（动物遗传育种与繁殖专业论文）提高大熊猫（Ailuropoda+melanoleuca）初生幼仔免疫力前期研究.pdf

摘要 本研究通过对不同大熊猫圈养单位的人工乳配方，以及黑熊，成都麻羊等动物 初乳的初步分析，选定了大熊猫代用乳配方；检测了由大熊猫母亲育幼的大熊猫初 生幼仔肠道菌群的建立及组成情况；应用生化的方法测定了大熊猫幼仔血清中y 一 球蛋白含量：将收集到的健康成年大熊猫血清冻干，并进行了冻干血清微生物培养、 动物口服等安全试验。为提高大熊猫初生幼仔免疫力的研究奠定了一定的基础。 研究结果： 1 、通过对圣迭哥动物园、北京动物园以及成都大熊猫繁育研究基地的人工乳的配方， 以及黑熊成都麻羊和大熊猫初乳中粗蛋白、粗脂肪、乳糖、矿物质元素的含量进行 分析，通过比较检测结果，认为成都大熊猫繁育研究基地的人工乳配方比较适合大 熊猫幼仔。此配方为：山羊初乳：熊猫奶粉( p a n d am i l k ) ：去离子水= 3 ：l ：6 ( 质量 比) 2 、大熊猫幼仔肠道f 常菌群与其它动物相比比较特殊，厌氧菌的检出率和含量相对 较低。l 一3 j 同龄大熊猫幼仔肠道正常菌群中以大肠埃希氏菌、粪链球菌为主。这期 间粪便中菌群组成为较单纯，基本没有什么变化，在2 5 同龄时才检测到乳杆菌，但 仅是微量。截止2 月龄没有发现双歧杆菌，肠道菌群也基本没有变化。 3 、双缩脲法测定大熊猫初生幼仔血清中总蛋白量，电泳分析不同蛋白比例，发现y 一球蛋白含量极低，截止1 9 周龄最高仅为1 9 9 1 ，为成年大熊猫的2 2 6 2 ，y 一球 蛋白仅占血清总蛋白4 1 ，而成年大熊猫此数据为1 2 0 9 ：1 3r 龄死亡的一只幼 仔y 一球蛋白含量仅为0 4 9 1 ，为成年大熊猫的4 7 6 ，y 一球蛋白占血清总蛋白 1 5 ，证明大熊猫初生幼仔免疫力低下。根据检测结果确定了计算大熊猫幼仔添加 成年大熊猫血清量的公式：添加剂量：7 5 m l l o o g 体重幼仔体重5 0 x6 m g m l - 7 - 5 0 8 ，4 m g m l 4 、健康成年大熊猫的血清冻干处理后进行微生物培养、哺- l 4 , 鼠口服等安全试验， 证明口服冻干后的血清不会造成试验动物腹泻或发育不良等负面影响。 关键词：大熊猫初生幼仔人工乳肠道正常菌群冻干血清免疫添加剂 前言 营养与免疫是营养学与免疫学相结合的一门新兴学科。营养素具有免疫功能是 本世纪营养学、医学及免疫学极富成就的发现之一。在此方向上人们投入的研究力 量不断加强，随着研究的深入，人们对能量与免疫、脂类与免疫、矿物质微量元素 与免疫、维生素与免疫等问题都有了较为深刻的认识，并应用于我们的生活中，对 提高人类生活质量起了重要作用。同时应用于家畜的饲养实践中，对防治应激、预 防疾病、提高畜禽生产力方面也起到了重要作用。营养、免疫和感染三者的互作关 系是动物机体健康和营养状态的核心。主动免疫需要大量的能量和蛋白质参与免疫 活性细胞的分裂分化和效应性分子免疫球蛋白的合成( d r e w ，1 9 9 9 ) 。因此，动物机 体的营养状态对启动强而有效的免疫应答至关重要。纵使轻微的某单一营养成分的 缺乏也会严重损害免疫功能。免疫反应也影响到动物机体的营养需要，除合成淋巴 细胞时蛋白质需要增加养分外，免疫介质的释放也会显著改变基础代谢。因此，营 养和免疫是密切关联的互作系统，应把二者作为整体，而不是作为互不相干的独立 因素来研究。 母乳为哺乳动物新生幼仔提供营养和能量来源，能为幼仔的生长发育提供全面、 均衡的营养，能促进机体功能的成熟。不仅如此，其所含的免疫物质、激素、生长 因子、细胞因子等能将母亲与初生幼仔在生物化学、免疫功能之问的联系建立起柬， 还能影响胃肠道发育，对预防初生幼仔疾病、过敏反应等起保护作用，为任何代乳 品所不及，所以母乳是动物初生幼仔包括人婴儿的最佳天然食物。母乳与新生儿免 疫是一个非常活跃的研究领域。用功能性免疫球蛋白和其它免疫刺激物质对营养成 分平衡的人工乳进行强化，并将这种方法作为新生仔畜的免疫性保护手段，这对提 高动物健康和改善生产性能是- - h p 常有前途的方法。 1 初乳的生物学意义 初乳通常呈黄色，粘度较大，略偏酸性。泌乳开始后如何划定初乳的时间范围， 还很不统一，乳业生产中习惯把第一周的牛奶称为初乳，但现在明显地倾向于根据 乳中各组分组成的浓度和活性来区分初乳和常乳。 新生的哺乳幼仔，胃肠道未发育完全，消化、吸收机能不健全，体内只有非常 有限的糖、脂、维生素和微量元素的贮备，通常缺乏母源抗体和应变能力，难以抵 抗环境因子( 物理的、化学的和生物学的) 的作用。而此时的初乳，包含有保证其生 2 存和生长所需的所有物质，因此具有独特的生物学意义。 概括的说，乳和初乳对于新生哺乳幼仔有三方面的功能：提供能量和生物合 成前体物的营养性功能；提供特异的和非特异的免疫保护的防御机能；传达母 源神经与内分泌的调节信号功能。因此把乳仅看作是新生哺乳幼仔单纯的营养源的 观点已显陈旧，特别是初乳在哺乳幼仔生长发育早期，在为幼仔提供免疫保护和传 达代谢信息方面有特殊的贡献。基于这样的认识，对初乳的生化性质研究以及深度 刀+ 发成了当前的热点。 2 初乳的成分及作用 2 1 初乳的成分 初乳和常乳的划分是根据乳中各组分的浓度和活性。