（急诊医学专业论文）th17细胞在脓毒症中的作用机制研究.pdf

一 | 军医进修学院硕士学位论文 军医进修学院 研究生学位论文原创性声明 秉承我院“敬业、勤奋、求实、创新 的学风，本人声明：所呈交的论文是 我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特 别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写 过的研究成果，也不含为获得我院或其他教育机构的学位及证书而使用过的材料， 对本文的研究作出贡献的个人或集体，均已在文中做了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名： 指导教师签名： 日期：厶f o 、f 叮 日期：厶l p 巧 军医进修学院 研究生学位论文版权使用授权书 本人保证毕业离院后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为军医进修 学院或解放军总医院。学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文原件、复 印件和电子版本，可以采用影印、缩印、扫描或其它手段保存论文以供被查阅和 借阅。学院可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) 。 论文作者签名：易叭同期： 指导教师签名 日期： 如t o 5 巧 如l 兮论 上 j 1 一 j 军医进修学院硕士学位论文 目录 目j 录1 缩略词表3 中文摘要s 英文摘要7 前言1 0 试验流程图1 1 实验一a p a c h ei i 评分与脓毒症患者预后关系研究1 2 1 实验目的1 2 2 实验对象1 2 3 实验方法1 2 4 实验结果一王3 4 1 脓毒症患者a p a c h ei i 评分分析1 3 4 2 脓毒症患者a p a c h ei i 评分与各临床指标相关性分析1 4 4 3 脓毒症患者a p a c h ei i 评分与临床预后相关性分析一1 5 5讨 论一1 6 实验二t h l 7 细胞在脓毒症发病中的作用机制研究1 8 1 实验目的1 8 2 实验材料一1 8 3 实验方法1 9 4 实验结果2 0 4 1 脓毒症患者与健康对照组t h l 、t h l 7 表达频率分析2 0 4 2 脓毒症各分组与健康对照组t h l 、t h l 7 表达频率分析2 1 4 3 脓毒症患者t h l 7 表达频率与a p a c h ei i 评分相关性分析2 3 5 讨论2 4 实验三单核细胞在脓毒症发病中的作用机制研究2 7 1 实验日的一2 7 2 实验材料2 7 一 r j l 1 1 l - 军医进修学院硕上学位论文 3 实验方法2 7 4 实验结果2 7 4 1 脓毒症患者与健康对照组单核细胞计数分析2 7 4 2 脓毒症患者与健康对照组单核细胞群组成分析2 8 4 3 脓毒症患者与健康对照组单核细胞弧群h l a d rm f l 分析3 1 4 4 脓毒症患者与健康对照组单核细胞群c d l 4m f l 分析3 4 5 讨 论。3 8 实验四单核细胞与淋巴细胞共培养实验4 0 1 实验目的4 0 2 实验材料4 0 3 实验方法4 0 4 实验结果4 l 一。 5 讨论4 2 全文总结一4 4 参考文献4 5 文献综述4 9 攻读学位期间发表文章情况6 2 致谢6 3 i j jj习 军医进修学院硕士学位论文 缩略词表 英文缩写英文全称 中文全称 a d a t o p i cd e r m a t i t i s 异位性皮炎 a c u t e p h y s i o l o g y a n dc h r o n i ch e a l t h急性生理学及慢性健康状 a p a c h e e v a l u a ti o n 况评分 a p c a l l o p h y c o c y a n i n异藻蓝蛋白 a p r a c u t e p h a s e r e a c t a n t s 急性时相反应蛋白 棚a c t i v a t e dp a r t i a lt h r o m b o p l a s t i nt i m e 活化部分凝血活酶时间 c o m p e n s a t o r ya n t i i n f l a m m a t o r yr e s p o n s e c a r s 代偿性抗炎反应综合征 s y n d r o m e c dc l u s t e ro fd i f f e r e n t i a t i o n分化群 c fc y s t i cp u l m o n a r yf i b r o s i s囊性纤维化 c o x c y cl o o x y g e n a s e环氧合酶 c r pc r e a c t i v ep r o t e i nc 反应蛋白 c x c lc x c 。