（化学工艺专业论文）四氟乙烷提取青蒿素的研究.pdf

中文摘要 本文研究了遵义地区野生黄花蒿中青蒿素的提取和分离，确定了一条由青蒿 原料出发，较为合理的提取分离工艺路线。主要研究内容和结果如下： 1 对青蒿素测定方法进行了验证，研究表明，用紫外分光光度法测定青蒿素 的含量，方法简便、准确，但衍生反应中要严格控制反应温度在5 0 士l ，n a o h 的质量分数在0 2 加0 2 范围内，否则q 2 9 2 的吸光度降低，会影响测定结果 的准确性。 2 根据文献，青蒿素含量大于2 m g 儋的青蒿才有提取的价值。本文采用紫外 分光光度法，经五次平行实验，测得青蒿样品中青蒿素的平均含量为8 9 5 7 m g ， 远大于规定值，具有开发利用价值。 3 为确定四氟乙烷提取青蒿素的最佳工艺操作条件，分别针对原料粒度、提 取时间、提取温度、溶剂量、搅拌速度等因素对青蒿素提取率的影响进行单因素 实验，结果表明这些因素在一定范围内都可以显著提高青蒿素提取率。优化这些 数据后采用五因素四水平正交实验，得到了四氟乙烷提取青蒿素较好的提取工艺 条件。工艺参数为原料粒度 8 0 ，1 0 0 】目，提取时间6 0 m i n ，提取温度5 0 ，搅拌 速度为4 0 0 r r n i n ，溶剂用量1 2 0 m 垤。五次平行实验得到该条件下青蒿素的平均提 取率为9 0 3 7 ，大于有机溶剂萃取平均数8 3 ，为以后工业化提供参考。 4 本文采用沸点为3 0 6 0 的石油醚萃取精制脱蜡，效果较佳。通过结 晶和重结晶操作，得到了青蒿素晶体。 5 通过对提取( 四氟乙烷恒温搅拌) 、分离( 石油醚萃取) 、精制( 重结晶) 工艺过 程的研究，最终确定了一条总提取回收率为7 7 7 的工艺路线。 关键词：青蒿素四氟乙烷提取分离含量测定 a b s t r a c t e 蛆r a c t l o na n ds e p a r a t i o no fa n e m i s i n i n 仔o mw i l da n e m i s i aa n n u al i 1 1z u n ) ，i w a ss t l j d i e d协t h i sd i s s e r t a t i o n ar a t i o n a le x t r a c t i o nt e c h n i c a lr o u t eb a s e do n a r t e m i s i l l i nr a wm a t e r i a lw a se s t a b l i s h e d t h em a 访c o n t c ：m s 2 m di e s u l t so ft h e r e s e a r c hi n c l u d e d ： 1 t 1 1 em e a s u r 撕o nm e t h o do fa n e m i s i n i nw 舔v e r 讯e db 弱e do np r e v i o u s s t u d i e s ，锄dt h eu l n a v i 0 1 e ts p e c t r o p h o t o m e t r yw 嬲s e l e c t e d 鹤as i m p l ea c c u r a l e m e t h o 也b u tt h et e m p e r a _ t u r eo ft h er a r n i f i c a t i o ns h o u l db ew i t h i n5 0 士1 锄dt h e m a s sc o n c e n t r a t i o no fn a o hs o l u t i o ns h o u l db ew j t m n0 2 士0 0 2 ，o t h e n v i s e ，m e a b s o r b a n c eo fq 2 9 2w o u l db er e d u c e d ，a n dt h ea c c u r a c yo ft 屺c o m e n td e t e m i i l a t i o n w a sa l s oa 行e c t e d 2 a r t e m i s i n i n 行o ma r t e m i s i aa n n u al w a so n l yw o r t he ) ( t r a c t i n gw h e ni t s c o n t e mo f a r t e m i s i n i nw a sa b o v e2 m g 佗a c c o r d i n gt ol i t e r a m r e u s i n gt h eu l t r a v i o l e t s p e c t r a p h o t o m e t e y ，t h ec o n t e n to fa r t e m i s i n i nw a sd e t e m i n e d 硒8 9 5 7 m ga r e r f i v ep a r a l l e le x p e r i m e m s t h u st h ec