流式细胞术PPT课件.pptx

流式细胞术-原理、操作及应用,1,.,主要内容,一、流式细胞仪结构和原理流式细胞术简介流式细胞仪的光信号检测流式细胞仪的结构组成荧光抗体的选择流式细胞术数据的存贮、显示与分析二、流式细胞术操作与技巧三、流式细胞术在生物医学中的应用,2,1.1流式细胞术简介,流式细胞术（FlowCytometry，FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。流式细胞仪（FlowCytometer）是集细胞与分子生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。,3,流式细胞术的特点,检测对象：单细胞悬液或生物颗粒；检测参数：多参数；检测特点：单细胞水平分析；检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒；检测结果：精度高、准确性好；可对目标细胞进行分选；,4,流式细胞仪的分类,分析型流式细胞仪细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。分选型流式细胞仪既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选；进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流式细胞仪一般只用于分选。,5,流式细胞仪的发展及商品化,1934Moldavanl:Firsttry(固定式细胞分析-流动式)；1953Crosland-Taylor:鞘流系统(解决难题)；1956Coulter原理(血细胞计数器)；1965Kamentsky:分光光度计定量细胞成分和散射光应用；1967Kamentsky等设计了细胞分选的装置；1969Vandilla等:第一台荧光检测细胞计(鞘流聚焦、激光)；1972斯坦福大学:研制出荧光激活细胞分选仪(FACS)；1973BD公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流式细胞仪-FACS。1975Kohler和Milstein:单克隆抗体技术(促进流式发展)。,6,BD公司分析型流式细胞仪,FACSCalibur双激光四色，市场覆盖率最高,LSRII双激光六色，三激光八色，四激光十色，分析型最高配,FACSCantoII双激光六色，三激光八色,FACSVerse双激光六色，三激光八色,7,BD公司分选型流式细胞仪,FACSVantageSE,FACSAriaIII,Influx,8,1.2流式细胞术光信号检测,光信号的类型散射光信号：与标记荧光素无关，是细胞的固有参数。前向散射光(forwardscatter,FSC);侧向散射光(sidescatter,SSC).荧光信号自发荧光(细胞色素因子、核黄素)：微弱特异荧光：标记的荧光素分子发出的荧光，比自发荧光强很多倍。,9,1.2.1散射光信号,（一）前向散射光FSCFSC信号方向与激光束平行，偏离度一般在1-6度范围内，亦称小角度散射光，主要反映被测细胞的体积大小和活力。,10,（二）侧向散射光SSC,SSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称90度散射光，其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化。,11,（三）散射光的作用,实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。,粒细胞,单核细胞,淋巴细胞,红细胞、死细胞和碎片,12,死细胞或碎片,粘连细胞,肿瘤细胞株FSC/SSC散点图,死细胞,加药处理后FSC/SSC散点图,通过FSC/SSC散点图，gate出目标细胞进行分析。,13,1.2.2荧光信号,（一）荧光：物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。,发射波长(荧光波长)Emissionwavelength,激发波长Excitationwavelength,14,（二）常用荧光素,499nm蓝色荧光（Blue）；500-549nm，绿色荧光（Green）；550-584nm，黄色荧光（Yellow）；585-615nm，橙色荧光（Orange）；616-700nm，红色荧光（Red）；700nm，远红外荧光（Far-Red）。标记抗体的荧光素,15,核酸荧光染料PI（碘化丙啶535,623）可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。7-AAD（7-氨基放线菌素D545,647）以插入的方式与DNA链的G-C碱基对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚358,456）可以非嵌入方式与DNA链上的A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想的DNA定量染料。