初乳一般指母畜分娩后 3 5 d 所分泌的乳汁，它的化学成分和物理性质都与常乳有很大区别。母乳作为初生 幼仔唯一的营养源要为幼仔的发育提供能量、蛋白质、脂肪酸、维生素和矿物质元 素等。因为初生幼仔的消化和调节系统尚未发育完全，并且受出生后新环境应激的 影响，所以初乳含有比常乳高得多的养分，如丰富的维生素和球蛋白等，特别是含 有一些初生动物健康生长所必需的生长因子( 见表1 ) ，这些成分对初生动物接受被动 免疫、被动提高抗病力、促进胃肠道的迅速生长有关键作用。初乳的蛋自质、脂肪、 灰分和密度均高于常乳，随着泌乳期的延长而下降，初乳成分逐渐接近常乳水平( 见 表2 ) ；p h 和乳糖的变化规律与之正相反。牛初乳中c a 、n a 、m g 、c l 、f e 、z n 、c u 的 含量均高于常乳几倍，甚至几十倍，但是k 和p 的含量较常乳低。 2 2 初乳的作用 2 2 1 初乳的营养作用 新生幼仔生长初期，初乳不仅为其提供营养，由于其含有较高浓度的生物活性 物质，也成为刺激器官快速生长发育的重要物质之一。b u r r i n ( 1 9 9 5 ) 等的研究表明， 喂初乳可增强仔猪消化能力。喂初乳的犊牛血清总蛋白质含量和白蛋白的含量均较 高( d a n i e k ，1 9 9 4 ) 。初乳中的生长因子和激素能调节新生幼仔胃肠道发育，也能调节 消化道的消化和吸收功能。b u h h e r 等( 1 9 9 8 ) 的研究表明，初乳使牛小肠绒毛变长，延 长喂初乳的时间，改变了小肠的形态，提高了小肠的吸收力。 2 2 2 初乳的免疫作用 关于哺乳动物的大量研究证明，初生幼仔可以通过吃初乳获得被动的免疫力。 初乳中被确认的免疫物质越来越多，如免疫球蛋白、免疫活性细胞及非抗体保护蛋 白等。乳汁中的免疫物质对幼仔具有两种完全不同的保护作用。种是初乳吸收进 入幼仔循环系统后，提供被动的可以预防微生物侵入的循环抗体。第二种是不被吸 收的乳汁，在消化道内提供一种被动的能保护肠管疾病的局部免疫力，其中l g g 、i g a 和i g m 都具有保护哺乳动物小肠的作用( 李蜀眉1 9 9 9 ) 。初乳中的免疫球蛋白能够有 效地被新生幼仔吸收与初乳本身的特点及新生幼仔小肠细胞的发育程度有关。关于 这个问题，有些人提出过一些见解( n k r e t e c h m e r ，1 9 8 4 ) ： ( 1 ) 初乳中含有丰富的胰蛋白酶抑制剂，有间接阻止各种蛋白酶水解免疫球蛋白的作 用( t a p p r ，1 9 7 9 ；s a i k k u ，1 9 7 9 ) ； ( 2 ) 免疫球蛋白是糖蛋白，糖可做为外壳对免疫球蛋白起保护作用： ( 3 ) 初乳的缓冲量大，具有减少免疫球蛋白在胃中变性的倾向； ( 4 ) 免疫球蛋白的氨基酸排列顺序很特殊，没有胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶所起 作用的肽键。 表1 初乳中某些生k 冈子的含目j j _ ( n g m 1 ) t a b l e it h ea m o u n to f s o m e g r o w t hf a c t o r si nt h ec o i o s t r u m sa n dm i l k s 表2 牛初乳部分成分与常乳的比较( 初乳成分为常乳成分的百分数) t a b l e2t h e c o m p a r i s o no f c o m p o s i t i o n o f c o l o s t r u m sa n dm i l k 2 3 初乳中免疫球蛋白的功能及来源 初乳和常乳中免疫球蛋白的含量不同( 见表3 ) ，乳中的免疫球蛋白包括i g g 、i g a 和i g m 等。人和兔初乳中主要的免疫球蛋白为i g a ，占初乳中免疫球蛋白总量的8 9 8 ， 也含有较高浓度的i g m 。其中i g a 对酸碱和蛋白酶的水解作用有较强的抵抗力，因此 能在消化道中保持其抗体活性，当其进入消化道后可附着在消化道粘膜表面，以防 止病原体吸附到肠壁上，达到了排菌的作用( w e l k e rw a ，1 9 7 6 ；w e l k s hj k ，1 9 7 9 ) 。 牛、猪初乳中免疫球蛋白主要为i g g 。约占免疫球蛋白总量的8 0 ，这与牛、猪胎盘 的特殊结构使母体血液中免疫球蛋白不能直接进入胎儿有关。猪初乳中i g g 具有保护 乳腺和向幼仔提供被动免疫力的双重作用。这些免疫球蛋白直接来源于母体血液循 环，因此，它们属于那些专一对付母体曾遭遇的病原体的免疫球蛋白。假如新生幼 仔所处生活环境与母体相同，那么这些免疫球蛋白就能为幼仔提供所需要的专一性 免疫保护。而且出于i g g 的半衰期较长( 1 4 天) ( b o u r n e 年dc a r t i s ，1 9 7 3 ) ，因此，仔 畜体内来源于母体的l g g 的浓度可以在几周内维持较高的浓度( k u m a r ，1 9 9 8 ) 。 猪的常乳中i g a 含量较高，而初乳中i g g 的含量占主导地位。初乳与常乳中免疫 球蛋白的生理来源截然不同。母猪初乳中绝大部分i g g 和4 0 的l g a 直接由母猪血液 中转移而来( f r a n c k 等，1 9 7 5 ) 。