（化学工艺专业论文）氯霉素和莱克多巴胺人工抗原合成及鉴定研究.pdf

摘要 摘要 氯霉素( c h l o r a m p h e n i c o l ，c a p ) 是一种广谱高效的抗生素，因其高效价廉， 曾作为细菌性疾病的治疗药物广泛应用于人和动物临床及畜牧业生产。但由于其 具有严重的毒副作用，长期微量摄入氯霉素将会导致抵抗力下降感染各种疾病。 莱克多巴胺( r a c t o p a m i n e ，r c t ) 是一种c 1 2 肾上腺素受体激动剂。最初在临 床上主要用于防治人、畜支气管哮喘和痉挛。大剂量使用时具有改变动物的营养 代谢，降低机体脂肪，提高瘦肉率，同时使动物增重，提高饲料使用率的作用， 因而被不法商人用于做饲料添加剂。r c t 在动物体内的蓄积性残留会对食用者 的安全构成潜在威胁。 研究用于氯霉素和莱克多巴胺的e l i s a ( e n z y m el i n k e di m 瑚加o s 0 舭n t a s s a y ) 检测试剂盒，对保护消费者利益，食品安全以及国际贸易有重要的意义。 本论文开展莱克多巴胺和氯霉素的人工抗原的合成及e l i s a 检测方法的建立等 方面研究，先用莱克多巴胺、氯霉素分别与载体蛋白牛血清蛋白( b o v i n es e r u m a l b u m i n , b s a ) 合成了免疫抗原，与载体蛋白卵清白蛋白( o v a l b u m i n , o v a ) 合成了 包被抗原，再经紫外、红外光谱、凝胶电泳实验证明半抗原与载体蛋白是否偶联 成功。 研究结果表明：氯霉素人工免疫抗原红外光谱图中3 4 2 5 7c m 1 处出现o h 伸缩振动吸收峰，1 6 4 1 2c m 1 和1 3 7 6 5c m 1 出现了c = o 和c - n 特征吸收峰，说 明生成了酰胺；1 0 0 0 - 1 2 0 0c m l 出现的宽且强的酚的c o 伸缩振动吸收峰，而 b s a 的i r 中并无此吸收峰，表明合成的人工抗原红外光谱图中具有蛋白质和 c a p 的特征吸收峰；人工抗原紫外光谱图中保留了氯霉素在2 2 6 n m 处的特征吸 收峰，在2 7 6 n m 处也出现了特征吸收峰，说明人工抗原紫外光谱图中呈现c a p 和牛血清蛋白的特征吸收峰；电泳图谱鉴定结果表明合成的c a p 人工免疫抗原 上偶联了3 0 个c a p 小分子，合成的c a p 人工包被抗原上偶联了3 7 个c a p 小 分子。 莱克多巴胺人工免疫抗原红外光谱图中呈现了蛋白质类共有的吸收，如 3 3 0 6c m l 的胺基n h 吸收峰、1 6 5 3c r n 1 的酰胺谱带和1 5 3 6c m 1 的酰胺谱带。 r c t 人工抗原在1 0 0 0 - 1 3 0 0c m 1 出现了r c t 与b s a 偶联后的c n 伸缩振动吸 广东工业大学硕士学位论文 收峰，而b s a 的中并无此吸收峰，说明人工抗原红外光谱图中呈现r c t 和牛血 清蛋白的红外特征吸收峰；人工抗原紫外光谱图中b s a - r c t 最大吸收峰特征波 长为2 7 6n m ，r c t 、b s a 的特征波长分别为2 7 4n m 和2 7 8r i m ，说明人工抗原 紫外光谱图中具有蛋白质和r c t 的特征吸收峰；电泳图谱鉴定结果表明合成的 r c t 人工免疫抗原上偶联了2 4 个r c t 小分子，合成的r c t 人工包被抗原上偶 联了3 0 个r c t 小分子。 用氯霉素人工抗原免疫母鸡制备抗氯霉素多克隆抗体，根据棋盘滴定抗体效 价为6 4 0 0 0 ，抗体的最适工作浓度为1 ：1 5 0 0 ，抗原最佳包被浓度为5 肛g m l ，确 定最佳包被条件为3 7 c 下温育l 小时，然后4 。c 下包被1 2 小时，用间接竞争e l i s a 法检测一系列浓度的c a p 溶液，发现有2 0 的抑制率，证明氯霉素人工抗原合 成成功。 通过免疫b a l b c 小鼠制备了莱克多巴胺多克隆抗体，抗体效价为1 9 2 0 0 0 ， 抗体最适工作浓度为1 ：6 0 0 0 ，最佳包被浓度为lg g m l ，通过优化实验，确定最 佳包被条件为3 7 下温育1 小时，然后4 。c 下包被1 2 小时。间接竞争e l i s a 法 测定莱克多巴胺结果表明莱克多巴胺浓度在1 0 2 1 1 0 5 “g l 范围之间曲线呈良好 的线性关系，线性回归直线方程为y - - 0 2 5 3 8 x - 0 3 3 3 1 ，相关系数r = 0 9 7 8 7 。莱克 多巴胺的检测范围为1 2 6 - - 2 9 1 4 1 “g l ，抑制率为5 0 时对应的莱克多巴胺浓度 为1 9 0 5p g l 。 