Hoechst（343,450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。PY（派若宁560,573）RNA染料，能进入活细胞。AO（吖啶橙509,525）DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光，RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。,16,1.3流式细胞仪的结构组成,液流系统流动室液流驱动系统光学系统激发光源光束收集系统电子系统光电转换器数据处理系统细胞分选系统喷嘴电偏转板样本收集器,17,1.3.1液流系统,鞘流技术：根据层流原理发展起来的技术，可以实现两种液体的同轴流动，样本细胞流位于轴心稳定流动，外面包裹有鞘液(sheath)。流体动力学聚焦：稳定的液流从截面积较大的部分流入截面积较小的部分后，有一个聚焦收缩作用，细胞流直径被约束在10-20um，避免了多个细胞重叠进入检测区。,鞘液,鞘液,细胞流,激光照射点,流体动力学聚焦示意图,18,1.3.2光学系统,（一）激发光源：激光器气体激光器：氩离子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪离子(647nm)、氪氩(568nm)；染料激光器：如氩离子激光泵浦的Rhodomin6G水溶液染料激光器，发出550-650nm可变波长激发光；半导体激光器：价格低、结构简单、寿命长。BD的FACSCalibur已采用635nm半导体激光器。激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照。现在仪器常配有仪器选配2-4根激光器，波长多为488nm、633nm和355nm、405nmUV；,19,（二）光收集系统,滤光片的组成长通滤片(LP)：只允许特定波长以上的光束通过；短通滤片(SP)：只允许特定波长以下的光束通过；带通滤片(BP)：只允许一定波长范围内的光束通过。,20,全反射光路,FACSAria流式细胞仪器信号检测系统,PE-Cy7,PerCP-Cy5.5,PE-TexasRed,PE,FITC,SSC,21,1.3.3电子系统,光电检测器将光信号转换成电子信号。前置放大电路将信号等比例放大，输出电脉冲信号。模数转换器将模拟的电脉冲信号转换成数字信号。数据处理系统计算机系统数据采集、分析。,22,（一）光电检测器(photodetector),光电二极管(photodiode)光灵敏度低，测定强信号（FSC）；光电倍增管(photomultiplier,PMT)光灵敏度高，测定弱信号（SSC,FL1,FL2,FL3,FL4)。,23,（二）电信号两种放大方式,由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析处理，一般信号的放大可以使用线性或对数两种方式。线性(linear;lin)对数(logarithmic;log)一般FSC和SSC变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号变异范围较大，多使用对数放大。,24,（三）荧光信号的面积A、宽度W和高度H,细胞通过激光检测区域时，产生的荧光信号被光电倍增管接收，形成脉冲信号。,荧光信号脉冲形成示意图,25,荧光信号脉冲的面积、高度和宽度,Width=Area/Height,一个信号脉冲有高度、面积和宽度。,26,27,通道(channel)一个光电检测器就是一个通道，有多少个光电二极管/倍增管，就有多少个通道：散射光通道:FSC通道和SSC通道；荧光通道通道命名方式：以FL(fluorescence)加数字命名，如FL1、FL2、FL3等。以该通道接收的主要荧光素命名，如FITC通道、PE通道、APC通道等。Forexample：FACSCalibur有488nm和633nm两根激光器，488nm能检测FSC、SSC、FL1(FITC)、FL2(PE)、FL3(PerCP)，635能检测FL4(APC)，代表Calibur有6个通道，最多能同时检测4个荧光，6种参数。,28,1.3.4流式分选,电荷式分选超声振动器(15-100kHz)液流充电系统高压偏转板收集装置(流式管、培养板),lasers,断裂点(充电),高压偏转板,29,四路分选原理,电荷式分选装置,30,分选指标,分选时间由三方面决定：进样速度、目标细胞所占比例、需要收集的细胞数。,分选时间表(机器流速10000个/s时),31,分选速度、分选纯度和分选收获率，相互影响。分选纯度指被分选出来的细胞所占的百分比，一般能达99%以上。