c h e m o k i n eii g a n d c x c 趋化因子配体 d cd e n d r i t i cc e l1 s 树突细胞 e v e c z e m av a c cin a t u m牛痘性湿疹 f i t cf l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e 异硫氰酸荧光素 g - c s fg r a n u l o c y t ec o l o n ys t i m u l a t i n gf a c t o r粒细胞集落刺激因子 g r a n u l o c y t e 。m a c r o p h a g ec o l o n ys t i m u l a t i n g粒细胞巨噬细胞集落刺激 g m c s f f a c t o r因子 h c th e m a t o c r it 红细胞压积 h i vh u m a ni m m u n o d e f i c i e n c yv i r u s艾滋病病毒 h l ah u m a nl e u k o c y t ea n t i g e n人类白细胞抗原 i c ui n t e n s i v ec a r eu n i t 重症监护单元 i f n yi n t e r f e r o n y y 干扰素 i li n t e r l e u k i n白介素 3 -rl-fl-i_，卜 -rlr 军医进修学院硕士学位论文 i l - 1 7 r i l 1 7 r e c e p t o r i l - 1 7 受体 i n ri n t e r n a t i o n a ln o r m a l i z e dr a t i o 国际标准化比值 l c m l y m p h o c y t i cc h o r i o m e n i n g i t i s淋巴细胞脉络丛脑膜炎 l c n 2 1 i p o c a l i n2脂质运载蛋白2 l p s l i p o p o l y s a c c h a r i d e s 脂多糖 m f im e a nf l u o r e s c e n c ei n d e x 平均荧光强度 m i p - 2m a c r o p h a g e 。i n f l a m m a t o r yp r o t e i n - 2 巨噬细胞炎性蛋白2 m 伊sm e t a ll o p r o t e i n a s e s 基质金属蛋白酶 m o d s m u l t i p l eo r g a nd y s f u n c t i o ns y n d r o m e多器官功能不全 n a p an e u t r o p h i1 一a c t i v a t i n gp r o t e i na中性粒细胞激活蛋白a n kn a t u r a lk i l l e rc e l l 自然杀伤细胞 p e p h y c o e r y t h r i n藻红素 p e r c pp e r i d i n i n - c h l o r o p h y l lp r o t e i n 多甲藻黄素一叶绿素蛋白 p m ap h o r b o lm y f is m t ea c e t a t e 佛波酯 s i r s s y s t e m i ci n f l a m m a t o r yr e a c t i o ns y n d r o m e全身炎症反应综合症 s i rs i m i a ni m m u n o d e f i c i e n c yv i r u s 猴免疫缺陷病毒 “统计产品与服务解决方 s p s ss t a t i s t i c a lp r o d u c ta n ds e r v i c es o l u t i o n s 案”软件 s i g n a l t r a n s d u c e ra n da c t i v a t o r o f s t a t信号传导与转录激活因子 t r a n s c r i p ti o n t g f t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r 