（外科学专业论文）转染gdf5的bmsc自体移植与应用gam对延缓椎间盘退变疗效的比较.pdf

r ll lll if iii ill r l llllll 17 6 9 5 8 8 目录 一、 摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要4 二、 英文缩略语7 三、论文一 前言8日u 舌毯 研究资料与方法8 结果11 讨论1 2 结论1 4 创新性评价b ooo 1 5 参考文献2 1 四、论文二 前言2 3 日u 吾z 3 研究资料与方法2 3 结果28 讨论2 9 结论3 1 创新性评价3 2 参考文献3 4 五、附录 综述3 6 在学期间科研成绩4 4 致谢4 5 个人简介4 6 中文论著摘要 转染g d f 5 的b m s c 自体移植与应用g a m 对延缓椎 间盘退变疗效的比较 目的 腰椎间盘突出症是骨科的常见病和多发病，也是腰腿痛的主要原因，严重影 响了人们的生活质量，并且丢失大量的社会劳动力，给社会带来沉重的负担。一 般认为椎间盘突出是在椎间盘退变的基础上发生的，其共同特征是髓核内蛋白多 糖含量的减少，因此可以通过生长因子刺激髓核细胞增加蛋白多糖的合成，减少 分解来缓解甚至逆转退变的过程。 随着基因强化组织工程学的发展，对椎间盘退变进行分子水平上的治疗成为 可能，本实验通过采用基因治疗的两种方法：干细胞体外基因修饰和直接体内转 染椎间盘细胞，使其在髓核组织内持续表达g d f 5 ，来对延缓椎间盘退变的效果 进行比较，以期为临床应用基因疗法治疗椎间盘退变提供依据。 方法 ( 一) 经超顺磁性氧化铁标记的自体b m s c s 在兔椎间盘内存活 时间的研究 1 、兔b m s c s 分离培养及检测 采用密度梯度离心法，分离、纯化兔骨髓问充质干细胞，进行体外培养扩增， 并进行细胞形态学、组织化学染色观察。 2 、s p i o 标记兔b m s c s 及检测 取第三代原代培养细胞，采用s p i o p l l 复合物标记细胞，并进行细胞普鲁 士蓝铁染色、透射电镜检测是否标记成功，m t t 法测定标记细胞增殖是否受到影 响。 3 、标记细胞在椎间盘内存活时间的研究 实验组和对照组分别注入经s p i o 标记和未标记的b m s c s 悬液，术后2 、4 、 6 、8 周，实验组和对照组分另0 取相应椎间盘行普鲁士蓝铁染色，镜下观察在细胞 质内是否出现蓝染颗粒。 ( 二) 体内体外两种转染方法对延缓椎间盘退变效果的比较研究 1 、脂质体介导的p c d n a 3 1 ( + ) g d f 5 重组质粒转染b m s c 用倒置显微镜观察细胞的生长情况和形态学变化。 2 、基因活化基质的制备 i 型胶原支架切成直径l m m 长5 m m 的长条经环氧乙烷消毒后备用，按步骤 2 的比列稀释质粒和脂质体，将支架放入其中浸泡3 0 m i n 后进行动物手术。 3 、动物手术后2 个月椎间盘退变修复效果检测 取术后2 个月各组兔椎间盘的髓核，间苯三酚法测蛋白多糖含量，流式细胞 仪检测凋亡率。 挂里 ；口7 卜 ( 一)兔b m s c s 其自体椎间盘中可以持续存活8 周 1 、刚接种b m s c s 的培养瓶中为大量圆形细胞，2 3d 出现少数长梭形细 胞；5 7d 后圆形细胞消失，长梭形细胞数量逐渐增多，成簇生长，呈放射状 排列；1 0 2 0d 开始呈对数生长。传至第3 代时细胞呈漩涡样生长，扫描电镜 显示第3 代细胞表面有大量微绒毛，糖原染色呈强阳性，c o li 、a l p 及脂肪染 色均呈阴性。 2 、经普鲁士蓝铁染色显示阳性细胞胞质内出现蓝染颗粒，透射电镜观察显示 胞质内有电子高密度铁颗粒，m t t 检测显示7d 内未标记细胞组和s p i o 标记细 胞组间细胞增殖比较差异无统计学意义。 3 、术后2 周，实验组镜下可见髓核中有大量蓝染颗粒，且位于胞质内；4 周， 髓核和纤维环均可见到位于细胞质内的蓝染颗粒；6 、8 周，仍可观见位于胞质内 的蓝染颗粒。各时间点对照组椎间盘切片均未观察到蓝染颗粒。 ( 二) 体内体外两种转染方法对延缓椎间盘退变效果的比较研究 1 、转染1 2 小时后可见部分细胞出现凋亡现象，4 8 小时后细胞生长良好，体 2 积略增大。 2 、转染4 8 小时后各组细胞以及手术后2 个月各组椎间盘r t p c r 结果如图， p c d n a 3 1 ( + ) g d f 5 转染细胞组，回输转染m s c 组和g a m 组的髓核均在约 5 6 0 b p 处有电泳条带，转染成功。 3 、各组与正常组之间通过方差分析，l s d t 检验，差异有统计学意义，但以 转染细胞组修复效果最接近正常椎间盘。 结论；口匕 l 、s p i o 是一种理想的细胞标记物，可以动态监测标记细胞；兔b m s c s 其 自体椎间盘中可以持续存活8 周。 2 、转染细胞组修复退变的椎间盘效果最好，但其成本最高。 