（免疫学专业论文）基于基因免疫抗hcgβ单克隆抗体的制备及其抗肿瘤活性的研究.pdf

目录 中文摘要1 英文摘要5 前言9 第一部分基于基因免疫抗h c g p 单克隆抗体的制备和生物学特性鉴定 材料和方法1 l 结果1 5 讨论2 5 第二部分具有抗肿瘤活性的抗h c g p 单克隆抗体的筛选 材料和方法2 8 结果3 0 讨论3 6 第三部分6 h 1 单克隆抗体的抗肿瘤作用及其机制 材料和方法3 9 结果4 1 讨论4 9 小结5 2 参考文献5 3 附录5 8 致谢5 9 文献综述6 0 基于基因免疫抗h c g l 3 单克隆抗体的制备及其抗肿瘤活性的研究 关键词：人绒毛膜促性腺激素d 亚基；单克隆抗体；细胞毒作用；凋亡 中图分类号：r 3 肿瘤生物治疗是继手术治疗、放射治疗和化学药物治疗之后新型的肿瘤治疗手 段，其中，针对肿瘤抗原物质而研制的单克隆抗体( m o n o c l o n a la n t i b o d y , m a b ) 是目前 肿瘤生物治疗的热点之一。抗原抗体反应的特异性决定了针对肿瘤特异性靶抗原的 m a b 会优先与相应的肿瘤组织结合，而不识别正常的组织。单克隆抗体不仅可以通 过a d c c 及c d c 等免疫效应机制发挥抗瘤作用，还可以直接诱导肿瘤细胞凋亡，并 可偶联放疗化疗药物从而降低药物对正常组织的非特异损伤，减少治疗的副作用。 单克隆抗体正是以其敏感性和特异性成为众所瞩目的肿瘤治疗方法。 自g a i l a n i 等报道非滋养层肿瘤细胞异位表达人绒毛膜促性腺激素( h u m a n c h o r i o n i cg o n a d o t r o p h i n ，h c g ) 以来，肿瘤细胞表达的异位h c g ( e c t o p i c eh c g ，e h c g ) 与肿瘤发生、发展的关系受到人们关注。根据文献报道及我们前期的研究结果证实， 许多不同类别和组织来源的肿瘤细胞都能不同程度地表达e h c g 。肿瘤细胞自分泌的 e h c g 具有生长因子活性，能促进和调控肿瘤细胞的增殖、分化和生长，使肿瘤细胞 在其微环境中能自我生长；膜结合型e h c g 使肿瘤细胞表面呈负电荷，推测可能与 肿瘤的转移特性、免疫耐受等有一定的关系，因而，e h c g 可以作为m a b 生物治疗 理想的靶抗原。 本实验室曾构建h c g d 肿瘤基因疫苗的真核表达载体t r 4 2 1 e h c g l 3 ，可以在小 鼠体内诱生较强的特异性针对h c g l 3 的体液免疫反应，我们发现由该基因疫苗诱导的 多克隆抗h c g l 3 1 血清可以在体外以补体非依赖的方式抑制h e l a 、h e p g 2 等肿瘤细胞 的增殖，并且抗h c g l 3 抗体的抗增殖活性与肿瘤细胞表达h c g l 3 的高低密切相关。为 了进一步研究抗h c g l 3 抗体对肿瘤细胞生物学功能的影响，本课题利用t r 4 2 1 h c g l 3 通过基因免疫手段免疫小鼠制备抗h c g l 3 单克隆抗体，鉴定其生物学特性，并从中筛 选具有抗肿瘤活性的单克隆抗体，分析其抗瘤效应，为基于h c g l 3 的肿瘤生物治疗寻 找新的途径。 第一部分基于基因免疫抗h c g 3 单克隆抗体的制备 一、t r 4 2 1 h c g ，基因免疫小鼠诱导产生特异性体液免疫应答 为制备抗h c g l 3 单克隆抗体，以t r 4 2 1 一h c g l 3 经肌肉免疫b a l b c 小鼠。采血收 集血清，检测各组小鼠血清中抗h c g l 3 抗体，结果显示：d n a 初次免疫后第1 0 天即 复旦大学t 海医学院 硕士论文 可检测出抗h c g p 特异性抗体，追加免疫后抗体的水平显著增高，特异性i g g 滴度 达1 ：1 0 4 ，在初次免疫后第4 周再次增强免疫，抗体水平继续升高，而且各免疫小鼠 的抗体上升水平趋向一致，以上结果提示t r 4 2 1 - h c g p 基因免疫小鼠可诱生特异性 体液免疫应答。为下一步成功高效的进行免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合奠定了 基础。 二、特异性分泌抗h c g i b 单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立 为获得特异性分泌抗h c g 3 单克隆抗体的杂交瘤细胞，取抗体效价最高的小鼠脾 细胞与s p 2 0 细胞融合，在8 块9 6 孔板中，共有3 4 0 孔可见明显杂交瘤细胞生长， 融合率为4 5 。随后，对已融合的杂交瘤细胞进一步检测其是否分泌特异性抗h c g d 抗体，e l i s a 结果显示：1 a 1 1 、2 e 9 、2 g 7 、2 h 3 、3 c 2 、3 f 2 、4 c 6 、4 g 7 、5 c 5 、 5 d 5 、6 h 1 、7 a 3 、7 a 8 、8 d 4 、8 f 1 初步检测到有特应性抗体产生。对筛选阳性孔进 行有限稀释法克隆和上清筛选，经过三次亚克隆，共获得9 株分泌特异性抗h c g 3 单抗的杂交瘤细胞，分别命名为l a l l 、2 e 9 、2 g 7 、3 c 2 、5 c 6 、5 d 5 、6 h 1 、7 a 8 和 8 f 1 。染色体核型分析显示所有获得的杂交瘤细胞株染色体数目均在9 0 条以上，将 杂交瘤细胞经体外连续传代培养，液氮冻存半年后复苏，仍生长良好，持续稳定分 泌抗体，证明9 株杂交瘤细胞株已成功建立。 