关键词：氯霉素；莱克多巴胺；人工抗原；酶联免疫分析；鉴定 a b s t r a c t a bs t r a c t c h l o r a m p h e n i c o l ( c a p ) w a sab r o a d - s p e c t r u ma n t i b i o t i ct og r a m - p o s i t i v ea n d n e g a t i v eb a c t e r i a l d u et oi t sh i g he f f i c i e n c ya n dl o wc o s t , c a pw a so n c eu s e dw i d e l y i nh u m a na n da n i m a l ，a n da n i m a lp r o d u c t i o n h o w e v e r , t h es t r o n gt o x i c i t ya n d c h r o m es i d e e f f e c t so fc a p ，l o n g t e r mi n g e s t i o nc o u l di n d u c ep e o p l ei n f e c tw i t h v a r i o u sd i s e a s e s r a c t o p a m i n e ( r c t ) w a so n eo ft h e1 3 2 - a d r e n e r g i ca g o n i s t s i tw a su s e d 嬲 c l i n i c a lm e d i c i n ef o rb r o n c h i t i sa n do b s t e t r i c a ld i s e a s e s i ti m p r o v e dt h en u t r i t i o n m e t a b o l i s m , d e c r e a s ef a t n e s s ，e n h a n c el e a nm e a tp e r c e n t a g e ，p r o m o t eg r o w t ha n d r e d i s t r i b u t et h en o u r i s h m e n ti nl i v e s t o c kp r o d u c t i o nw i t hl a r g ed o s ee m p l o y , a n dw a s u s e d 嬲f e e da d d i t i v eb ys o m el a w l e s sp e r s o n s t h er e s i d u eo fr c ti na n i m a lw o u l d h ep o t e n t i a lt h r e a t e nt oc o n s u m e r s h e a l t h t h e r e f o r e ，t h es t u d yo nc h l o r a m p h e n i c o la n dr a c t o p a m i n ee l i s a ( e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ) k i tp l a y e das i g n i f i c a n ts o c i a la n de c o n o m i cr o l ef o r p r o t e c t i n gc o n s u m e r s i n t e r e s t s ，f o rf o o ds a f e t yt e s t i n ga sw e l l 弱i n t e r n a t i o n a lt r a d e t l l i ss t u d yf o c u s e do ns y n t h e s i z i n gt h ea r t i f i c i a la n t i g e na n de s t a b l i s h i n ge l i s a m e t h o df o rt h e s et w os u b s t a n c e s t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 1 1 eh a p t e nc a pa n dr c tw e r el i n k e dt ot h ec a r r i e rp r o t e i n ( s u c ha sb o v i n e s e r u ma l b u m i n ( b s a ) a n do v a l b u m i n ( o v a ) ) r e s p e c t i v e l y , a n di m m u n o g e n sa n d c o a t i n ga n t i g e n sw e r eo b t a i n e d t 】ks u c c e s s f u lc o u p l i n go ft h eh a p t e n sa n dt h eb s aw e r ep r o v e db yu l t r a v i o l e t s c a n , i n f r a r e ds p e c t r o g r a ms c a na n ds d s - p a g ee l e c t r o p h o r e s i s t h eu vs p e c t r u mo f a r t i f i c i a la n t i g e no fc a ps h o