关键词 骨髓间充质干细胞；生长分化因子5 ；基因活化基质；细胞培养；转染 3 英文论著摘要 a c o m p a r a t i v es t u d yo f t h et r e a t m e n te f f e c to f i n t e r e r t e b r a ld i s c sd e g e n e r a t i o nb yi nv i t r oa n di nv i v o t r a n s f e c t i o n p u r p o s e a st h eo r t h o p e d i cc o m m o na i l m e n ta n df r e q u e n t l ye n c o u n t e r e dd i s e a s e ，l u m b a r i n t e r v e r t e b r a ld i s cp r o t r u s i o n ( l i d p ) s e r v e sa st h em a j o rc a u s eo fw a i s ta n dl e gp a i n s ， w h i c ha f f e c t st h el i f eq u a l i t yo fp e o p l es e r i o u s l ya n dl e a d st ot h el o s so fg r e a tl a b o r st o p u t ah e a v yb u r d e no nt h es o c i e t y i ti sg e n e r a l l ya c k n o w l e d g e dt h a tt h el i d pi sc a u s e d b yi n t e r e r t e b r a ld i s c sd e g e n e r a t i o n ，w h i c hi sc o m m o n l yc h a r a c t e r i z e db yt h er e d u c t i o n o fc o n t e n to fp r o t e o g l y c a n si nl u m b a rn u c l e u sp u l p o s u s t h u s ，i ti sa b l et oa l l e v i a t eo r e v e nr e v e r s et h ed e g e n e r a t i o nb yg r o w t hf a c t o rs t i m u l a t i n gn u c l e u sp u l p o s u sc e l lt o p r o m o t et h es y n t h e s i so fp r o t e o g l y c a n s w i t ht h ed e v e l o p m e n to fg e n ee n h a n c e dt i s s u ee n g i n e e r i n g ，i ti sf e a s i b l et ot r e a t i n t e r e r t e b r a ld i s c sd e g e n e r a t i o na tm o l e c u l a rl e v e l a f t e rc o m p a r i s o no ft h ee f f e c t so f r e l i e v i n gi n t e r e r t e b r a ld i s c sd e g e n e r a t i o nb yg e n et h e r a p yi nt w ow a y s ，i e g e n e t i c m o d i f i c a t i o no fs t e mc e l l si nv i t r oa n dd i r e c tt r a n s f e c t i o no fi n t e r v e r t e b r a ld i s cc e l l si n v i v o ，s oa st oc o n s t a n t l ye x p r e s sg d f - 5 i nn u c l e u sp u l p o s u s ，t h i se x p e r i m e n ta i m st o o f f e rb a s i sf o rt r e a t m e n to fi n t e r e r t e b r a ld i s c sd e g e n e r a t i o nb ya d o p t i o no fg e n et h e r a p y c l i n i c a l l y m e t h o d s 1 s t u d yo ns u r i v a lt i m eo fa u t o g e n e i cb m s c sl a b e l l e d w i t hs p