母猪乳腺上皮细胞的特殊受体负责将i g g d q 血液转入 初乳( b r a n d o n 等，1 9 7 1 ) 。猪分娩后2 4 4 8 小时后由血液转入乳中的免疫球蛋白急剧 下降，在产后第3 天，乳中9 0 的i g a f l t o 的i g g 均由乳腺中聚居的b 细胞产生和提 供。这些b 细胞属于粘膜免疫系统( b r o w n 等，1 9 7 5 ) 。所以，初乳中的免疫球蛋白主 要由系统性免疫系统来提供，而常乳中的免疫球蛋白主要由粘膜免疫系统来提供。 表3 牛乳和猪乳中免疫球蛋白的含量( m g m 1 ) t a b l e 3t h ea m o u n to fi m m u n o g l o b u l i n si nt h em i i ko fc o wa n ds o w 引臼b u r t o n 等( 1 9 8 9 ) 2 4 初乳中含有的其他保护和调节因子 2 4 1 免疫细胞 初乳中的免疫活性细胞有许多种，如t 淋巴细胞、b 淋巴细胞、臣噬细胞及嗜中 性颗粒细胞等，这些细胞能分泌特异的i g a 抗体，产生干扰素，或者表现直接的吞噬 作用，这对免疫系统尚未发育成熟的新生幼仔十分重要( c r a g o ，1 9 7 5 ：单虎等，1 9 9 8 ) 。 试验证明，母猪初乳中的淋巴细胞可被仔猪消化道吸收，增强仔猪的免疫力。r i e d e l c a s p a r i ( 1 9 9 1 ) 也认为活的初乳淋巴细胞能通过肠壁，初乳白细胞是初乳加强新生犊 牛被动免疫的主要成分。 2 4 2 非抗体保护蛋白 初乳中含有若干种非抗体保护蛋白，如抗胰蛋白酶因子，可保护免疫球蛋白不 被降解；乳铁蛋白对铁有高度亲合力，可降低细菌对铁的利用从而成为一种抑菌蛋 白；乳过氧化物酶系统对革兰氏阳性菌和阴性菌都有广泛的抑制作用( 邹恩湘等， 1 9 8 9 ) 。这些非抗体保护蛋白可以彼此结合成复合体，或者与免疫球蛋白( 如i g g ) 相 结合，其结果使有关成分稳定性增加，或产生出更强的抗菌效应。 2 4 3 各种生长因子 初乳中含大量的生物活性物质，主要是多肽性生长因子和类固醇激素，基本分 为四类； ( 1 ) 类固醇激素，如雌二醇、肾上腺皮质激素、皮质酮、皮质醇等； ( 2 ) 肽类和蛋白质激素，如促性腺激素、促甲状腺素、胰岛素、生长激素等： ( 3 ) 前列腺素； ( 4 ) 多肽生长因子，如i g f 、e g f 、t g f 、n g f 、e p o 、i l 等( 汪玉松和邹思湘，1 9 9 5 ) 。 其可能的生物学作用见表4 。 表4 乳中生物活性物质和可能的生物学功能 t a b l e 4g r o w t h s t i m u l a t i n gs u b s t a n c e si nm i l ka n dt h e i rp o s s i b l ef u n c t i o n 3 新生幼仔吸收外源性免疫球蛋白的意义和机制 哺乳动物的新生幼仔即便它的自身免疫系统已经比较完善，仍要从母亲那旱获 得抗体来被动提高免疫力。抗体的这种被动传递主要通过胎盘或初乳进行传递。母 源抗体传递给胎儿的方式取决于胎盘的类型( 表5 ) 。灵长类为血绒毛膜胎盘，这种类 型的胎盘允许l g g 由母体传递给胎儿，但i g m 、i g a 或i g e 则不能通过胎盘。狗、 猫为绒毛内皮胎盘，这种类型的胎盘允许部分i g g ( 5 - l o ) 通过，所以狗、猫的幼仔 也主要由初乳获得被动免疫力。偶蹿类家畜为结缔组织绒毛膜胎盘，猪、马为上皮 绒毛膜胎盘，母源抗体不能通过这两种胎盘传递给胎儿，在幼仔出生时血清和肠道 分泌物中均不合免疫球蛋白。所以这两种动物就必须通过吮食初乳来获得被动的免 疫力( t i z a r d ，1 9 7 7 ) 。由于不同的动物具有不同的转移抗体的方式，所以这些动物的 仞乳中i g g 、i g a 、i g m 的相对含量也不尽相同。 无论是对于保护胃肠道、还是系统免疫力，通过乳腺转移免疫力对于各种哺乳 动物的幼仔都是至关重要的。 各种家畜，肠道通透性的选择性和通透时间长短各不相同。肠壁对蛋白质的通 透性在刚出生时为最高，然后迅速降低，大约在2 4 h 后降至最低水平。在初生的最 初几个小时免疫球蛋白在新生幼仔的小肠内没有任何选择性地通过小肠粘膜细胞 的胞饮作用被新生动物吸收。l o g a h 等的研究指出。在出生后1 2 天内，幼仔肠道 不仅能够吸收同类动物的i g g ，也能吸收异类动物的i g g ，如奶牛初乳的i g o 在新 生羔羊的肠道中与羊初乳中i g g 有同样快的吸收力。单虎等( 1 9 9 8 ) 的研究也指出， 太湖猪仔猪在哺喂牛初乳之后约8 h ，血液中就出现了较高水平的牛i g g 。 幼畜血清中免疫球蛋白水平一般在1 2 1 4 h 达到最高峰，以后随着肠关闭( g u t c l o s s u r e ) 现象的出现，吸收终止。但啮齿类动物却有所不同，他们由肠道选择性地吸 收i g g 的过程可持续2 0 天。 肠关闭的时间长短因动物品种的不同和免疫球蛋白种类的不同而不同。引起肠 关闭的机制还不清楚。