w e dt h ea r t i f i c i a la n t i g e np r e s e r v et h ec h a r a c t e r i s t i c a b s o r p t i o np e a ka t2 2 6 n ma n da n o t h e ra b s o r b a n c eb e l o n g st ot h ec h a r a c t e r i s t i c a b s o r p t i o no fb s aa t 2 7 8 n ms h i f t st o2 7 6 n ma f t e rc o u p l i n g t l 硷i rs p e c t r u m a b s o r b a n c eb a n d so fb s a a p p e a r e do nt h ei rs p e c t r u mg r a p ho fa r t i f i c i a la n t i g e no f c a rm o r e o v e r , s h r i n k e dv i b r a t i o nb a n d sa t10 0 0 1 2 0 0 c m 1s h o w e dt h a tac - 0b o n d w a sp r o d u c e da n ds u g g e s t e dt h a tt h em o d i f i e dc a pa n db s ah a db e e nl i n k e d e l e c t r o p h o r e t i ci m a g es h o w e dt h a tt h ec o u p l i n gr a t i oo fh a t p e n - b s aw a s3 0a n dt h e c o u p l i n gr a t i oo fh a t p e n - o v aw a s3 7 t h eu vs p e c t r u mo f a r t i f i c i a la n t i g e no fr c t h a do n ea b s o r b a n c eb a n da t2 7 6 n mw h i c hw a sb e t w e e nt h ec h a r a c t e r i s t i ca b s o r h a n c e o fb s aa n dr c t t h ei rs p e c t r u ma b s o r b a n c eb a n d so fb s aa p p e a r e do nt h ei r 厂不工业大学硕士学位论文 s p e c t r u mg r a p ho fa r t i f i c i a la n t i g e no fr c t , m o r e o v e r , s h r i n k e dv i b r a t i o nb a n d sa t 10 0 0 - 1 3 0 0 c m ls h o w e dt h a tac - nb o n dw a sp r o d u c e da n ds u g g e s t e dt h a tt h em o d i f i e d r c ta n db s ah a db e e nl i n k e d f u r t h e rm o r e ，e l e c t r o p h o r e t i ci m a g es h o w e dt h a tt h e c o u p l i n gr a t i oo f h a t p e n - b s aw a s2 4a n dt h ec o u p l i n gr a t i oo f h a t p e n - o v aw a s3 0 a n t i - c h l o r a m p h e n i c o lp o l y c l o n a la n t i b o d i e sw e r eo b t a i n e dt h r o u g hi m m u n i z e d h e n c e a n t i b o d yt i t e rw a s 6 4 0 0 0 ，t h eo p t i m a l i z i n gd i l u t i o no fa n t i b o d yw a s1 ：15 0 0 ， a n dt h em o s ts u i t a b l ec o n c e n t r a t i o no fc o a t i n ga n t i b o d yw a s5 i t g r n l t h eo p t i m u m c o n d i t i o nw a sk n o w nt h a tw a s1h o u ri n c u b a t i o na t37 a n dt h e na t4 cf o r12 h o u r s f i n a l l y , d e t e c t i o no fas e r i e so fc o n c e n t r a t i o n so