o n c l u s i o nw 舔c o 计m e dt h a tt h ec o n t e n to f a r t e m i s i l l i ni nz u n y iw a sc o m p a r a t i v c l yh i g ha n da r t e m i s i aa n n u al - i nz u n y iw a l s w o n h e x p l o i t j n ga n du s i n 晷 3 i no r d e rt 0a s c e r t a i nt h eb e s tt e c h n i c a ir o u t et 0e x c r a c ta n e m i s i n i nf 两m a r t e m s i aa n n u al b yt e t r a 扪u o r o e t h a n e ，w ed i s c u s st h em o n o f 砬t o re f 艳c t so f t i m e ，t e m p e r 咖r e ，s t i r r m gs p e e d ，孕i n d j n gd e 黟e eo fm a t e r i a la j l dt h eq u a n t i t yo f t e t r a n u o r o e t h a n eo nt h ee x t r a c t i o nr a t eo fr e c o v e r ) ，a n d 竹忙r e s u h sw e r ea l s o 西v e n t h a tt h o s ef k t o r sw e r eb e n e 行c i a lt ot h ee ) ( t r a c t i o nw j t h i nac e n a i nr a n g e b yt h e o p t i m i z i n ge x p e r i m e n t ，t h e印p r o p r i a t e t e c h n i c a lc o n d i t i o nw e r ee s t a b l i s h e da s e ) ( t r a c t i o nt i m ea t6 0 m i n ，t e m p e r a t u r ea t5 0 ，s t i 仃i n gr a 士ea t4 0 0 r m m ，m a t e r i a l 铲i n d i n g d e 黟e e 砒【8 0 ，1 0 0 】m e s h e s ，s o l v e mq u a n t i t ya t12 0 m l 据u n d e rt h o s ec o n d m o n s ，a 1 1 a v e r a g ee ) ( t r a c t i o nr e c o v e 叫r a t ew ec a nc o n c l u d e d 、v a l s9 0 3 7 ，b u ti nl i t e r a t u r et h e a v e r a g ew a so n l y8 3 b yo r 昏n i cs 0 1 v e m t h o s ee x p e r a t u r er e s u l t sc o u l db eag u i d e f - o ri n d u s t i _ i a l i z a l j o nl a t e r 4 t h eb e t t e rr e s u l t0 fr e f i n i n ga n d d e w a ) i n gw a sa c h i e v e db yu s i n gt h e p e t r o l e u ne t h e rw i t hb o i l i n gp o i n to f3 0 一6 0 t h ec r y s t a lo fa r t e m i s i n i nw a s o b t a i n e db yt h ec r y s t a l l i z a t i o na n dr e c r y s t a l l i z a t i o n 5 t h r o u 曲t h et e c h n i c a lr o u t et 0e ) ( t r a c ta r t e m i s i n i n 仔o ma r t e m s i a 锄u al w h i c hw a l se s t a b l i s h e db yt h ew a yo fe ) ( t r a c t i o n ( c o n s t a m t e m p e r a t u r ea 士i r r i l l gw i t h t e t r a f l u o r o e t h a n e ) ，s e p a r a l i o n ( e 灯a c t i n g o f p e t r o l e u n e t h e r ) ， r e f i n i n g ( r e c r y s t a