i oi nr a b b i t i n t e r v e r t e b r a ld i s c s a s e p a r a t i o n ，c u l t u r ea n dd e t e c t i o no fr a b b i tb m s c s ：b m s c c a nb eo b t a i n e db y d e n s i t yg r a d i e n tc e n t r i f u g a t i o n ，m o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o no ft h e c e l l sh es t a i n i n g ， s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p ea n di m m u n o h i s t o s t a i n i n g , b l a b e l l i n gr a b b i tb m s c sw i t hs p i oa n dd e t e c t i o n ：d e t e c t i o nb yp r u s s i a nb l u e i r o ns t a i n i n ga n dt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e m t tm e t h o dd e t e r m i n e dw h e t h e r 4 m a r kc e l lp r o l i f e r a t i o n c s t u d yo ns u r i v a lt i m e o fa u t o g e n e i cb m s c sl a b e l l e dw i t hs p i oi nr a b b i t i n t e r v e r t e b r a ld i s c s ：t h ee x p e r i m e n t a lg r o u pa n dt h ec o n t r o lg r o u pw e r ei n j e c t e dw i t h s p i o 1 a b e l l e da n du n l a b e l l e db m s c sr e s p e c t i v e l y ，i nt h e2 n d ，4 t h ，6 t h ，a n d8 t hw e e k a f t e rt h es u r g e r y ，t h ed i s c ss e c t i o n sw e r es t a i n e di np r u s s i a nb l u ei r o ns t a i n i n gs o l u t i o n a n dr o u t i n e l ym o u n t e da c c o r d i n gt ot h ea b o v em e t h o d ，a n dt h ep r e s e n c eo fb l u e - s t a i n e d g r a n u l e si nc y t o p l a s mw a so b s e r v e du n d e r am i c r o s c o p e 2 t h ec o m p a r a t i v es t u d yo ft h et r e a t m e n te f f e c to fi n t e r e r t e b r a ld i s c sd e g e n e r a t i o n b yi nv i t r oa n di nv i v ot r a n s f e c t i o n a t r a n s f e c t i o no fb m s cw i t hp c d n a 3 1 ( + ) g d f - 5r e c o m b i n a n tp l a s m i d m e d i a t e db yl i p i d o s o m e ： b p r e p a r a t i o no fg e n e - a c t i v a t e dm a t r i x c ：c u tit y p ec o l l a g e ns c a f f o l di n t os t r i p so f lm mi nd i a m e t e ra n d5 m mi nl e n g t hw h i c ha r et ob es t e r i l i z e db ye p o x ye t h a n ef o ru s e ； d i l u t ep l a s m i da n dl i p i d o s o m eb yt h ep r o p o r t i o nm e n t i o n e di