（森林培育专业论文）红叶乌桕组织培养及植株再生研究.pdf

中文摘要 本研究为探索红叶乌桕( e u p h o r b i ac o t i n i f o l i al i n n ) 组织培养快速繁殖的有效 途径，以红叶乌桕当年生苗叶片、茎尖、茎段为外植体材料，对红叶乌桕的组织培养和 体细胞胚发生以及植株再生进行了系统研究，研究主要结果如下： l _ 在初代培养时，对外植体做如下处理：时片切割为1 o 1 ，0c m 2 大小有利于降低 褐化率，褐化率为2 8 9 ：茎段暗培养1 周，可显著降低褐化率，为3 8 o 。 2 茎段启动培养：有利于诱导红叶乌桕嫩茎启动的培养基为m s + 6 一b a1 o m g l + n a a 0 5 m g l + i b a0 1 m g l ，启动率为7 1 4 。 3 叶片愈伤组织诱导：其适宜的诱导培养基是m s + 2 ，4 - d1 o m g l + 6 一b a 0 1 m g l + n a a o 1 m g l ，诱导率达5 7 2 。 4 增殖与分化培养：腋芽增殖配方为m s + 6 一b a1 0m g l + i b a0 5 m g l + n 从0 1 m g l ，3 0d 后增殖倍数为5 5 6 。有利于红叶乌桕叶片愈伤组织增殖的培养基配方组合 为：m s + 6 一队2 o m g l + n a a0 5m g l + 2 ，4 - d0 1 m g l ，增殖率达8 6 4 。适宜的诱导愈 伤组织分化的培养基是m s + 6 一b a1 o m g l + n a a0 1 m g l ，再生率可达7 5 ， 5 生根培养：再生植株在1 2 m s + i b a1 0m g l + n a a0 i m g l + a c0 3 的培养基上生 根最好，生根率可达8 7 6 。 6 炼苗与移栽，在珍珠岩、蛭石、河沙的配比为3 ：2 ：1 的基质中的移栽成活率 最高，为8 3 3 。 7 胚性愈伤组织及体细胞胚诱导：胚性愈伤组织适宜培养基是m s + z t1 0m g l + 2 ， 4 - d0 5 m g l + n a a0 0 5 m g l ，诱导率为3 5 4 ：附加z t1 o m g l 和n a a0 1 m g l 的 m s 培养基有利于体细胞胚发育和成熟，仅少数体细胞胚可直接诱导产生再生植株，多数 需要将其转接到不含激素的m s 培养基。 关键词：红叶乌桕；茎段；叶片；组织培养；体细胞胚发生；植株再生 s t u d i e so nt i s s u ec u l t u r ea n dp l a n tr e g e n e r a t i o no f e u p h o r b i ac o t i n i f o l i al i n n a b s t r a c t v t h es t u d yw a sm a i n l yt op r o b ea ne f f i c i e n tw a yt h r o u g ht i s s u ec u l t u r ea n dr a p i d p r o p a g a t i o no fe u p h o r b i ac o t i n i f o l sl i n n t h el e a v e s ，s t e m so rs h o o t so fy o u n gb r a n c h e s w a st a k e na se x p l a n t s t h et i s s u ec u l t u r e ，s o m a t i ce m b r y o g e n e s i sa n dp l a n tr e g e n e r a t i o no f e u p h o r b i ac o t i n i f o l i al i n n w e r es y s t e m a t i c a l l ys t u d i e d t h em a i nr e s u l t sa sb e l o w ： 1 d i f f e r e n tt r e a t m e n t so ne x p l a n t sw e r et a k e nd u r i n gi n i t i a lc u l t u r ea sf o l l o w s ：c u t t i n g t h el e a v e si n t o1 0c m 2w a sa na p p r o p r i a t ew a y ，a n dd a r kt r e a t m e n tf o r7d a y sw a st h eb e s t w a yf o rd e c r e a s i n gb r o w n i n gr a t e t h eb r o w n i n gr a t e sw e r e2 8 9 a n d3 8 o r e s p e c t i v e l y 2 s t a r t i n go fs h o o t sa n ds