l l i z a t i o n ) ，an e wt e c h 面c a lr o u t ew i t ht h et o t a lr e c o v e r yr a t ew ec a ng o tw 硒 7 7 7 k e y w o i i s ：a n e m i s i n i n ，t e t r a n u o r o e t h a n e ，e x t r a c t i o na n ds e p 扰l t i o 玛c o n t e m m e a s u r a 士i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得天津大学或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 内彤天 签字目期：弼年秒6 月占日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解天：津大学有关保留、使用学位论文的规定。 特授权天津大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 两帛炙 导师签名： 签字目期：d 谬年9 舌月占目签字曰期： 胗 磊缉p 缮午澎 刖 舌 青蒿素是中国学者在2 0 世纪7 0 年代初从青蒿( a r t e m i s i a 锄u al ) 中分离得 到的抗疟有效单体，是含有过氧桥结构的新型倍半萜内酯化合物，是目前世界上 最有效的治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的药物，被世界卫生组织称为“治疗疟 疾的最大希望”，具有快速、高效、无抗药性、低毒副作用的特征。最新研究表 明，青蒿素不仅能抗疟疾，而且在抗病毒、肿瘤等方面都有独特效果，其医药价 值具有很大的开发空间。 天然产物提取青蒿素的方法主要有：有机溶剂提取法、超临界流体提取、离 子液体提取、氟代烷烃提取法等。当前，非极性有机溶剂提取法为大规模生产青 蒿素的主要方法。由于此类溶剂存在损害人体健康、污染环境、易燃易爆等缺点。 因此，有必要研究开发新的替代方法，既具有与非极性有机溶剂提取法相当的提 取效率和成本，同时又能克服其缺点。超临界二氧化碳萃取法虽然提取效率高、 速度快，但是因工作压力极高，设备投资大、运行成本高，限制了该技术的大规 模应用。离子液体是一项新兴的技术，尽管近年来该领域研究取得很大进展，已 有商业化应用，但从原提取物中分离精制青蒿素方法的改进及离子液体的再生和 青蒿残渣中溶剂的回收利用等问题还没有解决。 氟代烷烃心c 1 3 4 a 不易燃、对臭氧层无损害、价格低廉，在欧洲、日本和 美国h f c 1 3 4 a 被允许用作食品调料的提取溶剂。h f c 1 3 4 a 在常温常压下是气 体，在比较小的压力下即可液化，提取溶液经解压可迅速得到提取物，非常适合 连续提取生产工艺。由于只需较弱的加压和低温操作，连续解压加压过程消耗 的能量不多，该提取法具有低能耗、低成本的优点，且因提取过程不需要高压， 设备的投资较少。 本文确定适宜的提取工艺方法，并进一步对青蒿素提取的工艺条件，如温度、 时间、粒度、溶剂量及搅拌速度等进行了较系统研究，确定四氟乙烷提取青蒿素 的最佳工艺操作条件，旨在为改进现有青蒿素提取工艺提供一些依据。 第一章女镕 1 1 青蒿素 第一章文献综述 青蒿素( a 他m i s m j n ，q h s ) 是从菊科艾属植物青蒿和黄花蒿中分离得到的 一种新型倍半萜内酯。青蒿素具有过氧键和6内酯环，有一个包括过氧化物在 内的l ，2 ，4 一三呃烷结构单元，这在自然界中是十分罕见的，它的分子中包括 有7 个手性中心。它的生源关系属于锄。甲h 明e 类型，其特征是a 、b 环顺联， 异丙基与桥头氢呈反式关系，青蒿素中a 环碳架被一个氧原子打断。 青蒿索是一种无色针状晶体分子式为c l5 心2 0 5 ，分子量为2 8 23 3 6 ，熔点 为】5 6 1 5 7 ，易溶于丙酮、乙酸乙酯，氯仿、苯及冰醋酸，可溶于甲醇、乙醇、 稀乙醇、乙醚及石油醚，几乎不溶于水。由于其具有特殊的过氧基团对热不稳 定，在j 5 0 队上分解。青蒿素紫外无吸收蜂，其经过碱化后在紫外区生成有明 显吸收峰的新化台物，在波长2 0 0 4 0 0 兀处有一最大吸收峰，可用于色谱定量分 析f “。 在当今的抗疟药物市场，青蒿素类抗疟药以其高效、速效、低毒的特点脱颖 而出是目前治疗疟疾最有效的药物。青蒿素是我国唯一得到国际承认的抗疟新 药，也是我国第一个以一类新药制剂出口的化学药品。 1 毒h 圈1 1 青蒿素结构式 n j - i1 1 1 c 女r 吲o f q h s 图i 2 黄花蔫 f - 2 a s l 塞肇 第一章文献综述 1 2 氟代烃和全氟代烃的物性 氟代烃( h f c s ) 和全氟代烃( p f c s ) 的临界温度和临界压力都较低，有的在常温 下已是超临界状态( 如c f 4 ，4 5 6 ，3 7 4 b a r ) 。