（化学工程专业论文）脂肪酶催化酯合成的研究.pdf

摘要 在生物体中，脂肪酶催化甘油脂水解生成脂肪酸和甘油的反应。但在特定的 条件下，脂肪酶也能催化酯化、转脂、酰胺化等反应。近年来，脂肪酶在生物化 工领域的应用得到深入的研究，特别是8 0 年代以来，随着非水相酶催化反应方 法的建立，脂肪酶的非水相催化反应更是成为生物技术领域的研究热点，并且在 工业生产中得到了应用。 脂肪酶在非水溶剂中发挥催化作用有许多优点，但同时依然有一些关键技术 需要继续深入研究。以脂肪酶在非水相催化酯合成反应为例，水在反应过程中起 着重要作用：对酶的活性、稳定性以及反应的平衡点都有影响，微量的水是维持 酶活性所必需的，但是太多的水又会降低酶的活性和稳定性，还使反应平衡点朝 向酯水解方向移动。 因此，在非水相酶催化反应中，特别是在非水相脂肪酶催化酯合成反应中， 需要建立有效控制( 除去) 反应体系的水分的方法。现在，已经有许多方法用于 除去脂肪酶催化酯合成反应生成的水分，比如加入分子筛等吸水剂，或者用渗透 蒸发的物理手段。但是，如何有效的控制反应体系的水活度，如何有效地除去反 应过程中不断产生的水分，以及如何在除水的同时保证反应的连续操作性能、维 持酶的稳定性等问题依然没有得到很好解决。 在本论文中，我们提出了一种新的方法，用可截留盐的反渗析膜以及吸水性 的盐( 溶液) 可以将反应体系控制在稳定的水活度，有效的除去酯化反应生成的 水分。采用这种方法后，不仅酯化速率加快，而且酯转化率可以接近1 0 0 。另 外，这种方法还易于实现连续操作，有利于工业规模生产。 有许多脂肪酶已经实现商品化生产，并且很多已经用于工业催化。在本论文 研究中，考虑到酶的价格和来源，我们选择了国产的解脂假丝酵母脂肪酶( c l l ) 用于催化合成目标产物己酸乙酯。 由于游离酶稳定性差、不利于连续操作，因此，我们将c l l 吸附固定在一种 聚苯乙烯大孔疏水性树脂上。通过选择合适的固定化工艺，获得的固定化酶活性 为游离酶的2 4 5 倍，而且稳定性也得到提高。 另外，本论文还对c l l 的性质、表面活性剂对c l l 酯合成能力的促进作用以 及筛选反应溶剂方面作了初步研究。 关键词：脂肪酶，c l l ，酯合成，非水相，己酸乙酯，水活度 a bstr a ct i nn a t u r e ，l i p a s e sc a t a l y z eh y d r o l y s i so ft r i g l y c e r i d e st of a t t ya c i d sa n dg l y c e r 0 1 帅i l e u n d e rs p e c i a l c o n d i t i o n s ，l i p a s e s a l s o c a t a l y t i e r e a c t i o n si n v ol v i n g e s t e r i f i c a t i o r t , t r a n s e s t e r i f i c a t i o n a m i d a t i o r t , a n ds of o r t h 。d u r i n gr e c e n ty e a r s ，t h e b i o t e c h n o l o g i c a lu s eo fl i p a s e si nn o n a q u e o u sm e d i ah a sb e c o m eac o m m o na p p r o a c h i ni n d u s t r i a la p p l i c a t i o n s i ti sw e l lk n o w nt h a tl i p a s ee x h i b i tah i g hc a t a l y t i ca c t i v i t yi nw a t e r - r e s t r i c t e d e n v i r o n m e n t s a n de 筋r t st oi m p r o v eu p a s e sc a t a l ) j r z e db i o t r a n s f o r m a t i o n si nt h e s e m e d i aa r ew a r r a n t e da n dd e s k a b l e g e n e r a l l y ，w a t e ra c t i v i t y i so fv i t a li m p o r t a n ti nd e t e r m i n i n gt h ea c t i v i t yo f e n z y m e sa n dt h ec h e m i c a le q u i l i b r i u mp o s i t i o no fr e a c t i o ns y s t e m t h o u g hr e d u c e d w a t e ra c t i v i t ys h i f t st h er e a c t i o nt o w a r ds y n t h e s i s ，t h ed e p e