（化学工艺专业论文）巯基化羧甲基壳聚糖的合成及其凝胶给药性能的研究.pdf

武汉理工大学硕十学位论文 摘要 羧甲基壳聚糖是一类水溶性壳聚糖衍生物，是具有良好的生物相容性、生 物可降解性、无毒和生物粘附性的高分子多糖，其优良的性质使得在医药领域 有着广泛的应用。巯基化羧甲基壳聚糖是羧甲基壳聚糖的衍生物。它既保留了 羧甲基壳聚糖的优良生物特性，具备水溶性和p h 敏感性，同时也具备了优良的 生物粘附性，是制备生物凝胶材料优良原料。本文利用l 半胱氨酸进行巯基反 应制备巯基化羧甲基壳聚糖，通过1 乙基3 ( 3 二甲胺基丙基) 碳二亚胺盐酸盐 ( e d c h c i ) 进行交联，自体交联等方法成功地制备出一系列凝胶材料，对其溶胀 性能和药物缓释性能作了研究。主要研究内容和结论如下： 1 以羧甲基壳聚糖为原料，制备了不同巯基含量的巯基化羧甲基壳聚糖， 用e l l m a n s 试剂测定了产物中巯基的含量，并考察了l 半胱氨酸与羧甲基壳聚 糖( c m c ) 的配比，催化剂的用量，c m c 的分子量等对产物的巯基含量的影响。 选取脱乙酰度为7 7 2 1 ，羧甲基取代度为0 1 5 4 ，重均分子量为1 3 2 x 1 0 5 的羧甲 基壳聚糖作为原料，l 广半胱氨酸与c m c 的质量比为2 ：1 ，添加n 羟基琥珀酰 亚胺( n h s ) 和e d c h c i 的浓度分别为0 1 m g m l 和0 2 m g m l 可以使反应快速 进行并得到巯基含量高达6 2 3 2 1 【m o l g 的产物。 2 以巯基化羧甲基壳聚糖为原料，通过e d c 交联和自体交联等方式，制备 了微凝胶，并以猪胃粘蛋白为模型，测定了微凝胶的体外生物黏附性。实验表 明当巯基含量为6 2 3 2 1 t m o l g 的巯基化羧甲基壳聚糖粉术在p h 3 0 的介质中有 最大黏附率1 2 0 2 5 ，表现出了优良的生物黏附性能，具备制作口服药物和粘膜 给药缓释系统的应用潜力。 3 以羧甲基壳聚糖甲壳素和巯基化羧甲基壳聚糖为原料，通过e d c 交联 制备了两种新型的生物凝胶。两种生物凝胶均显示出很明显的p h 敏感性。当羧 甲基甲克素的脱乙酰度为2 6 5 1 ，取代度为0 1 5 4 时，其e d c 交联的凝胶前3 h 在p h1 0 下中只有1 3 4 2 的b s a 释放出来，后2 4 h 转入p h 7 4 下5 6 5 4 的b s a 释放出来，而羧甲基取代度低于0 2 的毓基化羧甲基壳聚糖，其e d c 交联的凝 胶前3 h 在p h l 0 下只有不超过1 5 的b s a 释放出来，后2 4 h 转入p h 7 4 下超过 8 0 的b s a 释放出来，它们都显示出用于口服药物缓释体系的应用潜力，能在 胃部的酸性环境中保护大分子药物，将其运载到高p h 值的肠道中并释放。 本研究表明巯基化羧甲基壳聚糖作为定位给药系统的一种新型的材料，适 合于多肽、蛋白类药物的口服给药系统。 关键词：羧甲基甲壳糖，巯基化，凝胶 武汉理工大学硕士学位论文 a b s t r a c t c a r b o x y m e t h y lc h i t i n o s a ni sah y d r o s o l u b l ed e r i v a t eo fc h i t o s a n ，a n dw i d e l yu s e d i nt h ef i e l do fm e d i c i n ed u et oi t sb i o d e g r a d a b i l i t y , b i o c o m p a t i b i l i t y , n o n - t o x i c i t ya n d b i o a d h e s i o n t h i o l a t e dc a r b o x y m e t h y lc h i t o s a n ( s h c a r b o x y m e t h y lc h i t o s a n ) t h e d e r i v a t i v eo fc a r b o x y m e t h y lc h i t o s a n i ti saw a t e r - s o l u b l ea n dp hs e n s i t i v em a t e r i a l w h i l er e t a i n e dt h ee x c e l l e n tb i o a d h e s i v e ，s oi ti sas u p e r e x c e l l e n tm a t e r i a lt op r e p a r e b i o g e l a t i n as e r i e so fg e l a t i nm a t e r i a l sb a s e do nt h i o l a t e dc a r b o x y m e t h y lc h i t o s a n c r o s s l i n k i n gd u et oe d ca n db yi t s e l fw e r eo b