同时，多数氟代烃的极性( 如二氟 甲烷h f c 3 2 ，四氟乙烷h f c 1 3 4 a ，三氟甲烷h f c 2 3 ，五氟代乙烷h f c 1 2 5 a ) 比c 0 2 大，表明这些氟代烃对极性物质有更好的溶解性，可用于溶质萃取和催 化反应掣引。 表l - 1 是实验所用溶剂四氟乙烷的物理性质 ! 坐：! ：! 卫星血型! 璺! 垫皇竺! 坚匹：! i 兰皇 温度压强比容密度比热容液熵值气熵值液焓气焓 k p a m 3 ，蝇蟛m 3u ( k g 木k ) k j 必k g 木k ) k j 必k g 卑k ) 值值 k j l ( gk j 瓜g 1 3 青蒿素的来源 1 3 1 青蒿素的化学合成 化学合成青蒿素这一复杂的天然分子是有机化学家所面临的挑战。中国科学 院上海有机所对青蒿素及其一类物的结构和合成进行了大量的工作5 1 。1 9 8 6 年， x u 等6 1 报道了青蒿素的全合成途径，其合成以r ( + ) 一香草醛为原料，经十几步合 成青蒿素，合成途径如图1 3 所示。国外也以不同原料为出发点进行青蒿素一类 第章文献综述 物的化学合成研究0 1 。1 9 9 4 年，z h o u 和x u 【1 l 】综述了国内外青蒿素全合成的研 究进展。青蒿素全合成研究虽已取得些明显的进展，但到目前尚未显示出商业 上的可行性。 争i 彼一致母一毁 h ：hh ：甲； c 图1 3 青蒿素的化学合成路线图 f i g 1 3c h e m s y m h e t i cp 砸h w a y so f a n e m i s i n i n 1 3 2 青蒿素的生物合成 了解青蒿中青蒿素的生物合成途径与该药的生产密切相关。包括：( 1 ) 通过 添加生物合成的前体来增加青蒿素的含量；( 2 ) 通过对控制青蒿素合成的关键酶 进行调控，或者对关键酶控制的基因进行激活来大幅度增加青蒿素的含量：( 3 ) 利用基因工程手段来改变关键基因以增强它们所控制酶的效率。 由于萜类化合物的生物合成途径非常复杂，因而对于青蒿素这一类低含量的 复杂分子的生物合成研究就更具复杂性。对于倍半萜内酯的合成，其限速步骤一 是环化和折叠成倍半萜母核的过程，另一个限速步骤为形成含过氧桥的倍半萜内 酯过程。a k h i l aa 掣1 2j 通过放射性元素跟踪法对青蒿素的生物合成途径进行了研 究，认为青蒿素的的生物合成途径应该是从法尼基焦磷酸出发，经牦牛儿间架、 双氢木香交酯、杜松烯内酯和青蒿素b ，验证并合成了青蒿素。国内也进行青蒿 素生物合成的研究，探索了由【2 1 4 c 】m v a 为前体生物合成青蒿酬1 3j ，以及由 青蒿酸为前体生物合成青蒿素及青蒿素b 的过程【1 4 】。 第一章文献综述 1 3 3 植物组织培养合成青蒿紊 利用植物组织培养来生产青蒿素是目前青蒿素研究的另一热点，可能成为大 规模生产青蒿素的重要手段。自8 0 年代以来，植物组织培养生产青蒿素的研究 工作已进行不少，已经在青蒿愈伤组织、悬浮细胞、芽和毛状根等培养体系中进 行了青蒿素合成的探索。 贺锡纯等1 15 】对青蒿的愈伤组织、带芽的愈伤组织和由愈伤组织分化产生的小 植株中青蒿素的合成进行分析，认为青蒿愈伤组织中不含青蒿素，在愈伤组织伴 随芽分化形成时，检测到青蒿素的含量约为干重的o 0 0 8 ，而在分化苗长成的植 株中，青蒿素的含量达到干重的0 9 2 高于野生植株。n a i r 等【1 6 】在进行青蒿愈 伤组织悬浮培养时，在愈伤组织中未检测到青蒿素的存在，但在悬浮培养液中检 测到微量的青蒿素( 8 峙m l ) 。同样在b r o w n 【1 7 】的研究中也证实了青蒿的愈伤组织 中不含萜类，但在分化的芽中检测到和亲本相似的萜类合成物。t a w f i t 等【1 8 】在研 究青蒿悬浮细胞培养时，在培养物中没有检测到青蒿素的合成，但在培养液的正 己烷提取物中检测到抗疟的活性。p a n i e 9 0 掣1 9 】在新诱导的青蒿愈伤组织中检测 到青蒿素的含量约为干重的o 0 8 0 1 ，此培养物经三次继代培养后，愈伤组 织内青蒿素的含量几乎难以检测到。由此可见，在未分化的青蒿植物组织中不含 或含有极低水平的青蒿素，而一定的组织分化则可促进青蒿素的合成。 、e r d e l l b a g 等【2 0 】在诱导的青蒿芽培养物检测到青蒿素的存在，并对营养物 和激素对青蒿芽生长和青蒿素的影响进行研究，发现赤霉素和水解酪蛋白等对芽 中青蒿素的合成具有强的刺激作用。f e l l r e i r a 掣2 1 】在青蒿芽的培养过程中，同样 检测到青蒿素的存在，并在诱导生根的青蒿芽中获得了高含量的青蒿素，约为干 重的0 2 8 7 。p a n i e g o 等1 22 j 建立了转基因的青蒿芽培养物，其青蒿素含量稳定， 约为干重的0 0 2 ，改进培养基中的各种金属离子和复合维生素对芽中青蒿素的 合成影响不明显，但添加赤霉素使得芽中青蒿素的含量提高了3 4 倍。1 9 9 4 年， 秦明波掣2 3 】用发根农杆菌16 01 成功转化青蒿幼茎获得毛状根培养物，提供了以 发根农杆菌作为基因载体进行青蒿的遗传改造的可行性。