fc a ps o l u t i o nb yu s i n gt h e i n d i r e c te l i s am e t h o da n df o u n dt h a ti n h i b i t i o nr a t ew a s2 0 ，r e c o n f i r m e dt h e s u c c e s so fs y n t h e s i so fa r t i f i c i a la n t i g e nf o rc h l o r a m p h e n i c 0 1 w eo b t a i n e da n t i - r a c t o p a m i n ep o l y c l o n a la n t i b o d i e sv i ai m m u n i z e db a l b c m i c e a n t i b o d yt i t e rw a s19 2 0 0 0 ，t h eo p t i m a l i z i n gd i l u t i o no fa n t i b o d yw a s1 ：6 0 0 0 ， a n dt h em o s ts u i t a b l ec o n c e n t r a t i o no fc o a t i n ga n t i b o d yw a sll x g m l e f f e c t so f e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n sh a db e e no p t i m i z e d t h eo p t i m u mc o n d i t i o nw a slh o u r i n c u b a t i o na t3 7 ，a n dt h e na t4 f o r1 2h o u r s t h ed e t e c t i n gr e s u l t so fi n d i r e c tc o m p e t ee l i s af o rr c ti n d i c a t e st h a tt h el i n e a r d e t e c t i n gr a n g eo fc a l i b r a t i o nc u r v e sf o rr a c t o p a m i n ew a s1 2 6 - - 2 9 1 4 1 9 9 l t h e l i n e a rr e g r e s s i o nl i n ee q u a t i o nw a sy = 0 2 5 3 8 x - 0 3 3 31 ，a n dc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tr w a s0 9 7 8 7 k e yw o r d s ：c h l o r a m p h e n i c o l ；r a c t o p a m i n e ；a r t i f i c i a la n t i g e n ；e n z y m el i n k e d i m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) ；i d e n t i f i c a t i o n i v 缩略词表 缩略词表 ( a b b r e v i a t i o n s ) v 攻读学位期间发表的论文 独创性声明 秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人 在导师的指导下进行的研究工作及取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标 注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含 本人或其他用途使用过的成果。与我同一工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明，并表示了谢意。 本学位论文成果是本人在广东工业大学读书期间在导师的指导下取得的，论 文成果归广东工业大学所有。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任，特此声明。 指导教师签专：瓤 4 9 论文作者签字： 加0 7 年6 月弓日 第一章文献综述 1 1 氯霉素概况 第一章文献综述 氯霉素( c h l o r a m p h e n i c o l ，c a p ) 又名左旋霉素、左霉素，是一种由委内瑞 拉链霉菌( s t r e p t o m y c e sv e n e z u e l a ) q 丁分离提取的广谱抗生素。氯霉素于1 9 4 7 年首 次分离成功，次年开始用化学方法合成【1 捌，世界各国对氯霉素的生产方法进行 过大量研究，归纳起来有：( 1 ) 对硝基苯乙酮法；( 2 ) 苯乙烯法；( 3 ) 肉桂醇法； ( 4 ) 对硝基肉桂醇法；( 5 ) 对硝基苯甲醛法。我国采用对硝基苯乙酮法，该法 由乙苯经硝化、氧化、溴化、成盐、水解、乙酰化、加成、还原、分解、分拆、 二氯乙酰化而得氯霉素。