 + 、m ：9 2 + 、c a 2 + x 寸该酶有较强的激活作用。蓝虹云，雷福厚等【5 l 】通过用分光光 度法考察漆树漆酶催化单宁酸的氧化情况，探讨了p h 值、反应温度、单宁酸浓 度、有机酸和金属离子等对催化反应的影响。结果表明，当反应温度为3 0 时， 漆树漆酶催化反应效果较好；在p h 值为4 2 9 8 的范围内，反应速率随p h 值增大而加快；另外发现，c u 2 + 、m 9 2 + 和s i 2 + _ - - 种金属离子对催化反应有激活作 用。 张春玲，赵长新等【5 2 j 国产大麦芽的酶活力不如进口大麦芽的酶活力强，其中 原因之一是国产大麦中某些金属离子含量低，而这些离子对大麦中的某些酶有抑 1 2 制和激活作用。实验发现：当添加n a + 、k + 、m f 、z n 2 + 和c u z + 浓度分别达到8 0 x 1 0 击、6 0 x 1 0 击、4 0 x 1 0 西、2 0 x 1 0 6 、2 0 x 1 0 击时，制麦酶系中的小淀粉酶、b 淀粉 酶、蛋白酶和纤维素酶活力都达到最大值，提高幅度明显。 吴珍红，樊少华等【5 3 】通过提纯中华蜜蜂工蜂体内的碱性磷酸酶，研究金属离 子及脲对碱性磷酸酶的影响。结果表明：m 矿、c a 2 + 、b a 2 + 浓度为0 5 5 r e t o o l l 1 时，对酶均有激活作用。薛超彬，王勤等f 5 4 】选用m g c l 2 、b a c l 2 和c a ( n 0 3 ) 2 为 效应物，测定m 矿、b a z + 和ca j 抖二价碱土金属离子对酶活力的影响。结果表明： 这些碱土族金属离子对酶均有不同程度的激活作用。其中m 9 2 + 的激活作用较为 显著，0 2 5m m o l lm 矿可使酶活力提高1 7 。这3 种金属离子的激活程度依次 为m 9 2 + c a 2 + b a 2 + 。王伟，乔旭光等【5 5 】在对大蒜中的蒜氨酸酶和蒜氨酸进行提 取的基础上，研究不同金属离子对蒜氨酸酶活性的影响，其中m g + 对蒜氨酸酶 有明显的激活作用。 抑制剂主要起到钝化作用，而激活剂可能与底物发生作用垆6 】，生成与酶更易 反应的复合物而产生激活作用。当酶催化反应产物对酶反应速度有抑制时，激活 剂可能是和这种产物形成某种复合体，使产物从反应平衡过程中分离出去，从而 加快酶的催化反应，达到激活的目的7 1 。 1 6 3 影响酶反应的其他因素 ( 1 ) 酶分子和底物反应的邻近效应； ( 2 ) 多元催化和微环境的影响； ( 3 ) 诱导契合效应。 此外，诸如辐射线、超声波、等离子体等都会使酶的活力降低或丧失。影响 酶的催化反应的因素还包括浴中的其他添加物，浴比、搅拌速度和溶液循环方式 等也会产生影响【5 8 1 。所以不同的处理设备将有不同的效果。 1 3 2 引言 2 1 问题的提出与意义 “回归自然，和谐发展 是2 1 世纪人类发展的目标，可持续发展战略也已 成为我国的基本国策。众所周知，生物技术是2 1 世纪三大关键高新技术之一， 而酶工程又是生物技术的重要组成部分。酶制剂被誉为“工业问题的自然界解决 方案”，因此，酶对人类活动的作用和影响是不可估量的。 酶制剂应用于纺织工业的生产已经有半个多世纪的历史。近几年酶制剂随着 现代提纯分离科技水平不断提高，越来越多地渗透到纺织工业的各个角落。同时， 绿色化学的兴起，循环经济和环境保护理念的提出，使天然纤维素纤维原料转化 和利用的研究受到高度重视和广泛应用，而酶制剂在转化和利用纤维素纤维的过 程中起到了至关重要的作用。近年来，很多学者都对生物酶在苎麻天然纤维脱胶 过程中的作用做了深入的研究。但是，酶脱胶中酶的活性持续时间较短，或者活 性不够，容易失活等等诸多问题，使苎麻纤维的生物酶脱胶方法很难实现工业化 生产，降低了纤维的利用效率。目前已有一些学者对如何提高生物酶的活性和持 续性作了探索性研究，但没有真正揭示有关机理。笔者在研读大量文献资料后认 为金属c a 2 + 对生物酶有较好的激活作用，但其作用机理是什么? 作用效果如何? 这些都需要精细研究，需要通过试验中酶活性的变化及处理后苎麻纤维性能指标 的分析，以及采用现代测试手段对脱胶后的各苎麻纤维进行了测试和表征，才能 合理解释c a 2 + 激活脱胶的机理，并为相关研究提供理论基础。 2 2 研究的主要内容 本文主要研究了苎麻生物酶c a 2 + 激活脱胶的机理，通过试验设计对处理前后 的酶溶液进行测试，并采用现代测试技术对脱胶后的苎麻纤维的性能进行表征， 初步揭示了c a 2 + 激活生物酶脱胶的机理，为相关研究提供理论基础。 本论文主要研究内容可分为四部分： ( 1 ) 苎麻c a 2 + 激活生物酶脱胶的工艺优化 ( 2 ) 苎麻复配生物酶脱胶和c a 2 + 激活复配生物酶脱胶后生物酶活性的测试 ( 3 ) 不同方法脱胶后，苎麻纤维的性能表征 ( 4 ) 对表征得到的现象和酶活性测试的结果进行讨论。 