分选收获率是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。分选纯度和收获率永远是相互矛盾的，纯度提高，收获率降低，反之亦然。富集模式(enrichmode)纯化模式(purifymode)单细胞模式(singlecellmode),32,1.4荧光抗体的选择,A根据流式细胞仪选择抗体流式细胞仪能检测的通道数(由激光器种类、数量和使用的光学滤片决定)。如FACSCalibur：多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的荧光素可以随意搭配。FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。,33,B根据抗原表达强弱合理选择抗体不同的荧光素强度有所不同；高表达的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的荧光素分配给表达低的抗原：CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PE,C选择荧光波谱间光谱重叠较小的荧光染料进行组合，同时需要正确的调节补偿。,CD5,34,1.5FCM数据存储、显示与分析,标准的FCM数据采用列表模式（listmode），记录了每个细胞的所有参数的信息。每个细胞检测5个参数，那么获取10000个细胞，容量为510000（字或双字）。,35,FCM数据显示方式,单参数直方图(Histogram)双参数数据显示：散点图(DotPlot)伪彩图(Pseudo-colorPlot)等高线图(ContourPlot)密度图(DensityPlot)假三维图(Pseudo3DPlot)三维图(3DPlot),常用分析软件CellQuestDivaFlowJOWinMDIFCSExpress,36,直方图Histogram,细胞的某一单参数数据的统计分布图，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，单位是道数，纵坐标一般是细胞数。,Counts,FITC荧光强度,37,横坐标既可以是线性的，也可以是对数的。,DNA倍体分析,抗原表达分析,Overlay图,38,散点图,散点图中每个点代表一个细胞，X轴与Y轴分别代表一种参数，优点是比直方图直观。,39,散点图和伪彩图,40,等高图和密度图,等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目相等，越在里面的曲线代表细胞数目越多。密度图：点密度越大的地方细胞越多，点密度越小的地方细胞少。,41,假三维图和三维图,42,设门与数据分析,门(Gate，简写G)是流式细胞术中的一个重要术语，FCM数据分析过程实际上就是选门和设门的过程。,椭圆形,圆形,43,矩形,任意形状,R(Region，区域)。门可以是单一区域(G=R1)，也可以是几个区域组合在一起：G=R1andR2;G=R1orR2;G=R1notR2。,44,十字门,线性门,45,二、流式细胞术操作与技巧,流式细胞术操作流程：,46,2.1单细胞悬液制备2.2免疫荧光标记2.3对照的设置2.4光谱重叠与补偿,47,2.1单细胞悬液制备,2.1.1新鲜实体组织的样本制备对于不同组织来源的实体组织和实体瘤标本，应该根据各自特点选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产量高、损伤小的目的。常用方法有：酶消化法机械法化学试剂处理法,48,酶消化法：根据分散组织类型来确定使用的酶类：胰蛋白酶水解酯键、肽键；胶原酶降解几种分子类型的胶原；溶菌酶水解糖蛋白、肽的糖苷键；弹性蛋白酶消化糖蛋白、弹性蛋白的纤维。将新鲜组织置于离心管中，加入1-2ml酶消化20-30min（恒温37或室温），间断振荡或吹打；终止消化，收集细胞悬液，300目尼龙网过滤，除去细胞团块，低速离心除去细胞碎片；将制备好的单细胞悬液进行荧光标记或保存备用。注意：酶的使用浓度、温度、消化时间、酶活性的pH值。,49,机械法特点：易造成细胞碎片和团块，实际操作时，应注意碎片和团块的去除，常与其他方法（如酶消化法）配合使用。,组织解离器,机械法：有剪碎法、网搓法、研磨法等。利用机械方法、物理方法给予组织交大的压力，使细胞从组织间分散开来。,50,化学处理法：作用原理：将组织细胞间起黏着作用的钙、镁离子置换出来，从而使细胞分散开来，常用试剂有EDTA、EGTA、TPB等。EDTA是一种螯合剂，可以和组织间的钙、镁离子形成螯合物，实际运用中常采用螯合物加酶法（主要是胰蛋白酶）。特点：用化学法细胞存活率低、细胞产额低，细胞碎片和聚集量不稳定。,51,机械法往往造成严重的细胞损伤，而结果却是较低的细胞产量，注意去除细胞碎片和团块以免影响FCM结果，如低速离心去碎片、尼龙网过滤团块等。酶消化法、化学试剂处理法对实体组织的分散效果较理想，但会造成所测化学成分的不良影响。