t a i n e d t h em a t e r i a l sw h i c hh a dp h s w e l l i n ga n ds u s t a i n e dr e l e a s ec h a r a c t e r i s t i ch a db e e ns t u d i e da sac a r d e rf o r t h ed r u g r e l e a s e t h em a i nc o n t e n t sa n dc o n c l u t i o n sw e r ea sf o l l o w e d ： 1 s h c a r b o x y m e t h y lc h i t o s a nw i t hd i f f e r e n tc o n t e n to f s hw e r eo b t a i n e db a s e e d o nc a r b o x y m e t h y lc h i t o s a nb yl - c y s t e i n e e l l m a n sr e a g e n tw a su s e dt ot h e d e t e r m i n a t i o no ft h ec o n t e n to f s h w h e nt h ed e g r e eo fd e a c e t y l a t i o nw a s7 7 2 1 t h ed e g r e eo fs u b s t i t u t i o nw a s0 15 4 ，t h em o l e c u l a rw e i g h tw a s1 3 2 1 0 5 ，t h er a t i oo f l - c y s t e i n ea n dc m cw a s2 ：1 t h ec o n c e n t r a t i o n so fn h sa n de d cw e r e0 1 m g m l a n d0 2 m g m l ，s h - c a r b o x y m e t h y lc h i t o s a nh a dt h e l a r g e s tc o n t e n to f - s h ， 6 2 3 。2 1 9 m o l g 2 m i c r o - g e lb a s e do ns h - c a r b o x y m e t h y lc h i t o s a nw a sp r e p a r e db yc r o s s l i n k i n g w i t he d ca n di t s e l f t h ei nv i t r ob i o l o g i c a la d h e s i o no fm i c r o g e lw a sd e t e r m i n e d a n dp i gg a s t r i cm u c i nw a su s e da sam o d e lp r o t e i n w h e nt h e - s hc o n c e n to f s h c a r b o x y m e t h y lc h i t o s a nw a su pt o6 2 3 2 1 t m o l g ，t h eb i o l o g i c a la d h e s i o no f m i c r o - g e lh a dt h eb i g g e s ti np h 3 0 ，1 2 0 2 5 3 t w on o v e lb i o l o g i c a lg e l sw h i c hh a dp hs e n s i t i v e t yw e r ep r e p a r e db a s e do n c a r b o x y m e t h y lc h i t o s a n c h i t i na n ds h c a r b o x y m e t h y lc h i t o s a nb yc r o s s l i n k i n gw i t ha l a r g ec o n c e n t r a t i o no fe d c w h e nt h ed e g r e eo fd e a c e t y l a t i o no fc a r b o x y m e t h y l c h i t i nw a s2 6 5 1 t h ed e g r e eo fs u b s t i t u t i o no fc a r b o x y m e t h y lc h i t i nw a s0 1 5 4h a s t h el o w e s td r u gr e l e a s er a l ei np h l 0i nt h ef i r s t3 h ，o n l y1 3 4 2 ，a n dt h el a s t2 4 hi n p h 7 4t h ed r u gr e l e a s er a t eu pt o5 6 5 