转化生长冈子 t hth e l p e rc e l l 辅助性t 细胞 实验性泰氏小鼠脑脊髓炎 t m e vt h e i l e r sm u r i n ee n c e p h a l o m y e l i t i sv i r u s 病毒 t n ft u m o r n e c r o sis f a ct o r 肿瘤坏死冈子 t r e gr e g u l a t o r yt调节性t 细胞 v vv a c c i n i av i r u s牛痘病毒 w b c w h i t eb l o o dc e l l 白细胞 - 4 军医进修学院硕士学位论文 t h l 7 细胞在脓毒症中的作用机制研究 中文摘要 背景：t h l 7 是新近发现的一种独立的辅助性t 细胞亚群，以分泌i l 1 7 为主要特征。该细胞在防御胞外细菌感染，介导慢性免疫炎症、自身免疫疾 病以及肿瘤免疫中发挥重要作用已证实i l 1 7 与肺炎克雷白杆菌、啮齿枸 橼酸杆菌、幽门螺旋杆菌、沙门氏茵、白色念珠菌、乙肝病毒以及寄生虫等 病原菌所致感染的转归密切相关但就目前研究现状而言有以下问题仍未解 决：1 、t h l 7 在脓毒症发病中的免疫调节机制；2 、单核细胞在脓毒症发病的 免疫机制中占有核心地位，t 1 1 1 7 与单核细胞的关系 目的：探讨t h l 7 在脓毒症发病中的免疫调节机制及与单核细胞间的相 互作用关系。 方法：本实验共分四个部分 实验一：a p a c h ei i 评分与脓毒症患者预后关系的研究 收集脓毒症患者体温、白细胞计数、c 反应蛋白、动脉血乳酸、血糖等 临床资料，统计学分析a p a c h e i i 评分与预后的关系。 实验二：t l l l 7 在脓毒症发病中作用机制的研究 根据疾病严重程度，将脓毒症患者分为脓毒症、重症脓毒症与脓毒性休 克三组。进行全血细胞刺激培养、胞内细胞因子染色，流式细胞仪检测，f l o w j o 软件分析t 1 1 1 7 表达频率。 实验三：单核细胞在脓毒症发病中作用机制的研究 按上述分组方法，对入组患者全血标本进行细胞染色，流式细胞仪检测， f l o w j o 软件分析单细胞亚群组成比例以及h l a d r 、c d l 4 平均荧光强度。 实验四：单核细胞与1 1 1 1 7 间的相互作用关系 分离健康人p b m c ，在不同l p s 浓度下进行细胞培养3 天，随后进行细 胞内因子染色与流式细胞仪检测，f l o w j o 软件分析t h l 7 表达频率。 结果： 实验一：脓毒症患者a p a c h ei i 评分与c 反应蛋白、动脉血乳酸以及 血糖呈正相关关系；a p a c h e i i 评分与预后呈显著负相关关系( r = 一o 6 6 7 ，p 与 l p r l-rrl 军医进修学院硕士学位论文 0 0 0 1 ) ；三组脓毒症患者间a p a c h ei i 评分均有显著性差异( p o 0 1 ) 。 实验二：脓毒症患者t h l 7 表达频率升高，较健康对照组差异显著( p 0 0 1 ) ，t h l 表达差异不显著( p = 0 0 6 2 ) ；按疾病严重程度分四组后，脓毒症 组与重症脓毒症组间差异不显著( p = 0 0 7 6 ) ，其余各组间均具有显著差异( p o 0 1 ) ，其中重症脓毒症患者t h l 7 表达频率最高，脓毒性休克组频率最低； 脓毒症患者t h l 7 表达频率与a p a c h ei i 评分呈负相关( r = 0 2 9 9 p = 0 0 1 4 ) 实验三：脓毒症患者单核细胞绝对计数较健康对照组升高( p 脓毒性休克组。 实验四：加入l p s , , l - 激e jp b m cn 1 7 表达频率较高，l p s 浓度为2 0 n g m l 时t h l 7 表达频率最高为5 8 7 。 结论： 1 a p a c h ei i 评分可以较好的反映脓毒症患者预后； 2 t 1 1 7 在脓毒症发病的免疫机制中可能发挥重要作用； 3 激活的单核细胞可以促进t h l 7 分化与扩增；c d l 4 + c d l 6 + 单核细胞 亚群起主要促进作用。 