（营养与食品卫生学专业论文）酶水解制备马铃薯多肽的研究.pdf

天津科技大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成 果。除文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包括任何其他个人或集体已经发表或 撰写的成果内容。对本文研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：泖喜钧 日期：a d 年；月l 萝日 专利权声明 本人郑重声明：所呈交的论文涉及的创造性发明的专利权及使用权完全归天津科技 大学所有。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：狮晦罚 日期： 略年弓月m g l t i 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权天 津科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密li ( 请在方框内打“”) ，在 年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密日( 请在方框内打“，) 。 作者签名：旆京罚 日期：留年；月落日 跏鹤：溯乞 醐：时期堋 ， 摘要 本论文以马铃薯蛋白为原料，对几种蛋白水解酶对其水解进行了研究，包括蛋白 酶水解度、水解物游离氨基酸的测定、水解物的苦味评价进行了初步研究。 马铃薯多肽可以通过对马铃薯蛋白的酶水解获得，本论文初步选择2 7 0 9 碱性蛋 白酶、菠萝蛋白酶、植物蛋白水解酶、a l c a s e 蛋白酶、n e u 仃a s e 中性蛋白酶、f l o u r z y m e 蛋白酶六种酶。 经过对蛋白酶的反应时间、反应温度、p h 值、底物浓度、加酶量五个因素的研 究，得到六种酶的最佳工艺条件，分别为： 2 7 0 9 碱性蛋白酶：加酶量( 水解液总量计) 0 0 4 ，p h 值8 o ，温度5 0 ，底物浓 度1 1 ，时间2 h 。此条件下能使马铃薯蛋白的水解度达3 0 9 4 。 菠萝蛋白酶：加酶量( 酶与底物比) 0 8 ，p h 值6 0 ，温度5 0 ，底物浓度8 ， 时间4 h 。此条件下能使马铃薯蛋白的水解度达2 6 0 0 。 植物蛋白水解酶：加酶量( 酶与底物比) 0 3 ，p h 值6 0 ，温度5 0 ，底物浓度 9 ，时间4 h 。此条件下能使马铃薯蛋白的水解度达4 0 4 0 。 a l c a s e 蛋白酶：加酶量1 4m l ，p h 值6 5 ，温度5 5 ，底物浓度1 0 ，时间6 h 。 此条件下能使马铃薯蛋白的水解度达4 7 0 2 。 n e u t r a s e 中性蛋白酶：加酶量4 5 m l ，p h 值4 5 ，温度4 0 ，底物浓度4 ，时 间4 h 。此条件下能使马铃薯蛋白的水解度达4 1 5 2 。 f l o u r z y m e 蛋白酶：加酶量1 3m l ，p h 值5 5 ，温度5 0 ，底物浓度1 1 ，时间 4 h 。此条件下能使马铃薯蛋白的水解度达4 8 7 9 。 本论文还对水解物中游离氨基酸总量以及水解物的苦味值进行了分析。 关键词：马铃薯蛋白；蛋白酶；水解；肽；水解度；游离氨基酸；苦味值 a b s t r a c t i np r e s e n ts t u d y ，p o t a t op r o t e i nw a su t i l i z e da st h er a wm a t e r i a lt oi n v e s t i g a t et h e e n z y m a t i ch y d r o l y z a t i o nb yu s i n gd i f f e r e n te n z y m e s t h eo p t i m a lp r o t e a s ew a sc h o o s e db y t h ed e g r e eo fh y d r o l y s i s ，d i s s o l v e df r e e2 k r n i n oa c i d sa n db i t t e rv a l u e p o t a t op o l y p e p t i d e sc a l lb eg a i n e db yh y d r o l y z i n gp o t a t op r o t e i n d i f f e r e n te n z y m e s w o u l dh a v ed i f f e r e n td e g r e eo fh y d r o l y s i s p r