Claudin_1_2_3_4在胃癌中的表达VIP

通信作者Claudin 1、2、3、4在胃癌中的表达刘志勇，欧阳忠赣南医学院第一附属医院血管乳腺科 ( 江西赣州 341100)【摘要 】 目的 探讨Claudin 1、Claudin 2、Claudin 3 及Claudin 4在胃癌组织中的表达及意义。方法选取手术切除的胃癌患者72例，术后均经病理证实为胃癌，且未合并其他肿瘤疾病，应用免疫组化ABC法检测胃癌手术标本中Claudin 1、Claudin 2、Claudin 3 和 Claudin 4 的表达。结果 Claudin 2 的表达率为73. 6%，Claudin 4 的表达率为44. 4%。Claudin 1 在腺癌中的表达水平明显降低，Claudin 3、Claudin 4 在淋巴转移阳性中的表达更低，Claudin 3在T3、T4中的表达明显降低。Claudin 3与其他Claudin蛋白质具有显著相关性。在生存分析里，Claudin 4 与良好的预后有关。结论 Claudin 3 与 Claudin 4 可以作为胃癌的分子标志物，检测Claudin 3与 Claudin 4在淋巴侵袭中具有重要意义。【关键词 】 胃癌； Claudin 1； Claudin 2； Claudin 3； Claudin 4胃癌在全世界恶性肿瘤的发病率位居第 2 位 ， 在中国的发病率仅次于肺癌 1。对于肿瘤的进展与转移 ， 上皮间充质转化 ( epithelial to mesenchymal tran-sition) 包括紧密连接蛋白如 Claudin 或 E 钙黏蛋白的丢失与重排 ， 被认为是恶性肿瘤进展及触发机制最重要的原因 2。Claudin 是 24 种上皮紧密连接蛋白中的一种 ， 这些蛋白对于维持上皮组织的紧密连接具有重要作用 3。这些蛋白在很多组织中已被发现 ， 保持上皮组织的稳定 ， 并决定上皮组织是否容易被侵破 。在这些紧密连接蛋白中 ， Claudin 被认为是起关键作用的蛋白 ，并且已在人类各种细胞及组织中发现了它们的存在 ， 而且 Claudin 已被证实其对肿瘤的进展具有重要的影响 4。Claudin 蛋白家族中的 Claudin 1、Claudin 2、Claudin 3、Claudin 4 在人类组织中广泛表达 ， Clau-din 1 的表达与结肠癌不良预后有关 ， 并且其可导致乳腺细胞侵袭性增强 5， Claudin 2 被发现在胃癌组织中具有表达 6。Claudin 3、Claudin 4 被认为与恶性肿瘤的侵袭途径有关 7。研究显示 Claudin 在各种不同组织中的侵袭性有差别 ， 并且 Claudin 的具体生物学功能还没有被研究出来 ， 我们的研究旨在通过研究胃癌中 Claudin 1、Claudin 2、Claudin 3、Claudin 4的表达并阐述其临床意义 。1 资料与方法11 一般资料 选取赣南医学院第一附属医院 2008年 1 月至 2009 年 9 月手术切除的胃癌患者 72 例 ， 术后均经病理证实为胃癌 ， 且未合并其他肿瘤疾病 ， 包含不同类型的胃癌 。其中男 42 例 ， 女 30 例 ， 年龄 27 68岁 ， 中位年龄 48 6 岁 。组织学类型 : 肠型胃癌 34 例 ，弥漫型胃癌 31 例 。分化程度 : 高分化胃癌 3 例 ， 中分化胃癌 29 例 ， 低分化癌 40 例 。浸润深度 : T1期胃癌 6例 ， T2期 43 例 ， T3期 22 例 ， T4期 1 例 。上述各种分类为随机选取的胃癌 。根据其病理所进行的分类 ， 取距瘤体 5 cm 处的正常胃组织标本 。12 免疫组织化学染色方法 采用免疫组化 ABC 法进行检测 。单抗 Claudin 1、Claudin 2、Claudin 3、Claudin 4 为 Beckmancoulter 公司产品 。生物素标记的马抗鼠 IgG 与 ABC 试剂均为福州脉新公司的产品 。主要操作步骤如下 : 切片常规脱蜡至水 ， 经 3% 过氧化氢甲醛溶液室温孵育 10 min， 微波炉抗原热修复 ， 室温下冷却后 ， 10%养血清孵育 10 min， 加一抗 ， 4孵育 24h， 生物素标记的二抗室温下孵育 30 min， 滴加 SABC试剂 37 20 min。