对任何一种动物，只要在一定时间内喂给初乳就能引起肠关 闭；应激也能引起肠关闭；给大鼠注射可的松还能引起肠道提前封闭 ( k r e t e c h m er 1 9 8 3 ) 。经研究发现，新生仔畜小肠粘膜细胞的徽绒毛上覆盖着大量密集 的液泡，出生后这些含有液泡的细胞逐渐挤靠微绒毛的顶端部位，同时微绒毛褶窝 内的细胞有丝分裂增加，促进了细胞移向微绒毛顶端大约出生后的3 天之内，吸收 上皮细胞完全被成熟的上皮细胞所代替，肠关闭现象完成( s i m p o s o n m o r g a n ，1 9 7 2 ： s t a l e ya n d b u s h ，1 9 8 5 ：t r a n h a i ra n d r o b i n s o n ，1 9 8 9 ) 。还有报道说，随时阳j 增长， 肠道上皮细胞逐渐成熟和肠道菌群逐渐建立起来，使得肠道吸收外源免疫球蛋白的 能力逐渐降低直至消失( c h a p p u i s ，1 9 9 8 ) 。 4 幼仔被动免疫失败的原因 初生幼仔获得的从母体传递来的抗体，在增强幼仔抵抗感染能力方面起着重要 的作用。( f e l s b u r g ，1 9 9 0 ：s t o k e s ，1 9 8 9 ；s h i f r i n e ，1 9 7 1 ) 。母兽初乳中免疫球蛋白 成功的传递给幼仔的前提条件有以下几个：1 、母兽初乳中必须有足够大浓度的免疫 球蛋白：2 、幼仔吸收消化足够量的初乳：3 、免疫球蛋白通过肠道由初乳中被吸收 进幼仔血液。以上3 个条件中任何一个发生问题都会影响母兽初乳中免疫球蛋白的 被动传递。 生产中总会出现由于母兽或幼仔的原因，或生产上的某些失误而导致以上3 个 前提条件难以满足，如有些优良的种母畜母性不好，基本不带仔，就会导致幼仔吃 不上或不能及时吃到初乳。大熊猫的实际生产中也经常出现母兽弃仔或不带仔的现 象使幼仔吃不到初乳或不能及时吃到、吃足初乳，从而造成抗体被动转移的失败。 袭5 胎赧类型与免接球蛋矗通过胎盘或斯乳进行母癸传递的笑系 表5r e l a t i o n s h i pb e t w e e np l a c e n t a l t y p ea n d t r a n s f e r o f i m m u n e g l o b u l i n s f r o m d a m t o f o e t u j n e w b o r nv i ap l a c e n t ao rc o o s t r u m 引臼t i z a r do _ 缺乏+ = 存在+ + _ 士耍来源+ + + = 唯一来源 5 配方奶及免疫添加裁的应用 5 1 婴儿配方奶 母驼喂养是为婴j l 健康生长积发育提供理想食品的堆佳方法，假由于个人、社 会等外界因素的影响使母亲的母乳不足或没有母乳的情况客观存在。在母乳不足或 没有母乳的情况下，以前人佛用牛乳直接喂养婴l 代替母乳，但两卷的内在成分存 在很大差异。母乳中蛋自质主要是乳清蛋白，乳清蛋白与酪蛋白比率为6 。4 ，牛乳 中酷蛋自占总蛋白7 8 以上，高酪蛋白含量不利于婴儿消化吸故。母乳中脂肪主要 是不饱和脂肪酸，并且台有大量人体必需脂肪酸如亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸 f a a ) 。牛乳多是饱程脂肪酸，不利充分消化吸收。乳耱和矿物质含量也存在差异， 牛乳咿物质含量高，会增加婴儿肾功能负担，对婴儿健康生长不利。为了使缺乏母 乳喂养的婴j l 健康生长，人们茬牛乳的基础上调整其能量稚营养索，如去除部分酪 蛋白和饱和脂肪酸，添加部分乳清蛋白和不饱和脂肪酸，增加乳糖，降低矿物质含 量，添加微量元素、维生器、某些氨基酸和其他成分，佳之与母乳接近，适合婴l 的营养需要和消化吸收而研制出母乳的替代品婴儿配方奶粉。从菜种意义上说婴 l 配方奶粉的发展历程就是模仿母乳他的过程。 随着科学技术的发展，婴儿配方奶粉大致经历如下过程： ( 1 ) 第一代婴凡配方奶粉阶段t 简单的向牛乳或炼乳加水稀释，有利于消化t 在牛乳中添加谷物、豆浆、蔗糖。 以增加热量。 ( 2 ) 第二代婴儿配方奶粉阶段( 现阶段配方婴儿奶粉) ； 添加外源物质，调节牛乳成分比例，如调节酪蛋白与清蛋白比例：提高不饱和 脂肪酸比例；强化缺乏的维生素、矿物质：牛乳中添加脱盐乳清粉、淀粉糖、维生 素、矿物质、植物油、牛磺酸、低聚糖、d h a ，提高肠道内双岐杆菌数量，促进喂 养婴儿神经系统发育。 ( 3 ) 第三代婴儿配方奶粉( 完善阶段) ： 以乳清蛋白( 如d 乳球蛋白) 水解物为基础，经抑菌处理添加免疫活性物质，保 证婴儿正常生长发育的营养需要，提高喂养儿机体免疫力和抗感染力。 虽然随着技术的发展，配方奶粉的成分与母乳越来越接近，但目前还没有一种 产品能与母乳成分完全一致。 s 2 免疫添加剂的应用 实际生产中经常会因为母兽母性不强不愿哺乳，或初乳不足，或者幼仔身体太 弱等原因而导致幼仔难以吃到足够初乳，通常会用牛乳或奶粉的方法进行补救，这 样做虽然可以起到一定的作用，但存在很多问题。其一是牛乳对于其他的动物来说 消化性存在差异，很多动物直接饲喂牛乳会引起腹泻，甚至死亡。其二是牛乳与其 他动物的初乳相比所含营养成分不同，即使幼仔喂牛乳后存活下来，对其以后的生 长发育和生产性能也会产生影响。