根据实验目的去选择合适的单细胞悬液制备方法，最终要求细胞呈单个分散状态；细胞碎片、团块尽量少；细胞活性不受到明显损伤，保证下一步荧光染色。,52,2.1.2石蜡包埋组织样本制备,切片：将石蜡组织切成50um厚的组织片4-5片，放入1试管中；脱脂：加入二甲苯3-5ml脱脂，室温下1-2天，脱净后弃二甲苯；水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度乙醇5ml，每步10min，去乙醇后加入蒸馏水3-5ml，3-5min后弃水；消化：加入5ml0.5%胃蛋白酶（pH1.5-2.0），37恒温水浴30min，每隔5-10min振荡一次；终止消化：加冷的PBS或生理盐水终止消化；过滤：用300目尼龙网过滤，未消化好的组织可做第二次消化；收集细胞悬液：将过滤液离心沉淀，再用PBS漂洗1-2次，低速离心沉淀去除碎片；根据实验目的标记荧光抗体，或保存细胞备用。,53,2.1.3血液、骨髓样本制备,外周血单个核细胞PBMC的分离,注意：由于多核粒细胞比较大，粒细胞沉降在红细胞层，所以该法不适合粒细胞研究；该法操作过程中可能丢失一些有意义的细胞或细胞亚群，所以临床上一般不主张分离血液或骨髓的单个核细胞。,54,红细胞裂解液去除红细胞原理：红细胞裂解液成分为低渗的NH4Cl溶液，利用双凹型的红细胞膜抗性差，白细胞膜抗性比较好的特点，加入低渗透压的红细胞裂解液时，红细胞膜胀破，而白细胞膜不受影响，从而达到去除红细胞的目的。,55,2.1.4培养细胞单细胞悬液制备,2.1.5体液脱落细胞样本制备,悬浮生长细胞,吸管反复吹打,贴壁生长细胞,消化处理,离心获得单细胞悬液,洗脱液尿液胸腹水,离心收集细胞，用生理盐水或PBS洗涤3次,300目尼龙膜过滤后离心沉淀去上清,单细胞悬液,56,FCM可检测下列细胞成分：表面标记物胞浆标记物核内标记物可溶性成分,2.2免疫荧光染色,57,荧光素偶联抗体抗体上偶联荧光素(FITC、PE等)，通过抗原抗体反应让目标细胞特异性的带上荧光。染色过程即抗原抗体反应过程。荧光染料/荧光化合物PI、DAPI等插入核酸链中；CFSE和蛋白质共价结合；AnnexinV-FITC检测凋亡。荧光蛋白如GFP，不需要染色，直接检测。,58,免疫荧光染色主要包括直接和间接免疫荧光染色两种方法。间接标记的方法难以进行多色标记，而且操作复杂、信噪比高，所以一般首先直标荧光抗体。,荧光抗体,荧光二抗,第一抗体,直接标记,间接标记,59,一般检测时，获取12万个细胞，标记0.51106细胞即可。下述情况细胞量需相应增加：检测胞内/核内抗原，离心次数多；细胞周期乙醇固定损失细胞多；检测细胞在标本中比例低,0.51106个细胞,孵育体积50-100ul,上机体积200-500ul终浓度约1106个/ml,加染料,洗涤后补加液体,细胞表面抗原标记,60,表面抗原分析是流式应用中最广泛的，标记步骤也相对简单。标记：取0.51106细胞，加入适量抗体(根据抗体说明书)，充分混匀后(总体积50-100ul)，4避光孵育10-30min。洗涤：加入1mlPBS洗液，300g离心洗涤5min。上机检测：弃去上清后加入200-500ulPBS，重悬细胞后立即上机检测；如不能及时上机检测，则加入同样体积的1%多聚甲醛，混匀后置于4冰箱内保存，一般不超过24h。,61,胞内抗原荧光标记,细胞内抗原：如MPO；核内抗原：如FoxP3；细胞内细胞因子(胞内因子)：IFN-r、IL-4、IL-17等。固定：4多聚甲醛破膜/透化0.05%皂素(saponin)；0.01%TritonX-10070%乙醇,62,膜表面抗原染色：分别加入相应的荧光素标记抗体和适量细胞标本，充分混匀后避光孵育10-30min。洗涤：加1mlPBS洗液，300g离心5min。固定：去上清后加入500ul4%多聚甲醛，固定20min。透化：离心洗去固定剂后，加皂素500ul，透化10min。胞内抗原染色：离心洗去透化液后，加入相应荧光素标记抗体，混匀后室温避光孵育30min。洗涤：加1mlPBS洗液，300g离心5min。上机检测：弃去上清后加入PBS200-500ul后上机检测。,63,2.3对照的设置,空白对照细胞内物质自身也发出荧光，能被FCM灵敏的检测到，这种未染色的细胞自身发出的一些荧光称为自发荧光。设置空白对照（未染色的细胞），用以区分细胞的自发荧光和特异性荧光，避免假阳性的结果。,64,流式结果中荧光强弱是一个相对值，光电倍增管电压越大，电子信号越强；电压越小，信号越弱。通过调节电压，使阴性对照管的荧光强度处于阴性的位置，实验组的荧光值都是相对对照组。,001,001,002,65,阳性对照PositiveControl,设置阳性对照是为了检测荧光抗体是否有效，并不是每次分析时都必须设置：使用新的荧光素抗体时；使用存储时间较长的荧光素抗体时。设置阳性对照的方法：用肯定表达有该抗原的细胞来检测；已经证明有效的、偶联其他荧光素的该抗原的抗体。