n d e n c eo fw a t e rf o r c a t a l y t i cv a r i e sw i d e l yf r o md i f f e r e n te n z y m e s t h e r ea r es e v e r a lm e t h o d su s e dt oe o n t r o lw a t e ra c t i v i t ya n dr e m o v ew a t e rf r o m n o n a q u e o u sr e a c t i o ns y s t e m , s u c ha sm o l e c u l a rs i e v e s 、p e r v a p o r a t i o n , a n ds oo n b u t , h o wt or e m o v ew a t e rp r o d u c e da st h er e a c t i o np r o g r e s s e s a n dh o wt oe o n t r o lw a t e r a c t i v i t y a tt h eo p t i m i z i n gp o s i t i o na r es t i l lt h em a j o rd i f f i c u l t i e s , e s p e c i a l l yi n l i p a s e s c a t a l y z e de s t e r i f i c a t i o nr e a c t i o n s i nt h i sd i s c o u r s e w ei n t r o d u c ean e wm e t h o dt os o l v et h i sp r o b l e m t h ew a t e r a c t i v i t yc a l lb ew e l lc o n t r o l l e db yr e v e r s eo s m o s i sc o m b i n i n gw i t hs a l th y d r a t e so r s a t u r a t e ds a l ts o l u t i o n s t h e o r e t i c a l l y ，t h er e a c t i o ns y s t e mc a nb ec o n t r o l l e da tt h e e x a c tw a t e ra c t i v i t yp o s i t i o nt h a tl i p a s e ss h o wg r e a t e s tc a t a l y t i ca c t i v i t ya n dt h ee s t e r c o n v e r s i o na c c e s s e st o10 0 f u r t h e r ，ac o n t i n u o u sr e a c t o ri sd e s i g n e df o rl i p a s e s c a t a l y t i ce s t e r i f i c a t i o n l i p a s e sf r o mm a n yo r g a n i s ma r ec o m m e r c i a l l ya v a i l a b l e m a n yo ft h e mh a v e b e e nu s e di ni n d u s t r y i nt h ef o l l o w i n gs t u d y ，c o n c e r n i n gt h ep r o d u c i n gc o s t ，w e s e l e c t e do l l eo ft h ec h i p e s tl i p a s e s c l l ( c a n d i d al i p o l y t i c al i p a s e s ) f o rs y n t h e s i so f e t h y lh e x a n o a t ei ne s s e n t i a l l yn o n a q u e o u s “1 1 i c r o a q u e o u s ) e o n d i t i o n s b e c a u s ec r u d es u s p e n s i o n so fl i p a s e sp o w d e r sa r ei n e f f i c i e n t i t sn e c e s s a r yt o i m m o b i l i z e dl i p a s eo n t os p e c i a ls u p p o f tm a t e r i a l t h e r ei sn o wag r e a td e a lo f l i t e r a t u r ed e s c r i b i n gt h em a n ym e t h o d sf o r t h ei m m o b i l i z