t e m s ：t h eo p t i o n a lc u l t u r em e d i u mf o rt h e i ri n i t i a t i o nw a sm s w i t h6 - b a1 0m g la n dn a a0 1m g l t h ei n i t i a lr a t ew a s7 1 4 3 i n d u c t i o no fc a l l u sf r o ml e a v e s ：c a l l u sw a si n d u c e di nm sm e d i u mw i t h6 b a0 5 m g la n dn a a o im 【g l t h ei n d u c t i o nr a t ec o u l du pt o5 7 2 4 p r o l i f e r a t i n ga n dd i f f e r e n t i a t i n gc u l t i v a t i o n ：t h eo p t i o n a lp r o l i f e r a t i n gb u d sc u l t u r e m e d i u mf r o ms t e m sa n ds h o o t sw a sm ss u p p l e m e n t e dw i t h6 - b a1 0m g l ，1 b a0 5 m g l a n dn a ao 1m g l o nw h i c hi tc o u l dm u l t i p l y5 5 6t i m e sa f t e r3 0d h i g h l yp r o l i f e r a t i n g c a l l u sw a so b t a i n e df r o mt h el e a v e sf o l l o w i n gc u l t i v a t i o no nm sm e d i u ms u p p l e m e n t e dw i t h 6 - b a0 5m g l ，2 , 4 一do 1m g la n dn a a0 5m g l t h ep r o l i f e r a t i n gr a t e sc o u l db eu pt o 8 6 4 t h eb e s tc u l t u r em e d i u mf o rc a l l u sb u d sd i f f e r e n t i a t i n gw a sm sw i t h6 - b a1 0m g l a n dn a a0 1m g l t h er e g e n e r a t i o nr a t ew a s71 4 5 r o o t i n gc u l t u r e ：r e g e n e r a t e d s h o o t sc o u l dp r o d u c er o o t si n1 2m sm e d i u m 四川农业大学硕士学位论文 。 一 c o n t a i n i n gi b a1 0m g l ，n a ao ir a g l a n da c 0 3 t h er o o t i n gr a t ec o u l du pt o8 7 6 6 t r a n s p l a n t i n g ：p l a n t l e t sw e r et r a n s f e r r e dt ot h em e d i u mw i t hr a t i oo f3 ：2 ：io f v e r m i c u l i t ea n dr u b ym i c aa n ds a n d s t h es u r v i v a lr a t ew a su pt o8 3 3 7 i n d u c t i o no fe m b r y o n i cc a l l u sa n ds o m a t i ce m b r y o ：t h es u i t a b l em e d i u m o f e m b r y o n i c c a l l u si n d u c t i o nw a sm s + z t i 0 m g l + 2 ，4 d o 5 m g l + n a a 0 0 5 m g l t h e i n d u c t i o nr a t ew a s3 5 4 a d d i n gz t1 0m g la n dn a a0 1 m g lt om sw a su s e f u lt o p r o m o t eg r o w t ha n dm a t u r eo fs o m a t i ce m b r y o t h e r ew a so n l yal i t t l es o m a t i ce m b r y o i n d u c e dp l a n t l e t sr e g e n e r a t i o nd i r e c t l ya n dm