ns t e p2t os o a kt h e s c a f f o l di nt h e m ；a f t e ri n f i l t r a t i o nf o r3 0m i n u t e s ，b e g i nt oo p e r a t eo nt h er a b b i t c t w om o n t h sa f t e rs u r g e r y ，d e t e c t i o no fr e p a i r m e n t ：o b t a i nn u c l e u sp u l p o s u so f i n t e r v e r t e b r a ld i s c so fe a c hg r o u po fr a b b i t s2m o n t h sa f t e ro p e r a t i o n ，d e t e c t i o no f c o n t e n to f p r o t e o g l y c a nw i t hp h l o r o g l u c i n o l ，d e t e c t i o n w i t hf l o w c y t o m e t r y r e s u l t s 1 r a b b i tb m s c sc a ns u r v i v ef o r8w e e k s a i nt h ec u l t u r ef l a s ki n o c u l a t e d 晰t hb m s c s ，t h e r ew e r e1 0 t so fr o u n dc e l l s ，a n d af e ws p i n d l ec e l l sa p p e a r e do nt h e2 n d 一3 r dd a y ；t h er o u n dc e l l sd i s a p p e a r e do nt h e5 t h 一7 t hd a y ，a n dt h es p i n d l ec e l l sg r e wg r a d u a l l y ，i nc l u s t e r s ，a n dr a d i a l l y ；t h es p i n d l e c e l l sg r e wl o g a r i t h m i c a l l yo nt h e1o t h 一2 0 t hd a y t h e3 r dg e n e r a t i o no f c e l l sg r e wl i k e aw h i r l p o o l ，o b s e r v e du n d e ras c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ，t h e r ew e r eal o t o f m i c r o v i l l io nt h es u r f a c eo ft h e3 坩g e n e r a t i o no fc e l l s ，i m m u n o h i s t o s t a i n i n ga n d o b s e r v a t i o nt h ec e l l sw e r es t r o n g l yp o s i t i v ef o rs t a i n i n gf o rg l y c o g e na n dn e g a t i v e f o rc o li ，a l pa n df a ts t a i n i n g b t h e r ew e r eb l u e s t a i n e dg r a n u l e si nt h ec y t o p l a s mo ft h ec e l l sp o s i t i v ef o r p r u s s i a nb l u ei r o ns t a i n i n g ，o b s e r v e du n d e rat r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e ，t h e r e w e r ee l e c t r o n d e n s ei r o ng r a n u l e si nt h ec y t o p l a s m ，a si n s p e c t e db ym t t ，t h e r ew a sn o s t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n td i f f e r e n c eo fc e l lp r o l i f e r a t i o nb e t w e e nt h es p l o - l a b e l l e da n d 5 u n l a b e l l e dc e l l si n7 da f t