与此同时，w e a t h e r s 等1 2 4 j 利用发根农杆菌15 8 3 4 感染青蒿的芽尖和叶片，获得青蒿毛状根培养物，并 且检测到青蒿素的含量约为干重的0 4 3 ，其含量远高于其它青蒿组织培养物 中青蒿素的含量。蔡国琴等【2 5 】利用发根农杆菌1 6 0 1 感染青蒿叶片建立了毛状根 培养系，并在培养物中检测到青蒿素，在添加赤霉素的条件下青蒿素的含量约为 干重的0 2 。v e 唱a u w e 等【2 6 】利用根癌农杆菌感染青蒿叶片，获得转基因植株中 青蒿素含量约为干重的0 1 7 ，青蒿素合成前体青蒿素b 的含量约为0 2 2 ，为 通过转基因植物量产青蒿素奠定基础。 第一章文献综述 目前，青蒿组织培养的研究工作主要集中在利用生物技术的手段来进行组织 培养物的改进和高青蒿素含量培养系的筛选和建立，对于利用生物反应器培养青 蒿组织来生产青蒿素的研究工作尚处于起步阶段。f u k l e 掣z 7 】利用1 l 生物反应 器进行青蒿芽的悬浮培养，经过3 0 天的分批培养可获得再生的植株，生物量提 高了4 5 倍。p a r k 掣2 8 】利用2 l 的长方形气提式生物反应器培养青蒿芽，经过4 周的培养，培养物增殖8 倍，获得的青蒿芽可长出不定根。我们目前与中国科学 院植物所合作，在国家“九五”科技重点攻关项目的资助下，对青蒿毛状根生长 和青蒿素合成的调控进行了研究【2 9 1 ，并利用合适的小型生物反应器进行了毛状根 的大量培养p0 1 ，获得了满意的结果，为进一步利用生物反应器进行青蒿组织大规 模培养生产青蒿素的研究工作奠定基础。 青蒿植物组织培养生产青蒿素的一系列研究表明，在未分化的青蒿组织培养 物( 愈伤组织和悬浮细胞) 中，青蒿素的含量极低，且青蒿素合成不稳定；而在分 化的器官( 芽、毛状根和再生幼苗) 中，青蒿素的含量明显提高，并且具有较稳定 的合成能力，尤其是转基因青蒿毛状根培养物为青蒿素的大规模生产提供了潜在 的应用前景。 1 3 4 植物中提取青蒿素 除了化学合成、生物合成、植物组织培养制各青蒿素以外，天然产物的提取 也是一种简便高效的青蒿素制备方法，尤其我国发展青蒿素产业在资源方面具有 无可比拟的优势。目前除黄花蒿外，尚未发现含有青蒿素的其它天然植物资源。 黄花蒿虽然系世界广布种，但青蒿素含量随产地不同差异极大。据迄今的研究结 果，除我国重庆东部、福建、云南、广西、海南部分地区外，世界绝大多数地区 生产的黄花蒿中的青蒿素含量都很低，无生产价值。因此，我国具有明显的资源 优势【3 1 1 。所以，通过天然产物提取青蒿素的各种方法，也就成为青蒿素制备研究 的热点问题。目前，天然产物提取青蒿素的方法主要有：有机溶剂提取法、超临 界流体提取、离子液体提取、氟代烷烃提取法等。 1 4 黄花蒿中青蒿素的提取方法 1 4 1 非极性有机溶剂提取 目前，该方法广泛应用于大规模工业化生产青蒿素。根据青蒿素的理化性质 ( 低极性、在植物体内化学和热不稳定、难溶于水和易溶于有机溶剂) ，选择非 极性有机溶剂提取青蒿，提取物经重结晶、柱层析等方法分离精制得到青蒿素。 一6 一 第一章文献综述 为提高提取效率，近年来，研究人员还进行了超声波和微波技术应用于提取过程 的研究。 赵兵掣3 2 3 3 】以干青蒿叶末为原料，分别用乙醚、氯仿、正己烷、石油醚( 3 0 巧o ) 搅拌提取青蒿素，结果表明石油醚是较适宜的提取介质。v o n w i l l e r 掣3 4 】对 石油醚提取青蒿素的工艺条件进行了较系统研究，较适宜的提取条件为原料粒度 6 0 目，提取时间2 h ，提取温度5 0 ，溶剂量6 0 m l ( 1 9 青蒿) ，搅拌速度8 0 0 r 佃j n 。 k l a y m a n d l 等1 35 j 进而研究考察了超声波用于强化石油醚萃取的功效，结果表明 采用2 0 k h z ，9 0 w 超声波，在5 0 下，单次处理2 0 m i n 后继续搅拌至3 0 m i n 时， 提取率可达8 3 ，而用超声波处理6 次，每次处理2 m i n 共计1 2 m i n 提取相同的 时间，提取率可达8 1 。 微波辅助提取那j ( m i c r o w a v ea l s s i s t e de ) ( t r a c t i o n ，m a e ) ，又称微波萃取 ( m i c r o w a v ee x t r a c t i o n ，m e ) ，是微波和传统的溶剂萃取法相结合而成的一种 萃取方法。微波辐射加热机制是内加热方式，使物质分子内部发生振动而产生瞬 间热能，会使细胞内的分子发生激烈热运动，最终导致细胞破裂程度增大。梁忠 生【38 】进行了青蒿微波预处理对青蒿素提取产率的影响研究。经微波处理后，加快 了从青蒿植株中提取青蒿素的速度，在相同的时间内，青蒿素提取率要高于未经 微波预处理的提取率。采用索氏提取法，分别以石油醚、环己烷、1 2 0 号溶剂汽 油为溶剂，对青蒿干粉进行有、无微波预处理的青蒿素提取比较实验，考察微波 预处理功率、时间以及提取时间对青蒿素提取率、产率的影响。结果表明：与无 微波预处理比较，微波预处理使青蒿素提取率提高近1 5 ，用1 2 0 号溶剂汽油为 溶剂，微波预处理功率4 5 0 w 、预处理4 m i n 、索氏提取6 h ，提取率达到8 8 以 e 。 