4 ，w h i c hs h o w e dt h a tt h eg e lh a dap o t e n t i a l a p p l i c a t i o no fs l o w r e l e a s eo r a ld r u gs y s t e m s h c a r b o x y m e t h y lc h i t o s a nw i t hl o w d so fc a r b o x y m e t h y lg r o u ps h o w e dt h es a m ep r o p e r t y , l e s st h a n1 5 o fb s a r e l e a s e di nt h ef i r s t3 hi np h1 0f r o mw h o s eg e la n dm o r et h a n8 0 o fb s ar e l e a s e d i nt h el a s t2 4 hi np h t h e i ra c i d si nt h es t o m a c he n v i r o n m e n tw e r et h ep r o t e c t i o no f d r u gm o l e c u l e sa n dt h e i rd e l i v e r yt ot h eh i g hp hv a l u ei nt h ei n t e s t i n a lt r a c ta n d r e l e a s e o u rs t u d ys h o w e dt h a tt h i o l a t e dc a r b o x y l m e t h y lc h i t o s a na san e wm a t e r i a li nd r u g d e l i v e r ys y s t e mi sf e a s i b l e i th a ss p e c i a lp r o s p e c ti nt h ea d m i n i s t r a t i o np e p t i d ea n d p r o t e i no r a l l y k e y w o r d s ：c a r b o x y m e t h y lc h i t o s a n c h i t i n ，t h i o l a t e d ，h y d r o g e l i i 独创性声明 本人声明，所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得武汉理工大学或其 它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名：垂童!日期：迦墨：丝：竺 关于论文使用授权的说明 本人完全了解武汉理工大学有关保留、使用学位论文的规定，即学校有 权保留、送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的 全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 日期：迎墨! 丝：! 垒 武汉理丁大学硕士学位论文 1 1 引言 第1 章绪论 壳聚糖是自然界中来源第二大丰富的亲水性多糖，由甲壳素( 主要来源于 甲壳纲动物如虾、蟹、昆虫及乌龟等的壳，也存在于一些软体动物、环节动物、 原生动物、腔肠动物及海藻、真菌等生物体中【l j ) 部分脱乙酰化而制成，是通过 酯键聚合而成的一种聚氨基葡萄糖，包括一系列不同相对分子质量( 5 x 1 0 4 2 x 1 0 6k d a ) 的壳聚糖聚合物。因为其具有安全、无毒、价廉、水溶性、可生物 降解、无抗原性、具生物粘附性、可促进吸收等优点，自2 0 世纪8 0 年代以来， 一直作为重要的药用辅料被广泛地使用l 引。如直接压片的辅料、控释骨架片、湿 法制粒、凝胶剂、膜剂、润湿剂、水性包衣材料、微凝胶和微囊、d n a 给药载 体等。疫苗给药载体、生物粘附材料、药物透膜转运的促进剂、多肽、蛋白类 药物的口服给药系统等【3 l 。 羧甲基壳聚糖是壳聚糖进行羧甲基修饰后的衍生物，具有优良的生物相容 性和促渗性【钔，壳聚糖只有在质子化条件下才可打开上皮粘膜的紧密连接通道， 在p h 6 5 以上的中性情况下，壳聚糖溶解性差，因而不利于在结肠部位的药物吸 收。羧甲基壳聚糖在中性和碱性下易形成凝胶和溶液，可与聚阴离子药物相容。 用c a c o 2 肠粘膜细胞作模型，高、低粘度的羧甲基壳聚糖都可提高肝素的渗透 性，两性聚电解质的羧甲基壳聚糖可打开粘膜细胞的紧密连接通道，并且对细 胞膜无损伤。羧甲基壳聚糖更适合在中碱性条件下应用，有利于提高结肠位点 的阴离子药物的渗透性。有关羧甲基壳聚糖应用于药物载体的研究报道很少1 5 j ， 将其应用于结肠位点的定位给药系统几乎未见报道。羧甲基甲壳糖是综合考虑 了时滞效应和胃肠道p h 差异而设计的，且可被结肠酶降解的天然高分子材料。 