其三是牛乳中不含免疫球蛋f l ( 抗体) ，这是造成 补喂牛乳的动物死亡的一个重要原因。 用免疫球蛋白对代初乳和断奶后的日粮进行强化，来解决代初乳中免疫球蛋白 缺乏的问题。大量关于大型动物的研究资料证明，血清中的i g g 浓度是用来评价幼仔 抵抗感染的最好的指标，( b a l d w i n ，1 9 9 1 ；c l a b o u g h ，1 9 9 1 ：r e ad e ，1 9 9 6 ；g a l e ， 1 9 9 8 ：v i i r t a l a ，1 9 9 9 ) 。所以在应用外源免疫球蛋白的时候，多以添d i i g g 来强化代 初乳。r a i n a r d ( 1 9 8 6 ) 报道，血清免疫球蛋白可在体外抑制大肠杆菌的生长：d r e w ( 1 9 9 9 ) 也报道，血清免疫球蛋白可抑制轮状病毒的生长，这表明，m 清中免疫球蛋白可在 机体局部( 肠道) 抑制肠道病原菌的侵袭。 应用猪血清免疫球蛋白的试验结果表明，血清免疫球蛋白对人工饲养的猪确实 可以提供肠道的局部保护作用( m c e a l l u m 等，1 9 7 7 ) 。 d r e w 和o w e n ( 1 9 8 8 ) 报道，从动物血液中提取免疫球蛋白制成人工初乳喂给新生 o 羔羊和初生仔猪，可使羔羊的死亡率由1 9 降到7 ，仔猪的死亡率山1 7 降到5 ， 能有效防止幼仔的各种传染性疾病，并能促进幼畜的生长发育。 提纯血清中的i g g 有多种方法，如盐析法、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析 以及高效液相色谱等方法。不同方法各有优缺点，应根据纯度要求，技术力量和实 验室具体条件加以选择。 提取i g g 的步骤比较繁琐，要求条件严格，而且容易在提纯操作中造成免疫球蛋 白变性和污染，并且生产实际中要应用到的i g g 量较大，实验室设施来提纯的小剂量 i g g 难以满足生产需要。b u r t o n ( 1 9 8 1 ) 、h e a t h ( 1 9 8 5 ) _ 手l l v e v m ，t l ( 1 9 9 1 ) 等将血清或i g g 纯品添加到人工乳中或注射到幼仔体内，有效提高了新生幼仔的抗病力，减少了传 染性疾病的发生，并提高其成活率和育成率。w e l l 等( 1 9 7 4 ) 总结出的注射血清法可以 提高鼻分泌液的抗体滴度，从而提高抗呼吸道病毒感染的能力。j u l i ek 等( 2 0 0 1 ) 将 猫血清皮下注射和腹腔注射到未食初乳的初生猫体内，有效的提高了初生猫血清中 的i g g 水平。a r t h i n g t o nj d 等( 2 0 0 2 ) 饲喂牛血清给初生犊牛，与饲喂初乳的犊牛进行 对照，出生后2 4 h 检测结果，饲喂牛血清的犊牛对i g g 的吸收率要高于饲喂初乳组， 得病率也相对较低。h u n te 等( 2 0 0 2 ) 、q u i g l e yj d 等( 2 0 0 2 ) 的研究也证明将牛血清给 犊牛口服，有效的提高了犊牛的抗病力。 但应用血清也存在缺点，如血清不易保存，易污染，而且适口性差，所以至今 尚未形成新产品。 6 大熊猫的概况 众所周知，大熊猫( a i l u r o p o d a m e l a n o l e u e a ) 是中国特产濒危珍稀动物，被认为是 哺乳类多样性的重要组成部分，同时大熊猫又具有很高的观赏和科研价值。由于大 熊猫繁殖力低、栖息环境不断缩小和割裂、遗传交流中断、人为干扰等原因，野外 大熊猫的数量急剧减少，已濒临灭绝。应当说大熊猫沦为濒危物种的原因是多方面 的，其中之一便是它自身遗传因素和繁殖存活率低下对扩大种群数目的影响。 太熊猫怀孕的前2 3 时间胚胎在子宫内游离而不着床，新生幼仔发育极不完全。 体重仅为母亲的1 9 0 0 ，从而大大降低幼仔对环境的适应能力。大熊猫幼仔在初生时 本身免疫系统发育不完善，对外界致病因素的抵抗能力很差，极易感染疾病且治愈 率很低，最终导致死亡。 近十年来，大熊猫的育幼工作取得了很大进展，如双胞胎育幼成功、人工辅 助育幼及全人工育幼等方法的引入，大大地提高了大熊猫幼仔的成活率，但从整体 来看，大熊猫幼仔的成活率依然较低，在1 9 9 0 年以莳，大熊猫幼仔到半岁的存活率 为仅3 3 9 1 ，1 9 9 0 年以后达到6 6 8 8 ，总计为5 2 7 9 ；特别是人工辅助育幼及全 人工育幼幼仔容易患各种感染性疾病，成活率明显低于全母兽哺育幼仔，以在成都 动物园及成都大熊猫繁育研究基地出生的大熊猫幼仔为例，在1 9 9 4 年以后出生并发 生死亡的共有1 0 只大熊猫幼仔，其中9 0 为人工辅助以及全人工育幼仔，其中有 6 0 死于各种感染性疾病，另外4 0 死于各种意外事故，( 如被母兽压死、出生h , t 目p 已死亡及不明原因的呼吸骤停等) 。就是在目前已存活的大熊猫中，在其育幼过程中 也有多例发生是过呼吸道、消化道感染后经抢救成活。可见提高大熊猫初生幼仔免 疫力成为提高大熊猫存活率的关键环节。 