i m a r y ，c h o o s e ds i xe n z y m e s ：t h e2 7 0 9 a l k a l e s c e n c ep r o t e a s e ，t h eb r o m e l a i n ，t h ep l a n tp r o t e a s e ，t h ea l c a s ep r o t e a s e ，t h en e u t r a s e p r o t e a s e 、t h ef l o u r z y m ep r o t e a s e i nt h i st h e s i s ，t h eb e s tc o n d i t i o no fh y d r o l y z eb yt h ei n v e s t i g a t i o no ft h eh y d r o l y s i s t i m e ；t h et e m p e r a t u r eo ft h er e a c t i o n ；t h es u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n ；t h er a t i oo fe n e z y m ea n d s u b s t r a t e ；p h t h er e s u l t sa sf o l l o w s ： t h e2 7 0 9a l k a l e s c e n c ep r o t e a s e ：t h er a t i oo fe n e z y m ea n ds u b s t r a t e ：0 0 4 ，p h ：8 0 ，t h e t e m p e r a t u r eo ft h er e a c t i o n ：5 0 。c t h es u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n ：11 , t h eh y d r o l y s i st i m e ：2 h t h eb e s tc o n d i t i o no ft h ed e g r e eo fh y d r o l y s i sc a nb ec o m et o3 0 9 4 t h eb r o m e l a i n ：t h er a t i oo fe n e z y m ea n ds u b s t r a t e ：0 8 ，p h ：6 0 ，t h et e m p e r a t u r eo f t h er e a c t i o n ：5 0 c ，t h es u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n ：8 , t h eh y d r o l y s i st i m e ：4 h t h eb e s tc o n d i t i o n o ft h ed e g r e eo fh y d r o l y s i sc a l lb ec o m et o2 6 0 0 t h ep l a n tp r o t e a s e ：t h er a t i oo fe n e z y m ea n ds u b s t r a t e ：0 3 ，p h ：6 0 ，t h et e m p e r a t u r eo f t h er e a c t i o n ：5 0 。c ，t h es u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n ：9 ，t h eh y d r o l y s i st i m e ：4 h t h eb e s tc o n d i t i o n o ft h ed e g r e eo fh y d r o l y s i sc a nb ec o m et o4 0 4 0 t h ea l c a s ep r o t e a s e ：t h er a t i oo fe n e z y m ea n ds u b s t r a t e ：1 4 m l ，p h ：6 5 ，t h et e m p e r a t u r e o ft h er e a c t i o n ：5 5 ，t h es u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n ：10 ，t h eh y d r o l y s i st i m e 6 h t h eb e s t c o n d i t i o no ft h ed e g r e eo fh y d r o l y s i sc a nb ec o m et 0 4 7 0 2 t h en e u t r a s e p r o t e a s e ：t h e r a t i oo fe n e z y m ea n d s u b s t r a t e ：4 5 m l ，p h ：4 5 ，t h e t e m p e r a t u r eo ft h er e a c t i o n ：4 0 。