关键词：脓毒症，辅助性淋巴细胞1 7 ，单核细胞，a p a c h e i i 评分 军医进修学院硕士学位论文 m e c h a nis mo ft h er oieo ft h l7o eiisint h ep a t h o g e n e sis b a c k g r o u n d ： o fs e p sis a b s t r a c t t h l7c e l l sa r ea ni n d e p e n d e n tt h e l p e rc e l ls u b s e t sw h i c hh a v et h ef e a t u r et o s e c r e t ei n t e r l e u k i n l 7 ( i l 一1 7 ) t h l 7c e l l sp l a ya 1 1k e yr o l ei nt h ed e f e n s eo f e x t r a c e l l u l a rb a c t e r i a li n f e c t i o n ，m e d i a t i n gc h r o n i ci m m u n ei n f l a m m a t i o na n di n t u m o ri m m u n i t y i l 17h a sac l o s e l yr e l a t i o n s h i pw i t l lt h ei n f e c t i o no fk l e b s i e l l a p n e u m o n i a , c i t r o b a c t e rr o d e n t s ，h e l i c o b a c t e rp y l o r i ，s a l m o n e l l a , c a n d i d a a l b i c a n s ，h e p a t i t i sbv i r u sa n dp a r a s i t i c h o w e v e r , i nt e r m so ft h ep r e s e n t c o n d i t i o no ft h ef o l l o w i n gp r o b l e m sr e m a i nu n s o l v e d ：1 ) t h ei m m u n er e g u l a t o r y m e c h a n i s m so ft hl7c e l l si nt h ep a t h o g e n e s i so fs e p s i s ；2 ) m o n o c y t eh a st h ek e y p o s i t i o ni nt h ep a t h o g e n e s i so fs e p s i s ，a n dw h a t st h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h e t h17c e l l sa n dm o n o c y t e o b j e c t i v e ： t oi n v e s t i g a t et h ei m m u n er e g u l a t o r ym e c h a n i s m so ft h l7c e l l si nt h e p a t h o g e n e s i so fs e p s i sa n dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h l 7c e l l sa n dm o n o c y t e m e t h o d s ：t h ei n v e s t i g a t ew a sd i v i d e di n t of o u rp a r t s p a r tl ：t oi n v e s t i g a t et h er e l a t i o n s h i pb e t w e e na p a c h ei is c o r ea n ds e p t i c p a t i e n t s t oc o l l e c tt h ec l i n i c a ld a t ao ft h e s e p t i c p a t i e n t sa n dt oa n a l y s i s t h e r e l a t i o n s h i po f a p a c h e i is c o r ea n dp r o g n o s i sw i t hs t a t i s t i c a lm e t h o d s p a r t2 ：t oi n v e s t i g a t et h ei m m u n er e g u l a t o r ym e c h a n i s m so ft hl7c e l l si nt h e p a t h o g e n e s i so fs e p s i s t od i v i d ea l lt h es e p