全人工育幼难究其原因，除大熊猫初生幼兽的自身免疫水平非常低外( 王平等， 1 9 8 0 ；1 9 8 3 ；m o n t a l ir j 等，1 9 9 0 ) ，主要由于大熊猫初乳尚远不能满足育幼需要， 而人工初乳中特异性免疫物质还不能从根本上得到解决( 钟顺隆等，1 9 9 3 ) 。目前对 大熊猫胎盘的类型还没有进行过系统研究，其胎盘属于那种类型还没有一个定论， 但大熊猫幼仔通过哺喂初乳而获得坚强免疫力在大熊猫育幼生产中已成为共识。北 京动物园在人工初乳中首次加入一定剂量的免疫球蛋l 白( i g g 、i g a 、i g m ) ，全人工育 幼未食过母体初乳的大熊猫初生幼兽，获得了一定的效果( 刘维新等；1 9 9 3 ) ，间接 证明了母体初乳的重要性，但所加抗体物质的种类和含量也仅根据多年人工育幼经 验和大熊猫初生幼兽的生物学特点，缺少理论依据。尽管用大熊猫剩余初乳配制成 人工乳哺育幼兽获得了成功( 钟顺隆等，1 9 9 6 ) ，但由于大熊猫初乳的采集具有相当 大的危险性，而且又需要产仔的同步性以及足够的产乳量，此方法尚难以满足生产 需要。因此目前大熊猫全人工或人工辅助育幼面临的最大问题之就是如何提高幼 仔的免疫力。 7 国内外概况 目前，在人类以及动物如马、狗上，人们都曾研制出血液球蛋白以补充自身的 免疫球蛋白不足来增强对疾病抵抗力。在人，免疫球蛋白的替补疗法已成为一种常 规的手段，有人对1 5 例极低体重儿应用0 5 0 7 9 k g 体重静脉注射人血球蛋白，可 以起到明显的防止感染作用，却无明显的副作用。对体重小于1 5 0 0 9 ，胎龄小于3 4 周的高危新生儿，每月应用o 5 9 k g 体重免疫球蛋白预防，其感染的发生率、败血 症发生率和病死率均较未应用预防组有明显的减低。有人提出大熊猫初生幼仔类似 于人类的早产儿，王成东等检测了大熊猫血液及乳中免疫球蛋白种类与含量，华盛 顿国家动物园r i c h a r d j 等采用电泳技术检测了初生大熊猫幼仔的血清，发现球蚤白 带较少，在注射了成年大熊猫血液中提耿的球蛋白后，其球蛋白带明显增多，但是 由于注射了大熊猫球蛋白的幼仔在子宫内已发生感染，大熊猫幼仔仅存活三天后死 亡。因此国内外目前尚无系统的关于注射用大熊猫血液球蛋白的研制与应用研究。 8 本研究的目的和意义 对大熊猫这一古老物种而言。，靠母乳哺育固然相当理想，它不仅含有幼仔生长 发育所需要的营养物质，而且还含有特异性的免疫物质，成为幼仔最早获得的被动 免疫。但事实证明，靠大熊猫初乳来哺育初生幼仔己远远不能满足育幼工作的需要， 将大大阻碍大熊猫圈养繁殖增加数量、扩大种群和延缓灭绝。为此有关学者进行了 诸多尝试，如给大熊猫幼仔口服人血球蛋白补充外源性抗体，补充山羊、猫、狗仞 乳，但都未收到预期效果。究其原因可能因为提供抗体的物种与大熊猫相比物种差 距太大，不同物种对不同疾病的易感性不同，因此用其它物种提供的抗体并不能对 大熊猫幼仔提供有效的保护。另一方面，比如采用人血球蛋白，本柬应肌注，但因 来源于异种蛋白，可能会导致过敏反应而只能口服，但是人血球蛋白在消化道中容 易被消化酶破坏而起不到应有的作用。因此采用同种抗体柬被动提高大熊猫幼仔的 免疫力成了唯一的选择。 在选择大熊猫的免疫添加剂的问题上，准备选用大熊猫血清来提供被动免疫用 的i g g ，因为提纯i g g 的过程对操作环境要求严格，在操作过程中可能由于条件的 变化或控制不严格而造成i g g 变性、污染等，血清处理过程中微量的药物残留对脆 弱的大熊猫幼仔可能都将是致命的。而且大熊猫血清量有限，目前的提纯i g g 的方 法并没有专门针对大熊猫的，还需要进行条件摸索，所以很容易造成对宝贵大熊猫 血清的浪费。在不充分了解大熊猫的血液生理生化机理以及生长发育机理的情况下， 应用大熊猫血清作为免疫添加剂是一个较好的选择，因为来自母亲血清中的除抗体 之外的其它物质，如自蛋白等通过肠道进入幼仔血液，可能也会对幼仔的某些机能 提供一定帮助。 本研究的目的是寻找与大熊猫母乳成分相似的代用乳饲喂幼仔，减少对幼仔脆 弱肠道的刺激，并提供足够的营养。目前在大熊猫的育幼实践中发现通过调整某些 奶粉的成份可以模拟大熊猫母乳成份。不同单位采用了不同配方，但是不清楚哪种 配方更接近大熊猫母乳，目前已经收集了相关配方，进行比较研究，以确定与大熊 猫母乳成分相似的代用乳配方。 选择合适的血清处理方法，在繁殖季节，在麻醉健康成年大熊猫进行采精和配 种时抽血，分离血清保存，并检测成年大熊猫和初生幼仔血清中各蛋白组成的含量， 确定以f f 清作为免疫添加剂的添d nt = j j 量，为大熊猫仞生幼仔实际应用血清制品以被 动提高大熊猫幼仔的免疫力做好前期准备。 试验一大熊猫初生幼仔肠道正常菌群的检测 1 试验目的 圈养条件下，大熊猫幼仔及亚成体易患腹泻，人t 孚l , f f ：养的个体以及脱离母乳 喂养进入亚成年生长期的个体，出于食物及环境条件改变，腹泻发病率更高，这与 不清楚大熊猫幼仔肠道f 常菌群组成情况有密切关系。特别是不了解仞生大熊猫幼 仔生长过程中肠道正常菌群的“演替”情况，对这一阶段萨确防治疾病、确保幼仔 成活等造成一定困难。 成都大熊猫繁育研究基地2 0 0 3 年繁殖的大熊猫由于母兽母性好、育幼经验丰富 且均为单胎，所以人工干预育幼少，几乎为全母亲育幼。幼仔可以说是在人工圈养 条件下所能达到的最好的育幼条件下生长的，这为我们研究初生幼仔肠道正常菌群 提供了很好的机会。 