e rl a b e l l i n g c u n d e ram i c r o s c o p e o ft h ee x p e r i m e n t a lg r o u p ，i nt h e2 加w e e ka f t e rt h es u r g e r y ， t h e r ew e r eal o to fb l u e s t a i n e dg r a n u l e si nt h en u c l e u sp u l p o s u s ，a n dt h e yw e r ei nt h e c y t o p l a s m ；i nt h e4 mw e e k t h e r ew e r eb l u e - s t a i n e dg r a n u l e si nt h ec y t o p l a s mo fb o t h n u c l e u sp u l p o s u sa n da n u l u sf i b r o s u s ；i nt h e 分“a n dt h e8 mw e e ka f t e rt h es u r g e r y t h e r e w e r es t i l lb l u e - s t a i n e dg r a n u l e si nt h ec y t o p l a s m w h i l et h e r ew a sn ob l u e - s t a i n e d g r a n u l eo b s e r v e di nt h ei n t e r v e r t e b r a ld i s cs e c t i o n so ft h ec o n t r o lg r o u p sa te a c ht i m e p o i n t 2 t h ec o m p a r a t i v es t u d yo f t h et r e a t m e n te f f e c to fi n t e r e r t e b r a ld i s c sd e g e n e r a t i o n b yi nv i t r oa n di nv i v ot r a n s f e c t i o n a t r a n s f e c t e da f t e r12h o u r s ，s o m ec e l l sc a nb eo b s e r v e di nc e l la p o p t o s i s ，a f t e r4 8 h o u r st h ec e l l sg r o ww e l l ，t h ev o l u m ei n c r e a s e ds l i g h t l y b t h ec e l l si ne a c hg r o u po f4 8h o u r sa f t e rt r a n s f e c t i o n ，a sw e l la st h ed i s c r t p c ri ne a c hg r o u po f2m o n t h sa f t e rs u r g e r y ，w h i c ha r es h o w ni nf i g u r e ，a r o u n dt h e 5 6 0 b p ，p c d n a 3 1 ( + ) g d f 一5t r a n s f e c t e dc e l l sg r o u p ，t r a n s f e c t e dm s ct r a n s f u s i o n g r o u pa n dt h en u c l e u sp u l p o s u so fg a mg r o u pa l la p p e a rt h ee l e c t r o p h o r e t i cb a n d s ， i n d i c a t i n gt h es u c c e s s f u lt r a n s f e c t i o n c t h r o u g ht h ea n a l y s i so fv a r i a n c e ，a n dl s d tt e s t ，t h ed i f f e r e n c eb e t w e e ne a c h g r o u pa n dt h en o r m a lg r o u ph a ss t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t ，b u t t h et r e a t m e n te f f e c to f t r a n s f e c t e dc e l l sg r o u pi sn e a r e s tt h en o r m a ld i s c 英文缩略语 7 论文一 经超顺磁性氧化铁标记的自体b m s c s 在兔椎间盘内 存活时间的研究 莉 吾 研究表明，椎间盘退变( i n t e r v e r t e b r a ld i s cd e g e n e r a t i o n ，i d d ) 是由于椎间 盘内活性细胞数目减少，椎间盘合成代谢失衡，导致蛋白多糖含量减少所致1 1 。 