1 4 3 试验材料与方法 3 1c a 2 + 激活复配生物酶脱胶试验 3 1 1 试验的原料 原料：取自安徽旌德县的苎麻头麻纤维。试验中主要的化学试剂如下表3 1 所示。 表3 - 1 主要化学试剂表 t a b 3 1 m a i ni e e c h d o mo fe x p e ri m e n t 其中：半纤维素酶( 活力为2 0 0 0 u m l ，有效p h 值范围4 0 5 0 ，有效反应温度4 0 5 5 c ) ； 果胶酶( 活力为5 0 u m l _ 1 ，有效p h 值范围3 5 5 0 ，有效反应温度4 0 5 5 c ) ；漆酶( 活 力为3u m l - 1 ，有效p i l 值范围4 0 5 5 ，有效反应温度4 0 5 5 c ) 。 3 1 2 试验主要的仪器 试验中主要的仪器和设备如下表3 2 所示。 表3 - 2 主要仪器及设备表 t a b 3 2 m aine x p e rim e n te q uip m e n ta n da p p a r a t u s 名称型号 产地 电子天平j a 4 1 0 3 上海天平仪器厂 数字酸度计 八篮恒温烘箱 电热恒温水浴锅 p h s 一3 c y 8 0 2 a i 珏i s 1 - n i 单纤强力机 n f l - y g 0 0 1 b 数显白度仪 s b d y l 上海鹏顺医疗器械有限公司 常州纺织仪器厂 北京长安科学仪器厂 温州大荣纺织设备仪器厂 上海悦丰仪器仪表公司 恒温加热磁力搅拌器 7 8 哪一l杭州仪表电机有限公司 1 5 3 1 3c a 2 + 激活生物酶脱胶试验工艺流程 c a + 激活生物酶脱胶试验工艺流程如下所示。 试剂：果胶酶与半纤维素酶以及漆酶的混合液( 其中：半纤维素酶活力为 2 0 0 0 u m l ，有效p h 值范围4 0 - - - 5 0 ，有效反应温度4 0 - - 5 5 ：果胶酶活力为 5 0 u m l - 1 ，有效p h 值范围3 5 5 0 ，有效反应温度4 0 - - 5 5 0 ；漆酶活力为3 u m l - 1 ， 有效p h 值范围3 5 - - - 5 0 ，有效反应温度4 5 - 5 5 ( 2 ) ；分析纯氯化钙。将酶粉剂溶于 水，并加入分析纯氯化钙，把原麻浸渍在酶和c a 2 + 的混合液中，在酶的催化作用 下，分解苎麻中的果胶质、木质素、半纤维素，从而完成酶解脱胶。 工艺条件：浴比为l ：3 0 t 的j 。 3 2 酶活性的测试试验 3 2 1 试验材料 采用复配酶脱胶和c a 2 + 激活复配生物酶脱胶试验后的酶液，包括半纤维素 酶；果胶酶：漆酶。 3 2 2 主要试剂及其配制 准确称取无水的3 , 5 一二硝基水杨酸6 5g 溶解待用。无水氢氧化钠4 0g 溶 解后移入5 0 0 m l 容量瓶，冷却后定容。将水杨酸溶解液移入1 0 0 0 m l 容量瓶并 加入3 2 5 m l 的氢氧化钠，再加入1 5 m l 丙三醇溶解定容至1 0 0 0 m l 贮存于棕色 试剂瓶中。以上试剂均为分析纯。水为蒸馏水。使用前一周配制。 c m c 标准液：称取c m c ( 羧甲基纤维素钠) 1 9 ，加入1 0 0 m l 水，在水浴 上加热使之溶解，再加入p h 5 0 的n a ，h p 0 4 柠檬酸缓冲液2 0 m l ，蒸馏水4 0 m l 混匀： 葡萄糖标准液的制作：用电子天平准确称取1 0 5 c 烘干两小时的葡萄糖 0 2 7 5 0 9 ，用容量瓶以蒸馏水溶解至2 5 0 m l ，制成l m g m l 的葡萄糖标准液，取 上述溶液5 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 m l 于5 0 m l 容量瓶中，稀释定容。取2 m l 配好的 溶液以蒸馏水作参比，分别加入3 m l d n s 试剂在沸水中加热2 0 m i n ，显色，在 5 2 0 r i m 处测定吸光值，以吸光值为y 轴，糖浓度为x 轴得到葡萄糖标准曲线并 计算回归方程删。【6 2 】。 1 6 3 2 3 试验试剂与仪器 仪器：酶标仪、水浴锅、摇床、超净工作台、电磁炉、血球计数板 试剂：刚果红、柠檬酸缓冲液( p h ：5 ) 、醋酸、羧甲基纤维素钠、霍夫曼一 号滤纸、微晶纤维素粉、明胶、无水3 ，5 一二硝基水杨酸、苯酚、n a 0 h 、无水亚 硫酸钠 3 2 4 脱胶后酶的c m c 酶活和f p a 滤纸酶活的测定 c m c 酶活力的测定方法：取0 5 m l 脱胶后的酶液稀释1 0 倍，加入 1 5 m l 0 6 2 5 m g m l c m c 标准液，于5 0 c 保温l k 加