1 4 2 超临界二氧化碳萃取 超临界流体萃取技术是近代化工分离中的一种新型分离技术，超临界c 0 2 萃取是采用c 0 2 作溶剂，c 0 2 具有化学惰性、无毒、价廉易得，超临界状态下的 c 0 2 流体密度和介电常数较大，对物质溶解度很大，并随压力和温度的变化而急 剧变化，因此，不仅对某些物质的溶解度有选择性，而且可以同萃取物完全分离 并循环使用，对环境无污染。超临界c 0 2 萃取特别适用于脂溶性，高沸点，热 敏性物质的提取，在天然药物的提取分离方面有独特的优势，具有很好的工业应 用前景。 何春茂等【3 9 】以青蒿素含量为o 2 9 6 的黄花蒿为原料，将黄花蒿粉碎成粒度 为0 2 - 2 m m 的碎料，在2 0 m p a ，c 0 2 循环量为2 0 2 5 埏h 的条件下，萃取2 h ， 第一章文献综述 青蒿素的提取率达到9 5 。实验表明：萃取压力，萃取温度越高，青蒿素的提取 率越高，但是萃取温度越高，萃取物中的杂质的含量也越高。 葛发欢等【4 0 j 对黄花蒿化学成分进行，表明青蒿素的超临界c 0 2 萃取提取率较 传统工业生产中有机溶剂法( 汽油及稀乙醇) 提高1 1 5 9 较传统汽油法提 高2 倍以上，提取时间大大缩短，成本降低，控制不同温度、压力、时间，还可 得到十八醇等成分。 m a r c e lk o h l 盯掣4 i j 用携带改性剂的超临界c 0 2 ，对黄花蒿进行了萃取研究， 实验中选用3 的甲醇( 或乙醇) 作为改性剂，萃取压力为1 5 m p a ，温度为5 0 ，c 0 2 的流速为2 m l m i n ，萃取时间为2 0 m i n ，并采用s f c f i d 方法对萃取物 进行了检测，青蒿素的萃取率在9 5 左右。添加改性剂后，能提高青蒿素的萃取 动力学，大大降低萃取时间。作者同时提出一个新的观点，萃取速率不是由有效 成分扩散进入提取介质的快慢所决定的，而是由它的洗脱过程决定。、，a nn i i l e n 等1 4 2 j 研究了如何提高超临界萃取中青蒿素溶出率的方法。 钱国平等1 4 3 j 研究了用超临界c 0 2 从青蒿中萃取青蒿素的影响因素。在 1 5 2 2 9 7 m p a 和4 0 巧o 范围内，萃取压力和萃取温度升高，萃取率增大，萃取 选择性下降。以萃取率和萃取选择性为目标，优化了超临界萃取工艺条件，得到 较佳的操作条件：萃取压力2 0 m p a ，萃取温度5 0 ，c 0 2 循环量l k 趴h 埏原 料) ，原料粒径6 0 8 0 目。在优化条件下萃取4 h ，萃取率达到9 5 以上，萃取物 纯度1 0 以上。 1 4 3 离子液体提取 离子液体的无味、无恶臭、低挥发性、无污染、不易燃、易与产物分离、易 回收、可反复多次循环使用、使用方便等优点，是传统挥发性溶剂的理想替代品， 它有效的避免了传统有机溶剂的使用所到来的严重的环境、健康、安全以及设备 腐蚀等问题，被称为“绿色替代溶剂”。离子液体是一项新兴的技术，尽管近年 来该领域研究取得很大进展，已有商业化应用，但应用离子液体提取生物分子未 见文献报道。在m m v 资助下，英国的b i o n i q sl t d 进行了该技术应用于青蒿中 提取青蒿素的初步研究和评价。 从5 种离子液体中筛选出2 种适合青蒿素提取的溶剂：n ，n d i m e t h v l e t h a n 0 1 a m m o n i u mo c t a n o a t e ( d m e ao c t ) 和b i s ( 2 - m e t h o x y e t h y l ) 啪m o n i u mb i s ( t r i n u o r o m et h y l s u l f o n y l ) i m i d e ( b m o e a b s t ) 。提取工艺与标准的液固提取相同，提取温度 为2 5 ，用d m e ao c t 溶剂提取3 0 m i n 达到最大溶质浓度，其中青蒿素的含量 与相同温度正己烷法提取产物相似。用b m o e a b s t 作为溶剂的提取速率与正己 烷相似，但明显较d m e ao c t 慢，但提取液中青蒿素的最高含量提高了2 3 。因 第一章文献综述 此，与正己烷提取法相比，d m e ao c t 提取法具有相同的提取率和较快的提取速 率，而b m o e a b s t 提取法具有较高的提取率和相同的提取速率。初提取液与水 进行分配萃取，从中分离结晶青蒿素，同时还分离得到青蒿油，青蒿素的纯度达 到9 5 ，且无溶剂残留，此分离过程约需1 0 m i n 。从原提取物中分离精制青蒿素 方法的改进及离子液体的再生和青蒿残渣中溶剂的回收利用等问题尚在进一步 研究中【4 4 】。 1 4 4 氟代烷烃h f c 一1 3 4 a ( 1 ，1 ，1 ，2 四氟乙烷) 提取 氟代烷烃耶c 1 3 4 a 不易燃、对臭氧层无损害、价格低廉，在欧洲、日本和 美国h f c 1 3 4 a 被允许用作食品调料的提取溶剂。h f c 1 3 4 a 在常温常压下是气 体，在比较小的压力下即可液化，提取溶液经解压可迅速得到提取物，非常适合 连续提取生产工艺。