c ，t h es u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n ：4 ，t h eh y d r o l y s i st i m e 4 h t h e b e s tc o n d i t i o no ft h ed e g r e eo fh y d r o l y s i sc a nb ec o m et o41 5 2 t h ef l o u r z y m ep r o t e a s e ：t h er a t i oo fe n e z y m ea n ds u b s t r a t e ：1 3m l ，p h ：5 5 ，t h e t e m p e r a t u r eo ft h er e a c t i o n ：5 0 ，t h es u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n ：1 1 ，t h eh y d r o l y s i s t i m e 4 h t h eb e s tc o n d i t i o no ft h ed e g r e eo fh y d r o l y s i sc a nb ec o m et o4 8 7 9 t h et h e s i sh a da n a l y s e dd i s s o l v e df r e ea m i n oa c i d sa n dt h eb i t t e rv a l u e k e y w o r d s ：p o t a t op r o t e i n ，p r o t e a s e ，p o t a t op o l y p e p t i d e s ，d e g r e eo f h y d r o l y s i s ，d i s s o l v e d f r e ea m i n oa c i d s ，b i t t e rv a l u e 目录 l 前言1 一 1 日u 茜 1 1 马铃薯概述1 1 1 2 马铃薯蛋白的研究历史、现状l 1 1 3 马铃薯的营养成分分析2 1 1 4 国外马铃薯在食品工业中的应用4 1 1 5 马铃薯蛋白的前景：4 1 ：! 酶z i 1 2 1 酶的概述4 1 2 2 酶的化学本质4 1 2 3 水解酶5 1 2 4 酶的催化剂特性5 1 2 5 影响酶促反应的因素5 1 3 肽的研究。7 1 3 1 肽的基本概述7 1 3 2 肽的生产7 1 3 3 肽的特性及其应用8 1 3 4 多肽的保健作用一8 1 4 苦味机理9 1 4 1 苦味机理的一般性叙述9 1 4 2 多肽苦味的特殊性1 2 1 5 本论文研究意义1 6 1 6 本论文主要研究内容1 7 2 材料与方法。1 8 2 1 材料18 2 1 1 原料与主要试剂1 8 2 1 2 仪器与设备1 9 2 2 实验方法1 9 2 2 1 酶活力的测定方法19 2 2 2 蛋白质含量的测定一2 1 2 2 3d h 值( 水解度) 测定方法j 2 l 2 2 4 氨基酸态氮的测定一2 1 2 2 5 蛋白质水解工艺优化实验一2 2 2 2 6 游离氨基酸总量的测定2 3 2 2 7 苦味评价2 4 3 结果与讨论2 5 3 1 马铃薯蛋白含量测定2 5 3 2 蛋白酶的酶活测定2 5 3 2 1 标准曲线的建立2 5 3 2 2 酶活力的测定2 5 3 3 马铃薯蛋白的键摩尔数的计算2 6 3 4 马铃薯蛋白酶水解工艺的确定2 6 3 4 12 7 0 9 碱性蛋白酶的水解工艺研究2 6 3 4 2 植物蛋白酶的水解工艺研究3l 3 4 3 菠萝蛋白酶的水解工艺研究3 5 3 4 4a l c a l s e 酶的水解工艺研究3 9 3 4 5f l a v o u r z y m e 酶的水解工艺研究4 3 3 4 6n e u t r a s e 酶的水解工艺研究4 7 3 5 游离氨基酸含量的测定5 l 3 5 1 游离氨基酸标准曲线5 l 3 5 2 六种蛋白酶在最佳条件下水解物的游离氨基酸含量5 l 3 5 - 3 六种蛋白酶水解物的苦味评价5 2 4 结论5 3 4 1 六种酶的最佳工艺条件。5 3 4 2 水解物中游离氨基酸总量o 。