a t i o no fl i p a s e s a n df o ri t s s i m p l eo p e r a t i o n s a n dh i g h e f f i c i e n c y ，a d s o r p t i o n i st h em o s tw i d e l yu s e d i m m o b i l i z a t i o nm e t h o d si nl i p a s e sc a t a l y t i cn o n a q u e o u sr e a c t i o ns y s t e m t h e r e f o r e c o n s i d e r i n gt h ef o l l o w i n gc r i t e r i a ：t h ea c t i v i t yo fi m m o b i l i z e dl i p a s e s ；t h ea p p r o p r i a t e p o r ea n dp a r t i c l es i z e ：t h es u i t a b l em e c h a n i c a lp r o p e r t i e s ；a n dt h ec o m m e r c i a l i n e x p e n s i v e ，w ei m m o b i l i z ef i p a s e c l lb ya d s o r p t i o no n t oah y d r o p h o b i c p o l y ( s t y r e n e d i v i n y l b e n z e n e ) r e s i n a f t e ro p t i m i z e di m m o b i l i z e dt e c h n o l o g y ，t h e e s t e r i f i c a t i o na c t i v i t yo fi m m o b i l i z e dl i p a s ei s2 4 5t i m e so ff r e ee n z y m e k e yw o r d s ：l i p a s e s ，c l l ，e s t e r i f i c a t i o n , n o n - a q u e o u s ，e t h y lh e x a n o a t e ， w a t e ra c t i v i t y 1 前言 1 1 脂肪酶及其催化机理 1 1 1 脂肪酶催化的反应 在分类上，脂肪酶槭于水解酶类( e c 3l 13 ) ，催化甘油脂的水解反应 o oc h l o 一 - r ， r ，一! o 去t n + h ，o ly c h l o - c - r ， 甘浪三嚣 圈? k c l - - o - - p c 喝 r i c 叫印+ r 删 h a c o h 甘油二醢鹰腑靛 图1 一l 脂肪酶催化的水解反应 不同束源的脂肪酶在位置特异性上有差别有蝗选择性的水解甘油脂的 3 俺脂酰基，有些则没柯严格的位置选择件。 1 2 脂肪酶的活性位点 脂肪髓部属于s er 水解酶类催化活性基团为a s p ( g lu ) - h is - s er 三联体 见下图“) ， 图12c r l 的活性位点 上海化工研究院硕士学位论文 1 1 3 脂肪酶的催化机理 在催化过程中，首先是甘油脂进入脂肪酶的活性位点，然后活性位点s e r 的 羟基在a s p ( g l u ) - - h is 的帮助下，进攻甘油脂的羰基，形成四面体过渡态中间 物( 见下图) 。接着中间物脱去醇，生成脂酰化酶复合物。然后一分子水在a s p ( g l u ) 一h is 的帮助下，作为亲核试剂攻击脂酰基化酶复合物，形成第二个四 面体过渡态中间物，中间物分解后，脂肪酸脱离酶的活性位点。酶再进入下一个 循环，继续发挥催化作用1 。 a s p ( g l u ) | l 、 q r 图1 3 脂肪酶的催化机理 o 广 只 催化过程中形成的四面体过渡态中间物具有较高的能量，但脂肪酶的活性位 点周围有一个特殊的氧阴离子洞，能够稳定四面体过渡态中间物的氧阴离子，降 低活化能，使反应顺利进行。见图1 - 4 瞄1 ： ：，皇二 一苟j r o h 图1 4 稳定脂肪酶催化过程中氧阴离子的氧阴离子洞( 氢键) 2 一卜 一 叫 q h眦+ 上海化1 ：研究院硕十学位论文 1 2 非水相中的酯合成反应 在生物体内，脂肪酶参与脂肪的代谢和转换，催化甘油脂水解为甘油和脂肪 酸。但除了水解反应，在合适的反应条件下，脂肪酶还能催化其它一系列反应， 如酯化反应、转酯反应、酰胺化反应。 一直以来，脂肪酶的应用研究都是生物化工领域的研究重点，因为酯类化合 物在生物、医药、化工、食品、保健品、化妆等行业有着重要用途。特别是自 8 0 年代以来，随着非水相酶催化反应取得的突破性进展，脂肪酶在非水相溶剂 中的应用研究更是成为热点。 非水相酶催化反应有许多优点，比如能改善底物的溶解性能，提高酶的稳定 性，便于连续操作和酶的回收利用等。