三、抗h c g d 单克隆抗体的基本生物学特性鉴定 为证明所获得的单克隆抗体可以特异性识别h c g 3 分子，用免疫印迹法( w e s t e r n b l o t ) 鉴定抗体与h c g 3 分子的特异性结合，结果显示：9 株单克隆抗体印染的p v d f 膜在h c g 3 的位置上出现了特异性的染色条带，大小为3 0 k d 左右，与文献报道的人 h c g 3 分子量相符合，证实获得的单克隆抗体均可以特异性识别真核细胞表达的 h c g 3 蛋白。应用间接免疫荧光证实，9 株单克隆抗体可以不同程度识别h e l a 细胞、 h e p g 2 细胞和h l 6 0 细胞上表达的膜型h c g 3 分子。同时应用间接e l i s a 确定其亚 型，1 a 1 l 、2 e 9 、5 d 5 和7 a 8 亚型为i g g l ，2 g 7 、3 c 2 和6 h 1 亚型为i g g 2 a ，5 c 6 和8 f 1 的亚型为i g g 2 b 。 第二部分具有抗肿瘤活性的抗h c g b 单克隆抗体的筛选 一、具有抗肿瘤细胞增殖活性的抗h c g p 单克隆抗体的筛选 在筛选具有抗肿瘤细胞增殖活性的单克隆抗体之前，我们对本实验中通过基因 免疫获得的多克隆抗血清进行了功能鉴定。肿瘤细胞体外增殖结果显示： t r 4 2 1 - h c g b 质粒免疫血清( 1 ：1 0 稀释) 相对于正常血清对h e l a 细胞和h e p g 2 细胞增 2 复- 日人学上海医学院硕士论文 殖有明显的抑制作用( p 0 0 5 ) 。灭活补体后的免疫血清对细胞增殖的仍然有较显 著的抑制作用，提示：抗h c g 3 多克隆抗体对h c g 3 阳性肿瘤细胞具有明显抑制作用， 且该作用不依赖补体。为检测第一部分中制备的抗h c g 3 单克隆抗体是否同样抑制肿 瘤细胞的体外增殖活性，我们通过检测杂交瘤细胞的培养上对h e l a 细胞增殖的影 响，发现：6 h 1 杂交瘤细胞培养上清与h e l a 细胞共孵育4 8 小时后，抗体处理组活 细胞数占未处理组细胞数的8 1 6 7 + 7 6 3 ，提示6 h 1 能够抑制体外培养的h e l a 细 胞的增殖。 二、6 h 1 单克隆抗体的制备纯化及基本特性鉴定 为进一步对6 h 1 单克隆抗体的抗肿瘤效应进行分析，我们采用体内法收集小鼠腹 水，制备高效价高纯度的6 h 1 单克隆抗体，腹水产生的阳性率为8 0 ，收获量平均5 m l 只，腹水抗体效价达l ：1 0 6 。腹水经预处理后经p r o t e i ng 亲和层析柱纯化，用 s d s p a g e 电泳鉴定纯度达到9 0 以上。e l i s a 鉴定纯化6 h 1 单克隆抗体可以特异性 的结合h c g ，同时与h l h 或f s h 无交叉反应性。f a c s 检测结果显示：7 株肿瘤细胞表 达的膜结合型h c g 可以不同程度的被纯化6 h 1 单抗识别并结合。间接免疫荧光染色进 一步证实，6 h 1 单抗能够特异性的识别h e l a 细胞表达的具有天然构象的膜型h c g l 3 分子。 第三部分6 h 1 单克隆抗体的抗肿瘤作用及其机制 一、6 h 1 在体外抑制肿瘤细胞增殖 为观察纯化的抗h c g l 3 单克隆抗体6 h 1 对肿瘤细胞增殖活性的影响，选择天然高 表达h c g l 3 的人h e l a 细胞作为靶细胞，检测纯化6 h 1 抗体孵育细胞的增殖活性。结 果证实，6 h 1 与h e l a 细胞共孵育后显示有明显的细胞毒作用，并且呈剂量依赖性， 当6 h 1 以浓度1 6 0 i _ t g m l 作用时，h e l a 细胞生长抑制率达5 8 。随着孵育时间的延 长，6 h 1 对细胞生长的抑制效应也趋明显，呈时间依赖性。为进一步观察纯化的抗 h c g l 3 单克隆抗体6 h 1 对其他表达h c g 3 的肿瘤细胞增殖活性的影响，选择其他表达 h c g l 3 的人肿瘤细胞系h l 6 0 、k 5 6 2 、h e p g 2 、7 7 2 1 、p c 3 以及s k o v - 3 作为靶细 胞，以不表达h c g l 3 的e c v - 3 0 4 细胞为对照，检测纯化6 h 1 抗体孵育细胞的增殖活 性。结果显示，除h e l a 细胞外，h l 6 0 、h e p g 2 、7 7 2 1 和p c 3 不同程度的对6 h 1 单克隆抗体的细胞毒作用敏感，而k 5 6 2 和s k o v - 3 细胞活度没有明显变化。 二、6 h 1 在体内抑制肿瘤生长 复旦火学上海医学院硕l 论文 为进一步验证6 h 1 单克隆抗体对h e l a 细胞存在细胞毒作用，我们进行裸鼠体 内肿瘤攻击实验。将裸鼠皮下种植h e l a 细胞肿瘤后进行抗体干预，每周测量肿瘤大 小及并记录荷瘤小鼠的生存周期的变化。结果显示：荷瘤后第2 8 天，6 h 1 处理组肿 瘤平均体积为1 7 6 c m 3 ，分别与对照抗体处理组3 4 1 c m 3 、p b s 处理组3 6 3 c m 3 相比， 差异有统计学意义( p 0 0 1 ) 。同时监测荷瘤小鼠的生存周期，p b s 对照、对照抗体 处理小鼠的平均生存期分别为3 0 和3 7 天，而6 h 1 处理组的小鼠直至第4 8 天，仍有 1 0 0 的存活率，小鼠平均生存期为7 7 天。