羧甲基甲壳糖同时带有羧基和氨基，成为两性聚电解质，羧甲基壳聚糖的p k a 和 p k b 值为2 3 和6 6 1 6 j ，在p h 2 3 和6 6 之间羧甲基壳聚糖不溶于水，控制羧甲基 甲壳糖的取代位置、取代度和脱乙酰度，可相应地调整它的p k a 和p k b 值，控 制载体材料的交联方法和交联度，可望使其在胃部和小肠部位保持收缩状态不 释药，到结肠部位才溶胀，并在结肠部位的细菌酶的降解作用下释放药物。 最近几年，随着对壳聚糖二位伯氨基衍生物研究的不断深入，发现对壳聚 糖进行修饰之后，它的某些衍生物具有更强的生物粘附性、促吸收和酶抑制载 武汉理t 大学硕士学位论文 体的功用1 7 】，如壳聚糖半胱氨酸偶合物、壳聚糖一聚丙烯酸偶合物、壳聚糖e d t a 等。实验证明，壳聚糖中引入巯基可以使其粘附性显著增强，因为引入的巯基 可以通过二硫化交联反应与粘液层以共价键结合，从而与粘液糖蛋白中的半胱 氨酸子区域产生相互作用。巯基化修饰的羧甲基壳聚糖结合了羧甲基壳聚糖与 巯基壳聚糖的双重优点，既有优良的生物粘附性和相容性，又有更宽阔的应用 空间。 巯基化聚合物是最广泛的具有黏附性质的聚合物大分子，它们一般都同时 含有巯基侧链。基于巯基与二硫键的交换反应，二硫键在这种聚合物和半胱氨 酸含量丰富的子域的粘液蛋白之间形成，并生成粘液凝胶层。因此，硫代聚合 物可以模仿自然机制中的糖蛋白分泌黏液一种生物系统中最常见的结构， 这本身也是价立足于粘液层形成的二硫键。到目前为止，主要有阳离子硫代物： 壳聚糖半胱氨酸，壳聚糖4 丁巯内酯，壳聚糖巯基乙酸和负离子硫代物：聚( 丙 烯酸丙烯酸) 半胱氨酸，聚( 丙烯酸) 半胱胺酸，羧甲基纤维素半胱氨酸和 海藻酸钠半胱氨酸产生了。由于聚合物含有游离的巯基，其粘附性能具有高达 的2 - 1 4 0 倍的改善。高疗效的新一代的粘附聚合物经过适当的修饰，通过各种 研究，可以在不同的动物物种和人类的体内的各种黏膜膜上进行运用。已经发 展为商业产品的第一代产物，包括硫代聚合物等都已经面世。 水凝胶是一种包含了高分子骨架、水和交联剂的复合三维空间网络，在医 药和相关领域获得越来越广泛的应用，它们可用于伤口敷料、隐形眼镜、人工 器官和药物释放体系等【8 l ，以生物降解材料制备的水凝胶一直以来是国内外专家 研究的重点。同时含阳离子，阴离子活性基团的两性聚电解质水凝胶近几年来 倍受瞩目，它们能随外界环境，包括溶剂组成、p h 、盐浓度和温度的改变而产 生连续或不连续的体积相变。这种对外界环境变化十分敏感的凝胶，即所谓的 “智能凝胶1 9 j 在高分子科学领域中已成为主要研究课题之一，因为它们在药品、 医疗及相关领域有极重要的科学研究及应用价值。大量的科研人员已经围绕人 工合成两性聚电解质凝胶的体积相变展丌研究。它们将载有阳离子功能基团的 单体与载有阴离子功能基团的单体通过物理、化学的方法聚合，生成两性聚电 解质凝胶。目前主要的研究对象还是以聚丙烯酰氨为基础的各种凝胶，结果显 示凝胶的体积相变与分子链上电荷密度密切相关。然而，关于天然高分子两性 聚电解质凝胶如羧甲基甲壳糖凝胶的报道还较少。 2 武汉理下大学硕十学位论文 1 2 巯基化聚合物( 硫醇聚合物) 自从黏附概念在2 0 世纪8 0 年代被人们提出，人们一直在尝试研究改善聚 合物的粘接性能。到目前为止，人们已经尝试的研究包括，使用线性聚( 乙二 醇) 作为粘附凝胶i 删，离子聚合物的中和1 1 l l ，或者通过持续的水和过程达到黏 附作用【1 2 j 和通过聚合物与黏附性物质进行偶联达到与具体部位的上皮细胞结合 的目的的研究【1 3 。1 4 】等。然而，所有这些系统的研究都是基于非共价键的形成， 如氢键，范德华力和离子的相互作用等。因此，它们只能提供相对薄弱的黏附 作用，在许多情况下不足以保证定位药物输送系统在某一特定的目标进行传送。 因此在许多情况下，黏附性聚合物并不能被证明是有效的医药胶水【1 5 d 6 】。 硫醇化聚合物是一种新型的黏附聚合物【r 刀。与传统的黏附性聚合物相反， 这种新型的聚合物能够形成共价键。在这种聚合物和粘膜的粘液凝胶层中发现 了在生物结构中常见的桥架结构二硫键。具有黏附性能的硫醇聚合物都含 有带巯基的侧链( 图1 - 1 ) 。基于巯基与二硫键的交换反应，在这种聚合物和半 胱氨酸含量非常丰富的子网域的粘液蛋白之间形成了二硫键，并生成粘液凝胶 层【1 8 1 。 上+ t 。h g i a o n ld b e a r t n 罾 图1 - 1 带有巯基侧链的硫醇大分子 1 2 1 阳离子硫醇物 h 阳离子硫醇物主要是对壳聚糖进行巯基化修饰的。壳聚糖上氨基葡萄糖c 2 位的伯氨基是巯基修饰的主要地点。正如图1 2 所示的那样，含巯基的试剂可以 与壳聚糖上的伯氨基反应形成酰胺键或者脒等共价键从而引入巯基。l 半胱氨酸 和毓基乙酸的羧基与壳聚糖的伯氨基在碳二亚胺盐的催化下进行反应形成酰胺 键【1 9 。2 1 1 。在惰性环境下反应可以有效的防止巯基氧化。或者可以使反应条件控 3 武汉理t 大学硕十学位论文 制在p h 一h +， 一 亘三一s一一 多h h 8 一 jo x 多一 三 图1 4 硫醇物与黏液蛋白形成二硫键的示意图 】3 2 原位交联j 寸程 硫醇物对粘膜的黏附机理还有另一种可能就是它们可以进行原位交联。