而且，脂肪酶在非水相溶剂中还能催化在 水溶液中无法进行的酯化反应和转酯反应，从而合成一大批在医药、化工、食品、 日化领域有蕈要作用的产物。因此，非水相中的酶催化反应，尤其是非水相中的 脂肪酶的催化反应得到了广泛而深入的研究。 但目前脂肪酶非水相催化反应在工业规模得到成功应用的例子相对较少，而 且主要都是在一些高附加值的产品上。因为要将非水相脂肪酶催化反应大规模应 用在工业生产上，还有许多限制因素需要解决。其中最主要表现在生产成本和生 产效率两方面。 在酶催化反应中，酶的成本几乎占据了总成本的大部分。脂肪酶的非水相催 化反应中也是，由于酶表现出的活性较低，酶的成本问题也很突出。因此，在生 产上必须尽量采用价格低廉的酶源，并且需要采用合适的固定化方法，使酶能够 重复利用，降低成本。 另一方面，原料的利用效率、产品的分离纯化费用也是生产成本的重要组成 部分。特别是在脂肪酶催化酯合成的反应中，由于酯合成反应是可逆的，反应的 平衡点受热力学控制，一般酯转化率在6 0 - - , 9 0 之间。底物转化不完全会使产 品中混杂原料，增加产品分离纯化的费用，降低产品的品质。同时由于原料利用 不充分而造成浪费、增加成本。 另外，生产效率也倍受关注，因为有机溶剂中脂肪酶的活性本来就不高，而 且在反应过程中，大部分时间都消耗在反应接近平衡点处。假如能够采取适当的 反应工艺，缩短反应到达平衡点处的时问，就能够提高反应的效率，从另一方面 提高酶的利用效率，降低酶的成本。 脂肪酶的非水相酯合成反应中，控制反应体系中的水分是生产工艺中最关键 的技术之一。因为水分作为酯合成反应的产物，直接决定反应的平衡点。如果不 除去反应体系中积累的水分，则平衡转化率不高，产品分离纯化困难、品质低， 同时原料浪费严重。另外，当反应体系积累太多的水分后，酶颗粒会聚集在一起， 导致传质困难，反应速率低，而且酶还容易失活，缩短使用寿命。但是，脂肪酶 在催化时，必须要有微量水才能维持其活性，因此不能采用过于强烈的除水方法， 以防将维持脂肪酶活性的必需水分也被除去。 有效的控制和除去脂肪酶在非水相中催化酯合成反应生成的水分一直是个 意义重大但是难以解决的课题。 因此，在本论文中，选择在香料行业有巨大市场的己酸乙酯为目标产物，试 图以廉价的酶源，结合有效控制反应体系水分的方法，建立一种能够低成本合成 高品质的己酸乙酯的方法”。 3 上海化i ：研究院硕十学位论文 3 现有己酸乙酯的合成方法 己酸乙酯是一种广泛用于食品调香的酯类香料，主要应用在白酒、香烟和糖 果调香，有着巨大的市场需求。己酸乙酯是浓香型曲酒的主体香味成分，其含量 的高低直接影响酒的品质。每年我国用于浓香型曲酒调香的己酸乙酯达3 0 0 0 多 吨，产值上亿元1 。 长期以来，己酸乙酯基本上都是采用化学法合成 1 ，如用硫酸或对甲苯磺 酸作催化剂，由己酸和乙醇直接酯化得到。用硫酸等强酸催化的优点是催化剂活 性高，价廉易得。但硫酸除了催化酯合反应外，还会引起其它一系列难以控制的 副反应，使底物氧化、炭化，后处理困难，产品品质不高。而且，强酸还会腐蚀 设备，增加设备投资和维修费用。另外，采用酸催化时，生产过程产生的大量废 水会对环境造成污染。 除了酸外，也有以钛酸四异丙酯一1 ，硫酸锆n 叭，水合硫酸铁n ，硫酸高沛n 引， 钨磷杂多酸n3 1 ，固体超强酸n 们等为催化剂催化合成己酸乙酯的替代方法，但这些 方法由于催化剂的成本、活性以及能耗和产品质量等诸方面原因而难于取代酸催 化法。 化学合成的己酸乙酯直接成本较低，在价格上具有优势，但产品的品质及生 产过程对环境造成的危害一直难以解决，特别是在强调生活质量和环境保护的今 天。 随着人们对品质的追求和对环境的关注，工业上生物法合成己酸乙酯将只会 是时间问题。美国的联邦法规( u sc o d eo ff e d e r a lr e g u l a ti o n ) 认为生物法 合成的己酸乙酯属于天然产物n ”，因而在市场上的售价高出化学合成品价格的许 多。因此，探求生物法催化合成己酸乙酯有着很现实的经济价值。 己酸乙酯的生物合成法包括发酵法和酶法。发酵法由于生产率低下而被认为 实际意义不大。 酶法合成己酸乙酯则很有希望能够取代化学合成法n6 1 。酶法合成己酸乙酯的 优点在于反应条件温和，能耗低，对环境的危害小，酶的反应速率和转化率均比较 高，特别重要的是酶法合成的己酸乙酯产品纯度高，品质好，是美国联邦法规承认 的天然产品“5 1 ，价格比化学品高出许多。而且，在白酒勾兑试验中也表明，酶法 合成的己酸乙酯具有协调持久的自然香，而化学法合成的己酸乙酯产生的是浮香 效果，无法满足自然香的要求n 7 1 。 近几年，我国的无锡轻工业大学等单位在酶法合成己酸乙酯上作了大量的工 作，并取得了很好的成果n 副。已有了一些酶法合成己酸乙酯的专利n8 1 和报道。如 徐岩等以正庚烷为溶剂，用米根霉脂肪酶，圆柱形假丝酵母脂肪酶或猪胰脂肪 酶催化己酸和乙醇酯合转化率为在8 5 - 9 5 之间，生成的己酸乙酯浓度为 3 4 6 9 1 。夏咏梅等用解脂假丝酵母脂肪酶也得到相类似的结果n9 1 ，己酸乙酯的 转化率为8 5 。 除了烷烃外，超临界二氧化碳也可作为脂肪酶催化合成己酸乙酯的溶剂。