o s to f t h e mw a si n d u c e dw i t h o u t h o r m o n e k e yw o r d s ： e u p h o r b i ac o t i n i f o ，胁l i n n ，s t e m s ，l e a v e s ，t i s s u ec u l t u r e ，s o m a t i c e m b r y o g e n e s i s ，p l a n tr e g e n e r a t i o n 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学 位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名髟掰 石年月谚日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式 在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名：孳黏矽j j ! 卜 7p 屿 导师签名= 够久( j 渤6 年6 月毋日 跏石年多月甥日 1 前言 红叶乌桕( e u p h o r b i ac o t i n i f o l i al i n n ) 大戟科大戟属常绿灌木或小乔木，又名肖 黄栌、非洲红、血叶木、紫锦木。主干直立，分枝多，树冠圆形，叶片终年紫红色，嫩 叶鲜红色，远看似满树红花，为著名的红叶观赏植物。一般的枫类及黄栌等大都为秋日 遇霜而红，红叶乌桕却从春至冬常年红叶，浓艳华丽，点缀于其它绿色植物之中相映成 景，增加颜色变化，增添喜气。适合各种大小庭园绿化利用，可修剪成各种形状，给园 林增添景色。从红叶乌桕叶片提取的红色素可用于化妆品等产品中，还可用于添加维生 素c 的食品或饮料中，该色素也可以在含蔗糖的食品或饮料中使用【2 1 。红叶乌桕的组织 培养尚未见报道。除一品红外，大戟科大戟属的相关植物报道也很少。 2 文献综述 2 1 红叶乌桕生物学特性 红叶乌桕高2 5m 左右，树皮红褐色，干、茎有白色乳汁，树冠圆整，分枝颇多， 嫩枝暗红色，稍肉质；叶柄纤细，长约3c m ：叶3 4 片轮生；叶广卵形，长4 7c m ， 宽5 6e m ，极似黄栌，叶片全缘，叶尖钝，基部微盾，深红色，嫩叶鲜红色；叶柄长 4 7c m ，叶脉明显，中脉和侧脉鲜红色，叶背色较浅，中、侧脉凸起；花顶生浅黄色， 花小；种子近球形，直径约3m m ，褐色( 图版1 ) 。红叶乌桕为热带植物，喜高温高 湿环境，耐暑热，抗寒力低，当气温持续低于8 时，叶片脱落，嫩枝稍受寒害，春暖 后可正常发叶生长。北方地区只宜作盆栽秋后移入温室防寒越冬。喜光，不耐荫蔽，耐 烈日高温。对土壤要求不很严，较耐干旱，亦稍耐水湿。萌芽性强耐修剪，早期截干， 可萌发出多条干枝，稍加修剪，形成圆整的树冠，可提高观赏价值。红叶乌桕原产墨西 哥及南美洲，我国的广西、广东、海南、云南、台湾等省( 区) 有引种栽培。 红叶乌桕目前主要采取扦插繁殖f 3 】，从2 月至1 0 月，目均温在1 5 以上时都可以 扦插。但由于其干及枝均含有白色乳汁，若直接剪取新鲜的插穗马上进行扦插，则下端 容易霉烂而影响成活率。红叶乌桕对土壤要求不苛刻，栽培宣选择排水良好、阳光充足 的地段种植。 四1 1 i 农业大学硕士学位论文 2 2 植物组织培养中再生体系建立的研究进展 目前，对植物组织再生的研究越来越广泛，其中包括裸子植物、双子叶植物和单子 叶植物，由此可知再生在植物中是一个非常普遍的现象。但是，仍有很多优良的植物种 类没有完全建立起再生体系1 4 ”，如在果树中，即便是采用化学及电融合法已经获得了 柑橘、李、梨、柿、称猴桃、苹果等多种果树的种问、属间甚至亚科间近1 0 0 个组合的 体细胞杂种或胞质杂种，可是能够完成植株再生的较少。植物细胞培养技术的理论研究 和品种改良的应用都依赖于细胞或原生质体再生植株的能力；植物的遗传工程和转基因 植株的鉴定亦依赖于转化细胞再生植株的能力：原生质体培养和细胞融合的利用、无性 系变异与突变体筛选同样依赖于培养细胞再生植株的频率。因此离体培养细胞或组织发 生植株再生的研究是首要而关键的问题【6 。 植物组织培养获得再生植株有两条途径【7 。9 】：器官发生和体细胞胚胎发生。器官发 生途径是指离体植物组织或细胞在组织培养的条件下形成不定芽、根和花芽等器官的过 程。器官发生包括由茎尖、腋芽、叶片、球茎、鳞茎等外植体直接分化成器官的直接发 生和外植体先脱分化形成愈伤组织再分化成器官的间接器官发生，此途径中茎、芽和根 是在愈伤组织或外植体的不同部位分别独立形成的。体细胞胚胎发生途径是指双或单倍 体的体细胞在特定条件下，未经性细胞融合而通过与合子胚胎发生类似的途径发育出新 个体的形态发生过程。外植体通过培养分化出胚状体，在形态学上，它与合子胚一样具 有经原胚、心形胚、鱼雷胚及至具子叶的成熟胚的发育程序；在组织学上，它同亲本没 有维管束联系并容易与母体分离。由于成熟的体细胞胚具有根茎两个极性结构，因此 可一次性再生完整植株1 ”。 