DAB 显色 ， 苏木素复染 ， 脱水 、透明 ， 中性树胶封片 ， 显微镜下观察 、照相 。每批染色均设阴性空白对照 ， 即以 PBS 代替一抗作阴性对照 。每份标本常规 HE 染色作对照 。13 结果判定 所有切片均经 2 名病理科医师在不知切片来源情况下阅片并判断 。经免疫组化染色后 ，除胞膜出现棕黄色颗粒的细胞外 ， 必须经高倍镜观察细胞形态 ， 当确定为癌细胞后方可判定为阳性 。在高倍视野下对含棕黄色颗粒的细胞进行计数 ， 计算阳性细胞所占百分比 。在每个视野下计数 100 个细胞 。Claudin 染色玻片阳性评定标准 : 以定位明确 ， 整个细胞膜呈棕黄色染色者为阳性 ， 而染色弱或完全不染色者为阴性 。每张玻片取 2 个视野 ， 取其平均数 。根据阳性细胞数不同可以分为 5 个等级 : 阳性细胞 5%为 0 级 、6% 25% 为 1 级 、26% 50% 为 2 级 、51% 75%为 3 级 、76% 100%为 4 级 。将 0 1 级记为阴性标本 ， 2 4 级记为阳性标本 。14 统计学方法 采用 SPSS 11. 0 统计软件 ， Claudin与临床病理之间的关系以 2检验进行分析 ， 生存分析采用 Kaplan Meier 分析 。2 结果21 胃癌中Claudin的表达 细胞为胞膜呈棕黄色颗粒 。Claudin 1、Claudin 2、Claudin 3 及 Claudin 4的表达见图 1。Claudin 2 具有高表达率 73. 6%，067广东医学 2013 年 3 月 第 34 卷第 5 期 Guangdong Medical Journal Mar 2013， Vol 34， No 5Claudin 4 的表达率较低仅 44. 4%。Claudin 1 表达率为 56. 9%， Claudin 3 为 51. 4%。22 Claudin的表达与临床病理特征的关系 根据胃癌 Cauren 分类法 ， Claudin 1 在胃腺癌中的表达明显降低 ， Claudin 3、Claudin 4 在淋巴转移阳性中的表达明显降低 ( P = 0. 01， P 0. 001) 。Claudin 1 在 M0期中的表达明显弱于 M0期 ， Claudin 3、Claudin 4 在T3、T4期的表达明显低于 T1、T2期 。见表 1。23 Claudin家族相互之间的关系 分析各种 Claudin之间的关系可以发现 Claudin 1 和 Claudin 3 的表达具有相关性 ( P =0. 02) ， 与 Claudin 2、4 无相关性 ( P 0. 05) ； Claudin 2 与 Claudin 3 具有相关性 ( P =0. 01) ， 与 Claudin 4 具有相关性 ( P 0. 05) ； Claudin 3 和 Claudin 4 也具有相关性 ( P =0. 000 23) 。见表 2。A: Claudin 1； B: Claudin 2； C: Claudin 3； D: Claudin 4图 1 Claudin 在胃癌中的免疫组化染色 ( 40)表 1 Claudin 家族与胃癌临床病理学的关系 例项目 例数Claudin 1 Claudin 2 Claudin 3 Claudin 4阳性 阴性 P 值 阳性 阴性 P 值 阳性 阴性 P 值 阳性 阴性 P 值分化程度高分化 3 2 10543 0402 10602 1071中分化 29 14 15 19 10 13 16 12 17低分化 40 25 15 31 9 22 18 18 22Laurens 分类肠内肿瘤 34 18 16000124 1003814 2001713 21054转移性肿瘤 31 23 8 25 6 20 11 16 15淋巴结转移阳性 46 23 2301133 1306318 2800113 330001阴性 26 18 8 20 6 19 7 19 7静脉侵袭阳性 14 10 402210 41004 