t i cp a t i e n t si n t os e p s i s ，s e v e r es e p s i sa n ds e p t i cs h o c k g r o u p sa c c o r d i n gt od i s e a s es e v e r i t y t o g e t h e rw i t ht h eh e a l t h yc o n t r o lg r o u p ，t h e w h o l eb l o o do ft h r e eg r o u p sw a sc u l t u r e d ，s t i m u l a t e d ，s t a i n e da n dt e s t e db yf l o w 7 -r-i-i， 军医进修学院硕士学位论文 c y t o m e t r y , t h e nt oa n a l y z et h ef r e q u e n c yo f t h et h l7c e l l s p a r t3 ：t oi n v e s t i g a t et h ei m m u n er e g u l a t o r ym e c h a n i s m so f m o n o c y t ei nt h e p a t h o g e n e s i so fs e p s i s t h eb l o o ds a m p l e so ft h ep a t i e n t sa n dt h eh e a l t h yv o l u n t e e r sw e r es t a i n e d t h e nw e r et e s t e db yf l o wc ”o m e t r y t oa n a l y z et h ec o m p o s i t i o no ft h ep r o p o r t i o n o fm o n o c y t es u b s e t sa n dt h em f io fh l a - d ra n dc d14 p a r t4 ：t oi n v e s t i g a t et h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h l7c e l l sa n dm o n o c y t e t h ep b m ci s o l a t e df r o mh e a l t h yv o l u n t e e rw a sc u l t u r e dw i t h a n t i - c d 3 ， a n t i - c d 2 8a n dd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fl p sf o r3 dt h e nw a ss t a i n e da n dt e s t e d r e s u l t s ： p a r tl ：a p a c h ei is c o r e so ft h et h r e es e p t i c g r o u p sw e r es i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t ( p o o1 ) ；a p a c h ei i s c o r eh a sap o s i t i v ec o r r e l a t i o nw i t hc r p , b l o o d l a c t a t ea n dg l u c o s e ；a p a c h ei is c o r eh a sas i g n i f i c a n t l yn e g a t i v e l yc o r r e l a t i o n w i t ht h ep r o g n o s i s ( p o 0 0 1 ) p a r t2 ：t h ef r e q u e n c yo ft h l7c e l l so fs e p t i cp a t i e n t sw a sh i g h e rt h a nt h e c o n t r o l 伊o u p ( p o 0 1 ) ；t h lc e l l sh a dn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ；t h e r ew e r e s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s ( p 2 0 次分或p a c 0 2 1 2 1 0 9 l 或 1 0 。 