5 3 4 3 水解物的苦味值5 3 5展望5 4 6 参考文献_ 。5 5 7 攻读硕士期间论文发表情况6 0 8 致谢6 1 天津科技人学硕上学位论文 1 前言 1 1 马铃薯概述 马铃薯( s o l a n u mt u b e r o s u m ) 是茄科茄属一年生草本。又名土豆、山药、洋芋、洋 番薯等，其营养价值十分丰富，具有多种食疗保健作用。马铃薯在众多国家受到青睐。 意大利人叫“地豆”，德国人叫“地梨”，美国人叫“爱尔兰薯”，法国人叫“地下苹果”。 它是世界五大粮食作物之一，其年产3 0 x 1 0 8 t 左右，为此，一些国家称其为“植物之王” i l 】 o 我国种植面积约4 0 0 0 x l o 2 ，年产量5 5 0 0 1 0 4 t ，是仅次于前苏联的第二生产大 国，它含有多种化学成分，具有很高的营养价值。马铃薯块茎可供食用，是重要的粮 食、蔬菜兼用作物。有的学者认为马铃薯共有7 个栽培种，主要分布在南美洲的安第 斯山脉及其附近沿海一带的温带和亚热带地区。最重要的马铃薯栽培种是四倍体种。 四倍体栽培种马铃薯向世界各地传播，最初是于1 5 7 0 年从南美的哥伦比亚将短日照 类型引入欧洲的西班牙，经人工选择，成为长日照类型，后又传播到亚洲、北美、非 洲南部和澳大利亚等地。马铃薯产量高，营养丰富，对环境的适应性较强，现已遍布 世界各地，热带和亚热带国家甚至在冬季或凉爽季节也可栽培并获得较高产量。普通 栽培马铃薯的块茎繁殖生长形态因品种而异。株高约5 0 c m - - - 一8 0c m 。茎分地上茎和地 下茎两部分。块茎圆、卵圆或长圆形。薯皮的颜色为白、黄、粉红、红或紫色；薯肉 为白、淡黄或黄色。由种子长成的植株形成细长的主根和分枝的侧根；而由块茎繁殖 的植株则无主根，只形成须根系。初生叶为单叶，全缘。随植株的生长，逐渐形成羽 状复叶：聚伞花序顶生，有白、淡蓝、紫和淡红等色【2 】。 马铃薯传入中国已有3 5 0 多年历史，中国是世界马铃薯生产大国，年产量约 6 0 0 0 x 1 0 4 t ，居世界前列。现在主要产区在东北的中北部、华北西部、内蒙和西北及西 南各省山区。四川、黑龙江、云南、山西、甘肃、贵州、湖北、内蒙等地产量较高【2 】。 1 1 2 马铃薯蛋白的研究历史、现状 马铃薯蛋白质具有较高的营养价值。尽管蛋氨酸和异亮氨酸是限制氨基酸，但因 其赖氨酸含量高而与谷物蛋白营养互补：马铃薯蛋白的必需氨基酸平衡优于其它植物 蛋白，与全鸡蛋和酪蛋白相当；其蛋白质的功效比值( p e r ) 达到2 3 。玉米蛋白的p e r 只有1 4 3 、大米1 7 6 、面粉0 7 7 、大豆1 3 1 9 。维持人体氮平衡实验证明马铃薯 蛋白优于其它作物蛋白。a c k a p o o r 等报道球蛋白占马铃薯蛋白的7 l ，而用同样 的分离方法从清蛋白中只得到4 0 的球蛋白。有报道比较了马铃薯全蛋白粉、h c l 沉 淀蛋白，f c c l 3 沉淀蛋白、大豆分离蛋白以及酪蛋白的溶解度、乳化力和起泡力。结 果得出上述各种蛋白制品中蛋白质在p h8 0 时的溶解度分别为7 0 、2 7 、6 5 、 9 7 和9 0 ；马铃薯全蛋白粉的乳化力和起泡力与大豆分离蛋白相当。另外，日本 i 前苦 的考斯摩食品公司利用北海道产马铃薯为原料生产了马铃薯蛋白产品，并用其开发了 氨基酸含量丰富的优质调味料新品“菠台米克”，上市后反映相当不错。该产品可于低 温下使用，在增强食品风味的同时，能产生马铃薯味道，强化氨基酸，其用途丰富多 样。调味料产品“波台米克”是仅用马铃薯种原料制成的马铃薯蛋白质产品。制造过程 为：马铃薯蛋白质经过酸水解后，进行脱色、脱铁和电渗析，将盐分除去到极限，然 后用喷雾干燥法得到多种氨基酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、赖氨酸和谷氨酸、天门 冬氨酸等。与市场上销售的脱脂大豆h v p 和小麦蛋白h v p 相比较，氨基酸组成丰 富许多。w m j v a ng e l d e r t 3 l 用马铃薯蛋白质分析的总氨基酸和氨的数据用于评定氮 一蛋白质转换系数，从3 4 种多样的混合蛋白质来看，得出的系数为6 2 4 ，非常接近 于马铃薯蛋白质6 2 5 的试验系数。据报道s o s 显色试验和a m e s 试验发现甘薯粘蛋 白具有显著的抗突变作用，并对一月龄昆明种小白鼠的特异性细胞免疫( 迟发型过敏 反应) 、非特异性免疫( 巨噬细胞吞噬作用) 和体液免疫( 溶血素含量、对胸腺的增 重) 均有增强作用。此外研究还表明，薯粘蛋白还有较明显的降血脂作用。因而近年 来欧美和同本纷纷开始从马铃薯中提取药物的研究，掀起了一场马铃薯利用的新热 潮。 1 1 3 马铃薯的营养成分分析 马铃薯的块茎中含有大量的碳水化合物，含量为1 6 5 ，其中大部分为淀粉，并 含有少量的非淀粉性多糖、蔗糖、还原糖等。