因此，通过补充髓核内细胞数量和蛋白多糖成分，保持椎间盘高度和增加椎间盘 分散负荷的能力，有助于停止或延缓i d d 进程【2 1 。b m s c s 有多向分化潜能，体 内外研究均己证实其可分化为间充质细胞系，包括软骨细胞、成骨细胞、脂肪细 胞、肌肉细胞、心肌细胞，b m s c s 。移植可能是治疗i d d 的一种简便、有效的方 法【3 训。我们采用超顺磁性氧化铁( s u p e r p a r a m a g n e t i ci r o no x i d e ，s p i o ) 标 b m s c s ， 观察标记后细胞在兔椎问盘内的存活时间，旨在为后期采用转染成功的b m s c s 预防i d d 提供依据，并观察注入的b m s c s 在活体椎问盘内的迁移规律。 材料与方法 一、材料 1 、实验实验动物及主要试剂、仪器 8 1 0 周龄健康s p f 级日本大耳白兔1 2 只，雌雄不限，体重1 5 2 0 k g ，由中国医科大学动物部提供。l d m e m 培养基( g i b c o 公司，美国) ；f b s ( h y c l o n e 公司，美国) ；1 0 7 7g lp e r c o l l 液( p h a r m a e i a 公司，瑞典) ；c o l i 抗体、s a b c 免疫组织化学试剂盒、d a b 显色试剂( 武汉博士德生物工程有限 公司) ；s p i o ( 东南大学生物医学工程学院张宇教授惠赠，浓度5 4m g m l ，平均 粒径1 0 姗) ；多聚左旋赖氨酸( p o l y - l l y s i n e ，p l l ) 、胰蛋白酶、m t t ( s i g m a 公 司，美国) ；d m s o ( a m r e s c o 公司，美国) 。5 c 0 2 细胞培养箱( h e r a e u s 公司， 德国) ；数码照相机( n i k o n 公司，日本) ；j s m t 3 0 0 型扫描电镜( 岛津公司， 日本) ；j e m 1 2 0 0 e x 型透射电镜( 日本电子公司) ；m o d l e 6 8 0 型酶标仪( b i o r a d 8 公司，美国) ；冷冻切片机( l e i c a 公司，德国) 。 二、方法 ( 一) 常用试剂配制 磷酸盐缓冲液( p b s ) 等渗，p h 约7 4 ； d m e m 培养液：青霉素、链霉素各1 0 0 u m l 的无血清低糖d m e m 培养液； 普通细胞培养液：在d m e m 培养液的基础上再加入1 0 的胎牛血清( f b s ) ； 细胞消化液：含有0 2 5 的胰蛋白酶及0 0 2 e d t a 的p b s 溶液； m t t 液：0 0 0 5 9m t t 粉末溶于1 0 m l p b s 中过滤除菌。 ( 二) 原代细胞分离、培养及相关鉴定 取日本大耳白兔速眠新( 0 3m l k g ) 全麻，无菌操作下于股骨远端穿刺，用 含30 0 0u m l 肝素的l d m e m 注射器抽出双侧骨髓约4m l 。p b s 洗涤2 次， 1 2 0 g 离心5m i n ；弃上清，沉淀用l - d m e m 培养液重悬，制成单细胞悬液； 将单细胞悬液缓。t 曼d n n 预先加有1 0 7 7g lp e r c o l l 单核细胞分离液的离心管中， 2 0 0 g 离心2 0m i n ；吸取中间白膜层，p b s 冲洗2 次后，1 2 0 g 离心5m i n ， 以2 1 0 5 个m l 密度接种于含1 0 f b s 的l d m e m 培养基，置于5 c 0 2 、饱 和湿度及3 7 。c 培养箱内培养4 5d 后首次换液，以后每3 天换液1 次，并于 倒置相差显微镜下每日观察细胞形态变化。待细胞生长融合达9 0 以上，以0 2 5 胰蛋白酶消化，按1 ：2 比例传代培养。取第3 代细胞进行以下观察。 h e 染色观察： 将细胞爬片用4 多聚甲醛固定后行常规h e 染色，光镜下观察。 扫描电镜观察： 将细胞爬片经2 5 戊二醛固定，梯度脱水，临界点干燥，喷金，扫描电镜 观察。 c o li 染色观察： 3 h 2 0 2 消除内源性过氧化物酶活性，蒸馏水冲洗，山羊血清封闭液2 0m i n ， 根据试剂盒说明书操作，常规脱水透明封片。 糖原染色： 置于o 5 高碘酸溶液中室温1 0 1 2m i n ，蒸馏水冲洗，放入s c h i f f 试剂 9 中避光1 0m i n ，蒸馏水冲洗后，置入亚硫酸氢钠溶液中浸泡2 次，每次5m i n ， 除去未结合的隐性染料，自来水冲洗5m i n ，蒸馏水冲洗5m i n ，常规脱水透明封 片，显微镜下观察并计数阳性细胞。 