,单标对照SingleStainingControl,两色或多色实验时须设置单标对照，用于补偿的调节；单标实验时不需要。,66,2.4光谱重叠与补偿,当细胞携带两种以上荧光素激发出不同波长荧光时，理论上可选择滤光片使每种荧光仅被相应的通道检测到。但由于目前使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质，虽然它们之间各自发射的峰值各不相同，但发射谱范围有一定的重叠，因而少量的荧光信号会被另一通道检测到，这种现象就是光谱重叠(spectraloverlap)。,FL1530/30,FL2585/42,发射波长,FITC发射谱,PE发射谱,67,实验操作中，常利用电子技术和计算机软件设置的方法将串入相邻荧光通道的信号扣除，这种技术称为荧光补偿(fluorescencecompensation)。,FL2-%FL1,FL-1(FITC),FL-2(-),FL-1(-),FL-2(PE),FL1-%FL2,补偿前,补偿后,FITC单标,PE单标,68,未补偿,正确补偿,FITC-PE补偿太大,PE-FITC补偿太大,补偿调节要合适,69,三、流式细胞术的应用,细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量,细胞结构,特异性抗原（细胞表面/胞浆/核）细胞内细胞因子细胞活性酶活性激素结合位点细胞受体,细胞功能,在上述分析基础上进行分选,70,3.1检测细胞周期3.2检测细胞凋亡3.3检测细胞增殖3.4免疫细胞亚型检测3.5检测细胞因子3.6检测细胞吞噬功能3.7流式分选,71,3.1检测细胞周期,处于不同细胞周期的细胞DNA含量不同，G0/G1期细胞含有二倍体量的DNA，G2/M期细胞含有四倍体量的DNA，而S期细胞DNA含量处于二倍体和四倍体量之间。,DNAContent,DNA荧光染料能与DNA结合，DNA含量的多少与荧光染料的结合量成正比，荧光强度反应了DNA吸收荧光分子的多少。通过流式检测就能反映细胞内DNA的含量，区分细胞周期的G0/G1期、S期和G2/M期细胞比例。,72,细胞周期分析核酸染料细胞膜非通透性染料：PI(碘化丙啶)、EB(溴化乙啶)，不能进入完整细胞膜，标记时需要通过固定等方法增加细胞膜的通透性。细胞膜通透性染料：DAPI、Hoechst，能染活细胞的DNA，但需紫外激光激发。PI标记法检测细胞周期需要乙醇固定增加细胞膜的通透性；需要加RNase，去除RNA对DNA的干扰。,73,PI法检测细胞周期一般步骤：收集单细胞悬液(1106个)，缓慢加入1ml预冷的70乙醇，于4固定过夜，或-20长期固定。离心收集细胞，再以1mlPBS彻底洗去乙醇；去上清后加入染色液(包含50ug/mlPI，100ug/mlRNaseA，0.2%TritonX-100)，37染色30min后上机检测。,74,细胞周期检测结果,脾脏细胞,培养肿瘤细胞,通过流式检测，能得出G0/G1期、S期和G2/M期细胞比例。增殖指数(proliferousindex,PI)：指处于S期和G2/M期细胞之和占总细胞的比例，反映了细胞的增殖能力。CV值(变异系数)：衡量仪器测量分辨率和精度的指标。,75,DNA倍体分析,病变肿瘤细胞常出现结构和染色体异常，流式检测DNA含量能反映异倍体情况。DNA指数(DNAindex,DI)：(样本的G0/G1期峰平均荧光道数)/(正常二倍体细胞G0/G1期峰平均荧光道数)，描述样品细胞DNA含量的偏离程度和倍体水平。倍体(ploidy)：染色体数目。二倍体DI=1；四倍体DI=2；二倍体四倍体之外统称异倍体。,二倍体,异倍体,异倍体,76,精子单倍体细胞,77,双联体细胞的去除利用信号脉冲FL2-W/FL2-A区别标本中的粘连细胞以及碎片，最大程度的减少假阳性。,78,79,3.2检测细胞凋亡,细胞死亡方式主要有两种：包括细胞坏死(necrosis)和细胞凋亡(apoptosis)。细胞凋亡，也称细胞程序性死亡，是细胞受基因调控的一种主动性的、高度有序的结束自己生命的过程。凋亡细胞在形态学和生化上有明显的特征，如细胞皱缩、核固缩、细胞膜卷曲、DNA片段化、线粒体电位发生变化。根据这些特征，流式有多种方法能定性及定量的检测细胞凋亡情况。,80,3.2.1亚二倍体(Sub-G1)峰的检测,凋亡细胞核小体崩解，DNA含量减少，加之由于DNA的降解，与荧光染料的结合减少，因此DNA染料的着色能力下降，荧光强度降低，表现在G1峰前出现亚二倍体峰，即亚G1峰(凋亡峰)。,细胞凋亡峰Sub-G1,四倍体峰,二倍体峰,PI,Number,81,3.2.2AnnexinV/PI双染法,正常细胞膜是不对称性的，胞浆面含有带负电的磷脂(如磷脂酰丝氨酸,PS)。早期凋亡时，细胞表面不对称性发生改变，PS外翻到胞外侧。AnnexinV是一种Ca2+依赖性的对PS有高度亲和力的磷脂结合蛋白，可作为探针识别膜表面是否有PS，从而识别凋亡细胞。,PS外翻,82,PI常用于鉴别死细胞。