2 _ 2 1 器官发生 植物的离体器官发生是指离体的组织或细胞在组织培养的条件下形成不定芽、根和 花芽等器官的过程。离体器官发生包括直接器官发生( 即由外植体直接发生，不经过 愈伤阶段就可以分化出器官) 和间接器官发生( 经过愈伤阶段) ，后者是指从愈伤组织表面 或内部形成芽和根的现象。离体器官发生是植物再生完整植株的最主要的方式之一。它 不仅在大量无性繁殖植物上具有重要的应用价值，而且是利用生物技术对植物进行遗传 红叶乌桕组织培养及植株再生研究 改良的前提和基础。在一些生物技术中如细胞融合培养体细胞杂种、利用花粉和胚乳获 得单倍体或多倍体植株和培育转基因植物等都需要进行离体器官发生和植株再生【1 4 “1 ， 另外离体器官发生还涉及到植物发育调控机制等基础理论问题 2 8 】。因而它既是重要的实 践问题又是重要的理论问题。目前，很多的木本植物和草本植物都进行了器官发生的研 究，并取得了一定的进展。影响植物器官发生的因子主要有： 2 2 1 1 基因型 基因型是影响植物器官发生的关键因子。基因型不同其再生能力和频率都有较大的 差异。许多学者研究表明同一物种不同的基因型之间存在着很大的差异。李昌珠等【1 6 】 用1 2 个基因型欧洲梨茎尖作为外植体，结果发现不同基因型增殖和形态分化显著不同； c o l e m a n e t a l 1 7 1 将1 6 种不同基因型的美洲黑杨( p d e l t o i d e s ) 茎段接种在附加z t 的培养基 中，有6 种难诱导，4 稀诱导率达5 以上，其余6 种则介于3 至2 3 之间。王艳等【1 8 1 总结出基因型的差异主要是核物质的不同，而相同基因型的不同外植体类型之间，主要 是细胞质的差异，不同的基因型，在同样条件下具有不同的再生效率，如平邑甜茶、圆 叶海棠等和栽培品种中的嘎拉、乔纳金、富士、千秋、北斗等苹果种类，虽然都能成功 地培育出再生植株，但其再生效果不同，而且需要不同的再生条件。而宁淑香f 1 卅等采用 组织培养的方法建立了6 种优良大樱桃砧木无性系，并对这些砧木的分化能力及生根情 况进行了比较，从中发现虽然不同的砧木分化力有别，但却都能在同一培养基上分化， 说明基因型相近的植物，在植物组织培养中要求的条件相同或相近。 2 2 _ 1 2 外植体种类、发育阶段及处理 外植体种类及发育阶段也是影响植物器官发生的重要因子。s t a m p 等【2 02 1 1 以欧洲葡 萄的叶柄和受伤叶片培养于n n 6 9 + b a 2 m g l 的培养基中3 周内再生出了不定芽。最幼 嫩的叶片( 长1 - 8 m m ) 生成不定芽的几率最高，9 0 的叶柄，1 6 的叶片都可再生出不定 芽，但其下部叶片的再生率较低。如用烟草的茎、髓、根、叶肉组织、叶胚和种子等不 同器官或组织进行培养时均能在同样的条件下诱导形成愈伤组织并进而使之形成芽和 根，并再生成植株【2 2 】。袁燕等1 2 3 1 用水花生的根、茎、叶、叶柄来诱导愈伤组织，发现茎 和叶的愈伤组织的诱导率均较高，两者相比，茎段所产生的愈伤组织较大而多，茎段仍 青，叶所产生的愈伤组织较小，且叶变枯黄，未见根诱导出愈伤组织。外植体的选择和 四川农业大学硕士学位论文 处理对褐变有较大影响。c h e v e r 2 4 1 分析欧洲栗的酚类含量的变化结果表明，幼龄材料酚 类化合物含量少，而成龄材料比较多。王坚等1 2 5 j 发现樟科樟属植物的茎段在培养基上能 生存并生长得较好，生存率约为8 0 ；叶在培养基上仅少量能生存且生长的很慢，叶的 生存率约为3 0 ；叶柄几乎不能生存。茎段、叶柄、叶三者在培养基上以茎段表象最佳， 生存量、增殖量和生存时间最长。金晓玲等【2 6 】以大叶榉种子的子叶、胚轴、顶芽、嫩枝 叶片和茎段等为外植体，对大叶榉进行愈伤组织诱导及继代培养研究结果表明：不同外 植体的愈伤组织诱导能力有差异，其诱导率按高低顺序排列依次为子叶、胚轴、叶片、 茎段和顶芽。 2 2 - 1 3 培养基成分的影响 主要包括基本培养基、生长调节物质、碳源、培养基的p h 值、活性炭等成分对诱 导植物器官发生和再生植株的影响。组织培养的培养基一般可以分为含盐量高的、高硝 酸钾、中等无机盐和低盐四种类型，不同类型的基本培养基对愈伤组织增长量和次生代 谢产物含量的影响有明显差异。在器官组织培养中，般采用固体培养，而在细胞和原 生质体培养中，则采用液体培养基【2 ”。据1 9 8 7 年陈正华统计，9 7 种木本植物芽诱导有 7 0 种是使用m s 及其改良的培养基，但m s 对某些植物的器官发生却又是是不利的，如 m s 对胶皮枫香树茎尖有毒害作用，n n 6 9 培养基是适于梨叶片再生植株的培养基【2 9 】。 器官发生的不同时期对培养基的要求是不一样的，如银杏愈伤组织、芽、根的诱导培养 基成分是不同的 ”。崔凯荣等6 】在植物组织培养中发现了生长素和细胞分裂素调控形态 发生和植株发育现象，并提出了“激素平衡”假说。这与2 0 世纪4 0 年代末，s h o o g 和 中国学者崔徽凯荣所确立的腺嘌呤生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一的 观点相吻合。