马铃薯是人类获得碳水化合物的一个重 要来源。 马铃薯的块茎中的蛋白质的含量为2 o ，若以无水物计算，则为9 8 ，高于稻 米中蛋白质的含量( 8 9 ) 。马铃薯的蛋白质中含有人体需要但体内又不能合成的亮 氨酸、赖氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、色氨酸、蛋氨酸等八种必须 氨基酸，这些氨基酸的含量和比例符合人体的需要，因此马铃薯的蛋白质有很高的营 养价值。马铃薯蛋白质含有大量的粘体蛋白质，粘体蛋白质是一种多糖蛋白的混合物， 能预防心血管系统由于脂肪沉积引起的多种疾病。 马铃薯的块茎中维生素的含量很丰富，可与蔬菜、水果媲美。每1 0 0 克中含v c 2 7 毫克，是芹菜的3 4 倍、番茄的1 4 倍、节果的6 8 倍，每1 0 0 克中维生素b 1 0 0 8 毫 克、维生素b 2 0 0 4 毫克、维生素e o 3 4 毫克、胡萝i - 素3 0 毫克，其中b l 的含量居常 用蔬菜之冠。 马铃薯的块茎中含有多种矿物质，每1 0 0 克中含钙8 毫克、铁0 8 毫克、锌0 3 7 毫克、磷4 0 毫克，还含有硒、钾、钠、镁等元素。 马铃薯不仅是我国的主要粮食、蔬菜兼用的事物，家畜家禽良好饲料，而且在工 业中可制作各类食品，也是生产食醋、葡萄糖、结晶果糖、麦芽糖、单细胞蛋白、柠 檬酸、乳酸、葡萄糖内脂等多种产品的原料。 以马铃薯为原料的新兴食品工业，在国外十分普及，产品如马铃薯全粉、马铃薯 2 天津科技大学硕士学位论文 饮料、马铃薯香肠、马铃薯面包、马铃薯奶、马铃薯饼干、马铃薯浓汤、油炸马铃薯 片等。这些食品味美可口，营养全面而丰富，市场前景十分广阔【4 1 。 表卜1 马铃薯与其它粮食的营养成分比较( 每百克含量) 【5 】 t a b l e1 - 1t h e e o m p a r a t i v i t yo f t h en u t r i t i o n i np o t a t oa n do t h e rf o o d s t u f f 营养成鲜兰铃 大米 标堂面 小米玉米面荞麦面莜麦面黄豆黑豆 分薯 粉 蛋白质 2 o7 41 1 29 08 19 31 2 2 1 6 3 6 1 ( g ) 脂肪g 0 20 81 53 13 3 2 37 21 5 51 5 9 碳水化 合g 能量 i ( j 膳食纤 维g 1 6 57 7 27 1 57 3 56 9 66 6 5 6 7 81 8 62 3 3 3 1 8 11 4 4 8 41 4 4 0 01 4 9 8 61 4 2 3 21 3 5 6 3 1 6 1 1 61 5 0 2 81 5 9 4 9 o 7o 72 11 65 6 6 501 5 51 3 7 7 0 钾m g 3 4 2 1 0 31 9 02 8 42 4 94 0 13 1 902 5 钙m g 8 24 72 71 8 3 52 2 4 磷m g 4 01 1 0 1 8 82 2 91 9 62 9 73 52 8 5 55 0 0 铁m g 0 8 胡萝卜 o 0 3 素m g 维生素 0 0 4 b ( 峭 维生素 o 0 8 b l x g 尼克酸 1 1 烬 维生c 2 7 烬 2 33 55 13 26 21 3 65 5 07 0 o0o 1 00 0 40 0 2o 2 22 0 00 0 3 0 0 5o 0 8o 1 00 0 90 1 60 2 03 9 50 3 3 o 1 lo 2 80 3 30 2 60 2 80 4 l1 2 50 2 0 1 92 01 52 32 22 11 o2 0 0o o0oo00 3 1 前言 1 1 4 国外马铃薯在食品工业中的应用 近2 0 年来，国外对马铃薯的开发利用，以加工马铃薯食品和开发马铃薯淀粉多 提经利用为主：( 1 ) 方便食品、快餐食品、方便面半成品，如蒸米，脱水马铃薯薯片， 马铃薯全粉，马铃薯面包，马铃薯方便面和薯糕；( 2 ) 消闲食品，这种食品具有方便 卫生、美味、食用方便、包装精美等特点，如马铃薯脆片、马铃薯果脯等；( 3 ) 马铃 薯饮料；( 4 ) 马铃薯提取淀粉后的渣滓用于酿酒，制马铃薯发酵饲料，单细胞蛋白等 或者直接用鲜薯酿酒；( 5 ) 传统油炸土豆片等产品，风味、色泽、口感等得到了改善， 包装质量大大提高，马铃薯在食品工业中得到了更广泛的应用【6 】。 1 1 5 马铃薯蛋白的前景 马铃薯是粮、菜、饲料及工业原料兼用型高产高效作物。马铃薯适应性强，已成 为我国第四大粮食作物，我国马铃薯种植面积年均增长约4 5 ，居世界前列。据国际 食品政策中心和国际马铃薯预测，在未来2 0 年中，全世界对马铃薯需求的增长有望达 到4 0 ，超过对水稻、小麦和玉米的需求【7 】。 