y u ， z e r - r a n 用固定在硅胶载体上的圆柱形假丝酵母脂肪酶，在超临界二氧化碳催化 合成的己酸乙酯，转化率也可达到为8 0 左右n 叫。 虽然目前在酶法合成己酸乙酯取得了不少成就，但要使酶法合成己酸乙酯在 商业上可行，还需要在酶的成本、酯的转化率以及连续操作性能都继续深入研究。 4 上海化f ：研究院硕 ：学位论文 2 酶的选择 2 1 不同来源脂肪酶的差异 虽然生物体内的脂肪酶都参与相类似的酯类代谢反应，但生活在不同环境中 的生物体内的脂肪酶在底物的选择性上必然存在着差异。不同来源的脂肪酶的最 适作用底物不完全相同，在合成己酸乙酯时，有些脂肪酶表现出较高的活性，有 些的活性则较低。 徐岩等人对不同来源的的脂肪酶在正庚烷中合成己酸乙酯的能力差别作了 比较n 1 ： 表2 - 1 不同来源脂肪酶催化合成己酸乙酯的活性差异 脂肪酶位置特异性酯转化率相对值 删l 1 ，3 9 5 5 1 0 0 o c r l 一1 无 8 6 2 5 9 0 3 p p l8 9 0 2 9 3 2 c l l 1 ，3 3 2 5 6 3 4 1 c s l 1 ，3 6 1 2 6 4 1 p n l 1 ，3 18 19 1 9 0 m j l1 6 0 0 1 6 8 a n l 无 8 5 8 9 p s l 1 ，3 8 7 0 6 9 1 2 c r l - 2 无 3 0 2 3 3 1 7 结果表明不同脂肪酶催化己酸乙酯合成的能力相差很大，m m i ，c r l 一1 ，p p l 和p s l 对己酸和乙醇的催化能力更高，而a i q l ，m j l ，p i q l ，c l l 对己酸和乙醇的 催化能力低。 2 2 脂肪酶同工酶的差异 这种催化能力的差别不仅表现在不同来源的脂肪酶上，甚至来自同种生物的 脂肪酶也不尽相同。实际上，每种生物体都有多种脂肪酶的同工酶，不同的同工 酶在性质上存在的差异，在底物的特异性上也不一样。如商品皱褶假丝酵母 ( c a n d i d ar u g o s a ) 脂肪酶( c r l 或c c l ) 就是由多种同工酶组成的混合物( 见 下表) 表2 - 2c r l 的五种同工酶 脂肪酶 l i p l 2 1 1l i p 2 n 1 1 l i p 3 2 2 1l 蝉 l i p 5 2 2 1 氨基酸数5 3 45 3 45 3 4 5 3 45 3 4 分子量m5 7 2 2 35 7 7 4 45 7 2 9 l5 7 0 5 l5 6 9 5 7 等电点p i 4 54 95 15 75 5 a s n 2 9 1 ，a s n 2 9 1 ， 糖基化位点 a s n 3 1 4 ， a s n 3 5 1 a s n 3 1 4 ， a 。s n 3 5 1 a s n 3 1 4 ， a s n 3 5 la s n 3 5 l a s n 3 5 1 含糖量 4 2 5 33 5 其它标志c r l bc i 也一a 倾向短链酯 长链脂( 1 6 一1 8 ) 表面活化现象有幢 千【2 3 】 l 5 上海化r 研究院硕十学位论文 这些同工酶在结构上存在差异，在具体催化特性上也有所不同。有的倾向短 链底物，表现为酯酶活性；有些倾向长链底物，表现为脂酶活性。有些对底物的 立体选择性高，而有些则较差。 2 3 确定酶源： 因为酶催化的反应中，酶的成本往往占据了生产成本的大部分。选择一个高 活性、低成本酶往往是生产能否取得成功的关键之一。 对于一个确定的底物，总存在一种最适的脂肪酶。在众多的商业脂肪酶中， 最常见于文献报道的是c r l ，在合成低分子量的底物或者极性比较大的底物时， 文献报道用的最多的也是c r l 。可能是因为c r l 的价格相对便宜，酶的纯度和活 性高，能催化许多底物发生反应，同时又有很好的立体选择性。 在催化合成己酸乙酯时，c r l 也有较高的活性。因此，综合酶的价格和催化 活性，采用c r l 有更大优势。 但考虑到目前有国产廉价的脂肪酶c l l 供应，为了能进一步降低酶的成本， 而且，从生产工艺角度看，不管是采用c r l 还是c l l ，在研究己酸乙酯合成工艺 上的成果都是适用的，因此，本论文中还是选择了目前廉价的国产解脂假丝酵母 脂肪酶( c l l ) ( 无锡酶制剂厂) 作为主要的酶源。 6 上海化- r 研究院硕十学位论文 3 解脂假丝酵母脂肪酶( c l l ) 的性质研究 国产c l l 脂肪酶是提取自解脂假丝酵母的中性脂肪酶，能够催化甘油三脂的 水解反应。商品c l l 脂肪酶是含有盐和糖等杂质的粗颗粒，酶活约为8 0 0 0 u g 。 3 1c l l 对不同有机酸和有机醇的催化能力差异 为了试验c l l 对底物的特异性，观察其对不同的脂肪酸和脂肪醇的催化能 力，实验选用了从甲醇到十六醇，从乙酸到棕榈酸的不同碳原子数的酸和醇作为 底物，并且从中选择了特定的组合作为试验组。具体组合如下表( 酸、醇后面的 数字为其分子的碳原子数量) ： 表3 1试验c l l 对底物特异性的底物组合 醇酸编号乙酸2 * 丙酸3丁酸4戊酸5己酸6辛酸8棕榈酸1 6 甲醇l 123 乙醇2456 丙醇3789 2 2 丁醇4 1 0ll1 2 辛醇81 31 4 1 5 十二醇1 21 61 7 1 8 十六醇1 6 1 92 02 1 注：木底物后面的数字为该种化合物分子的碳原子数 往5 0 m l 的磨口玻璃三角烧瓶中加入l o m l 正己烷，然后分别准确地加入给定 量醇和酸底物，配成醇和酸浓度都各为o 1 5 m o l 1 的溶液，再往瓶中加入o 1 0 0 0 9 c l l ，于4 0 。