之后人们对生长调节物质与形态发生的关系进行了大量研究，使得植物组 织培养技术获得了很大的发展。尽管如此，人们对植物离体器官发生调控机制的了解却 较为有限。2 ，4 - d 、水解乳蛋白( l h ) 和胺态氮能促进银杏胚完成后熟作用，l h 、水解 酩蛋白( c h ) 有利于外植体萌动和分化，低浓度生长素有利于生根，活性炭有利于生根及 防止褐变【3 1 - 3 44 ”。糖的使用浓度多在2 3 ，但不同植物材料对糖类的反应不完全相 同。杨树培养基中糖的使用浓度若超过3 ，则易使愈伤组织变黑老化：另一方面，糖 浓度太低也不宜于愈伤组织的诱导和分化。对于己发生玻璃化的试管苗来说，适当提 红叶乌桕组织培养及植株再生研究 高培养基中蔗糖含量，降低培养基中的渗透势，可以降低玻璃化3 7 1 。培养基的p h 值 还可以通过影响培养物的营养元素的吸收过程来影响呼吸代谢、多胺代谢与脱氧核糖核 酸合成、植物激素进出细胞等作用，进而直接或间接地影响愈伤组织形成及形态建成1 3 。 3 “。活性炭( a c ) 对外植体褐变有一定的抑制作用，活性炭除了能吸附培养基中的酚类 物质、减轻对培养物的毒害外，还在一定程度上降低光照强度，从两方面减轻褐变【4 ”。 但由于活性炭具有较强的吸附能力，它能使培养基内有效物质的浓度降低，从而限制某 些植物的生长。刘用生1 4 2 j 在胡杨的培养基中加入活性炭后芽丛不再增殖，甚至2 周后芽 开始萎黄。 2 2 1 4 其它培养条件 光照、温度、继代培养次数等培养条件也对诱导植物器官发生和再生植株起着重要 的调控作用。一般来说，前期进行暗培养对不定芽的诱导是有利的，但品种不同，培养 基的组成不同，对光的需求也不一样，v i a p l a n a 4 3 】在光下同样诱导出了较高频率的不定 芽。孙清荣等 4 4 1 研究发现，苹果叶片暗培养比光培养有利于促进不定芽的再生。在光照 条件下培养的银杏愈伤组织，生长量大，愈伤组织呈鲜绿色，质地较硬，黄酮类化合物 含量高，在黑暗中诱导的愈伤组织诱导率高，生长速度和生长量也较大，但质地较松， 愈伤组织中测不出黄酮类物质。不同光质其效果差异显著，以红光与白光的效果最好， 绿光与黄光的次之，蓝光的较差【4 ”。低温可以抑制酚类化合物的合成，降低多酚氧化酶 的活性，从而减轻褐变，w a n g 等1 4 6 1 在桃、王续衍等 4 7 1 在苹果的茎尖培养中发现，5 的低温对控制褐变效果十分显著，而且在低温下培养时间越长，褐变越少，但存活率也 随之下降，最佳时间为7 d 左右。温度对试管苗玻璃化有一定影响。h 学贤等1 3 6 1 i a n ： 在1 0 。c 2 6 c 范围内培养的牡丹植株无玻璃苗出现，在2 6 3 0 。c 范围内培养，有6 3 的试管苗发生玻璃化现象，而在3 0 。c 以上培养的牡丹苗竞有8 4 发生玻璃化现象。温 度对生根也有一定影响。苹果无根苗在2 8 生根最佳，而在2 1 和2 3 生根率下降， 在2 2 。c 、2 5 c 或2 9 对生根无反应f 4 7 4 8 1 。继代培养次数对外植体褐变和试管苗玻璃化 也有定影响。李师翁等【4 9 在沙棘嫩茎的愈伤组织培养中，及时转移培养材料，继代周 期不超过4 周，可有效降低愈伤组织的褐变。但继代次数也不可过多，继代4 次或5 次， 则玻璃化频率提高，一般以2 3 次最佳。含有不同浓度n a a 、i b a 的i 2 m s 培养基1 7 4 - 7 6 四川农业大学硕士学位论文 及附加不同含量的活( a c ) f 7 1 性炭有利于诱导生根。刘福建等f 7 7 发现合适的炼苗与移栽 的方法和恰当的基质选择可以大大提高移栽植株的成活率。 2 2 2 体细胞胚发生 植物组织培养中从各种器官、组织外植体，以及悬浮培养的细胞和原生质体都可以 形成类似合子胚的结构，但它们与合子胚起源不同，因此称为不定胚或胚状体 ( e m b r y o i d ) ，由体细胞发生的胚状体称为体细胞胚( s o m a t i c e m b r y o ，s e ) 。植物通过体细 胞胚胎发生途径再生植株因植物种类而异。胚状体的定义包括三点含义5 1 ：胚状体是 组织培养的产物，区别于无融合生殖的胚；胚状体起源于非合子胚，区别于合子胚： 胚状体的形成经历胚胎发育的过程，区别于组织培养中分化的芽体。 自19 5 8 年r e i n e r t 和s t e w a r d 在胡萝h 韧皮部的组织培养中观察到从薄壁细胞形成 胚状体以来，诱导出胚状体的植物不断增加，目前诱导出胚状体的植物已包括了裸子植 物、单子叶植物和双子叶植物中几乎所有重要科的代表。并利用各种不同的器官、组织、 细胞和原生质体进行培养得到了胚状体，至今已有4 3 科9 7 属2 1 0 种植物中有了s e 发 生的报道，其中4 0 多种木本植物获得了体细胞胚【5 2 】。火炬松、挪威云杉、辐射松等树 种体细胞胚发生已应用于生产实践，在阔叶树种中，桉属、檀香属、枫香属、杨属、鹅 掌揪属等树种的组织培养中观察到体细胞胚发生f 7 9 1 。 