证明6 h 1 单克隆抗体可以抑制体内h e l a 细胞的生长。 三、6 h 1 单克隆抗体诱导肿瘤细胞凋亡 为探讨6 h 1 单克隆抗体对肿瘤细胞增殖的抑制效应的作用机制，相差显微镜下 观察6 h 1 孵育4 8 h 的h e l a 细胞形态，结果发现，与6 h 1 抗体共孵育的h e l a 细胞 与对照相比，部分细胞体积变小，表面无光泽，变圆，细胞表面突起多个小球状的 凋亡小体，提示：6 h 1 能诱发h c g l 3 f f l 性肿瘤细胞活力下降甚至凋亡，h c g l 3 阳性肿 瘤细胞增殖活性下降可能与其有关。h o e c h s t3 3 2 5 8 染色试验进一步从形态学上提示： 6 h 1 单克隆抗体可以诱导h e l a 凋亡。收集6 h 1 作用的h e l a 细胞，抽取细胞总d n a 进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示：与正常对照组细胞基因组d n a 相比，6 h 1 作用的 h e l a 细胞d n a 呈明显的l a d d e r ，提示有凋亡细胞的存在。对6 h 1 处理的h e l a 细 胞进行a n n e x i nv p i 双染，f a c s 检测结果显示：6 h 1 单克隆抗体作用4 8 小时后， 显示早期凋亡信号( a n n e x i nv 们i _ ) 的h e l a 细胞数量( 9 4 6 ) 明显多于对照抗体组 ( 0 8 0 ) ，晚期凋亡细胞( a n n e x i nv + p i + ) 数量( 4 5 5 ) 也明显多于对照组( o 7 1 ) ，坏死 细胞( a n n e x i nv - p i + ) 数量也较对照组有部分增加。说明6 h 1 单克隆抗体可以通过引 起肿瘤细胞凋亡介导其抗肿瘤作用。 综上所述，本课题基于基因免疫原理，运用经典的b 细胞杂交瘤技术，获得了 9 株持续稳定分泌特异性抗h c g l 3 单克隆抗体的杂交瘤细胞株，这些单克隆抗体可以 特异性结合肿瘤细胞表达的h c o l 3 分子。通过对这些单克隆抗体进行生物学功能的筛 选，我们发现6 h 1 单克隆抗体可以在体外抑制h e l a 细胞的增殖，通过进一步的实 验证明，6 h 1 对h c g l 3 j 日性的肿瘤细胞株有比较显著的细胞毒作用，并具有体内抑瘤 活性。通过对凋亡相关指标的监测，我们证明6 h 1 可以通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥 其体内外抗肿瘤效应。本研究为今后h c g l 3 表达阳性的肿瘤的防治提供了新的途径， 并可进一步对这株抗体进行人源化改造，因而具有潜在的实用价值；同时，本研究 提示肿瘤表达h c g l 3 分子可能与肿瘤的增殖或抗凋亡特性相关，也为深入研究肿瘤异 位表达的h c g l 3 与肿瘤生物学特性之间的关系提供了新的思路。 4 复旦人学上海医学院 硕上论文 a b s t r a c t g e n e r a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fa n t i h c g bm o n o c l o n a la n t i b o d y b a s e do ng e n e t i ci m m u n i z a t i o na n da n a l y s i so fi t sa n t i - t u m o ra c i t v i t y k e yw o r d s ：h u m a nc h o r i o n i cg o n a d o t r o p h i nd ；m o n o c l o n a la n t i b o d y ；c y t o t o x i c i t y ； a p o p t o s i s c l a s s i f i c a t i o n ：r 3 t u m o rb i o t h e r a p yi san e w l yd e v e l o p e ds t r a t e g yb e s i d e ss u r g e r y , r a d i o t h e r a p ya n d c h e m o t h e r a p y m o n o c l o n a la n t i b o d y ( m a b ) t a r g e t e dt u m o ra s s o c i a t e da n t i g e nh a sb e e n p a i dm u c ha t t e n t i o nn o w a d a y s t u m o rt i s s u ec a nb er e c o g n i z e db ys p e c i f i c m a b t h e c y t o t o x i c i t yo fm a bo nt u m o rc e l l si sn o to n l yt h ee f f e c to fa d c c o rc d c ，b u ta l s ot h e a p o p t o s i s i n d u c i n ge f f e c t t h es e n s i t i v i t ya n ds p e c i f i c i t yo fm a b m a k e si tap r o