1 2 酶 1 2 1 酶的概述 酶是一种特殊的催化剂。在适宜的条件下，酶催化反应的速度不是一般的化学催 化剂可以比拟的，有时其至是无法想象的。所以，酶应用领域的工作者必须掌握酶的 微生物特性，只有把工艺和酶学特性有机地结合起来，组成既有利于酶作用的条件， 又有利于生产设备要求的体系，才能使酶催化反应迅速、高效地进行，获得更高的经 济效益。 酶是一种由活细胞产生的生物催化剂，是一种蛋白质，在生物体的新陈代谢中起 着非常重要的作用。它参与生物体大部分的化学反应，使反应有控制地、有秩序地进 行，从而使新陈代谢进行下去。 尽管人们在很久以前就有将活生物体提取的物质( 当时还不存在酶的概念) 应用于 日常生活中的例子，但酶学作为一门科学还只起始于1 9 世纪，尤其在最近5 0 年中取 得了飞速发展。与此同时，酶制剂工业也有了同样的发展。酶的工业化制剂称为酶制 剂，目前它正被广泛应用于食品、酿造、纺织、制革、医学、日化等方面。 1 2 2 酶的化学本质 ( 1 ) 酶是高分子的胶体物质，且是两性电解质，酶在电场中能像其他蛋白质一 样泳动，酶的活性p h 曲线和两性离子的解离曲线相似。 ( 2 ) 紫外线、热、表面活性剂、重金属盐以及酸碱变性剂等能使蛋白质变性的 因素，往往也能使酶失效。 ( 3 ) 酶本身能被水解分解而丧失活性。 ( 4 ) 对现在所能供的高度纯化和结晶的酶进行组分分析表明，酶或者是单纯的 4 天津科技大学硕士学位论文 蛋白质，或者是蛋白质与小分子组成的络合物。t ( 5 ) 人们已于1 9 6 9 年第一次从氨基酸人工合成了具有比活性的酶【8 l 。 1 2 3 水解酶 此类酶使化大分子物质加水分解成为小分子物质 这类酶大都属于细胞外酶。在牛体内分布最广，数量也最多，应用最广泛。如今 工业中已经应用的酶中多数为水解酶类，例如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、核 糖核酸酶及纤维素酶等【s l 。 1 2 4 酶的催化剂特性 ( 1 ) 高效性 酶催化反应可以在常温常压和温和的酸碱度下，高效地进行。1 个酶分子在l m i n 内能引起数百万个底物分子转化为产物。 ( 2 ) 专一性 酶对作用底物有严格的专一性。一般地说，酶具有两方面的专一性，一方面是对 被作用的反应物是专一的；另一方面是对于被催化的反应是专一的。一种酶通常只催 化特定的底物进行特定的反应，不同的酶其专一程度颇不相同。一种酶只作用于一种 底物，这叫作绝对专一性。还有一些酶仅仅催化一种类型的反应，而不管作用键的两 边邻近基团的性质如何，就是说他对于被催化的反应是专一的，叫作反应专一性。 1 2 5 影响酶促反应的因素 酶在催化反应中本能改变反应的平衡，但可以加快反应速度。要想在实际生产中 最好地用好酶，让其发挥最大的作用，达到比较小的成本也能生产出同样价值量的产 品，必须对影响酶促反应的主要因素有充分而准确的认识。 影响酶促反应的它要因素有：底物浓度、酶浓度、激活剂抑制剂、温度、p h 值等。 ( 1 ) 底物浓度的影响 在反应一开始时，也就是初速度时，米氏方程可以简化为： u ：旦【s 】 ( 1 1 )= is lll ij k m 。 即初速度与底物浓度成正比，当反应速度慢慢加快时，米氏方程可以简化为下列 形式：u = v 此时，速度不再随底物浓度而变化。食品工业中，为了节省成本，缩短时间，一 般以过量的底物在短时间内达到最大的反应速度。 ( 2 ) 酶浓度对反应速度的影响 在酶促反应中，根据中间产物学说，催化反应可分两步进反应式如下： e 十s = e s p 十s ( 1 - 2 ) e 一酶s 底物e s 一中间产物p ，s 最终产物 l 前言 酶促反应的速度是以反应产物p 的生成速度来表示。根据质量守恒定律，产物p 的生成决定于中间产物e s 的浓度。e s 的浓度越高，反应速度也就越快。 在底物大量存在时，形成中间产物的量就取决于酶的浓度。酶分子愈多，则底物 转化为产物也就相应地增加，这就意味着底物的有效转化随着酶浓度的增加而成直线 地增加。如 v = 型：k f e l ( 1 - 3 ) 衍 。 式中v - 一反应运度 【e 】酶浓度 k - 一速度常数 【s 】底物浓度 卜- 时间 生产中底物浓度一般是过量的，所以反应速度取决于酶浓度，而酶的实际使用量 又是同发酵工艺的制订及生产效益结合起来考虑的，一般应根据具体情况而定【引。 ( 3 ) 温度对酶反应的影响 。 温度对酶的影响是两个方面的： 合适的温度可加速催化反应 一般而言，温度每升高1 0 ，反应速度相应地增加l 2 倍。温度对酶反应速度的影 响通常用温度系数q l o 来表示： q - o - = 型瓮篇铲 ( 4 ， 当温度升高到酶的变性温度时，完成酶的变性过程 在较高的温度下，酶的变性和酶反应的速度将一样快，而且此种变性是不可逆的。 