脂肪染色： 7 0 乙醇洗切片，置苏丹黑b 染液中染色1 0m i n ，7 0 乙醇洗去多余染液， 蒸馏水洗，常规脱水透明封片。 a l p 染色： 将细胞爬片浸入g o m o r i 孵育液于3 7 。c 孵育4h ，自来水冲洗，2 硝酸钻中 浸泡5m i n ，蒸馏水洗数次，置入1 硫化铵中2m i n ，自来水冲洗，自然干燥， 封茂。 ( 三) s p i o 标记兔b m s c s 及检测 取闩取s p l o 和p l l 加入l d m e m 培养基中，3 7 振荡6 0m i n ，使s p i o 终 浓度为2 5p g m l ，p l l 终浓度为0 7 5g g m l ，0 2 2g m 过滤消毒。取第3 代 b m s c s l 1 0 6 个，去掉原来培养基，p b s 冲洗3 次后加入含s p i o p l l 的培养 基中，5 c 0 2 、3 7 。c 及饱和湿度培养箱内孵育1 8h 完成标记，并行以下检测： 细胞普鲁士蓝铁染色： 将标记后的细胞在经过浓盐酸浸泡去铁处理的盖玻片上爬片，过夜后4 多 聚甲醛固定，置入2 盐酸2 亚铁氰化钾等比混合的溶液中3 7 。c 、5 0m i n ，蒸 馏水洗3 次，1 中性红复染数十秒，蒸馏水冲洗，脱水透明，中性树胶封片。 以胞质内出现蓝染颗粒为阳性细胞，随机取1 0 个低倍视野行标记阳性率统计， 阳性率= 阳性细胞数细胞总数x 1 0 0 。 透射电镜观察： 将标记后的细胞经0 2 5 胰蛋白酶3 7 。c 消化1m i n 后，1 2 0 g 离心5m i n ， p b s 冲洗2 次，2 5 戊二醛固定；p b s 冲洗，1 锇酸后固定2h ，梯度乙醇、 丙酮脱水，6 1 8 环氧树脂包埋液浸透包埋，超薄切片机6 0 0 8 0 0n l l l 切片，醋 酸铀、枸橼酸铅染色，透射电镜观察。 细胞活力鉴定： 取1 滴标记后细胞悬液与2 滴2 锥虫蓝溶液混合后，滴入细胞计数板，阳 1 0 性蓝染细胞为死亡细胞，在显微镜下计数1 0 0 个细胞，计算活细胞比例。细胞活 力= 染色阴性细胞数1 0 0 1 0 0 。 m t t 法测定标记细胞增殖： 调整标记后和未标记细胞密度为40 0 0 个孔，接种于7 块9 6 孔板上，每块 各接种1 0 孔。每2 4 小时取出1 个培养板，吸出原有培养基并加入m t t - 培养 基混合液，3 7 。c 、5 c 0 2 中孵育4h 后，小心吸出上清，每：y l ：0 1 入1 0 0g ld m s o 溶解紫色颗粒，放入酶标仪中在5 7 0n n l 处测吸光度( a ) 值，并绘制细胞生长曲 线。 ( 四) 动物分组及手术方法 将1 2 只日本大耳白兔随机分为实验组( n _ 8 ) 和对照组( n = 4 ) 。2 0 乌拉 坦( 5m l k g ) 耳缘静脉注射麻醉后，采用后侧方入路寻找横突并暴露椎问盘，于 l 1 、2 、l 2 、3 、l 3 、4 、l 4 、5 注入自体细胞。实验组和对照组分别注入经s p i o 标记和未标记的b m s c s 悬液2 0 此，细胞浓度均为5 1 0 5 个m l 。入针深度事 先标记，以感到突破感为准，确定进入髓核组织，并在相应椎间盘处用铜线标记 棘突。术后关闭伤口，动物自由饮食，术后前3d 每日4 0 万u 青霉素注射抗感 染。 术后2 、4 、6 、8 周，实验组和对照组分别取2 只和1 只动物，于耳缘静脉 注射空气1 0m l 处死，暴露棘突，确认相应椎间盘，取出后脱钙作7l x m 厚冰冻 切片。同上法行普鲁士蓝铁染色，常规封片，镜下观察在细胞质内是否出现蓝染 颗粒。 ( 五) 统计学方法 采用s p s s l 3 0 统计软件包进行分析。数据以均数4 - 标准差表示，组间比较 采用t 检验，p 值 0 0 5 ) ，细胞生长曲线见图3c 。 三、兔椎间盘组织学检测 术后动物无死亡。术后2 周，实验组镜下可见髓核中有大量蓝染颗粒，且 位于胞质内；8 周，仍可观见位于胞质内的蓝染颗粒。各时间点对照组椎间盘切 片均未观察到蓝染颗粒( 图4 ) 。 讨论 i d d 是引起下腰痛的常见病因之一，严重影响患者生活质量。一般认为腰 椎间盘突出症是在i d d 基础上发生的。由于各种特殊运动的兴起，青少年腰部损 伤的可能性大大增加，该类腰椎损伤患者随着年龄增长，发生椎间盘突出的可能 性增加，因此对此类患者行保留椎间盘的手术，并在术中增加预防i d d 的措施有 重要意义。 目前临床上尚无有效预防i d d 的措施，但研究者经过动物实验认为细胞疗法 或搭载细胞的基因疗法对修复退变的椎间盘有肯定疗效。i d d 细胞疗法的细胞来 源目前有3 种：椎间盘细胞、软骨细胞和m s c s 。目前认为椎间盘细胞移植是治 疗i d d 最有效的细胞，但这种细胞来源存在较多问题：供者椎间盘会因此发生退 变【5 】；使用椎间盘切除术所得的椎间盘细胞进行移植治疗【6 刁】，因切除的椎间盘本 身已发生退变，所获得的细胞数量少且活力差，不是刺激再生的理想细胞【8 】；椎 1 2 自j 盘细胞的体外培养非常困难。