凋亡细胞的细胞膜仍然是完整的，所以PI不能进入早期凋亡细胞核内。,AnnexinV-FITC,PI,活细胞,早期凋亡,晚期凋亡坏死细胞,裸核,83,免疫荧光图,84,85,3.2.3线粒体膜电位检测法,凋亡细胞线粒体膜电位会发生改变，利用荧光探针罗丹明123(Rh123)、DiOC6和JC-1等标记后，经过流式能检测出线粒体电位的变化，从而反映了细胞的凋亡情况。JC-1在正常细胞中在胞浆以聚合体形式存在，在Fl-1和Fl-2有荧光；细胞凋亡时线粒体膜电位发生去极化，JC-1进入线粒体以单体形式存在，仅在Fl-1通道有荧光。,JC-1(Fl-1),JurkatTCells,Control,Camptothecin,JC-1(Fl-2),86,3.2.4DNA断裂片段的检测(TUNNEL法),凋亡中晚期会发生核酸内切酶的激活，双链的DNA出现不对称的断裂点，即产生一系列3-OH端。加入外源性的脱氧核苷酸末端转移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT)能够催化外源性荧光素标记的dUTP连接到DNA的3-OH端，通过流式检测就能知道DNA断裂片段的多少，这种方法叫做TdT介导的dUTP缺口末端标记法(TdTmediated-dUTPnickendlabeling,TUNEL)。近来研究证实，Br-dUTP(BrdU)更容易掺入到凋亡细胞的DNA中，所以现在流式中都先用BrdU进行掺入反应，然后使用荧光素标记的BrdU抗体进行细胞染色，流式检测后得到凋亡结果。,87,TUNEL法检测凋亡原理,88,Fas-inducedApoptosisinJurkatTCells,AnnexinV-FITC,89,3.3检测细胞增殖,细胞增殖(proliferation)是细胞生命活动的重要特征之一。检测细胞增殖的方法主要有：MTT检测法胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入法流式细胞术细胞周期法相对计数法/绝对计数法示踪染料标记法BrdU标记法增殖蛋白检测,90,3.3.1示踪染料标记法,示踪染料能与细胞发生非特异性的稳定结合，主要有两种结合方式：一种进入胞内与蛋白质共价结合，如CFSE和BRSE；另一种嵌入细胞膜的脂质双分子层，与细胞非共价结合，如PKH类和CellVue类等。,CFSE标记细胞后对细胞没有很强毒性，被激发后能发出很强的荧光，并且非常稳定，只有当细胞分裂时，母细胞内的染料会被平均分配到子细胞中，细胞的荧光信号减少一半。,91,PMA刺激小鼠的脾细胞增殖图,92,3.3.2BrdU标记法,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)是胸腺嘧啶核苷的类似物，在细胞增殖DNA合成时可以与内源性的胸腺嘧啶核苷竞争掺入到新合成的DNA中，而BrdU抗体可以特异性的识别BrdU，所以可以检测细胞增殖。,anti-BrdU,AcidorDNase,打开双链,93,BrdU标记时同时加入DNA染料(PI,7-AAD)，结果为一个典型的“马蹄形”峰，不仅能得到G0/G1期、S期和G2/M期的比例，还能比较不同细胞DNA合成能力的不同。,sub-G15.6%,G0/G138.6%,G2/M14.4%,S期38.6%,94,BrdU标记法检测细胞增殖的另一优势是：发挥流式多参数的特性，能和其他指标同时检测，既可以是表面抗原，也可以是胞内蛋白。,取致敏BALB/c小鼠脾脏细胞，体外刺激(PMA和离子霉素)后掺染BrdU45min，标记anti-BrdU、7-AAD、CD8以及IL-10进行多参数分析,27%,24%,34%,38%,95,3.4免疫细胞亚型检测,CD分子是细胞(包括白细胞、红细胞、血小板、内皮细胞等)在分化为不同谱系(lineage)、不同阶段以及活化过程中或疾病状态下出现或消失的细胞表面标记。分化群(clusterofdifferentiation,CD)：一类分化抗原的总称，进行流水编号，至2009年已至少有350种CD分子。大多数白细胞分化抗原在生物进化中具有保守性，但是有些小鼠白细胞分化抗原和人类还是有所不同：某些人CD分子尚未在小鼠中确定；某些人和小鼠CD分子编号相同，但功能有所差别。,96,免疫细胞特征表型,Lin为谱系标记Lineagemarker，是造血细胞来源的各种血细胞和免疫细胞特异性标记的总称。Lin虽然包括很多种抗体，干细胞鉴定时，可能把它们标上同一种荧光素，只需分配一个流式通道。各流式抗体公司一般都有用于流式的lineagecocktail。,97,Granulocytes,Monocytes,Basophils,Lymphocytes,PeripheralWhiteBloodCellsCD45+,CD3+,CD3-CD19+,CD3-CD16+CD56+,Monocytes,CD14+,98,3.4.1淋巴细胞亚群分析,根据功能，淋巴细胞主要分为：T淋巴细胞(CD3+)，与细胞免疫有关；辅助性T细胞(CD3+CD4+)：helperTcells，Th细胞；细胞毒性T细胞(CD3+CD8+)：CytotoxicTcells，Tc细胞。