脓毒症感染导致的s i r s 重症脓毒症脓毒症合并器官功能障碍、低血压或低灌注 脓毒性休克充足的液体复苏后仍存在脓毒症导致的低血压 以下患者剔除：自身免疫系统疾病( 如类风湿性关节炎、多发性硬化、 系统性红斑狼疮、哮喘等疾病) 、急性脑卒中、心肌梗塞、病毒性肝炎、艾滋 病病毒( h u m a ni m m u n o d e f i c i e n c yv i r u s ，h i v ) 感染以及入院前3 月内使用 过激素或免疫抑制剂。 3实验方法 收集入组患者姓名、年龄、性别、体温、心率、收缩压、舒张压、呼吸、 f i0 2 、p h 、p a 0 2 、p a c 0 2 、氧合指数、c 反应蛋白( c r e a c t i v ep r o t e i n ，c r p ) 、 降钙素原、2 4 h 尿量、i n r 、a p t t 、w b c 、h c t 、血小板、中性粒细胞计数、淋 巴细胞计数、单核细胞计数、乳酸、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素、 军医进修学院硕士学位论文 白蛋白、钾、钠、肌酐、尿毒、血糖、血培养、痰细菌真菌培养、激素使用、 发病日期、入院日期、转入i c u 日期、转出i c u 日期、出院同期、i c u 天数、 住院天数、预后等资料。并计算g l a s g o w 评分与a p a c h ei i 评分得分。结果以 均数标准差( s ) 表示，使用s p s s l 7 0 软件分析数据相关性，采用非参 数检验( m a n n w h i t n e yu ) ，p o 0 5 表示差异有统计学意义，p o o l 表示 差异有显著统计学意义。 4实验结果 4 1 脓毒症患者a p a c h ei i 评分分析 三组患者a p a c h ei i 评分结果差异均有显著统计学意义( p 0 0 1 ) ，其中 脓毒症组评分结果最低，脓毒性休克组评分结果最高( 见表1 - 2 ，图i - i ) 。 表卜2 三组脓毒症患者a p a c h ei i 评分 组别例数a p a c h e l l 分值 脓毒症 1 56 2 6 7 4 - 4 0 9 6 重症脓毒症4 11 1 5 3 7 4 - 7 3 1 8 脓毒性休克 1 1 2 0 2 7 3 4 - 8 5 4 5 注：( d p o o lv g 重症脓毒症，脓毒性休克；p o o lv s 脓毒性休克 4 0 筠 3 0 脓毒症重症脓毒症脓毒性休克 p 屯n 工m h h 评分 军医进修学院硕士学位论文 _ _ _ - _ _ i - - 一 4 2 脓毒症患者a p a c h ei i 评分与各临床指标相关性分析 a p a c h e i i 评分与c r p 、动脉血乳酸与血糖间呈正相关关系。( 见图卜2 、 1 3 、1 - 4 ) 。 o z m i = 1 毛 言 甬 = c 印( m g d 1 ) 图1 _ 2 a p a c 皿评分与脓毒症患者c p , p 水平相关性分析 乳酸( m m o l l l ) 图卜3a p a c i e 评分与脓毒症患者乳酸水平相关性分析 k 一 军医进修学院硕士学位论文 图1 - 4a p a c 髓评分与脓毒症患者血糖水平相关性分析 4 3 脓毒症患者a p a c h e 评分与临床预后相关性分析 a p a c h ei i 评分与预后呈显著负相关( p = 0 0 0 0 ) 。( 见图1 - 6 ) 表卜3 不同预后脓毒症患者a p a c h e 评分 预后 例数 a p a c h e 分值 存活 4 l 7 8 2 9 5 7 4 8 死亡 1 91 9 7 3 7 7 3 4 0 不详71 3 4 2 9 5 8 5 5 注：木p o 0 1v s 死亡 存活死亡 p n 工m 岛 军医进修学院硕士学位论文 图卜6a p a c h ei i 评分与脓毒症患者预后关系 5讨论 急性生理学及慢性健康状况评分系统即a p a c h ei i 评分是目前临床上对 急危重症患者病情最广泛、最具权威的评价系统，它由急性生理学评分、年 龄评分、慢性健康状况评分3 部分组成，最后得分为三者之和。理论最高分 7 1 分，分值越高病情越重。我们应用了该评分系统对本研究入组的脓毒症患 者进行了a p a c h ei i 评分，并对脓毒症、重症脓毒症与脓毒性休克三组患者评 分结果进行了统计学分析，结果发现三组患者评分结果差异具有统计学意义， 其中脓毒症组评分结果最低，脓毒性休克组评分结果最高。