由于只需较弱的加压和低温操作，连续解压加压过程消耗 的能量不多，该提取法具有低能耗、低成本的优点，且因提取过程不需要高压， 设备的投资较少。缺点是它的全球温暖化潜值是c 0 2 的1 ，3 0 0 倍，因此，在提取 过程中完全回收和循环利用溶剂非常重要。2 0 0 4 年据此提取原理建立的商业化 提取工厂( p h u r u an a 抛r a lo i l sl 硫i t e d ) 在泰国开始运行。 h f c 一13 4 a 对蜡状物和重油的溶解度很小，预计对青蒿素的提取具有较好的 选择性，且据文献报道，该技术已在其它天然产物提取中得到应用，其在青蒿素 提取中的应用值得深入研究。 1 5 天然药用成分的分离方法 在将植物中的有效成分提取出来后，要进一步将这些复杂的混合物进行分 离。一般常用的方法有：溶剂处理法、酸碱沉淀法、铅盐沉淀法、萃取法、吸附 法、层析法、离子交换法等。目前混合物分离所用方法中比较多的是柱层析( 也 称柱色谱) 。一般用薄层层析来摸索柱层析的条件以及检验各种成分从色谱柱中 洗脱出来的顺序。以前应用较为广泛的纸层析近年来用得已经不多。下面对这几 种层析方法加以简单的介绍。 ( 1 ) 纸层析 纸层析是由c o n s d e n 、g o r d o n 、m a j t i n t k 和s y n g e 发现的，纸层析一般可分 为分配、吸附和离子交换层析，也可按所使用的方法分为“洗脱”屏层析法、多 次层析、单向和双向层析、圆形层析、楔形层析和离心层析。纸层析所用设备比 薄层层析所用设备要便宜。 ( 2 ) 薄层层析法 一9 一 第一章文献综述 薄层层析法【4 5 】是估计有机化合物纯度最快、最容易也是最常用的方法。它是 一种物理化学的分离技术。原理是由于薄层上的吸附剂对不同物质的吸附力的大 小不同，当溶剂流过薄层时，被分离的各物质移动的速度各不相同，经过一段时 间毛细管作用的移动，不同的物质就彼此分开，从而获得分离。它操作简便，不 受温度等因素影响，混合物分离时间短、灵敏度高、样品用量少。 ( 3 ) 柱层析1 4 6 j 柱层析可用来分离多种物质，尤其是复杂天然混合物的分离。吸附柱层析法 能分离毫克量级到百克量级的物质。常用的吸附剂为硅胶和氧化铝。由于常压柱 层析有其局限性，如分离速度慢、样品可能被不可逆吸附、不适合采用小颗粒吸 附剂等，人们便不断改进柱层析，如使用干柱层析、减压液相层析等。 层析中所用到的吸附剂，主要介绍如下： 对于吸附剂，首先是进行合适的选择，当然吸附剂的制备、精制、过筛、活 化、活化标化和回收也是较为重要。 任何类型的化合物都可以首先考虑试用硅胶和氧化铝，若水溶性的化合物在 吸附薄层上分离不好，可以试用纤维素等分配薄层。如果脂溶性化合物的分离在 吸附薄层上不成功，则试用反相分配薄层。 硅胶略带酸性，氧化铝略带碱性，两者1 ：1 掺和，得中性。硅胶表面吸附的 水称为“游离水”，其活性的强弱与“游离水”的含量有关，“游离水”多，活 性低，反之活性高。硅胶g 是指含1 3 1 5 煅石膏的硅胶。 1 6 青蒿素的分析测定方法 1 6 1 定性分析 1 6 1 1 薄层色谱法 薄层色谱法( t h i n - l a y e rc h r o m a t o 可印h y ，t l c ) 是将细粉状的吸附剂或载体涂布 于玻璃板、塑科板或铝片上，成一均匀的薄层，经点样、展开与显色后，再与适 宜的对照物质按同法所得的色谱图作对比，用于进行药品的鉴别，杂质检查或含 量测定的方法。 t l c 法是一种物理化学的分离技术。将吸附剂( 如硅胶) 加一定比例的水调 成浆状液，均匀的铺成厚度约为o 2 5 m m 的薄层版，一般在制版时加一些粘合剂 ( 如煅石膏) ，在水平位置上放置阴干后，在1 1 0 烘箱中活化m 。用薄层点 样器将样品溶液点到薄层的下端距边缘1 5 c m 处，待样品溶剂挥干后，将薄层板 斜放到一个盛有一定数量溶剂的展开色谱缸中，使溶剂浸没薄层板的下端约 第一章文献综述 o 5 c m ，盖上盖子，密闭。当溶剂前沿达到距另端2 0c i t l 时，取出，挥干薄层 板上的溶剂后，如有颜色，则可在薄层板上看出色斑：若无颜色，在紫外光灯下 观察荧光或在薄层板上喷显色剂，即可看出各组分斑点的颜色【4 7 鄞】。 吸取一定量样品青蒿素溶液，点样于以硅胶g 或硅胶c m c n a 制作的薄板 上，采用石油醚一乙酸乙酯( 8 0 ：2 0 ) 或苯乙醚( 8 0 ：2 0 ) 作展开剂，再以香草醛浓硫酸 ( 旷1 ) 作显色剂，结果是青蒿素呈鲜黄色斑点，继而又变为潮蓝色。 或用1 l o 活化1 h 的层析硅胶片，点样后，以石油醚( 6 0 9 0 ) 乙醚( 6 0 ：4 0 ) 为展开剂，展开后，挥去溶剂，以0 2 5 9 对二甲氨基苯甲醛溶于5 0 m l 冰醋酸、 5 9 旷8 5 磷酸和2 0 m l 蒸馏水的混合液作显色剂，8 0 烘箱中烘半个小时取出， 青蒿素呈蓝紫色斑剧4 9 1 。 ， 1 6 1 2 显色法 显色法即利用青蒿素的显色反应来鉴别青蒿素。