B淋巴细胞(CD19+)，与体液免疫有关；NK细胞(CD3-CD16+CD56+)，行使免疫监控功能，能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。总T、总B和NK细胞的比例以及Th/Tc可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病。,99,FSC,SSC,CD3PerCP,SSC,CD4FITC,CD8PE,42.04%,48.3%,1.8%,13.9%,35.9%,T淋巴细胞亚群分析,CD3PerCP,CD4FITC,CD8PE,42.82%,37.41%,49.68%,100,T细胞、B细胞和NK细胞比例检测,健康成年人外周血淋巴细胞参考范围,101,3.4.2树突状细胞,树突状细胞(dendriticcell,DC)是机体功能最强的专职抗原递呈细胞，它能高效摄取、加工处理和递呈抗原。根据DC来源可将DC分为髓样DC(myeloidDC,mDC)和浆细胞样DC(plasmacytoidDC,pDC)。mDC主要由CD34+细胞和单核细胞分化而来，特征性标志为CD11c。pDC与淋巴细胞来源于同一前体细胞，特征性标志为CD123。一般认为：mDC表型为：Lin-/lowHLA-DR+CD11c+CD123-；pDC表型为：Lin-/lowHLA-DR+CD11c-CD123+。（Lin包括CD3、CD14、CD16/56和CD19/20）,102,FSC-Height,SSC-Height,Lin-FITC,HLA-DRPerCP,CD123PE,CD11cAPC,R1,R2,R30.16%,R4,IdentificationofpDCinPBMC,JImmunol.2004;173:1535-1548,103,GM-CSF和IL-4,分选,诱导分化,LPS或TNF-,促成熟,CD14+Monocyte,Immaturedendriticcell,maturedendriticcell,Monocyte-DerivedDendriticCell,104,3.4.3调节性T细胞,调节性T细胞(regulatoryTcell,Treg)是在机体免疫系统中发挥负向调节作用，属于一种免疫耐受的细胞，已成为目前免疫学领域研究的热门课题。目前为止已经发现了多种表型的Treg存在，一般认为Treg是指表达特征为CD4+CD25+Foxp3+的一群T淋巴细胞。Foxp3是Treg细胞的特异性标志，它是一种转录因子，调控着Treg分化发育及功能维持。胞内染色法才能检测，不能用于分选。,105,FSC,SSC,CD4FITC,SSC,CD25APC,IgG1PE,CD25APC,Foxp3PE,Treg细胞设门方法,106,以前根据CD4+CD25high来分选Treg。最近发现，CD127(IL-7受体)在Treg中低表达，因此CD127可以作为Treg比较理想的表面标记分子，以CD4+CD25int/highCD127low作为Treg的标志。,CD4、CD25、CD127三标法分选Treg细胞,107,3.4.4HLA-B27表型分析与强直性脊柱炎,强直性脊柱炎(ankylosingspondylitis,AS)是一种慢性的自身免疫性疾病，主要累及骶髂关节、脊柱、脊柱软骨组织及四肢关节，发生炎症和增生，严重影响人类正常生活，甚至丧失劳动能力。HLA-B27抗原属于型MHC，基本上表达在机体所有有核细胞表面，特别是淋巴细胞表面含量丰富。研究发现：HLA-B27的表达与AS有密切相关性，AS患者中HLA-B27频率为71-100%，而对照组仅为3-12%。临床上对疑似AS的病人，通过流式检测淋巴细胞HLA-B27的表达，作为一项重要的辅助诊断依据。,108,健康人,AS患者,HLA-B27FITC/CD3PEkit,109,3.4.5CD34+绝对计数与造血干细胞移植,外周血干细胞移植时，采集物中造血干细胞的数量对移植的成功有着直接的影响，因此有必要准确测定造血干细胞的绝对数量。CD34是目前应用最多的干细胞表面标记，采用流式细胞术快速定量CD34+细胞，被临床上广泛采用。其基本原理都是加入一定量的微球作为内参，通过已知浓度的微球测定CD34+细胞的绝对值。,绝对计数管,110,CD34+细胞绝对计数计算公式：CD34+细胞绝对值(获取CD34+细胞数/获取微球数)(每管微球数/标本体积),Nogate,Nogate,G=R1andR2orR3,111,3.5检测细胞因子,细胞因子(cytokine)是一类能在细胞间传递信息、具有免疫调节和效应等功能的蛋白质或小分子多肽。根据功能可以分为6大类：白细胞介素、干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、生长因子和趋化因子。