由于体细胞胚产生的数量多、诱导成苗率高、生产速度快、结构完整、遗传特性比 较稳定、再生植株变异小、其发生和发育途径更接近自然状态等特点，它不仅是植物快 速繁殖的条新途径，为人工种子的制作提供原材料，而且为研究植物细胞的全能性、 细胞分化、发育形态建成、基因表达与调控等一系列重大理论问题提供了理想的实验体 系【5 3 】。据统计，通过悬浮培养，在1 l 培养基中可以产生1 0 万个体细胞胚【5 4 】，因此， 体细胞胚发生途径是目前最有应用前景的快速繁殖手段，如果用于未来的人工造林，还 可以获得更大的潜在遗传增益。同时，为优良基因型的种质保存、繁殖、以及细胞培养 和原生质培养难以分化的植物开辟了条有效的发育途径。因而，体细胞胚发生途径在 理论研究和应用上具有重大意义。 红叶乌桕组织培养及植株再生研究 2 2 2 1 基因型 季良越等【5 5 】对玉米的4 3 个基因型的未熟幼胚进行离体培养，结果发现4 3 个基因型 中仅部分基因型再生了植株，基因型是能否再生植株的主要因素。张家明等1 5 6 1 在特定培 养条件下对6 2 个陆地棉( g o s s y p i u m h i r s u t u m l ) 品种进行了离体培养研究。结果表明，基 因型对愈伤组织的诱导率没有明显影响，但对体细胞胚胎发生能力影响很大基因型对愈 伤组织的生长速度有明显影响。双列杂交结果表明，基因型间愈伤组织生长速度和体细 胞胚胎发生能力存在显著差异。陈金慧等 5 7 1 发现在参试杂交鹅掌楸的3 个基因型中， x 8 号亲本上采集的聚合果各个发育阶段试材均未能诱导出体细胞胚，而亲本n 和亲本 f 的诱导频率较高，胚性愈伤组织诱导出来以后，多数能顺利产生体细胞胚。 2 2 2 2 外植体种类及发育阶段 能够产生胚状体的外植体种类多种多样，如根、茎、叶、下胚轴、花芽、花药、子 叶等器官，还有各种单细胞、游离的小孢子、原生质体以及胚状体本身都有产生胚状体 的能力。 汤浩茹等【5 8 1 发现核桃体胚发生不仅与基因型有关，而且还与外植体的种类有关。刘 德华等 5 9 1 将不同茶树品种以叶柄为外植体诱导体细胞胚胎发生时，发现分化率存在明显 差别。欧阳权等 6 0 l 在火炬松体细胞胚胎诱导过程中也有类似报道。外植体的来源及其所 处的发育阶段或生理状态也是影响体细胞胚发生的重要因子。子叶、胚珠、胚及幼胚和 下胚轴是研究体细胞胚胎发生最常用的外植体。在松属植物中，子叶前期的种胚最适， 而云杉属植物中子叶期种胚较好川。已报道的诱导落叶松体胚发生的外植体，有未成熟 合子胚、成熟合子胚、胚轴、子叶等。其中，以未成熟合子胚为主要材料【6 2 】。花器官也 经常作为体细胞胚胎发生的外植体，如葡萄的花丝、橡胶树的花药等均已诱导体细胞胚 胎发生成功【6 3 删。叶片、茎段、茎尖等其他外植体也可诱导体细胞胚胎发生。达克东 研究了苹果栽培品种试管苗叶片的离体培养，获得了体细胞胚胎，并能萌发成小植株。 s u s s e x l 8 0 1 以构骨叶为外植体材料，可以实现体细胞胚的直接发生。成功的还有桑树幼叶 直接诱导发生体细胞胚f “。四合木蚓的茎尖、茎段、叶和花蕾均能诱导体细胞胚胎发生， 但诱导率有明显差异，其中花蕾的肉质花托最高，可达1 0 0 。 四川农业大学硕士学位论文 2 2 2 3 生长调节剂 胚状体的发生是在一定的激素种类和合适的组合浓度的诱导下，形成胚性愈伤组 织，把这些愈伤组织挑选出来，转入专门的再生培养基，让胚性愈伤发育成胚状体，再 经过胚状体的各发育阶段最终获得再生芽的过程。这种途径也适合建立转基因的再生系 统，最有利于获得真正的转化体。一般来说，林木体细胞胚发生的胚性愈伤组织是在含 较高水平的生长调节物质的固体培养基上起始的，生长调节物质可以包括至少种生长 素和细胞分裂素，使用的种类及其浓度要根据物种而定f 7 9 1 。韩碧文f 6 s 】把体细胞发生与激 素的关系归结为三种情况：( 1 ) 不需加任何生长调节剂；( 2 ) 必需加生长素和细胞分 裂素： ( 3 ) 只需加生长素类。不同种类植物以及同一植物愈伤组织的诱导和体胚的诱 导，对激素的种类、浓度和作用时间的要求不同【6 9 】，激素对体胚的作用主要是诱导基因 的差别表达。 在含有适宜浓度的2 ，4 - d 的培养基上，可以从植物的外植体或其愈伤组织上产生 胚性细胞，然后降低浓度来诱导胚状体，如萝h 、长寿花、玉米。陈利萍等发现一品红 可用2 ，4 - d 来诱导胚性愈伤组织，又用z t 来诱导产生胚状体 7 0 - 7 2 。1 9 9 3 年s a l a n d y 等用佛罗里达红豆杉针叶作为外植体诱导出的愈伤组织在含lm g l 的2 ，4 一d 和1m g l 谷氨酞胺的m s 培养基中进行细胞悬浮培养，从愈伤组织中诱导出了胚性结构细胞 3 1 1 。 而爬山虎则用6 - b a 和n a a 就可诱导出胚性愈伤组织及胚状体；张宝红等【7 3 1 用l1 种激 素研究了外源激素对棉花胚性愈伤组织增殖、胚胎发生和发育的调控作用，结果表明， 不同激素对棉花胚性愈伤组织增殖、胚胎发生与发育的影响不同，除2 ，4 d 和b a 对 棉花胚性愈伤组织的增殖影响不大外，其它激素对棉花胚性愈伤组织的增殖均具有抑制 作用，且具有一定的时间效应，同时还受基因型的影响。 