本试验的目的就是检测大熊猫初生幼仔肠道f 常菌群的组成及建立过程，为今 后评价新的代用乳效果和腹泻病的诊断打下基础。 2 材料方法 2 1 供试动物 成都大熊猫繁育研究基地2 0 0 3 年出生的3 只幼仔，健康，采样i 口未迸行过抗生素 处理，主要食物为母乳。 2 2 标本采集 用无菌器械采集幼仔粪便后，立即放入预先消毒灭菌、称重、装有i m l d h 7 4 硫 1 4 乙醇酸盐( 0 1 5 硫代乙醇酸钠，0 1 1 磷酸氧二钠，0 i 氯化钠，00 0 9 氯化钙) 转 运r 勺塑料离心管中，振摇均匀，称重，计算标本的蓐量。直刻拿到实验室进行检 验。每只幼仔自出生后每天取样，但由于是母兽疗幼，所以母兽会舔拭幼仔肛周刺 激排便并吃食幼仔粪便，所以不可能每灭在从母兽处墩出时都采集到粪样。 2 3 培养基 b l o o dh e a r t i n f u s i o f i ( b h i ) 培养基，麦康凯琼脂平皿、乳杆菌培养基等，以 上培养基均为商品化成品。 2 4 微生物培养及鉴定 2 4 1 微生物培养 根据称重结果将待检粪便用生理盐水稀释成1 0 。稀释度，从中取0 i m 加o 9 m l 尘理赫水稀释摇匀此为l o 。稀释度，此方法连续稀释到直至l 0 “。 用滴点法接种于r h t 培养基上( 4 8 滴m ) ，每份样品，每个浓度接种：3 滴。以上操 作均在无菌条件下完成。3 7 。c 下倒置培养4 8 h 。培养后根据菌落的外观、颜色等进行 初步鉴定，然后再分别接种到麦康凯、乳酸卡t 菌培养基等专性培养基上培养。后根 据初步具体的检测结果将部分稀释液直接滴点接种于不同专性培养基上进行培养。 其中麦康凯平皿培养需氧下3 54 c 培养2 4 h ，乳杆菌菌培养基为厌氧3 7 。c 培养4 8 h 。 2 4 2 细菌的形态学鉴定 取出培养皿，观察各培养基上菌落生长情况，挑选相同菌落进行计数、染色， 生化鉴定按伯杰氏细菌鉴定手册( 第九版) 及- - 般细菌常用鉴定方法进行。 3 结果 检测结果见附表。 从检测结果可以看出：l 、初生大熊猫幼仔肠道中菌群以大肠埃希氏菌、粪链球 菌为主，1 开龄幼仔的粪便中检测到了大肠埃希氏菌和表葡萄球菌，2 r 龄时即可检 测到粪链球菌。从整个检测结果可以看出表皮葡萄球菌可能为环境污染，办或因为 母兽舔拭幼仔从而使幼仔肛周或排便时带有表葡菌，而非幼仔肠道内的菌群。2 、卜3 5 闩龄大熊猫幼仔肠道中的优势菌为大肠埃希氏菌、粪链球菌。这期间粪便中菌群较 为单纯，基本没有什么变化，在2 5 闩龄时爿检n n - 卡t 菌，但也是微量。3 、应用抗 生素使幼仔肠道内菌群完全消失。在6 天后可检测到大肠埃希氏菌，但与其它幼仔相 比，菌群组成中比较单一，没有粪链球菌。 4 讨论与分析 1 、在】1 龄的大熊猫幼仔粪便中即州检测到大肠埃希氏菌，其丽群米源。叮能为 母兽怀抱幼仔不停舔拭，从而使口腔中细菌进入幼仔消化道：也口j 能因为幼仔在母 兽怀抱中时或吃食初乳时环境中的细菌进入口腔从而进入消化道。幼仔粪便中的菌 群组成很单一，以大肠埃希氏菌为主，粪链球菌次之，这与以前关r 成年大熊猫和 大熊猫幼仔肠道f 常菌群的报道相似( 张志和、何光昕1 9 9 5 ，1 9 9 7 ：) 。在2 5 同龄后 出现乳杆菌，但含量很低，此后又进行了不定期的检测，发现在此后较长f i e f j 内( f i o d ) 除去有时可检测到表皮葡萄球菌、萘瑟氏菌等过路菌外，粪便菌群组成基本没有变 化。在整个试验中一直没有发现双歧杆菌，这与文献所报道幼仔肠道菌群以双歧杆 菌为最优势菌不同( 张志和、何光听，1 9 9 7 ) ，原因不清楚。而且厌氧菌含量虽然后 来有所增长，但不是主要的组成部分，这与成年大熊猫肠道中需氧菌检出量及检出 率相对较高，而厌氧菌的种类及数量相对较少相吻合( 张志和，1 9 9 5 ) 。 2 、微生念学研究表明，尽管人和动物胃肠道l f 常菌群的原籍苗及需氧菌和厌氧 菌的比例有一定的差异，但其中9 5 以j i 的细菌为生理性号性厌氧菌( 魏曦，1 9 8 5 ； 康白，1 9 8 8 ) ，但本试验中大熊猫仞尘幼仔肠道中菌群组成却不同，排除系统和偶然 误差，客观上可能这就是大熊猫该f 1 龄段的肠道菌群的特点，也可能与其消化道短， 进食频繁、肠道蠕动快等原因有关。 3 、从微生态学角度出发，f 常情况下处于微生念平衡之中的正常菌群成员是不 致病的，但不利的内外环境因素破坏了生态平衡，造成其中一种或数种菌优势繁殖， 则成为致病菌( 条件性致病菌) ：或使其中数量少，但f 常情况下因其它微生物的拮 抗或机体免疫屏障等方面的作用不足以致病的致病菌大量生长繁娘，电可引起机体 发病。本试验中采集到一只幼仔( 6 同龄) 在应用抗生素后的粪便，经培养无细菌生长， 证刚抗生素己将肠道内的菌群全部杀灭，在6 d 后采集粪便再做培养，仅发现大肠埃 希氏菌，与相似同龄的其它幼仔相比组成较单一，证明肠道内菌群在被全部杀灭后 重新慢慢建立起来。对人及动物的大量研究已经证实，菌群失调是某些疾病特别是 腹泻病的本质病因，在圈养条件下大熊猫办是如此，腹泻病列大熊猫幼仔的威胁尤 其大( 仇秉兴，1 9 8 4 ；冯文和等，1 9 8 7 ：胡锦矗，1 9 8 8 ；钟顺隆等，1 9 9 3 ) 。