与 粘膜之问的渗透过程因黏附聚合物而异，在期间和之后的渗透过程中，硫醇物 本身通过与粘膜黏液凝胶层形成的导致额外的锚链接形成二硫键。该机制的说 明见图1 5 。这种机制类似于大多数的胶黏剂的粘结机制，即渗透到粘合剂的某 些表面结构之后，稳定进入粘合剂。硫醇物表现出原位凝胶特性主要是依赖于 6 武议理t 大学坝 学位论文 巯基在生理口h 范嘲内的氧化该氧化过程可以直接导敛分子内和分子键的二硫 键的形成。 硫醇物的原位凝胶行为可以通过流变学进行体外测量。硫醇物由液态到凝 胶的过度一般是在p h 环境变为5 5 后2 小时，此时，高度交联已经形成。馥s o l g e l 过渡蔬基化壳聚糖，例如，已完成在p h 值5 , 5 后2 小时，当高度交联凝胶形成。 同时，我们发现，巯基的含量明显减少了，这也同时说明了二硫键的形成2 7 1 。 但是在整个研究过程中，巯基化的壳聚耱仍然保持着未修饰的壳聚糖所表现出 来的流变特性。更进一步的流变特性的研究发现，巯荩参与交联的数量与所形 成的凝胶的弹性之问存在和显著的关联性。壳聚糖中接入的巯基越多，凝胶的 弹性越大o “卸。 争莘了 n 。二、密 ! 掣夕) l 戛鹭 o 囤1 - 5 原位交联机理的示意图 这一类原位交联形成的凝胶特别适合在阴道，鼻腔和眼部形成，凼此也特 别适含应用于这些部位的粘胰层进行定位给药。 1 4 水凝胶 天然水凝胶包括明胶、胶原、纤维蛋白、透明质酸盐、海藻酸盐、琼脂糖 和壳聚糖等。人工合成水凝胶包括聚阿烯酸及其衍生物、聚氧乙烯及其衍生共 聚物、聚乙烯醇、聚磷腈和多肽等。根据水凝胶所受的刺馓信号不同，可分为 p h 值响虚性水凝胶、化学物质响应性水凝胶、温度响应性水凝胶、磁场响应性 水凝胶等；根据溶胶凝胶的转变是否可逆，可分为町逆性和不可逆性水凝胶； 根据交联方式可分为物理交联水凝胶和化学变联水凝胶；根据聚合物的侧基可 分为离子型和非离子型水凝胶；根据水凝胶的三维网络物理结构可分为无定形 u 他n n。l； = 竺 武汉理工大学硕十学位论文 态、半结晶态；根据其形成机理可分为氢键结构、超分子结构和胶束团聚结构 【4 3 4 5 】 o 表1 - 1 构建水凝胶的几种亲水性聚合物 分类聚合物 天然聚合物阴离子聚合物 阳离子聚合物 两性聚合物 中性聚合物 合成聚合物聚酯类 聚醚类 聚丙烯酸衍生物类 天然聚合物合成聚合物杂化物 透明质酸，海藻酸，硫酸软骨素，硫酸右旋 糖苷 壳聚糖，聚赖氨酸 胶原，明胶，羧甲基壳聚糖，血纤维蛋白 右旋糖苷，琼脂糖 p e o p l a p e g，p e g p l g p e g， p e g p c l - p e g ，p l a - p e g p e a , p ( p f - e g ) p e o p p o p e o p a a m ，p n i p a a m ，p h e m a ，p v a 聚乙二醇多肽共聚物，海藻酸接枝 p e o p p o p e o ，海藻酸丙烯酸共聚物，透 明质酸接枝异丙基丙烯酞胺 注：p a a m ：聚丙烯酞胺，p e g ：聚乙二醇，p l a ：聚乳酸，p l g a ：聚俘l 酸共乙醇酸) ， p c l ：聚己内酷，p e o ：聚氧化乙烯，p p o ：聚氧化丙烯，p h e m a ：聚甲基丙烯酸羟乙酯， p i v i p a a m ：聚异丙基丙烯酰胺，p v a ：聚乙烯醇，p p f ：聚富马酸丙二醇酯。 随着水凝胶体系在各个领域应用的不断扩大，许多聚合物及其复合物已经 被选择用于水凝胶的构型矧，表1 - 1 列出了现在研究得比较广泛的几种材料。许 多天然聚合物及合成聚合物均可形成水凝胶并作为组织工程支架使用。天然水 凝胶因其来源不同，结构与性能存在批次间差异，因此有一定的局限性，这就 促使人们考虑使用合成水凝胶的可行性。合成水凝胶由于结构与性能可精确调 控，避免了不同批次间的差异。由于羧甲基壳聚糖上含有大量的羧基和氨基， 属于两性聚电解质，通过改变羧甲基壳聚糖羧甲基的取代度，控制脱乙酰度等 来调节羧基与氨基的比例，可以制备不同p h 环境敏感的水凝胶。 1 4 1 环境敏感水凝胶 1 4 1 1 温度敏感型水凝胶 温度敏感水凝胶是其体积能随温度变化而变化的高分子凝胶，分为热胀温 度敏感型和热缩温度敏感型水凝胶【4 7 1 。热胀温度敏感型水凝胶指水凝胶的体积 8 武汉理工大学硕士学位论文 在某一温度附近随温度升高而突然增加，这一温度叫做“较高临界溶解温度” u c s t ( u p p e rc r i t i c a ls o l u t i o nt e m p e r a t u r e ) 。u c s t 以上大分子链亲水性增 加，因水合而伸展，使水凝胶在u c s t 以上体积突然膨胀；热缩温度敏感型水 凝胶则是温度升高，大分子链疏水性增强发生卷曲，使水凝胶体积急剧下降， 体积发生突变的温度叫“较低临界溶解温度l c s t ( l o w e rc r i t i c a ls o l u t i o n t e m p e r a t u r e ) 。温度敏感型水凝胶随环境温度的变化而发生可逆性体积变化的性 质被应用于药物控制释放系统，主要是l c s t 型水凝胶。