显色反应是用于鉴定青蒿素 简单可行的方法，主要有以下几种1 4 7 ，4 8 】： ( 1 ) 对二甲氨基苯甲醛缩合反应：取实验产品青蒿素约1 0 m g ，加乙醇2 m l 溶 解，加对二甲氨基苯甲醛试剂1 m l 置水浴上加热，溶液呈蓝紫色反应。 ( 2 ) 异羟肟酸铁反应：取样同( 1 ) ，溶于l n 也甲醇中，加入9 = 7 盐酸羟胺甲醇 溶液4 5 滴，在水浴上加热至沸，冷却后加稀盐酸调至酸性，再加入旷1 f e c l 3 ，乙醇溶液l 2 滴，溶液呈紫红色反应。 ( 3 ) 2 ，4 一二硝基苯肼反应：取样同( 1 ) ，溶于l m l 氯仿后，滴于滤纸片上，以2 ，4 一 二硝基苯肼试液喷洒后，在8 0 烘箱中烘1 0 m i n ，产生黄色斑点。 ( 4 ) 碱性间二硝基苯反应：取样同( 1 ) ，溶于2 m l 乙醇中，加入旷2 间二硝基 苯的乙醇液和饱和的k o h 乙醇液各数滴，水浴微热，溶液呈红色反应。 1 6 2 定量分析 1 6 2 1 青蒿素含量较高时的定量分析 这些方法的优点是准确简单，缺点是选择性和灵敏度均较低，不适于复杂成 分，含量较低样品的测定，根据测定方法的机理不同，可将之分为三类。 ( 1 ) 利用青蒿素分子的过氧基进行测定，目前常用的有碘量法和脉冲极谱法。 碘量法是采用经过改进的桥式有机过氧物碘量法。其改进之处是避免常规碘 量法以极易氧化碘离子的冰醋酸为酸性介质，而是改用2 5 m o l l 硫酸为酸性试 剂和无水乙醇组成的酸性介质，以使在增加碘离子浓度的同时，减少自身氧化产 生的碘。此法在4 2 下恒温1 h ，回收率较理想【5 0 】。 第一章文献综述 脉冲极谱法也是利用过氧桥可还原的性质，选用0 0 5 m o l l 硫酸铵为底液， 青蒿素于o v ( v s s c e ) 处出现一良好峰形，浓度在0 1 6 嵋m l 范围峰高与浓度呈 线性关系，测定下限为2 嵋m l 【5 1 】。 ( 2 ) 利用内酯在碱性条件下水解开环的特性。 青蒿素分子中的内酯及过氧七元环结构，在碱性条件下水解开环，等全部中 和后，其突跃范围是p h 7 2 1 1 o ，终点在p h 8 9 附近，与酚酞的p t 相符，因此， 既可用指示剂指示终点，又可用电位指示终点的滴定分析法来测定样品青蒿素的 含量【5 2 l 。 ( 3 ) 用碱或酸将青蒿素定量分解成有紫外吸收的化合物，再进行测定。 用碱处理的机理是使青蒿素转变成在2 9 2 n m 处有明显吸收峰的新化合物而进 行测定。此法经改进后，青蒿素乙醇溶液用q = o 。2 n a o h 溶液处理，5 0 反应 3 0 m i n ，结果较为理想1 5 3 】。 也可将碱化后九m a x 2 9 2 n i n 反应液，酸化为九m a x = 2 6 0 n m 的溶液进行测定， 实验表明，这一转化全部完成存在一个临界p h 值【5 4 1 。 谑# 埙 胃秘暇锄 图1 - 4 青蒿素与紫外吸收化合物的相互转化【5 5 】 f i g 1 4r e c i p r o c a l l y 舰n s f o r mo f a n e m i s i n i na n du 】t r a v i o l e ta b s o r p t i o nc o m p o u n d 另外，用h p l c 也可以，方法是用异辛烷、甲醇、乙醇混和液作流动相，在 s i i i c aa 硅胶柱上作正相洗脱；或用甲醇一水溶液作流动相，在p e a b o d s l 0 斗柱 上作反相洗脱，以胆固醇作内标，u v 检测，可测青蒿素含量【5 4 】。 1 6 2 2 低含量青蒿素的测定方法 ( 1 ) 薄层扫描定量法 此法适用于多组分物质和微量组分的含量测定，较其它一些薄层层析定量法 具有准确度好、灵敏度高、方法简便、快速等优点。其做法是在硅胶g 板上点标 准品氯仿溶液，展开显色后扫描得浓度、积分值标准曲线这一线性关系，再通过 标准品积分值回归方法计算出样品含量56 1 。 ( 2 ) 气相色谱法 第一章文献综述 青蒿素在1 5 0 以下呈现热稳定性，当加热到1 8 0 2 0 0 时，就会分解为数 个产物，s i p a h i m a l a n ia t 等建立了种快速g c 测定法，主要是基于对色谱柱 洗脱出来产物的检测的一种间接的测定方、法【5 7 5 引。 ( 3 ) 红外光谱测定 刘炳玉等用b i o r a df t s 一6 5a 型傅立叶变换红外光谱仪、d t g s 检测器、氯 化钠液体池、青蒿素标准品、四氯化碳，通过差示光谱技术分析表明可完全消除 供试复方制剂中其他成分的干扰1 59 1 。 ( 4 ) 还原性电化学高压液相色谱法( h p l c e c ) a c t o nn 等采用薄层含金汞齐电极响应过氧桥，它灵敏度高，选择性好，测 定迅速，是测定植物提取液青蒿素含量的一种好方法，但需除氧等较高要求【6 0 1 。 ( 5 ) 高效液相色谱法( 胛l c u 该法适用于植物材料青蒿素含量的测定，在生药学及其他学科中也适用。青 蒿素在紫外区仅在2 0 3 肿处有弱吸收，将其碱反应后酸化为一吸收峰在2 6 0 n r i l 处的化合物( q 2 6 0 ) ，则可在紫外区测定【6 1 ，6 2 1 。 1 7 本