3 研究目的与意义 红叶乌桕具有很高的观赏和实用价值。目前红叶乌桕的繁殖方式还是以扦插为主， 未见相关的组培报道，而长期的扦插繁殖容易造成真菌和病毒的累积，导致品种退化， 完善的组织培养技术可以成为红叶乌桕新品种培育及生理生化机制研究的重要手段，因 此红叶乌桕组织培养的应用前景十分广阔，它不仅可以快速繁殖红叶乌桕优良种苗，用 红叶乌桕组织培养及植株再生研究 于大面积人工栽培生产，可满足市场需求，还为下步筛选优良无性系，建立采穗圃奠 定良好的基础。本试验通过对红叶乌桕的组织培养进行研究，以期建立基于胚状体再生 植株的技术体系，提高其增殖系数，满足生产需要。 目前，在已经成功诱导体细胞胚形成的植物中，草本植物占了大多数，而木本植物 只有4 0 多种。所以研究红叶乌桕胚状体的发生不但具有重要的实践意义，还可以丰富 木本植物体细胞胚的研究。 4 材料与方法 4 1 试验材料 以四川农业大学林学园艺学院林木遗传育种实验室苗圃中以盆栽红叶乌桕为组织 培养试验材料。 4 2 技术路线 4 3 试验方案与方法 4 3 1 初代培养 4 3 。1 1 外植体的选择 本实验以红叶乌桕带芽茎段及叶片作为接种外植体材料，不同季节的外植体材料对 实验效果影响很大，取材时间和材料选择是组织培养关键技术之一：在预备实验阶段进 行外植体材料的选取实验。外植体的采集：通过预备实验，确定为在4 月、1 0 月，取生 t 毋) l l 农业大学硕士学位论文 长旺盛、无病虫害、带有腋芽的健壮红叶乌桕嫩芽、幼叶为外植体材料最佳。 4 。3 1 2 外植体的消毒与接种 将红叶乌桕带芽茎段剪成带有2 - 3 个节、长为4c m 左右，取保留叶柄的幼嫩叶片， 用清水浸泡5 1 0m i n ，然后加入洗衣粉流浸泡1 0m i n 后，用流水水冲洗2 。3h ，滤干备 消毒处理。 消毒按以下程序进行处理：将预处理过的外植体放在超净工作台上用7 0 的酒精浸 泡2 5 - 3 5 ，一取出放入0 1 升汞溶液中消毒6 1 0m i n 无菌水冲洗5 - 6 次滤去 无菌水后备用。接种时，在超净工作台上将外植体材料茎段切成lc r l l 左右、带有1 2 个 腋芽，叶片切割成1 0c ：1 1 1 2 大小，按无菌操作要求接于培养基中。实验中将带柄叶片分 别切取0 5 * 0 5c n l 2 、1 0 毕1 0c m 2 、1 5 1 5c m 2 大小，分别接种到启动培养基上；将接种 的茎段及带柄叶片一部分进行光照培养( 暗培养0d ) ，另一部分暗培养( 1 周暗培养， 2 周暗培养) 。最后统计褐化率、存活率( 接种后2 0d ) ，选择最优接种方案。 4 3 1 3 带芽茎段有效芽的诱导 接种外植体：带芽茎段 基本培养基：m s 生长调节剂：6 - b a 、i b a 、n a a 试验采用三因素三水平正交试验设计( 表1 ) ，每处理接种1 5 个外植体，各处理重 复3 次。 4 3 1 。4 叶片愈伤组织的诱导 接种外植体：带柄叶片 基本培养基：m s 生长调节剂：6 - b a 、2 ，4 - d 、n a a 试验采用三因素三水平正交试验设计( 表2 ) ，每处理接种2 0 个外植体，各处理重 复3 次。 红叶乌桕组织培养及植株再生研究 表1带芽茎段有效芽的诱导正交试验设计及实施方案l 9 ( 3 4 ) t a b l e1 o r t h o g o n a ld e s i g n a n di m p l e m e n t a r ys c h e m eo f b u d si n d u c t i o no f s t e m sl 9 ( 3 4 ) 表2 叶片愈伤组织诱导的正交试验设计及实施方案l 9 ( 3 4 ) t a b l e2o r t h o g o n a ld e s i g na n di m p l e m e n t a r ys c h e m eo f c a l l u si n d u c t i o no f l e a v e sl 9 ( 3 4 ) 4 3 2 继代增殖与分化培养 4 3 2 1 带芽茎段不定芽的增殖培养 接种外植体：带芽茎段 基本培养基：m s 生长调节剂：6 - b a 、i b a 、n a a 四川农业大学硕士学位论文 试验采用三因素三水平正交试验设计( 表3 ) ，每处理接种2 0 个外植体，各处理重 复3 次。 表3 带芽茎段芽增殖的正交设计及实施方案l 9 ( 3 4 ) t a b l e3o r t h o g o n a ld e s i g na n di m p l e m e n t a r ys c h e m eo f b u d sp r o l i f e r a t i o no f s t e m sl 9 ( 3 4 ) 4 3 - 2 - 2 愈伤组织增殖培养 基本培养基：m s 生长调节剂：b a 、2 ，4 - d 、n a a 将初代培养产生的愈伤组织转接到增殖培养基上，使愈伤组织进一步大量生长。试 验采用三因素三水平正交试验设计( 表4 ) 。