m i s i n g a p p r o a c hf o rt h et r e a t m e n to f c a n c e r h u m a nc h o r i o n i cg o n a d o t r o p h i n ( h c g ) ，ag l y c o p r o t e i nh o r m o n es e c r e t e db yf e t a l s y n c y t i o t r o p h o b l a s t i np r e g n a n tw o m a n ，p l a y sa i li m p o r t a n tr o l ei nm a i n t a i n i n gt h e f u n c t i o no fl u t e i na n di n h i b i t i n gf e t a lr e j e c t i o nb ym o t h e r m u c ha t t e n t i o nh a db e e np a i d t ot h em l m i o nb e t w e e ne h c ga n dt u m o rs i n c eb r a u n s t e i na n dh i sc o l l e a g u e sr e p o r t e dt h a t e c t o p i ch u m a nc h o r i o n i cg o n a d o t r o p h i nw a se x p r e s s e d i ns y n c y t i o t r o p h o b l a s tt u m o rc e l l s a n dn o n s y n c y t i o t r o p h o b l a s tt u m o rc e l l s a c c o r d i n gt oo u rp r e v i o u sr e s e a r c ha n do t h e r s s t u d i e s ，e h c gw a se x p r e s s e di nm a n yk i n d so ft u m o r s i t i s i n t r i g u i n gt h a tt h e h c g a l 3d i m e rs e c r e t e db yt u m o rp e r f o r m st h ef u n c t i o no fg r o w t h f a c t o rt h a te n h a n c e sa n d r e g u l a t e st h ep r o l i f e r a t i o n , d i f f e r e n t i a t i o na n dg r o w t ho ft u m o rc e l l s ，s ot h a tt h et u m o r c e l l sc a ng r o wi nm i c r o e n v i r o n m e n ta u t o n o m o u s l y m o r e o v e r ，t h ee x p r e s s i o n o f m e m b r a n e a s s o c i a t e de h c g , c o n t a i n i n gs i xo l i g o s a c c h a r i d es i d ec h a i n sw i t hn e g a t i v e c h a r g e ，m a d et h et u m o rc e l l ss u s c e p t i b l et os i a l y a t i o n ，w h i c hm a y r e l a t et ot h ei m m u n e a n e r g yo ri m m u n et o l e r a n c e t h e r e f o r e ，e h c gc a n b eu s e da sa ni d e a lt a r g e tt u m o ra n t i g e n t od e v e l o pn o v e lm o n o c l o n a la n t i b o d i e sf o rc l i n i ci m m u n o t h e r a p yf o rt r e a t m e n to f t u m o r a sm e n t i o n e da b o v e ，w eh e r es e l e c te h c g f l a sat a r g e ta n t i g e nt o g e n e r a t e m o n o c l o n a la n t i b o d i e sa n ds t u d yi t sp o t e n t i a la n t i - t u m o ra c i t i v i t y p a r thg e n e r a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fa n t i - h c g pm o n o c l o n a la n t i b o d i e s b a s e do ng e n e t i ci m