c 的恒温摇床，2 0 0 r p m 反应，定时测定反应液中的酸浓度，计算反 应速率和转化率以及酶催化酯合成的活性。 将测定得到的酶活性数据与酸、醇碳原子数的关系作成三维图和等高线图如 下： e s t e r i f i c a t i o nr 砒eo fd i f f e r e n ts u b s t r a t e s ： ： 图3 - 1 - a c l l 对不同底物的催化能力( 三维图)图3 - 1 bc l l 对不同底物的催化能力( 等高线图) 从图中可以看出，醇和酸的碳原子数对酶的催化能力影响都很大，酶对低分 1 1 - _ 海化工研究院硕士学位论文 子量的底物的反应性能很差。随着酸的碳原子数增加，酶的催化能力也增加，这 种趋势从乙酸一直到辛酸都很明显，当底物酸分子的碳原子数在1 0 以上时，酶 的催化能力基本上达到最人值。醇同样也表现出这种趋势，但和酸稍有差异的是， 当醇的碳原子数增加到5 以上时，酶基本上就能稳定在最大催化活性。而且，当 酸碳原子数比较多时，酶即使对甲醇和乙醇这样的低分子量醇也表现出较高的催 化能力。 为了尽量消除单独一次测定反应速率可能存在的误差影响，下面以第1 、3 、 7 ，2 0 小时时分别测定计算得到的反应速率按方程r - - k * t 拟合，以拟合得到的 常数k 表征反应速率和酶的催化能力。计算方法为： 假设在第n 组中，第t 1 1 = 1 小时时测定计算得到酶的反应速率为r 1 】，第 t 2 】_ 3 小时时测定计算得到酶的反应速率为r 2 】，第t 【3 】= 7 小时时测定计算得 到酶的反应速率为r 3 1 ，第t 4 1 = 2 0 小时时测定计算得到酶的反应速率为r 【4 】。 再假设从第o 小时一直到第2 0 小时酶都以恒定的线性速率k 催化酸和醇合成酯 ( 在酯转化率低于6 0 时，从转化率曲线来看，酯的生成速率与反应时间成基 本上符合线性关系，见下图) ： 岔 芑 暑 墨 8 t i m e t h r ) 图3 2c l l 催化酯合成的转化率曲线 因此数组r ，t 和常数k 之间满足方程： r = k t 用最d - - 乘法可以求出速率k ，而且k 能更准确的代表从第o 小时到第2 0 小时酶的反应速率。得出k 后，再将k 对酸和醇的碳原子链长作图如下： 8 上海化，1 ：研究院硕士学位i 幺宜 c a r b o na t o m s0 fa c i d 图3 - 3c l l 催化合成酯的反应速率常数与底物分子碳原子数的关系 从图中可以看出，酶对底物的选择性和前面叙述一致。c l l 对长链的脂肪酸 和脂肪醇表现出较高活性。 根据酶一底物结合理论，酶对底物的选择性主要是由酶的底物结合区域基团 的特定分布方式决定的。以c r l 为例，c r l 的底物结合部位是一个几乎贯穿酶 分子的狭长孔道，分布在孔道周围的氨基酸的侧链基本上都是疏水性的或芳香性 的【4 l ，这些基团依靠疏水作用力同底物结合。因此，长链的脂肪酸将能够占据更 多的孔道区域，与酶存在更多的疏水作用力，同酶的结合更紧密和稳定，有利于 脂肪酸的羧基顺利的同酶的催化活性位点s e r 2 0 9 结合形成过渡态中间物，进而 在醇的攻击下形成酯。 而短链脂肪酸进入酶的底物结合孔道后，可能因为碳原子链较短，与酶相互 作用的基团较少，致使结合得不够紧密，脂肪酸的羧基不易和s e r 2 0 9 紧密接触 形成过渡态化合物，反应速率慢。 对于醇的分子量的效应，则可能是分子量大的醇更易于依靠疏水作用力同酶 的底物结合孔道入口处的疏水性氨基酸的侧链结合，因此有更多的机会攻击脂肪 酸与酶形成的过渡态中间物，形成酯产物。 另外，因为酯的形成的前提条件是脂肪酸与酶生成过渡态中间物，因而，脂 肪酸对反应速率的影响将比醇更为重要，这可能是c l l 在催化棕榈酸和甲醇的 酯合成反应具有较高速率但是乙酸和十六醇反应却非常缓慢的原因。 3 2c l l 催化不同碳原子数羧酸生成乙醇酯的能力差异 日化最常见的酯类香料是羧酸和乙醇形成的乙酯类化合物。己酸乙酯就是其 中的一种。根据上面的实验结果，为了进一步研究醇底物为乙醇时酸的碳原子链 长对反应速率的影响，再比较了不同脂肪酸与乙醇的酯合成反应中时c l l 的催 化性能的差异。实验的方法如同上例，只是醇底物为乙醇，而脂肪酸则分别是乙 酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、辛酸和油酸。结果如下： 9 上海化_ 【研究院硕七学位论文 e s t e r i f i c a t i o nr a t ev sd i f f e r e n tf a t t ya c i d s c a r b o na t o m so ff a t t ya c i d s 图3 4c l l 催化不同碳原子数的羧酸和乙醇生成酯的能力差异 从这里可以更加清楚的看出，随着底物脂肪酸碳链长度的增加，脂肪酶c l l 的催化能力也几乎呈线性增加。 