每处理接种3 0 块1 0c m 2 大小的愈伤组织， 各处理重复3 次。2 0d 、4 0d 时分别统计其增殖倍数。 4 3 2 3 愈伤组织的分化培养 基本培养基：m s 生长调节剂：6 - b a 、n a a 将增殖后的愈伤组织转接到分化培养基上，使愈伤组织分化成苗。试验采用二因素 三水平完全试验设计( 表5 ) ，每处理接种3 0 块1 0 c m 2 大小的愈伤组织，各处理重复3 次。3 0d 后统计其分化倍数。 红叶乌桕组织培养及植株再生研究 表4 叶片愈伤组织的增殖正交设计方案及实施方案l 9 ( 3 4 ) t a b l e4o r t h o g o n a ld e s i g na n di m p l e m e n t a r ys c h e m ef o rc a l l u sp r o l i f e r a t i o ni n d u c t i o nl 9 ( 3 4 ) 表5 愈伤组织分化正交设计方案及实施方案l 9 ( 3 4 ) t a b l e5o r t h o g o n a ld e s i g nm a di m p l e m e n t a r ys c h e m ef o rc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o ni n d u c t i o nl 9 ( 3 4 ) 4 3 3 生根与壮苗培养 基本培养基：】2 m s 生长调节剂：i b a 、n a a 将长至2 - 3 c m 高的小芽，接种于生根壮苗培养基中，以使根芽成比例生长。试验采 用含有不同浓度n a a 、i b a 的1 2 m s 培养基及附加不同含量的活性炭( a c ) 。试验采用 四川农业大学硕士学位论文 三因素三水平正交试验设计。每个处理接种外植体1 5 个，重复3 次。( 表6 ) 表6 生根壮苗试验的正交设计及实施方案l 9 ( 3 4 1 t a b l e6 o r t h o g o n a ld e s i g na n di m p l e m e n t a r ys c h e m eo f r o o t i n gl 9 ( 3 4 ) 4 3 4 体细胞胚的诱导及再生 4 3 4 1 胚性愈伤组织的诱导及组织观察 接种外植体：叶片愈伤组织 基本培养基：m s 生长调节剂：z t 、2 , 4 一d 、n a a 试验采用三因素三水平正交试验设计( 表7 ) ，每处理接种2 0 块1c m 2 大小的愈伤 组织，各处理重复3 次。3 0d 后统计其愈伤组织诱导率及愈伤组织生长状况及增殖倍数。 并对其进行组织观察。 4 3 4 。2 体细胞胚的诱导 接种外植体：胚性愈伤组织 基本培养基：m s 生长调节剂：z t 、n a a 每个处理组合接1 0 块胚性愈伤组织。试验采用二因素三水平完全试验设计，每处 红叶乌桕组织培养及植株再生研究 理重复3 次。( 见表8 ) 表7 不同激素配比对胚性愈伤组织影响的正交设计及实施方案l 9 ( 3 4 1 t a b l e7o r t h o g o n a ld e s i g na n di m p l e m e n t a r ys c h e m ef o re m b r y og e n i ec a l l u sl 9 ( 3 4 1 表8 体细胞胚的诱导的正交设计及实施方案l 9 ( 3 4 ) t a b l e8 o r t h o g o n a ld e s i g n a n di m p l e m e n t a r ys c h e m eo f s o m a t i ce m b r y ol 9 ( 3 4 ) 1 i1 1 00 21 2 1 00 0 5 3 131 0 0 1 421 2 00 5 22 2 00 0 5 6 23 2 00 1 7 31 3 00 8 32 3 00 0 5 933 3 00 1 4 3 4 3 植株再生 有胚状体发生后，将胚性愈伤组织转接在无激素m s 培养基上，使胚状体进一步发 育成茁。 四川表业走学颠士学位论t 4 3 5 炼苗与移栽 材料：瓶内生根培养获得的带根健壮苗。 基质；珍珠岩、蛭石、河沙 材料预处理：将培养有生根的瓶苗转移到室温条件f ，揭去封口膜，放置1 - 3d ， 然后取出单苗洗净根上带的培养基，把根浸泡在02 的多菌灵溶液中浸泡3r a i n ，栽人 以下不同基质中( 表9 ) ，观察红叫乌桕组培苗的生长隋况。每个处理接种外植体1 0 个， 重复3 次。 表9 不同基质对炼苗移栽成活率的影响 t a b l e9t h ee f f e c t o f l i v i n gr a t eo f d i f f c r c n t m l d i u m o nd o m e s t i c a t i o n 她理号基质成分 4 3 6 培养条件 珍珠岩：河沙( 1 ：1 ) 珍珠岩：蛭石f 】：1 ) 珍珠岩，蛭石：河沙( i ：1 ：】) 珍珠者蛭石i 河沙f 3 ：2 ：j ) 培养条件如无特别说明，温度均为2 5 2