而软骨细胞和m s c s 不存在上述问题，但两者移 植治疗i d d 的效果仍无肯定结论。我们实验采用的b m s c s 具有来源丰富、体外 扩增快、有多向分化潜能的特点，第3 代细胞糖原染色呈强阳性，扫描电镜观察 有大量微绒毛，表明细胞活力好，是理想的实验用细胞。关于b m s c s 修复i d d 的 机制仍不明确，目前认为主要有以下两方面：b m s c s 在体内与椎间盘细胞共同生 存一段时问后，可向椎问盘细胞方向分化，产生e c m ，达到既增加椎间盘内活性 细胞数目，又补充丢失的e c m 的目的；b ms c s 通过旁分泌作用激发其周围剩余 椎间盘细胞活力，使其增殖并分泌e c m 来进行修复。无论是以上哪种机制， b m s c s 移植修复i d d 的疗效看是肯定的 9 - 1 0 】。 但不论采用哪种细胞移植，都面临移植细胞能否在活体椎间盘内存活以及其 存活时间的问题。所以，细胞标记技术一直是研究热点。目前常用的标记技术如 各种荧光染料，对细胞毒性大、染料本身稳定性差、示踪时间短等；各种转染方 法如转染绿色荧光蛋白、l a c z 等，对标记技术要求较高，操作难度大。随着m r i 技术的发展，一种新的细胞示踪技术s p l 0 标记法逐渐成熟起来。我们实验采 用的s p i o 平均粒径为1 0n n l ，理化性质稳定，标记效率高，操作简便，标记时间 长，且其检测可采用m 。同时s p i o 标记法是一种无侵袭性检测，可以动态监 测同一标记细胞在体内的迁移，避免了动物个体差异和操作者差异造成的偏差， 更适合临床应用。s p i o 是否影响干细胞成软骨方向分化仍存在争议1 1 1 d 2 】，但可能 与采用的s p i o 颗粒、标记浓度以及载体的不同有关【1 3 1 。s p i o 对细胞的毒副作用 主要是细胞内铁含量增加，但如降低s p i o 浓度则会导致标记效率降低。已有文献 报道s p i o 浓度的安全浓度范围是2 5 5 0i - t g m l t l 4 15 1 ，实验采用2 5r t g m l s p i o ，结果显示无论标记效率还是对细胞的毒副作用均较满意。 冰冻切片结果显示在各时间点均可观察到胞质内有蓝染颗粒的细胞，说明标 记细胞仍存活。因为细胞增殖虽然会使氧化铁浓度降低，但在细胞增殖分裂过程 中，胞内氧化铁也不会释放到胞外；如果注射细胞死亡崩解后释放出的s p i o 很 难被椎间盘细胞所吞噬，是因为椎间盘组织e c m 丰富，外来物质难以被其吞噬， 而且我们的实验结果显示高倍镜下有大量胞质内有蓝染颗粒的细胞，可以认为只 要是胞质内有蓝染颗粒的细胞，绝大多数是我们注射入的外源b m s c s 。动物实验 1 3 显示，4 周时标记细胞己由注射点迁移至纤维环处，与文献1 1 6 峙艮道的1 2 周才出 现迁移有差异，可能是因为我们实验的注射点比较靠近纤维环，不在髓核中央处。 这种现象的出现使得注入的b m s c s 在椎问盘罩能较均匀地分布，理论上有利于对 退变椎间盘进行修复，但目前对其机制了解较少。机体受损后为进行修复，能够 动员本身的干细胞分泌各种细胞因子，目前研究较多的细胞因子是基质细胞衍生 因子1 ( s t r o m a lc e l l sd e r i v e df a c t o r1 ，s d f 1 ) 基质细胞衍生因子受体4 ( c x c c h e m o k i n er e c e p t o r 4 ，c x c r - 4 ) 系统【1 7 - 18 1 。研究表明，包括b m s c s 在内的各种 干细胞能够沿s d f 1 的浓度梯度实现“归巢，【1 9 之，在此过程中，b m s c s 可以表 达c x c r 4 t 2 2 1 ，而退变的椎间盘里也有s d f 1 的表达f 2 3 1 ，这种外源性干细胞迁移 与s d f 1 系统是否有关尚需迸一步研究。 结论= 日 己 通过的实验结果显示s p i o 是一种理想的细胞标记物，可以动态监测标记细 胞；兔b m s c s 其自体椎间盘中可以持续存活8 周，并且在4 周时发生迁移，更 均匀地分布在椎问盘内，为后期进行i d d 基因疗法奠定了基础。 1 4 创新性自我评价 l 、s p i o 标记b m s c s 的方法、浓度等国内文献较少报道，而且对标记后细胞 活力的测定方法较先进。 2 、椎间盘组织中应用s p i o 标记的方法国内未见报道，并且对植入b m s c s 的 迁移的原因作出合理解释。 图l a 倒置相差显微镜x 4 0 倍 图l b 扫描电镜x 7 5 0 0 倍 1 5 图2 a 糖原染色x 2 0 0 倍 岬一一 翟r 1 ： 7 ； t 。 l 7 、j + ； 1 ，。j 一 多。 f 一 i i ， 。 一。 、。： f #o o o 、 e 一 一 暮 ，一 ， 。 铲1 ，黑 ， ”一罗莆，