酶在低温下只是催化反应速度慢，甚至慢到不易察觉。但决不是不会作用。所以一般 可以用低温冷藏技术来保存酶制剂，因为低温下酶的变性极小。在实际生产过程中， 酶制剂的作用温度是酶的最适温度及最佳经济效益的统一【9 】。 ( 4 ) p h 的影响 p h 值对酶活力的影响是很大的，一些酶有一个很宽的最适p h 范围，而另一些则 很窄。酶的稳定性也受p h 的影响。甚至局部的p h 变化也会对两反应影响很大。酶对 p h 的敏感程度比对温度还要高，一般在较低温度下。酶的活性小，在高温时，也会 有一些瞬间活性。但对p h 而言，当溶液p h 不是酶适用范围之内时，便可以使酶丧 失全部活力。所以生产中应严格控制p h ，在有必要调整p h 时，必须事先调好p h ， 再加入酶，否则酶作用肯定不好。这是使用时关键的一点【i o l 。 综上所述，温度、p h 对酶的变性是不可逆的，即高温及不适合的p h ，使酶变性 而不可能再恢复活性，而金属离子使酶的变性反应有时是不可逆的。所以在试验中尤 其要注意控制p h 及温度，使酶处于合适的作用环境。 6 天津科技大学硕士学位论文 1 3 肽的研究 1 3 1 肽的基本概述 蛋白质的加工在我国具有悠久历史，其制品已成为人们日常生活中的必需品。 所有生物的蛋白质都是由2 0 种蛋白质氨基酸组成，氨基酸彼此以酰胺键( 也称 肽键) 相互连接成为“肽”，它们与氨基酸一起构成了千姿百态的蛋白质世界。一般少 于1 0 个氨基酸的肽被称为寡肽，超过1 0 个氨基酸的称为多肽，但两者术语的介定并 不严格。氨基酸为5 0 多个以上的多肽称为蛋白质。多肽和蛋白质只有肽链长短之别， 二者间没有严格区分j 。 肽基蛋白水解物，因蛋白水解物中富含肽，故称肽基蛋白水解物 ( p e p t i d e - b a s e d p r o t e i nh y d r o l y s a t e ) 或简称“肽”。较之相同组成氨基酸及其母本蛋白 ( p a r e n tp r o t e i n ) ，具有许多独特的理化特性与生物活性，如起泡性、粘度、胶凝性、乳 化性等功能。随着新型加工技术的应用及人们对“肽”的认识进一步加深，肽的研究成 为近十年来的热剧1 2 j 。 1 3 2 肽的生产 蛋白质水解物生产方式多种多样，包括化学法、生物法与合成法，其中化学法是 利用酸碱水解蛋白。但反应条件剧烈，破坏了氨基酸原有构型，产生了有毒物质1 1 3 j 已处于被淘汰边缘。与酸水解和碱水解比较，酶法水解蛋白质具有多种优点【1 4 , 1 5 j 蛋白 质的酶水解是一种不完全、不彻底的水解，其产物主要是肽而不是氨基酸。反应条件 温和，反应时间短，效率高，不产生消旋作用，也不破坏氨基酸，产品纯度高，产物 易分离，成本低。而通过基因工程、化学合成的方法生产生物活性肽需要相当大的投 入，且其安全性还需要进行研究【1 6 1 。因此酶法水解蛋白质制备活性肽是目前生产活性 肽的主要方法。反应产物与原料蛋白、相同组成的氨基酸相比具有特殊的理化性能与 生理功能，所以肽基蛋白水解物成为蛋白制品的发展方向。 生物方法生产肽类制品时，底物的选择主要是基于蛋白的营养价值、成本、口感、 抗原性、溶解性和功能性，目前较常用的原料包括酪蛋白、乳清蛋白及大豆蛋白【1 7 j 。 尽管低纯度蛋白制品价格相对便宜，但产品风味差。为提高产品转化率和底物原料利 用率，底物的预处理必不可少。常用方法包括高压和高温处理。高温处理具有方法简 便投资少、蛋白变性不易回复的优点f 1 8 1 。 酶是决定底物利用率、产品性能的又一主要因素，内肽酶可以降低产品中游离氨 基酸的相对含量，外肽酶能选择作用于疏水性氨基酸，去掉或减轻产物中的苦味；为 提高底物转化率，较好的方法是内肽酶和外肽酶混合使用，当然还要考虑酶的安全性、 经济性与有效性【1 9 j 。 水解方式的选择也对水解产物得率有较大影响。蛋白水解通常使用间歇式方法1 2 0 j 该法具有产量低、劳动强度大、生产效率低、生产成本高等诸多不足【2 。连续搅拌罐 膜反应器( c s t m r ) 则克服了这些不足。与其它形式反应器相比，c s t m r 体系具有 7 1 前言 如下优点：保持了酶的可溶性状态，利于酶的作用：产品性能均一，无批次间的差异； 产物转化率高，酶可循环使用，产品成本低；易于控制产品的分子组成：操作连续， 自动化程度高，劳动强度小。c s t m r 体系亦有不足：反应底物浓度低，产物浓度亦 相对较低。这是该体系不可避免的，否则，反应底物浓度高不利于产物转化率的提高 即体系的长时间稳定运行圈。 1 3 3 肽的特性及其应用 研究发现，肽与蛋白质相比，具有良好的溶解性、低粘度、抗凝胶形成性，低分 子肽不会产生过敏反应等优点。