当时被作为一种疗效较好的抗生素用于治疗伤寒、立克 次氏体病及其他感染性疾病，但不久即发现少数病人应用氯霉素后出现再生障碍 性贫血等副作用【3 ，4 】。 1 1 1c a p 化学结构 氯霉素的化学结构含有对硝基苯基、丙二醇、二氯乙酰胺三个部分( 如图 1 - 1 ) ，其抗菌活性主要与丙二醇有关嘲。 0 。 忏= 慨 图1 - 1 氯霉素分子结构图 f i 酉- 1m o l e c u l es t r u c t u r eo fc h l o r a m p h e n i c a l 1 1 2c a p 理化性质 氯霉素( c a p ) 分子式：c l l h l 2 c 1 2 n 2 0 5 ，为白色或微黄带绿色针状结晶，无 臭，味极苦，分子量：3 2 3 1 3 ，熔点1 5 0 5 1 5 1 5 c ( 1 4 9 7 1 5 0 7 ) 。在高真空下 可以升华。微溶于水( 0 2 5 m g m l ，2 5 ( 2 ) ，略溶于丙二醇( 1 5 0 8 r a g m e ) ，易溶 于甲醇、乙醇、丁醇、乙酸乙酯、丙酮，不溶于乙醚、苯、石油醚，植物油【6 】。 广东工业大学硕士学位论文 干燥状态下可保持抗菌活性5 年以上，饱和水溶液在冰箱中或室温避光条件下保 持活力数月，碱性环境易破坏其抗菌活性，对热很稳定。当p h 在2 - 9 之间时对 氯霉素水溶液的效价无影响，而当p h 大于1 0 时则可失去活性。其水溶液稳定， 可冷藏保存几个月，煮沸5 小时也不变化【刀。氯霉素琥珀酸酯钠盐在水中溶解度 大，宜作为注射制剂，其余酯化物除去苦味，可制成宜于儿童服用的混悬剂或粉 剂。 1 1 3c a p 的抗菌范围 氯霉素具有广谱抗菌作用【s l 。在需氧革兰氏阳性细菌中，对草绿色链球菌、 白喉杆菌、炭疽杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎链球菌等均敏感， 对d 组链球菌则相对不敏感；在需氧革兰氏阴性菌中，对流感杆菌、志贺氏菌 属、百日咳杆菌、淋球菌及脑膜炎球菌均有良好抗菌作用，对沙门氏菌属、大肠 杆菌属、奇异变形杆菌、霍乱弧菌等亦敏感，而对粘质塞拉蒂( 原译沙雷) 氏菌、 肠杆菌属、克雷伯氏肺炎杆菌则不甚敏感。许多厌氧菌包括消化球菌、消化链球 菌、产气荚膜杆菌、梭形杆菌属、脆弱拟杆菌等均能被其抑制。此外，对大部分 立克次氏体、衣原体和菌质体均有效，但对绿脓杆菌、吲哚阳性变形杆菌、结核 菌、真菌、病毒及原虫则均无抑制作用。 1 i 4c a p 作用机理 细菌细胞的7 0 s 核糖体是合成蛋白质的主要细胞成分，它包括5 0 s 和3 0 s 两个亚基。氯霉素通过可逆地与5 0 s 亚基结合，阻断转肽酰酶的作用，干扰带有 氨基酸的胺基酰t r n a 终端与5 0 s 亚基结合，从而使新肽链的形成受阻，抑制蛋 白质合成【9 1 。由于氯霉素还可与人体线粒体的7 0 s 结合，因而也可抑制人体线粒 体的蛋白合成，对人体产生毒性。因为氯霉素对7 0 s 核糖体的结合是可逆的，故 被认为是抑菌性抗生素，但在高药物浓度时对某些细菌亦可产生杀菌作用，对流 感杆菌甚至在较低浓度时即可产生杀菌作用。 1 1 5c a p 毒副作用 自1 9 4 9 年首次使用氯霉素后，氯霉素作为一种广谱抗菌的药物在治疗一系 2 第- ! 章文献综述 列疾病中取得了很好的疗效，尤其是在伤寒流感的治疗中。然而伴随着氯霉素的 大量使用，氯霉素的。副作用也随之出现【1 0 】，其中以造成严重致死性血液系毒性 最为突出【1 1 1 。此后氯霉素出现的问题日渐增多。 变态反应。氯霉素的变态反应极少，可表现为各种皮疹、药物热、血管神经 性水肿等，直接接触可发生接触性皮炎或接触性结膜炎。 血液系统。再生障碍性贫血是最严重的一种【1 2 】，多在用药后2 8 周发生， 死亡率超过5 0 。表现为不可逆地全部血细胞减少，多因出血、感染等因素死 亡。其发生与用药剂量无固定关系，发病机理尚不清，可能与遗传有关。另一种 为中毒性骨髓抑制，临床表现贫血或伴有白细胞、血小板减少。其发生与用药剂 量密切有关，当血药浓度超过2 5 r t g m i , 时容易产生此并发症，但停药后可恢复。 其发病机理是骨髓细胞线粒体合成蛋白质的功能受到暂时抑制。 灰婴综合症。早产儿及新生儿接受大剂量氯霉素后引起的一种全身循环衰 竭，表现腹胀、呕吐、皮肤苍白、紫绀、循环及呼吸障碍，常在发病数小时后死 亡。其发病机理是早产儿或新生儿的肝脏葡萄糖醛酸的结合能力不足和肾小球滤 过氯霉素的能力低下，使体内的游离氯霉素浓度显著增高，直接抑制细胞线粒体 的氧化磷酸化过程。 再生障碍性贫血。临床表现为皮肤粘膜癖点、癖斑、苍白、咽痛、黄疽、高 熟等，应用氯霉素后再生障碍性贫血的发生率估计为1 ：4 0 0 0 0 ，一旦发生，则难 逆转，死亡率可高达5 0 ，少数可发展为粒细胞性白血病。此反应原因可能是某 些人群存在遗传性体质异常，其骨髓造血细胞有某种代谢缺陷，因而对氯霉素分 子中硝基苯基团的作用特别敏感。 白血病。氯霉素引起的严重骨髓损害者中少数幸存者可能逐渐进展至粒细胞 性白血病。可能由于氯霉素促进了非整倍细胞系列的发育，最后发展成为白血病， 以儿童或5 0 - - 7 0 岁的老年患者中多见。 