这种水凝胶在l c s t 以 上的突然收缩性质，在药物尤其是蛋白质类药物控制释放中具有很大的应用价 值【辑5 3 1 。 1 4 1 2p h 敏感型水凝胶 p h 敏感型水凝胶是体积随环境p h 值、离子强度变化而变化的高分子凝胶 h 。这类凝胶大分子网络中具有可解离成离子的基团，其网络结构和电荷密度 随介质p h 值的变化而变化，并对凝胶渗透压产生影响；同时因为网络中添加了 离子，离子强度的变化也引起体积变化。一般来说，p h 敏感型水凝胶都是含有 酸性或碱性侧基的大分子网络，即聚电解质水凝胶。随着介质p h 值、离子强度 的变化，酸、碱基团发生电离，导致网络内大分子链段间氢键的解离，引起不 连续的体积变化。形成碱性敏感水凝胶( 阴离子型水凝胶) 的大分子的分子链 侧链上含有碱性介质中能够解离的基团，如羧基，常用的是丙烯酸( a a ) 类聚 合物1 5 6 1 ；酸性敏感水凝胶( 阳离子型水凝胶) 则是由含有碱性基团的大分子 形成的，常用的是含胺基的聚合物，如n ，n 二甲基氨乙基甲基丙烯酸酯 ( d m a e m ) 【5 7 1 。 p h 敏感水凝胶常用来制备口服药物控制释放制剂，定位于胃或小肠部位释 放药物。合成p h 敏感型水凝胶的局限性是不能生物降解，只适用于口服给药， 不适合于植入、注射给药，从而使其应用受到了限制。因此，可生物降解的水 凝胶的开发受到了重视，集中于多肽、蛋白质及多糖类水凝胶的研发【5 8 1 。 1 4 1 3 葡萄糖敏感型水凝胶 葡萄糖敏感型凝胶系统，是专为糖尿病的治疗研发的药物载体，所用的药 物为胰岛素( i n s u l i n ) m 。血液中的糖浓度上升时，凝胶能感应并释放胰岛素。 最有代表性的葡萄糖敏感型智能系统要属利用了p h 敏感型高分子和葡萄糖氧化 酶( g l u c o s eo x i d a s e ) 的系统【鲫- 6 0 。 1 4 1 4 其它类型环境敏感水凝胶 抗原敏感型水凝胶利用的是抗体能与抗原产生特异结合的特性。这种结合 有静电结合、氢键结合、范德华力结合等，其分子识别能力非常高，在免疫系 9 武汉理t 大学硕士学 ) = 论文 统内起到非常重要的作用。 光敏感型水凝胶的特征是高分子主链或侧链上导入了在光作用下异构化的 化合物。光刺激的特点是，光信号不但能够立即传入感应器部位，而且信号量 能够得到严密控制。具有光异构化性能的化合物是偶氮苯( a z ) 、三苯甲烷无色 染料衍生物【6 1 】等。 电磁场敏感型凝胶材料主要是指电解质水凝胶。它的优点是，在离凝胶较 远的位置变化电场强度也可达到控制材料特性的目的。如将部分水解后的聚丙 烯酞胺( p a a m ) 水凝胶直接与阴极和阳极接触并置入电场后，凝胶会随电压的 变化而发生体积相变【6 2 1 。 1 4 2p h 敏感水凝胶的制备 p h 敏感性水凝胶一般含有c o o 、o p 0 3 。、n h 3 + 、s 0 3 + 等阴阳离子基团。 以聚丙烯酸为例，在高于丙烯酸的p k a ( 4 2 8 ) 时，羧基c o o 呈解离状态，亲 水性增加；而低于p k a 时，c o o h 基团的亲水性降低。所以改变p h 值将引起丙 烯酸类水凝胶的体积相变。在聚合中加入交联剂也可影响其膨胀行为，所以p h 敏感性水凝胶的聚合所用的单体必须含有c o o 。、o p 0 3 。、n h 3 + 、s 0 3 + 等阴阳 离子基团，并且在聚合过程中要加入交联剂【6 3 j 。高分子水凝胶材料的制备方法 主要有单体的交联聚合、接枝共聚和水溶性高分子的交联等。 1 4 2 1 化学引发聚合 化学引发聚合是常见的制备水凝胶的方法。对于一些水溶性的单体，如丙 烯酰胺、丙烯酸及其一些衍生物，可采用自由基引发水溶液聚合法制备相应的 水凝胶。提高水凝胶的响应速度，合成快速响应的水凝胶一直是智能型水凝胶 研究的一个重要课题。a k a 畔j 的工作表明，水凝胶溶胀或收缩达到平衡所需的 时间与水凝胶的线形尺寸的平方成正比。据此得出，小的凝胶颗粒响应外界刺 激比大凝胶快。因此，为了提高响应速度，研究者们竞相合成出微米尺寸的水 凝胶。微米级颗粒度均匀的单分散聚合物微凝胶具有比表面积大，吸附性强， 凝集作用大及表面反应能力强等特性，在分析化学、生物化学、免疫医学、标 准计量以及某些高新技术领域中有着极其优越的应用性，因而对这类材料的研 究越来越引起了重视哗j 。 制备聚合物微凝胶的传统方法是乳液聚合法和悬浮聚合法。微凝胶及纳米 凝胶的制各可以根据不同情况采用不同方法。乳液聚合能制备粒0 1 p m 0 7 t i m 的 颗粒，悬浮聚合制备的聚合物微凝胶粒径则一般在1 0 0 p m 一1 0 0 0 p m 之间，且是多 分散性的。采用无皂或低皂乳液聚合法制成的单分散聚合物微凝胶粒径接近 1 0 武汉理工大学硕士学位论文 1 “m ，但难于制备粒径小于1 t m 的聚合物微凝胶。 反相悬浮聚合法( i s p ) 是近十年才兴起的一种高分子合成方法。所谓反相 悬浮聚合法1 6 5 j 就是以非极性溶剂为分散介质，水溶性单体以滴加的方式加入到 油相中，在强力搅拌及分散剂的作用下被分散成小液滴于油相中，形成“油包 水 型的悬浮液，在水相中进行的聚合反应。