据此结果可以看 出，现有的分组方法较好的将入组的脓毒症患者根据疾病严重程度进行区分， 各组患者具有较好的代表性。 该组患者的a p a c h ei i 评分与血糖、c r p 以及乳酸水平均呈正相关。随着 a p a c h e1 i 评分的升高，患者病情随之越重，虽然目前对i c u 患者的血糖已经 给予了很高的关注，并实施了严格的血糖控制计划，但血糖水平仍会随着疾 病的加重而升高，而血糖的异常升高会很大程度上影响患者的预后n7 1 ，所以 进一步严格的监测与控制血糖十分必要，尤其要将控制重点放在病情相对危 重的患者。另外我们可以看到c r p 和乳酸与a p a c h ei i 评分具有较好的相关性， 说明两指标也可以较好的反应疾病严重程度。尤其是乳酸，目前监护室均以 军医进修学院硕士学位论文 2 m m o l l 作危重患者乳酸的相对警戒值n 8 1 ，而本研究仅有7 例患者乳酸水平 高于2 m m o l l ，但乳酸水平仍与a p a c h ei i 有较好的正相关关系，剔除了上述 7 例患者后进行相关分析仍得到类似的结果( r = 0 2 8 7p = o 0 2 6 ) ，说明较 低水平的乳酸已与疾病的严重程度呈明显的正相关。随后我们分析了乳酸水 平与预后的相关关系，结果显示二者无相关关系( r = - o 2 4 0p - - o 0 6 5 ) ，但 已存在负相关的趋势( p 接近0 0 5 ) 。因此，较低水平乳酸升高对预后已有负 面影响，但这种轻度升高的乳酸对i c u 患者预后的影响具体有多大? 什么水 平的乳酸才是相对安全水平的乳酸仍需进一步研究。 本组资料显示，死亡患者的a p a c h ei i 评分显著高于存活患者( p 0 0 1 ) 。 死亡组a p a c h ei i 评分最低为8 分，存活组最高评分为2 9 分。h a r b a r t h 等认 为，a p a c h e i i 是危重病患者茵血症的独立危险因素，可预测菌血症的发生n 9 l 。 c h e n 等发现在a p a c h ei i 低分值范围内预测死亡概率往往估计较高，而在高分 值范围内预测死亡概率则又估计过低心引。w o n g 等发现烧伤患者a p a c h e1 1 分值 是耐药鲍曼不动杆菌感染的独立危险因素，并与病死率明显相关乜。本组 a p a c h ei i 评分与预后呈显著负相关( 1 - - - 0 6 6 7p = o 0 0 0 ) ，说明该评分系统 对本研究的脓毒症患者预后具有较好的预测功能，这与既往文献报道相符瞳2 2 3 1 。故临床各科尤其i c u 应高度重视患者的a p a c h e l l 分值，对评分较高患者， 应积极预防感染和增强抢救措施，以降低病死率。 军医进修学院硕士学位论文 实验二t h l7 细胞在脓毒症发病中的作用机制研究 l 实验目的 调查脓毒症患者与健康对照组间t h l 7 表达频率的差异。 2实验材料 2 1 实验对象 同实验一 2 2 实验试剂 试剂名称生产厂家 r p m i 一1 6 4 0 美国s i g m a 公司 杭州四季青生物 小牛血清 制剂公司 佛波酯( p h o r b o lm y f i s m t ea c e t a t e ，p m a ) ：储存液： 培养刺激 溶于无水酒精，l o o n g m l ，一2 0 c 分装保存。工作液：储美国s i g m a 公司 体系 存液用r p m i 一1 6 4 01 ：2 0 稀释，5 n g m l ； 离子霉素( i o n o m y c i n ) ：储存液：溶于无水酒精，ll ig m l ， 一2 0 分装保存。工作液：储存液用r p m i 一1 6 4 0l ：1 0 稀美国s i g m a 公司 释，l o o n g m l ； 美国 a n t i h u m a ni l 一1 7 ap e e b i o s c i e n c e 公 流式细胞 司 术标记单 a n ti - h u m a nc d 8p e r c p 美国叻公司 克隆抗体 a n t i h u m a nc d 3a p c 美国b d 公司 a n ti - h u m a ni f n yf i t c 美国b d 公司 破膜美国b d c y t o f i x c y t o p e r mw i t hg o l g is t o pk i t 试剂盒p h a r m i n g e n 公司 2 3 实验仪器 仪器名称 生产厂家 超净j 1 ：作台苏州安泰空气技术有限公司 军医进修学院硕士学位论文 l d z 5 - 2 型台式低速离心机北京京立离心机有限公司 一2 0 4 冰箱h a i e rb c d 一2 7 0青岛h a i e r 公司 流式细胞仪( f a c s a li b u r )美国b d 公司 m i l l i - q 纯水系统美国密理博公司 旋涡混合器g l 一8 8 b江苏海f 】其林贝尔仪器制造有限公司 二氧化碳细胞培养箱美国热电公司 3 实验方法 1 取2 5 0ul 肝素锂抗凝全血。 