3 3 底物浓度对c l l 合成己酸乙酯的影响 化学反应中，反应速率与底物的浓度有密切关系，一般底物浓度越高，反应 速率越大。但在酶催化反应中，经常存在底物抑制效应和产物抑制效应。特别是 在脂肪酶催化的酯合成反应中，许多文献都提到底物抑制效应。因此，脂肪酶催 化酯合成时存在一个最佳的底物浓度。 为了寻找c l l 合成己酸乙酯的最佳底物浓度，设计了以下实验，以研究己 酸浓度、乙醇浓度，以及己酸和乙醇浓度比例对酶催化性能的影响。 方法：己酸浓度从0 0 5 - 0 6 m o l 1 ；乙醇浓度从0 0 5 - 0 3 m o l 1 ；两者之比从 l ：2 到2 ：l ，参见下表：( 底物浓度单位为m o l 1 ) 表3 2 试验不同浓度底物浓度下c l l 催化合成己酸乙酯能力筹异时所用的底物浓度配比 组号欲试验己酸浓度实测己酸浓度欲试验乙醇浓度酸醇比 a0 0 5 00 0 4 60 0 5 01 ：1 b0 0 5 00 0 4 6o 1 0 01 ：2 c0 1 5 0o 1 3 50 0 7 52 ：l d0 1 5 0 o 1 3 80 1 5 0 l ：l eo 1 5 00 1 4 00 3 0 0l ：2 f0 3 0 00 2 7 80 1 5 02 ：l g0 3 0 00 3 0 00 3 0 01 ：1 h0 3 0 00 2 7 30 6 0 01 ：2 10 5 0 00 4 6 10 2 5 02 ：l j0 5 0 0 0 4 4 40 5 0 0 l ：1 。 ko 1 0 00 0 9 70 1 0 0 1 ：l l0 2 0 0o 1 8 6o 2 0 01 ：l m0 6 4 00 5 8 00 3 2 0 2 ：1 结果见下图( 酶活性单位为um o l ( m i n 宰g ) ) ： l o fa!ui暑ioe竹)lej uoiu鼍al l ：海化l ：研究院硕七学位论文 c o n c e 删i o no f b e x a n o i c 撕d ( m o i i 图3 5c l l 催化合成己酸乙酯的能力与底物浓度的关系( 等高线图) 从图中可以看出，基本趋势是在低底物浓度时，随着酸醇浓度的增加，酶的 反应速率也增加，在己酸和乙醇的浓度为o 3 m o l l 左右时达到最高值，随后， 随着底物浓度的增加，酶的活性反而降低，表现出底物抑制作用，这和文献报道 的脂肪酶c r l 受高浓度的醇抑制眨4 2 5 1 相一致。值得注意的是，酶对醇的浓度更为 敏感，在乙醇浓度高于o 3 m o l l 后，随着乙醇浓度的增加，酶的催化活性迅速 降低，乙醇表现出很强的抑制能力。以反应速率和乙醇浓度作双倒数图能更清楚 的看出，乙醇表现出典型的底物抑制曲线( 见下图) 。 a h g c , e o m o 图3 - 6 己酸浓度不变时，c l l 催化合成己酸乙酯的能力与乙醇浓度的双倒数图 相对而言，己酸的抑制作用没有那么明显。如在乙醇浓度为0 3 m o l l 时， 随着己酸浓度的增加，反应速率仅有缓慢的降低。 另外一方面，底物的抑制作用同乙醇和己酸的浓度配比也存在关系。当己酸 的浓度较低时，较低的乙醇就能表现出抑制作用，而在己酸浓度较高时，需要较 高的乙醇才能抑制c l l 。 这种底物抑制作用可以从脂肪酶酶的催化机理得到解释。以c r l 为例，酶的 底物结合部位位于酶分子中间的一个几乎贯穿酶分子的凹槽内，凹槽的周壁基本 上由疏水性氨基酸的侧链构成。催化活性基团g l u 3 4 1 - h i s 4 4 9 一s e r 2 0 9 三联体位 于凹槽的入口处。在凹槽的外面有一个a 螺旋结构的盖子。在酯合成过程中，首 先是脂肪酸从盖子下面通过凹槽的入口进入凹槽中，脂肪酸凭借疏水作用紧密结 上海化j ：研究院硕七学位论文 合在凹槽中，其羧基端朝外，恰好靠近凹槽入口处的催化活性位点，然后在 g l u - h i s - s e r 三联体催化作用下经历两次四面体的过渡态复合物和醇生成酯。 在生成酯的过程中，有两个关键步骤：1 脂肪酸进入酶的底物结合部位并与 酶形成脂酰化酶复合物；2 乙醇接近酶的活性位点并且攻击脂酰化酶复合物形成 酯。 可以预见，当溶液中醇太多时，醇会占据凹槽的入口，阻碍脂肪酸进入酶的 底物结合部位，不能形成脂酰化酶复合物，酶的活性被抑制。但当酸太多时，也 可能会阻碍醇接近活性位点，酯生成速率也会受到一定程度的抑制，但相对而言， 此时酸对醇的阻碍作用不会象醇对酸的阻碍作用明显，抑制作用较弱。因此，醇 和酸都会表现出竞争性抑制抑制作用，其中醇的抑制作用将更为显著。 1 2 4 表面活性剂对酶活性的影响 脂肪酶催亿的酯合成反应足酯水解反直的逆反戍，雕论卜月日肪酶埘酯水解和 酯台成反应的催化能力足一致的。忸实际上脂肪酶在催化脂肪水解时有很高的活 性，而在催化醛合成时活性很氐。通常是数干个水解酶话爿能对应一个酯台成酶 活( 单位部是g m o lp r o d u c t ( r a i n + ge r a m e ) ) 。造成这种差距有反应环境j ： 的原因，但如此大的差距更可能足山脂防酶本身的特殊结构特性决定的。 