神经系统。少数病人可出现视神经炎或伴有周围神经炎。极少病人有头痛、 抑郁、精神障碍。 消化系统。口服氯霉素可以引起消化道症状，食欲减退、恶心、腹泻、口角 炎、口腔苦味等，但胃肠道反应较少见。 3 广东工业大学硕士学位论文 1 2 莱克多巴胺概况 莱克多巴胺( r a c t o p a m i n e ，r c t ) 又名雷托帕明、舒喘灵、权莱克、金菜多巴、 p a y l e a n ，与克伦特罗( 瘦肉精) 一样是一种苯乙醇胺类f 1 2 肾上腺素受体激动剂， 可选择性激动平滑肌的f 1 2 受体，临床上主要用于治疗支气管哮喘、充血性心力 衰竭症和肌肉萎缩症等 1 3 , 1 4 1 。r c t 由美国e l i l i l l y 公司研制成功，并于2 0 0 0 年 被美国f d a 批准作为新型饲料添加剂应用于动物生产1 1 5 】。有研究表明，动物日 粮中r c t 的添加量为临床治疗剂量的5 1 0 倍时，动物体内的营养成分由脂肪向 肌肉转移，表现出营养再分配效应，进而调控动物体的物质代谢，增强脂肪分解， 促进蛋白质合成【l6 1 ，显著提高胴体瘦肉率和饲料报酬，且对猪的饲养效应尤为 明显。为追求更大的饲养效益，众多养殖场不断提高动物日粮中r c t 的添加量， 其滥用及在动物性食品中的残留严重危害人们的健康和生命安全，除美国f d a 外，我国和世界上多数国家都严禁r c t 用作饲料添加耕1 7 , 1 8 】。 1 2 1r c t 化学结构 h o 毒 h o n h 0 h 图1 2 盐酸莱克多巴胺分子结构图 f i 酉- 2m o l e c u l es t r u c t u r eo fr a c t o p a m i n eh y d r o c h l o r i d e r c t 的化学成分为1 ( 4 羟基苯基) 2 - 1 - 甲基一3 ( 4 羟基苯基) - 丙胺基】一乙醇， 见图1 2 。动物生产中以r c t 盐酸盐形式用作饲料添加剂，称之为盐酸莱克多巴 胺( r c t h c l ) ，分子式为c a ；h 2 3 0 3 n h c l ，分子量为3 3 7 8 3 ，是以对羟基苯乙酮 和复盆子酮为原料合成的，对羟基苯乙酮经催化溴化反应制得w 二溴对羟基苯乙 酮，复盆子酮经肟化和催化氢化制得1 甲基3 ( 4 羟基苯基) 一丙胺，将两者加入碱 性水溶液和乙酸乙酯组成的两相体系中搅拌反应，产物经盐酸酸化处理得到中间 产物1 ( 4 羟基苯基) 2 - 1 甲基3 一( 4 - 羟基苯基) 一丙胺基】- 乙酮的盐酸盐，再经催化 氢化还原即制得r c t h c l 。r c t h c l 分子结构中有两个手性中心，分别为1 、3 位，因而有r s 、s r 、r r 、s s 四种异构体【l9 1 ，作为饲料添加剂应用的r c t h c i 是其四种异构体的混合物，其中r r 生理活性最强，r s 次之，s r 、s s 没有生理 4 第一章文献综述 活性f 2 0 1 。 1 2 2r c t 理化特性 r c t h c l 呈白色粉末状，常温下暴露在空气中性质稳定，溶于水，由于 r c t h c l 分子中含有仲胺( p h 8 8 5 ) 、对羟甲基酚( p h 9 2 1 ) 和i 碱性酚( p h l l 0 1 ) 3 个 电离基团，其水溶液呈碱性，p h 为9 4 。r c t h c l 在碱性环境中以非离子化的形 式存在，易被乙酸乙酯等有机溶剂从水相中萃取出来【2 1 1 。r c y h c i 微溶于丙酮， 易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，溶液呈中性，p h 为6 0 7 0 。在r c t h c l 分子 结构中，仲胺基和酚羟基是进行化学反应和结构修饰的活性部位，乙醇胺基是与 受体结合的有效部位【2 2 1 。 1 2 3r c t 作用机理 r c t 与靶组织细胞膜b 2 受体结合，激活腺苷酸环化酶，催化三磷酸腺苷( a t p ) 转化为环一磷酸腺苷( c a m p ) ，c a m p 使蛋白酶活化，诱发一系列酶的磷酸化过 程和生理效应，达到营养再分配的目的。 g r a n t 等1 2 3 】在猪日粮中添加r c t 2 0 m g m l ，4 周后测定背最长肌中c a m p 、 r n a 的浓度和d n a 的转录活性。结果表明r c t 可显著提高猪背最长肌中c a m p 的浓度，c a m p 能促进基因转录与翻译过程，进而促进蛋白质的合成。研究发现 在r c t 作用下，促进氨基酸向细胞膜内转运，为蛋白质的合成提供更多的底物； 同时使皮下脂肪中的c a m p 浓度升高，c a m p 作为第二信使刺激脂肪分解，抑制 脂肪合成。 1 3 小分子人工抗原合成及鉴定的进展 氯霉素和莱克多巴胺均为小分子化合物，抗原性弱，不能够刺激机体产生免 疫应答，必须把其连接到大分子物质( 如载体蛋白质) 上，才能形成较为理想的免 疫原。蛋白质偶联方法主要有碳二亚胺( e d c ) 法、混合酸酐( m a ) 法、戊二醛法、 n 羟基琥珀酰亚胺( n h s ) 法、琥珀酸酐法和重氮化法等。 