m u n i z a t i o n 5 复旦大学j ：海医学院硕士论文 1 s p e c i f i ca n t i b o d yr e s p o n s e si n d u c e db yt r 4 2 1 - h c g p i m m u n i z a t i o n b a l b cm i c ew e r ei n t r a m u s c u l a r l yi m m u n i z e dw i t ht r 4 21 - h c g l 3p l a s m i dd n a s e r aw e r ec o l l e c t e da tt h ei n d i c a t e dt i m e sf r o mt h ei m m u n i z e d - m i c ea n dt h el e v e l so f a n t i h c g l 3a n t i b o d yw e r ed e t e r m i n e db ye l i s a t h er e s u l t ss h o w e dt h a t a l lm i c e i m m u n i z e dw i t i lp l a s m i dt r 4 21 - h c g l 3d e v e l o p e dh i g hl e v e l so fa n t i h c g l 3a n t i b o d y o n ew e e kl a t e r t h eb o o s t e ri m m u n i z a t i o nw i t ht r 4 21 h c g l 3a c c e l e r a t e dt h el e v e l so f s p e c i f i ca n t i b o d y , w h o s et i t e rw a s1 ：10 4 b o o s t e ri m m u n i z a t i o nw a sp e r f o r m e da g a i n4 w e e k sa f t e rt h ef i r s ts h o t ，w i t ht h el e v e l so fs p e c i f i ca n t i b o d yr i s i n gm o r ed r a m a t i c a l l y t h e s er e s u l t s s u g g e s t e dt h a tt h es p e c i f i ca n t i b o d yr e s p o n s e sh a db e e ni n d u c e db y t r 4 21 h c g l 3g e n ei r m n u n i z a t i o n 2 e s t a b l i s h m e n to fh y b r i d o m ac e l l ss e c r e t i n gs p e c i f i cm o n o c l o n a la n t i b o d i e s t og e n e r a t eh y b r i d o m ac e l ll i n e s s e c r e t i n ga n t i - h c g 3m o n o c l o n a la n t i b o d i e s ， s p l e n o c y t e sf r o mm o u s ew i t hh i g h e s ta n t i b o d yt i t e rw e r ea d o p t e dt of u s ew i t hs p 2 0 c e l l si np e g f u s i o ne f f i c i e n c yw a s4 5 a f t e rr e p e a t e dl i m i t e dd i l u t i o n sa n d s u b c l o n i n g sw e r ep e r f o r m e do nt h ei n d i c a t e dh y b r i d o m ac e l l s ，9s t r a i n so fh y b r i d o m a ( n a m e d1 a 1 1 ，2 e 9 ，2 g 7 ，3 c 2 ，5 c 6 ，5 d 5 ，6 h 1 ，7 a 8a n d8 f 1r e s p e c t i v e l y ) 。s e c r e t i n g a n t i h c g l 3m o n o c l o n a la n t i b o d ys p e c i f i c a l l ya n ds t a b l yw e r eo b t a i n e d t h eh y b r i d o m a c e l l sg r e ww e l la f t e rl o n g - t e r ms t o r a g ei nl i q u i dn i t r o g e n 3 c h a r a e t e r i z a t i o no fa n t i h c g l bm o n o c l o n a la n t i b o d i e s f o ra n a l y s i so ft h ec h a r a c t e r