有很多脂肪酶都表现出一种“表面活化”# q ( i n t e r f a c i a la c t i v i t y ) 的现象：在 油水界面处的脂肪酶会表现出很商的活性。从脂肪酶分子的二维结构柬看，这种 “表面活化”现象是由于脂肪酶的活性位点外面有个特殊的“螺旋盖”纬构口”。 “螺旋盖”足一段特殊的n 螺旋的氯基酸片段，由司隔排列的亲水性和疏水性氨 基酸构战。以c r l 的同丁酶i lp l 为例，螺旋盖的7 0 到9 2 号氨基酸依次为 g l u 7 0 ，g i u 7 1 ，as n 7 2 ，1 e u 73 ，p r 0 7 4 ，l y s 75 ，a l a7 6 ，a i a 7 7 ，i e u 7 8 ，as p 7 9 ，l e u s 0 ， v a l8 1 ，e t 82 ，g l u 83 ，s er 8 4 1y s85 ，v a i86 ，p h e 87 ，g i u 88 ，a l a 89 ，v a l9 0 ， s e r 9 1 ，p r 0 9 2 。这些氨基酸在形成n 螺旋的二级结构后，亲水的氯基酸 g l u 70 ，g iu7 1 ，as n 7 2 ，l y s75 a l a7 6 ，a s p 79 ，9 1u 83 ，s er 8 4 ，l y s85 ，g i u 8 8 ，a l a 8 9 ， s er9 l 的例链朝向溶液环境，衙其它疏水氨基酸的侧链则偏同活性何点的一侧。 螺旋盖下酶的活陛位点俐尉的也主要是城水性氨基酸冈此在水溶液中， n 螺旋盖的亲水性氨摹暖和水溶液作用，疏水眭的氨基酸则和滑性位点周围的疏 水氨基酸相互作用。螺旋盖千戈 j j ，底韧不易进入活性部能，酶表现出低活性。 仉、体系出现油水两相界面时，脂肪酶吸附在油水界面j 二，界面的亲水疏 水特性使酶的螺旋盖的亲水侧链和永溶液接触，疏水部分则和界面的疏水区域作 用，a 螺旋盖打丌，如下图： 罔4 一1 ac r l 的底物结合部位与。螺旋盖( 开放状态 圈4 - 1 一bc r l 的底物结合都商与q 螺旋盖【开放状志 因此酶酋底物站台环泣暴露，底物史弈易进入活陀f 盘点，反| 立速率增加。 但是，脂肪酶乏非水相催化台成酯叫体系中， = 币存在油水两相界面，可能脂 肪酶的螺旋盖冕掏生多的足处殖：天闭状态波有发山活化现蒙，酶催化酯合成的 能力低。假如能够找到一种方法，使非水相中的脂肪_ 锋电能处在螺旋盖“开放” 状态，应该能够；窑挺脂瞄酶性化潜力，提高脂骄酶在非水柑中催化酶合成的能力。 在这一方可，已终尝试过许多方法，比如用育机溶剂预处理”，用两亲性物 质( 如p e g ) 修饰刚表面活陡剂处理”。等， 其中使用的晟多的是表面活性制，井f ! l 茳现有许多求衙活性剂修饰脂肪酶后 能显著提高酶的催化缝合成能力( 见卅表2 ) ， 表面活性剂对非水相中指肪酶的催化能力的促进怍用可能足多方面的。首 先，游离的腊折酶小能溶觯在非极性溶剂巾，容茹聚集成颗粒，因此反戍物在溶 剂和酶颗粒问的扩散存在管鞍大阻力和较小的扩散面积。当酶经表面活性剂处理 后，表面括性荆的索水端将群分r 包是起柬，踊水端划溶解在溶剂中，使酶分子 悬浮分散在溶剂中，有助于增加酶和底物的接触面积促进体质。另外，附着在 酶分子表面的裹呵活性荆电许还具有定的分j 1 1 己效应，利用其亲水性的基团吸引 极性的底物聚曼至j 酶分子周围有助于底物和酶接触。 但是，上述推测迁下能够解释山什幺不川曲表面活性荆对脂肪酶酶活性的促 进作用相差很大以及有些袁而活性荆能健酶的活性增加儿f 甚至上百倍这样的 现象。这种现象表明脂肪酶同表面活性剂之间可能还存在特异性的作州。最有可 能的尾表面活性捌能够使酶的“螺旋盖”打开。 遮挡脂肪尊活胜世点的。螺旋盖的亲水眭的氨基酸基水上位于钠向溶液的 一侧，而疏水性的氮基酸则钠向底物结合郁，这种疏水一亲水的特性使人很容 易联想到表面活性剂的疏水亲水性质而且，a 螺旋的横向宽度为lo 到2 0 埃， 和表面活性剂丹于的长度相类似，也许其中有着某种联系。 另外，在试验过的表面活性剂巾。非离子系列特别是带冉长链脂肪酸侧链 上海化l ：研究院硕七学位论文 的非离子表面活性剂对酶的活性有较显著的效果。可能是因为这类表面活性剂和 脂肪酶的底物在结构上存在类似之处，根据酶和底物的结合关系推测，也许会存 在这种可能：特定的表面活性剂作为一种底物类似物( 在某些反应中，表面活性 剂实际上就是酶的底物) ，进入底物结合部位( 尤其可能的是表面活性剂的脂肪 酸侧链首先进入底物结合部位) ，但由于表面活性剂的庞大体积使其难以完全进 入，因此就依靠其脂肪酸侧链的疏水性作用力和同酶的底物结合部位入口处的疏 水性氨基酸以及q 螺旋盖朝里一侧的疏水性氨基酸的侧链相互作用。从而，表面 活性剂就像锲子一样将盖住酶的底物结合凹槽的a 螺旋挤开，减少底物进入酶活 性位点的障碍，加快反应速度。由于酶从盖子开放状态的构象回到盖子封闭状态 的构象需要一定的能量和时间，因此，即使将体系中的表面活性剂洗脱，酶的高 活性应该仍然能够持续一段时间。 为了观测表面活性剂对c l l 催化性能的影响，设计了以下试验： t w e e n8 0 处理c l l 对其合成酯能