1 3 1 分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶联 广东工业大学硕士学位论文 1 3 。1 。1 碳二亚胺( ( e d c ) 法 碳二亚胺( e d c ) 使羧基和胺基问脱水形成酰胺键，半抗原上的羧基先与e d c 反应生成一个中间物，然后再与蛋白质上的胺基反应，形成半抗原与蛋白质的结 合物。e d c 被称作零长度交联剂之一，因为它作为酰胺键的形成介质并没有形 成手臂分子。此连接方法十分简便，只需将载体蛋白质和抗原按一定比例混合在 适当的溶液中，然后a n * 水溶性碳化二亚胺，搅拌1 2 小时，置室温2 4 小时， 再经透析即可【2 4 1 。如果半抗原分子中不含羧基，可通过某些化学反应引入羧基。 在引入羧基后，也可用上述方法进行偶联。 h n r 蛋白质一c o o 。+ r 矗h c n r 一蛋白质一如o - k k i - i - - r - h n ro 蛋白曩一a ) 0 c 州h - r + 睾抗纛* h i 羹白彝昏n h 一半抗最+ 冀一n h c 一n 一彭 l_h 图1 3 碳二亚胺法 f i 驵- 3t h ec a r b o d i i m i d er e a c t i o n 二环己基碳一亚胺( d c c ) 与水溶性碳二亚胺( e d c ) 法是近年来偶联小分子 物质与蛋白质时常用的方法【2 5 1 。胡江丽等【2 6 1 采用二环己基碳一亚胺( d c c ) 和水溶 性碳二亚胺( e d c ) 法，分别将琥珀酸酯化的薯祯皂素与牛血清白蛋白( b s a ) 偶 联，得到不同的免疫原，通过免疫获得兔多克隆抗体，用间接竞争性d o t e l i s a 方法分析比较这两种免疫原的免疫效果结果表明d c c 法合成的薯祯皂素免疫原 免疫效果优于e d c 法。 徐海祥等伫7 1 利用碳二亚胺法将合成的人脑钠肤与牛血清白蛋白偶联制备单 个抗原，反复免疫b a l b e 小鼠，应用杂交瘤技术将免疫小鼠的脾细胞与b a l b c 小鼠肾髓瘤细胞在p e g 下融合，h a t 选择性培养，间接酶联免疫吸附力法对细 胞培养上清检测、筛选，选择筛选结果脑钠肤抗体阳性的细胞株连续进行3 次亚 克降，建立稳定分泌脑钠肤单克降抗体的杂交瘤细胞株。结果免疫小鼠血清呈脑 钠肤抗体阳性，经筛选得到3 株稳定分泌脑钠肤单克降抗体的杂交瘤细胞株，纯 化的单克降抗体经鉴定为i g g 型，蛋白质印迹分析证实单克降抗体可特异识别脑 钠肤，具备较高的特异性及敏感性。 郑劫等【2 8 1 用碳二亚胺将结构修饰了的双酚a 与牛血清蛋白相偶联，经透析 6 第一章文献综述 得到纯的双酚a 人工抗原并冷冻干燥备用。然后用紫外光谱、红外光谱和免疫 方法对人工抗原进行鉴定。结果表明合成的人工抗原紫外光谱图中具有蛋白质和 双酚a 的特征吸收峰；人工抗原红外光谱图中呈现双酚a 和牛血清蛋白的红外 特征吸收峰；通过竞争e l i s a 试验表明用合成的人工抗原免疫的b a l b e 小鼠血 清中产生抗双酚a 的抗体。 1 3 1 2 混合酸酐( m a ) 法 混合酸酐( m a ) 法也称氯甲酸异丁酯法。半抗原上的羧基在正丁胺存在下与 氯甲酸异丁酯反应，形成混合酸酐的中间体，再与蛋白质的胺基反应，形成半抗 原与蛋白质的结合物。 0 0 拳抗曩卜0 0 0 h 十d c o c h l c h ( c h i 2 曼半抗山墨o c 竭c h ( c 啦) l 0o 半抗原0 o h ：c h t c h ：h + 蛋白质载侉一n h 。2 坠 半抗原c j 0 i n h 一蟹白质+ h o 湖露h ( a 魄) 3 图1 4 混合酸酐法 f i 酣- 4t h em i x e da b h y d r i d er e a c t i o n 早在1 9 5 7 年e r l a n g e r 等【2 9 1 用改进的混合酸酐法合成的人工抗原氯霉素琥珀 酸酯牛血清白蛋白( c a p h s b s a ) ，经红外波谱，初步鉴定偶联成功。1 9 8 4 年 c a m p b e l l 等【3 0 1 使用混合酸酐( m a ) 法制备氯霉素半琥珀酸酯，用于竞争酶联免疫 吸附试验。后来又有很多此方面的研究【3 l 】。 石德时等【3 2 1 采用改进的混合酸配法合成的兔疫原氯霉素琥珀酸酯牛血清白 蛋白，经红外波谱鉴定后，兔疫5 只家兔，3 个月后，产生合格氯霉素抗血清， 用双向琼脂扩散方法测定效价为1 ：1 6 。此氯霉素抗血清与氯霉素半琥珀酸酯和琥 珀酸钠氯霉素的交叉反应率分别为8 5 0 0 、8 0 0 o ，与磺胺二甲嘧啶、磺胺二 甲5 甲氧嘧啶、水济性氟哌酸、青霉素、链霉素的交叉反应率均小于0 0 1 。 于洪侠等【3 3 】采用多元酸酐法活化盐酸莱克多巴胺，用混合酸酐法将活化的 莱克多巴胺与载体蛋白( k l h ，b s a ) 偶联，制备了莱克多巴胺免疫原k l h r a c 和包被抗原b s a - r a c 。以k l h r a c 免疫新西兰白兔获得了莱克多巴胺多克隆抗 体，以b s a - r a c 为包被抗原，采用间接e l i s a 检测抗血清，其效价达到1 ：6 0 0 0 ， 7 广东工业大学硕士学位论文 间接竞争e l i s a 测得抗血清的i c 5 0 值约为5n g m l ，其与克伦特罗、沙丁胺醇特 布它林的交叉反应性小于0 0 1 。 