除此之外，还具有众多的生理活性，如促进发酵、抗 氧化、降血压、降胆固醇、抗疲劳、促进乙醇代谢等活性1 2 3 2 4 过去，科学家一直对利 用贮藏蛋白如大豆、玉米、小麦等种子蛋白和动物营养蛋白及乳蛋白水解制备生物活 性肽给予应有的重视。随着科学的发展与进步，科学家逐渐注意到：在营养蛋白的多 肽链内部可能普遍存在着功能区，选择适当的蛋白酶水解这些多肽，有可能将其释放 出来，从而制备各种各样的生物活性肽，为能生产出更好满足人类保健需要的食品基 料提供了新的机遇【2 5 】。 1 3 4 多肽的保健作用 ( 1 ) 降低血清胆固醇 日本学者营野等人【2 6 】通过实验发现，大豆多肽中，相对分子量在5 0 0 0 d a 以上的 部分有降低胆固醇的作用。多肽通过刺激体内甲状腺激素的分泌量增加，促进胆固醉 的胆汁酸化，从而阻碍肠道内胆固醇的再吸收并促使其排出体外。多肽降低血清胆固 醇具有其独特的特点：对于胆固醇正常的人无降低作用；对高胆固醇者有明确的降低作 用，并且是使对人体有害的低密度胆固醉值降低鲫。 ( 2 ) 降血压作用 血管紧张转化酶( a c e ) 在人体血压调节过程中是至关重要的【2 8 】。血浆中的血管紧 张素原被肾素水解成血管紧张素i ，在a c e 酶作用下，继续水解产生血管紧张素i i 。 血管紧张素i i 致使血管强烈收缩，血压上升。大豆蛋白经特殊的酶水解后得到的多肽 可以抑制阻碍a c e 酶催化水解血管紧张素i 成为血管紧张素i i ，从而防止血管强烈收 缩，降低了血压【2 引。因此，多肽可以作为保健食品的功能性成分添加到食品中，开发 出具有高蛋白含量的老年保健食品，对老年人的高血压、高胆固醉、心脑血管疾病达 到很好的预防和治疗作用。 ( 3 ) 迅速的使人恢复疲劳并提高耐力 有关报道【2 9 】表明，要使运动员体能增加就要使运动员肌肉量增加，就必须由适当 的运动刺激和充分的蛋白质补充。通常，刺激蛋白质合成的成长激素的分泌在运动后 1 5 3 0 m i n 之间以及睡眠后6 0 m i n 时达到顶峰，若能在这段时间内适时提供消化吸收 良好的多肽作肌肉蛋白质的原料将是非常有效的【3 0 l 。小分子的多肽类比蛋白质和氨基 酸更容易吸收。因此，多肽可以添加到运动员食品或饮料中促进脂肪代谢，较快的将 8 天津科技大学硕士学位论文 脂肪转化为能量，及时补充机体所需能量，还可以在运动时迅速的为肌肉提供充足的 蛋白质，使体力得到及时的恢复和增强【3 。 ( 4 ) 抗血栓形成 血栓形成是由于纤维蛋白原参与的结果，纤维蛋白原既参与血小板的凝固，又参 与纤维蛋白的形成，血纤维蛋白原r - 链c 末端h i s h i s l e u - g l y - g l y - a l a _ l y s g i n a l a - a s p v a l 片段与a r g g l y a s p s e r p h e 片段，这两种肽都能抑制血小板的凝集和纤 维蛋白原结合到a d p 活化的血小板上1 3 2 1 。大豆蛋白水解物中含9 肽m e t a l a - h i s p 胁 p r o l y s a s n - a s p - l y s 能有效地抑制a d p 诱导的血小板凝集。大豆多肽经小肠吸收进 入血液，能对血小板的凝集、对纤维蛋白原与活化的血小板结合起到抑制作用，从而 对人体起到健康保护作用【3 3 1 。 ( 5 ) 促进金属离子的吸收 人体吸收钙、磷等离子时必须在小肠粘膜上处于溶解状态才能有效地被人体吸 收。人体内存在p h 梯度，特别是处于吸收段的小肠环境p h 为碱性，使得钙易与磷 酸形成不溶性盐，从而大大降低了钙的吸收，在这种状态下通常人体只能吸收 3 0 - 5 0 ，从而导致d , j l 、老年、孕妇等敏感人群普遍缺钙，目前由此引发的少年缺 钙、老年骨质疏松已成为社会关注的焦点问题【3 4 l 。多肽可以与金属离子形成鳌合物， 保证其可溶状态，有效地防止了不溶性磷酸钙形成，大大促进了体对钙磷物质及微量 元素的吸收。张智【3 6 】等报道大豆肽可用于补钙产品促进钙的吸收。多肽具有和钙及其 它微量元素有效结合的活性基团，可以形成有机钙多肽络合物，大大促进钙的吸收。 目前，补钙制剂主要是乳酸钙，但吸收率并不高。而大豆肽和钙形成的络合物其溶解 性、吸收率和输送速度都明显地提高。大豆肽也可以添加到普通食品中，使人在日常 膳食中即可达到补钙的目的。此外，多肽还可以与铁、硒、锌等多种微量元素结合， 形成有机金属络合肽，是微量元素吸收和输送的很好载体【3 7 1 。 ( 6 ) 调节免疫功能 最早证实多肽的免疫刺激作用是从人乳蛋白中获得的肽类，免疫刺激肽就是从人 乳的酶解产物中分离得到的一类具有刺激吞噬细胞功能的肽。大豆蛋白经酶解或微生 物水解法可以得到l e u l e u t y r 和t y r - t y r - m e t p r o l e u t y r ，只要极低剂量( o 1 u m ) 就 可以通