2 采用l m l 刺激体系： 成分体积( 1 11 ) 全血2 5 0 含1 0 胎牛血清或新生牛血清的r p m i 一1 6 4 0 6 8 0 工作浓度p m a 6 0 工作浓度离子霉素 1 0 共计：1 0 0 0 震荡混匀后，放入3 7 c 恒温，1 h 后加入g o l g i s t o p1i jl ，振荡混匀， 继续培养5 h 。 3 细胞内因子染色流程： 1 ) 加l m l 磷酸盐缓冲液( p h o s p h a t eb u f f e rs a l i n e ，p b s ) 洗一次， 1 5 0 0 转离心5 m i n ，移液器弃去上清。 2 ) 加入c d 3a p c5 u1 ，c d 8p e r c p1 0 ul ，振荡混匀，避光2 0 m i n 。 3 ) 加红细胞裂解液3 m l ，震荡混匀，避光5 m i n 后，1 5 0 0 转离心5 m i n ， 弃上清。 4 ) 加入l m lp b s 洗1 次，1 5 0 0 转离心5 m i n ，弃上清。 5 ) 加入3 0 0 i jl 破膜剂，震荡混匀，避光2 0 m i n 。 6 ) 加入l m l 破膜洗剂，1 5 0 0 转离心5 m i n ，弃上清。 7 ) 加入i l - 1 7 ap e1 0l a1 ， i f n - yf i t c1 01 1l ，振荡混匀，避光 2 0 m i n 。 8 ) 加l m l 破膜洗剂，震荡混匀，1 5 0 0 转离心5 m i n ，弃上清。 】9 军医进修学院硕上学位论文 9 ) 加2 5 0u11 多聚甲醛固定，振荡混匀，流式细胞仪检测。 4 实验结果 4 1 脓毒症患者与健康对照组t h l 、t h l 7 表达频率分析 圈选淋巴细胞 1 9 50 3 0 _ - j 0 f _ ：壤? 7 ：”? ；铡： 冬6 籍蠢隧5 5 9 8 1 8 4 专瀵 ：藏葛 一?：fto器j 二，j：；：?jt： 一2 圈选c d 4 ( + ) t 细胞 1 0 9 。_ i ? j 。t _ 。? ；j 麓薯j 黪蠖二5 i i 灌：| j 0 9 3o 3 2 i 。i 蕊露： - j ：一： 。i 二? ： - ：每* j 1 7 1 二话蓬豁誓憾4 i n f - vf i t c 各分组t h l 7 细胞表达频率典型图 图2 - 1t h l 、t h l 7 表达典型图 脓毒症患者t h l 7 表达频率显著高于健康对照组( p 0 0 1 ) ( 见表2 - 1 、 图2 3 ) ，但两组间t h l 表达无显著差异( 见表2 一l 、图2 - 2 ) 。 军医进修学院硕士学位论文 表2 - 1 脓毒症患者与健康对照组t h l 、t h l 7 频率表达 组别例数t h l 频率t h l 7 频率 健康对照组 3 02 5 9 8 5 _ _ _ 5 5 9 1 2 4 1 7 _ _ _ 0 6 4 2 脓毒症 6 72 3 2 1 8 1 0 7 9 64 6 5 7 2 7 2 4 注：p = o 0 6 2v s 脓毒症；p 0 o lv s 脓毒症 - 4 了 l - a 8 、j 錾6 零 4 2 o 图2 - 2 脓毒症患者与健康对照组间t h l 表达频率比较 健康对照组 脓毒症 p o 0 5 ) ( 见 表2 - 2 、图2 - 4 ) 。比较四组间t h l 7 表达频率，除了脓毒症组与重症脓毒症组 间差异无统计学意义( p = 0 0 7 6 ) ，其余各组间差异均具有显著的统计学意义 ( p 0 0 1 ) ，其中重症脓毒症患者t h l 7 表达频率最高，脓毒性休克组频率最 低。( 见表2 - 2 、图2 5 ) 表2 - 2 脓毒症各分组患者与健康对照组t h l 、t h l 7 频率表达 组别例数t h l 频率t h l 7 频率 健康对照组( a )3 02 5 9 8 5 + _ 5 5 9 1 02 4 1 7 o 6 4 2 脓毒症( b ) 1 5 2 5 4 6 1 7 3 2 34 2 3 3 + - 2 0 0 5 固 重症脓毒症( c ) 4 12 3 3 7 5 1 0 5 8 85 5 9 3 2 7 5 9 脓毒性休克( d ) l l1