i s t i co ft h em a b s ，w e s t e r n - b l o ta n a l y s i sc o n d u c t e dt o d i s c e r nt h es p e c i f i cr e c o g n i t i o no fm a b sw i t hh c g l 3m e m b r a n ep r o t e i n s r e s u l t s s h o w e dt h a tm a b s ( h y b r i d o m as u p e r n a t a n t s ) c o u l ds p e c i f i c a l l yr e c o g n i z eh c g l 3 f a c sa n a l y s i sw a sa l s op e r f o r m e dt os h o wt h eb i n d i n ga c t i v i t yo fm a b s ，w i t hh e l a ， h e p g 2a n dh l 6 0a st h et a r g e tc e l l s r e s u l t si n d i c a t e dt h a tm e m b r a n ef o r mo fh c g l 3 c o u l db er e c o g n i z e db ym a b s s u b c l a s s e so fm a b sw e r ed e t e r m i n e du s i n ge l i s a p a r ti i ：s c r e e n i n ga n dc h a r a c t e r i z a t i o no fa n t i - h c g l m o n o c l o n a la n t i b o d i e sw i t h a n t i - t u m o ra c t i v i t y 1 s c r e e n i n go fa n t i h c g l 3m o n o c l o n a la n t i b o d i e sw i t ha n t i t u m o ra c t i v i t y s e r u mf r o mt r 4 21 一h c g l 3i m m u n i z e dm o u s ei n h i b i t e dp r o l i f e r a t i o no fh e l aa n d h e p g 2 c e l l ss i g n i f i c a n t l y ( p 0 0 5 ) ，i nc o n t r a s tw i t hn o r m a ls e r u m t h es e r u mw i t h o u t 6 复且人学上海医学院硕上论义 c o m p l e m e n ts t i l ls h o w e da no b v i o u sr e d u c t i o no nc e l lp r o l i f e r a t i o n w h i c hi n d i c a t e d t h a t p o l y c l o n a la n t i - h c g l 3s e r u m c o u l di n h i b i th c g l 3p o s i t i v et u m o r s g r o w t h i n d e p e n d e n to ft h ee x i s t e n c eo fc o m p l e m e n t t os c r e e nt h em a b sw i t ha n t i - t u m o r e f f e c t s ，s u p e m a t a n t sf r o mt h eh y b r i d o m ac e l lc u l t u r e sw e r ec o l l e c t e da n da n a l y z e df o r t h ea b i l i t yt or e d u c et h eg r o w t ho fh e l ac e l l s r e s u l t ss h o w e dt h a tt h en u m b e ro f h e l ac e l l si n c u b a t e dw i t h6 h1r e d u c e dt o81 6 7 7 6 3 ( n = 3 ) o ft h en u m b e ro f u n t r e a t e dc e l l s ，i n d i c a t i n g6 h1m i g h th a sap o t e n t i a la b i l i t yt oi n h i b i tt h ep r o l i f e r a t i o no f t u m o rc e l l s 2 p u r i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no f6 h 1m o n o c l o n a la n t i b o d y f o rl a r g e - 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