反相悬浮聚合体系一般由单体、 引发剂、分散介质、分散剂四个基本组分组成，为水溶性单体提供了一种具有 高聚合速率和高分子量产物的聚合方法【删。 对于悬浮法树脂，分散剂、搅拌、转化率是影响颗粒特性的三大主要因烈6 7 】。 聚合温度、引发速率、油水比等也有影响。悬浮树脂一般是由形状和大小具有 一定分布的颗粒群所组成。由于聚合釜中的物理环境的差异，树脂颗粒有球形 粒子，也有非球形粒子，球形粒子大小通常用粒径表示，非球形粒子大小虽然 也用“粒径 表示，但实为当量直径，已有不同含义畔j 。颗粒群的粒子大小用 平均直径表示，有不同的平均值表示方法。由于平均粒径定义和测量方法不同， 往往有不同的数值。粒径分布用线图表示，在定量处理上常选用其特征值。 1 4 2 2 辐射引发聚合 辐射引发聚合是另一种比较常用的制备高聚物水凝胶的方法。这种交联方 法主要是利用y 射线、电子束、x 光及紫外线等直接辐射凝胶水溶液，或辐射用 物理交联法制备水凝胶。辐射聚合的基本特点有：( 1 ) 无需采用化学引发剂或 其它化学物质，所得高聚物很纯净，性能优越；( 2 ) 反应可在低温下进行；( 3 ) 反应易控，操作简便【叫。 由于高聚物水凝胶与生物活体组织具有很好的亲合性，因而在生物和医学 等领域，常将水凝胶作为一些生物活性分子的载体材料使用。在这些领域内， 用辐射引发聚合制备水凝胶比化学引发聚合具有很多的优点：( 1 ) 不会因使用 化学物质而影响生物分子的活性；( 2 ) 在低温下反应可避免加热聚合而导致生 物分子的失活。 1 4 2 3 载体的接枝共聚 水凝胶的机械强度一般较差，为了改善水凝胶的机械强度，可以把水凝胶 接枝到具有一定强度的载体上，在载体表面产生自由基是最为有效的制备接枝 水凝胶的技术，单体可以通过共价键连接到载体上。除了使用化学法引发聚合 外，辐射技术是常用的产生自由基的一种技术。 1 4 3p h 敏感水凝胶在缓控释体系中的应用 口服结肠定位释药系统( o r a lc o l o n s p e c i f i cd r u gd e l i v e r ys y s t e m ，o c d d s ) 武汉理工大学顾十学位论文 是胃肠道给药系统的重要分支，是现代药物剂型的高新技术之一【7 0 1 。它是通过 专一载体，应用特种释药技术，使药物口服后，避免上消化道释药，只有当药 物转运到回盲部位后，才开始崩解或释放载药微凝胶，达到结肠定位释放的目 的，其主要意义有：治疗结肠局部疾病而避免药物所引起的全身副作用；利用 结肠对药物择时吸收治疗如晨僵、哮瑞等时辰性疾病；利用结肠吸收避免胃肠 道对蛋白质、多肽类药物的破坏以及“首过效应 而提高生物利用度。因而， 它具有高效、低毒、靶向和定位等特剧7 。 水凝胶与生命联系极为密切，由于它们对外界环境刺激的响应性，水凝胶 已成为当今研究的热点，并广泛应用于固定化酶、物料萃取、细胞培养、温敏 开关和药物的控制释放等领域，己发表了很多相关的综述【7 2 。7 3 】。 等一卜彳一彳t 卜c 卜 一c 十 上上 n o h 。 o h 一 i c h 2 c h z n ( c h 2 c h 3 ) 2 王一瞽 o o 丧h 2 c h 寻( c h 2 c h 3 b 图1 - 1p h 敏感水凝胶在缓冲溶液中的电离 由于在人体内存在环境变化，环境敏感水凝胶在药物控释体系中具有巨大 的应用前剽7 4 - 7 5 。利用体内p h 值的降低或温度的升高，p h 敏感和温度敏感凝 胶被用于定位释药体系。例如h o f f m a n 等在1 9 9 1 年就结合磷脂酞乙醇胺和 p n i p a 作为脂质体的药物释放体系1 7 6 j ；z h u o 等合成了以p n i p a 为主的温敏水凝 胶作为药物释放载体，研究了模型药物s 氟尿喀陡的释放过程f 7 7 】；另有关于温 度及p h 敏感水凝胶在生物大分子控制释放中的应用的报道，卓仁禧等对木瓜酶 在控释过程中的活性及释放过程进行了研究【7 引。利用对分子的响应，例如葡萄 糖或抗原水凝胶作为生物传感器用于释药体系。p a r k 研究了葡萄糖敏感水凝胶 作为大分子胰岛素的释药载体i 丹j ；g u i s e p p i e l i e 报道了葡萄糖水凝胶作为生物传 感器的特性，及包载胰岛素的释放过程【8 0 1 。光敏感、压力敏感和电场敏感水凝 胶在药物释放和生物分离技术中也得到了广泛应用。冯增国报道了光聚合星型 1 2 卜一 一 h c i h 斗 武汉理工大学硕十学位沧文 可生物降解水凝胶用作蛋白质、多肽药物载体【8 1 】。尽管人们对这些环境敏感水 凝胶进行了很多研究，但离实际应用还有距离。 1 5 课题主要内容和研究意义 1 5 1 主要研究内容 ( 1 ) 考察巯基化羧甲基壳聚糖的制备条件，优化凝胶的制备工艺，通过比 色法测定产物中游离的巯基含量，并利用红外图谱进行表征； ( 2 ) 制备巯基化羧甲基壳聚糖微凝胶和凝胶块，考察巯基化羧甲基壳聚糖 微凝胶，e d c 交联羧甲基壳聚糖凝胶及e d c 交联巯基化羧甲基壳聚糖凝胶的制 备工艺及其溶胀性能差异； ( 3 ) 探讨巯基化羧甲基壳聚糖的生物粘附性能； ( 4 ) 研究各项凝胶对蛋白质药物的释药性能。 