王自良等【3 4 】将氯霉素( c a p ) 进行化学修饰引入羟基活性基团，合成具有半抗 原结构特征的氯霉素半琥珀酸酯( c a p h s ) ；采用混合酸配( m a ) 法将c a p h s 与 牛血清白蛋白( b s a ) 和卵清蛋o ( o v a ) 偶联合成人工免疫原b s a c a p h s 和包被 原o v a - c a p h s ，用红p f ( i r ) 、紫外( u v ) 、凝胶电泳( s d s p a g e ) 进行鉴定；用b s a - c a p h s 免疫新西兰白兔和s p f 鸡制备多克隆抗体( p a b ) ，间接e l i s a 测定 其效价，阻断e l i s a 鉴定其敏感性，琼脂双扩散试验、w e s t g o l d 膜杂交试验和 交叉反应试验鉴定其特异性。结果表明，b s a - c a p h s 偶联成功，其分子结合比 为1 5 6 ：1 ，获得了高价、敏感、特异的c a pp a b ，为c a p 残留免疫学检测方法 的建立垫定了基础。 张海棠等【3 5 】将莱克多巴胺进行化学修饰引入羧基活性基团，合成具有半抗 原结构特征的r a c 戊二酸酐半醛化合物( r a c s a ) ；采用混合酸酐法将r a c s a 与牛血清白蛋i 刍( b s a ) 和卵清蛋1 刍( o v a ) 偶联合成人工兔疫原b s a - r a c 和包被 抗原o v a - r a c ，用红外( i r ) 、紫外( u - v ) 和凝胶电泳( s d s p a g e ) 进行鉴定，推 算分子结合比：用b s a - r a c 兔疫新西兰白兔，间接e l i s a 测定多克隆抗体( p a b ) 效价，阻断e l i s a 鉴定其敏感性，琼脂双扩散试验。w e s tg o l d 膜杂交试验和交 叉反应试验鉴定其特异性。结果表明，b s a - r a c 偶联成功，分子结合比为2 4 5 ：1 ； 获得了高价、敏感特异的r a cp a b ，为r a c 残留免疫学检测方法的建立奠定了 基础。 王雪等【3 6 1 采用混合酸酐法和重氮化法将半抗原氯霉素与载体牛血清白蛋白 及卵清蛋白偶联制备免疫抗原c a p b s a 和包被抗原c a p o v a 。以紫外扫描确 定偶联率，并用酶联免疫( e l i s a ) 的方法鉴定，确定偶联成功。经过比较混合 酸酐法优于重氮化法。 1 3 2 含有胺基或可还原硝基半抗原的偶联 1 3 2 1 戊二醛法 双功能试剂戊二醛的两个醛基分别与半抗原和蛋白质上的胺基形成s c h i f f 键 ( n = c 事抗卜 - r o t s 联 图1 5 重氮化法 f i 酿5t h ed i a z o t i z a t i o nr e a c t i o n w o l f e r s 等【4 3 】使用重氮法合成抗肿瘤的抗体，随后很多学者在这方面进行研 究，得到许多不同的结果【“舶】。 王选年等1 4 7 j 用重氮化法将半抗原克伦特罗( c l ) 偶联于载体蛋白b s a 免疫 b a l b c 小鼠，应用杂交瘤技术建立分泌c l 单克隆抗体细胞株；用体内诱生腹 水法生产c l 单抗，硫酸钠盐析法提纯。应用抗小鼠同种型抗体测定单抗的同种 型，用竞争性e l i s a 和胶体金膜层析试验测定c l 单抗的反应特异性和反应动 力学。筛选出c 4 g 1 、c 一2 h 6 、c 2 d 6 和c 4 c 9 等4 株高敏感性和高特异性杂交 瘤生产单抗，其单抗的间接e l i s a 效价分别为5 x 1 0 弓、3 x 1 0 4 、6 x 1 0 4 、2 x 1 0 巧； 同种型分别为i g g l l ：、i g g l h c 、i g g 2 a l ：、i g g 2 a x 。c 一4 g 1 的亲和力常数k = 1 6 8 x 1 0 8l m o l ，c 2 h 6 的亲和力常数k = i 3x 1 0 8l m o l 。经w e s t g o l d 蛋白质印迹鉴 定单抗与c l 特异性结合。c 4 g 1 单抗对c l 的半数抑制浓度( i c s 0 ) 为7 1 9 4 n g m l ， 对沙丁胺醇( s b ) 的i c 5 0 为1 0 0 0 n g m l ，对肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上 腺素和来克多巴胺的i c 5 0 均2 6 4 0 0n g m l ；c 4 g 1 单抗与s b 的交叉反应性为 o 7 9 ，与异丙肾上腺素的交叉反应性为o 1 2 ，而与肾上腺素、去甲肾上腺素、 来克多巴胺、各类抗生素及多种维生素均无交叉反应性。用单克隆抗体杂交瘤技 术成功制备了半抗原c l 的单克隆抗体并可用于竞争性e l i s a 试验检测c l 。 胥传来等【4 8 】制备氯霉素( c a p ) 牛血清白蛋白( b s a ) 及氯霉素( c a p ) 卵清白蛋 f l ( o v a ) 的偶联物并进行鉴定。采用混合酸酐法和重