细胞因子的检测方法：ELISA流式细胞术胞内细胞因子：胞内染色法(intracellularstainingassay)；胞间细胞因子：CBA法(cytometricbeadassay,流式微球阵列),112,3.5.1胞内因子检测,目的：检测胞内因子，结合膜表面抗原，可以对免疫细胞进行分类，Th1、Th2和Th17。Th细胞根据分泌细胞因子能力的不同，分为Th1细胞和Th2细胞。,细胞免疫,体液免疫,113,目前并没有找到公认的细胞表面鉴别标志，所以仍以分泌的细胞因子来区分Th1和Th2细胞：Th1：CD4+IFN-+Th2：CD4+IL-4+Tc1：CD8+IFN-+Tc2：CD8+IL-4+Th17是最近发现的一种效应性CD4+T细胞，以分泌IL-17为特征。Th17：CD4+IL-17+,114,活化：自然状态下，静止的淋巴细胞不分泌或者分泌极少量细胞因子，刺激激活后，细胞内的细胞因子合成增加。常用的刺激剂有佛波酯PMA、离子霉素(Inomycin)、ConA、PHA、LPS等。抑制分泌：细胞因子合成后很快就主动分泌到细胞外，位于细胞内的细胞因子的量很少，一般无法达到流式分析检测的最低标准，因此必须阻止细胞因子分泌到细胞外。蛋白质分泌抑制剂如莫能霉素(monensin)、BFA(brefeldinA)能抑制细胞因子分泌，使其累积在细胞内。,检测原理,115,取抗凝血和培养基1:1等体积稀释，加入刺激剂PMA、离子霉素和阻断剂莫能霉素，37、5%培养箱4-6h；取200ul，溶血后用PBS洗一遍；细胞表面染色：加PerCP-CD3和APC-CD8室温孵育20min(PMA刺激后CD4分子会被内吞减少)；固定、破膜后加PBS洗一遍；细胞内染色：加入荧光抗体FITC-IFN-和PE-IL-4，混匀后避光孵育30min；加2ml洗液，离心弃上清，加200ulPBS重悬细胞上机检测。,检测步骤(以检测全血Th1/Th2为例),116,细胞因子分析图,117,吸毒人外周血Th1/Th2和Tc1/Tc2比例检测,Th2,Tc2,Tc1,Th1,118,AS,RA,Control,在自身免疫性疾病AS和RA病人外周血中，Th17和Th22细胞增多,119,3.5.2CBA法,CBA(cytometricbeadarray,流式微球阵列)是新发展起来的能定量检测胞外游离可溶性成分(如细胞因子等)的新方法。CBA应用领域包括血清、血浆、泪液等体液标本以及细胞培养上清液中多种可溶性成分的检测。技术优点：能同时检测多种目的蛋白；样本需求量小；更高的灵敏度和更好的重复性；操作简单省时省力。,120,+,Bead,CaptureAb,CaptureBead,cytokine,DetectionAb,CBA技术原理,微球上包被细胞因子抗体后形成捕获微球(capturebead)，捕获微球上的捕获抗体(captureantibody)能与样本中相应的细胞因子特异性结合。这样捕获了细胞因子的微球就类似于一个细胞，加入相应的荧光素检测抗体形成“三明治”式夹心复合物，上流式后就能得到细胞因子的含量。,121,CBA微球是包被有荧光染料的，一系列荧光强度不同的微球就能同时检测多种细胞因子。,PE,PE-Cy5,IL-2,IL-4,IL-8,122,CBAkit中含有已知浓度的标准品，测定前将标准品稀释成不同浓度，制作标准曲线。,123,0pg/mL,80pg/mL,1250pg/mL,5000pg/mL,FL3Beads,IL-2IL-4IL-6IL-10TNFIFN-r,IFN-r,TNF-a,IL-10,IL-6,IL-4,IL-2,CBAhumanTh1/Th2cytokinekit标准曲线,PE,PE-Cy5,124,3.6检测细胞吞噬功能,巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞等都具有很强的吞噬功能，检测吞噬功能是免疫学研究的重要内容。把细菌或者吞噬颗粒标上荧光后，与目标细胞在37作用一段时间，流式细胞仪检测荧光信号的强弱就可以区分目标细胞是否具有吞噬功能以及吞噬功能的强弱。,125,Blood.2008;112:3175-3185,实验组：LRDC和cDC与FITC偶联的BSA在37作用4h；对照组：LRDC和cDC与FITC偶联的BSA在4作用4h；,LRDC的吞噬功能要强于cDC。,BSA-FITC,Counts,126,3.7.1免疫细胞亚群分选3.7.2GFP阳性稳转株分选3.7.3干细胞分选（一）造血干细胞分选（二）肿瘤干细胞分选（三）侧群细胞分选,3.7流式分选,127,3.7.1免疫细胞亚群分选,128,3.7.2GFP阳性稳转株分选,GFP(greenfluorescentprotein,绿色荧光蛋白)是一种含有内在荧光素的蛋白质，被488nm激光激发后能够产生稳定的绿色荧光，是常用的报告基因。将编码GFP的基因整合到目标基