肠道菌 群的建立与个体、遗传、环境、食物等因素有关，所以在应用抗生素后菌群被严重 破坏，在重新建立菌群的过程中难免会因食物组成、食量、环境等的改变而造成某 些菌群的失调从而导致腹泻等疾病。对初生幼仔建矗k 期的肠道埔群峪测制度，尤 其足在试用新的食品配方或 = r 4 喂力式时这种制度刈f 幼和疾病珍断虹具有重要意 义。在抗生素的应用上，应根据各病的具体情况选择弄目应敏感抗生素，以免造成肠 道菌群被大部分或全部破坏从而加大菌群失调的危险。 4 、影响f 常菌群的因素很多，除技术、遗传、食物等因素外，同龄及采样时削 与测定结果密切相关。在一般情况卜，大熊猫母兽哺育时常常将幼仔粪便舔食掉， 且幼仔排便时i 刈不固定，多导致无法采样，使同龄及采样时| h j 刈测定结果的影响无 法控制，致使试验定量检测结果的波动较大。如果条f t ：允许还应扩大试验样本数， 并对菌群定位等作进一步研究。 附表：检测结果 备注：表示没检测山。十为6 曰龄时所检测的样本冈为在取样的前一大发生腹泻麻删抗 e 素治疗，经检测粪便中无细菌。12 曰龄检测的是与6 日龄时检测的同一只幼仔。 试验二大熊猫代用乳的选择 1 试验目的 为了能配制出与母乳成分尽可能千目似的人： 乳，使大熊猫幼仔可以从人工乳中 获得生长所需的营养并狭得举强免疫力，国内外的大熊猫研究人负对大熊猫乳汁成 分作了一定的研究，对大熊猫乳汁成分有了一定的了解，但山于所能得到的用于研 究的乳样的量比较少，实验得不到重复，得出的结论受个体差异，采样时问等具体 因素的影响，很难当作权威结论来应用，但这些研究也为人工乳的配制打 f 了一定 的基础。目自h 可以肯定的是大熊猫乳的成分与几种常见乳差异还是比较大，如表1 表l 儿种常见乳与人熊猫乳营养成分的比较( w ) t a b l e lc o m p a r i s a t i o no f n u t r i t i o n a lc o m p o s i t i o n ga m o n gc o m m o nm i l k sa n dg i a n tp a n d am i l kf w 、 乳样 w a t a t c pe el a ca s hc apg e 人熊猫( g i a n tp a n d a ) 8 4 3 50 873 3 10 7o 8 90i 2 40 1 0 51 0 1 人熊猫( g i a n tp a n d a ) 70 5 o 2 9 8 8 2 人h u n m a n i i58 1349 l0 0 2 3 30 0 1 151 0 l 成都麻芋g o a t 5 2 966 64 0 30 1 6 0 12】0 2 狗d o g 7 5 41 l ，29 63 10 7 303 2 502 2 21 6 4 奶牛c o w 8 723 5374 907 l0 1 2 10 0 9 57 5 引口刘选珍( 1 9 9 6 ) 黑熊( s e l e n a r c t o st h i b e t a n u s ) 与大熊猫均属食肉目熊超科的物种，但对大熊猫与熊 科物种间的亲缘关系及其分类地位仍有众多争议。o b r i e n 等( 1 9 8 5 ) 根据对大熊猫 和熊科物种的染色体( 包括x 染色体在内) g 带带型分析，并结合分子方面的证据， 认为人熊猫介于熊和浣熊之b j ，更接近熊。：e 希成等( ) 9 8 8 ) 从免疫学角度探讨火熊 猫的亲缘关系，认为大熊猫与黑熊更接近。 黑熊与大熊猫的初生幼仔部十分弱小，且生长发育在初期相当长段时阳j 都依 赖母乳。可能二者的乳中都富含某些对发育不成熟幼仔的生长发育有帮助的因子。 国外对黑熊、北极熊等熊的乳汁进行过研究，发现其乳汁成分与大熊猫有定的相 似性，如乳糖含量相对较低，蛋白含量高( o l a v e ，1 9 9 3 ) ，以及认为乳中某些特殊结 构的寡糖对免疫功能有一定的刺激作用等( t a d a s u ，2 0 0 0 ；t a d a s h i ，2 0 0 0 ) 。综上所述， 我们有必要把黑熊乳当作- i 中考虑的代用乳选择，并在前人研究工作的基础上，更加 深入的分析大熊猫与黑熊初乳及常乳的成分，对比二者的相似性及区别。 同时，综合国内外专家针对大熊猫的研究，以及国内外对大熊猫人工育幼的实 践经验，我们得到其它l 个大熊猫人工乳的配方。如北京动物园报道的在初乳期( 出 生后1 3 天) 哺喂幼仔人t 乳，取得较好效果，初乳期人工乳基础配方为熊猫奶粉 ( p a n d am i l k ) ：狗初乳= 1 ：1 ( 质量比) ：还有圣迭哥动物园的配方：狗奶f , a ( g s b i l a c p o w d e r ) ：人婴儿奶粉( e n f a m i lp o w d e r ，l o w i r o n ) ：水= l ：1 ：6 ( 体积比) ；以及基r 成都 大熊猫繁育研究基地现用配方所做的修改：l l i 羊仞乳：熊猫奶粉( p a n d am i l k ) ：去离 子水= 3 ：1 ：6 ( 质量比) ，分别记为人工乳i 、人i 乳2 、和人工乳3 。 本试验的目的在于，分析现有配方以及