1 5 2 研究意义 随着现代生物技术的迅猛发展，蛋白质药物发挥着越来越重要的作用，这 类药物通常采用注射的给药途径。然而这类药物需要长期注射，给病人带来痛 苦，比较而言口服药物是一种更理想的给药途径。巯基化羧甲基壳聚糖分子链 中含有c o o 和n h 3 + ，通过调节它们的比例可以控制其水凝胶在不同p h 和离子 强度条件下的溶胀行为，在不同的p h 环境下具有不同的响应，其药物传载性能 也随着环境p h 的改变而改变，是一种理想的p h 敏感的凝胶材料；另外巯基化 羧甲基壳聚糖还具备良好的抗菌性、生物相容性，并可在生物体内完全降解， 加上巯基的引入，使得巯基化羧甲基壳聚糖凝胶在粘蛋白膜上黏附能力增强， 更有利于药物在特定部位的长时间释放，开发成口服药物缓释体系极具发展潜 力。 1 3 武汉理t 大学硕士学位论文 第2 章巯基化羧甲基壳聚糖的合成与表征 2 1 引言 羧甲基壳聚糖是n 羧甲基壳聚糖、o 羧甲基壳聚糖、n ，o 羧甲基壳聚糖 的总称，是一种具有多功能基的天然生物材料，在食品、化妆品、环保、印染、 农业等领均有广泛应用，其优良的性能，低廉的价格，使得它在生物医学领域 有巨大的的应用潜力。生物大分子药物( 包括多肽和蛋白质及基因药物) 的给 药途径除了注射给药，还包括口服、鼻部、肺部以及眼黏膜给药等。羧甲基壳 聚糖可以增强生物大分子药物的透膜能力，提高生物黏附性和生物可降解性， 有助于增加生物大分子药物在体内的吸收。羧甲基壳聚糖是两性聚电解质，在 水及生理p h 值下的溶液中可形成粘性凝胶，对低分子量的肝素可通过增强透过 肠道上皮细胞的透过性，提高肝素的吸收率。 巯基化羧甲基壳聚糖由于具备与聚丙烯酸聚丙烯酰氨体系相似的分子结 构，且通过分子链中c 0 0 。和n h 3 + 比例的调节可以控制其水凝胶在不同p h 和离 子强度条件下的溶胀行为，是一种理想的智能凝胶材料；另外羧甲基甲壳糖还 具备良好的抗菌性、生物相容性，并可在生物体内完全降解，开发成药物缓释 体系极具发展潜力。因此，巯基化羧甲基壳聚糖在不同的p h 环境下具有不同的 响应，其溶胀性能和药物传载性能也随着环境p h 的改变而改变。再加上由于巯 基的引入，使得巯基化羧甲基壳聚糖凝胶在粘蛋白膜上黏附能力增强，更有利 于药物的释放。 本文结合国内外研究现状，选用对动物体没有生理损害的l 广半胱氨酸盐酸 盐作为巯基化原料，对不同分子参数的羧甲基壳聚糖进行巯基化修饰，并测定 了产物的巯基含量，同时利用红外表征技术对巯基的引入进行验证。 2 2 实验部分 2 2 1 材料和仪器 2 2 1 1 材料 1 4 武汉理工大学硕士学位论文 表2 - 1 材料 2 2 1 2 仪器 表2 - 2 仪器 仪器名称，产地 d f 1 0 1 s 集热式恒温加热磁力搅拌器 f a 2 0 0 4 型分析天平 循环水式真空泵 恒温振荡器 c s 5 0 1 型超级恒温水浴 f t - i r 红外光谱仪2 0 0 0 7 6 0 c r t 分光光度计 郑州长城科工贸有限公司 上海天平仪器厂 郑州长城科工贸有限公司 江苏太仓市实验设备厂 上海浦东荣丰科学仪器有限有公司 p e r k i n - e l m e r , j a p a n 上海精密仪器厂 2 2 2 实验方法 2 2 2 1 巯基化羧甲基壳聚糖的合成 取羧甲基壳聚糖质量为1 9 ，将不同分子参数的羧甲基壳聚糖与l 广半胱氨酸 盐酸盐按质量比1 - 1 投料，调节羧甲基壳聚糖溶液的p h 5 ，总质量体积比为 0 2 、v ，与l 半胱氨酸盐酸盐混合搅拌，恒温震荡3 h ，静置过夜，于l m m o l l h c l 溶液中透析4 8 h ，再分别于5 m m o l lh c l 和l m m o l lh c l 透析2 4 h ，用无水乙醇 洗涤，得到白色固体。5 0 下真空干燥，得到淡黄色固体，置磨口棕色瓶中于 冰箱中4 。c 备用。 同样的合成方法，加入l 半胱氨酸盐酸盐的同时，加入l 半胱氨酸盐酸盐 质量0 1 的n 羟基琥珀酰亚胺( n h s ) 进行催化，相同的纯化方法得到淡黄色 武汉理工大学硕十学位论文 纤维状固体，置磨口棕色瓶中于冰箱中4 备用。 调节羧甲基壳聚糖与i ，半胱氨酸的质量比( 1 ：0 2 5 ，1 ：0 5 ，1 ：1 ，1 ：2 ) ， 得到巯基含量不同的巯基化羧甲基壳聚糖，调节反应介质的p h 范围在4 5 ，可 以有效的避免巯基被氧化。另外，储存条件也对毓基氧化有很大影响，有实验 证明【8 2 】，冰箱4 c 低温冷藏可以有效的延缓毓基被氧化。 2 2 2 2 测定巯基化羧甲基壳聚糖巯基含量的试剂的配置 以往测定s h 基有电流滴定法，设备复杂；光电比色法用盐酸茶乙二烯二胺 法，试剂毒性大，用量多、费时间，而结果也不令人满意。e l l m a n s 试剂法为简 便、迅速的比色法，近年来国外已广泛用此法。 t r i s 甘氨酸缓冲液( p h8 o ) 的配置：称取三羟甲基氨基甲烷1 0 4 9 ，甘氨 酸6 9 9 ，e d t a n a 2 1 2 9 ，加蒸馏水溶解并稀释至1l ，混匀后用o 1 m o