100064 10018阴性 58 31 27 43 15 33 25 28 30神经侵袭阳性 33 20 1305627 601517 1609812 21020阴性 39 21 18 26 13 20 19 20 19生长方式扩张性 16 6 100774 120987 90886 10018扩张兼有 27 13 14 7 20 14 13 18 9浸润性 29 12 17 8 21 14 15 16 13T 分期T16 4 20344 20266 00045 1017T243 22 21 34 9 22 21 17 26T322 15 7 15 7 9 13 10 12T41 0 1 0 1 0 1 0 1N 分期N024 16 803617 705215 903913 11016N124 12 12 20 4 13 11 13 11N216 7 9 10 6 6 10 14 2N38 6 2 6 2 3 5 2 6M 分期M061 38 23004645 1610033 2802828 33075M111 3 8 8 3 4 7 4 7UICC/TNM 分期期 20 13 703514 609414 601112 8029期 19 12 7 15 4 11 8 9 10期 17 10 7 12 5 6 11 6 11期 16 6 10 12 4 6 10 5 11167广东医学 2013 年 3 月 第 34 卷第 5 期 Guangdong Medical Journal Mar 2013， Vol 34， No 5表 2 Claudin 3 与 Claudin 1、Claudin 2、Claudin 4 的相互关系 例 ( %)项目Claudin 3阳性 阴性 P 值Claudin 1 阳性 26( 813) 15( 366) 002阴性 11( 355) 20( 645)Claudin 2 阳性 32( 604) 21( 396) 001阴性 5( 263) 14( 737)Claudin 4 阳性 26( 813) 6( 188) 000阴性 11( 275) 29( 725)24 Claudin阳性表达与阴性表达术后生存时间的差别 Claudin 1、2、3 阳性表达与阴性表达 4 年生存率没有显著差别 ， Claudin 4 阳性表达的预后要好于Claudin 4 阴性表达的预后 。见图 2。图 2 Claudin 4 阳性与阴性表达术后 4 年患者生存率3 讨论上皮间充质转化被认为是肿瘤进展与转移的最重要途径 ， 对于上皮间充质转化来说 ， 紧密连接蛋白如ClaudinS E/M 钙黏蛋白 ， 弹性蛋白组成完整的细胞层 ， 并控制细胞增殖 。紧密连接蛋白在肿瘤进展中的作用很复杂 ， 且是相互影响的 ， 同时紧密连接蛋白的缺失或下降会导致肿瘤细胞的侵袭 8。E 钙黏蛋白在肠癌及其他恶性肿瘤有较多报道 ， 然而 Claudin 家族与胃癌的关系鲜有报道 ， 大多都是局限一种或两种Claudin蛋白 ， 但 Claudin 蛋白家族在乳腺癌 、胰腺癌 、肝癌 、食管癌等恶性肿瘤中已有相关报道 9。Claudin 家族可以作为胃癌的进展及转移中切实可行的分子标志物 ， MATSUDA 等 7曾经报道了 Claudin 在胃癌中的表达 ， 在本研究中我们用免疫组化 ABC 法研究 Claudin 1、Claudin 2、Claudin 3 及 Claudin 4 在胃癌中的表达 ， 并研究它们之间的相互关系 ， 结果显示 Claudin 家族成员在胃癌中的表达各不相同 10。Claudin 4 在 胃 癌 中 的 表 达 最 低 仅 44. 4%。Claudin 2 在胃癌中的表达最高为 73.6%。Claudin 1在胃癌中的表达率为 56.9%， 特别是在肠型腺癌中的表达率显著降低 ， 但它在其他病理特征中无显著差异 ， Claudin在 M1期胃癌中的表达明显低于 M0期 ， Claudin 1 在弥漫性腺癌中的表达显著降低 ， 并且 Claudin 1 可以用来提示胃癌是否是弥漫性腺癌 。另有报道 11显示在胃癌的侵袭及转移过程中其表达率明显升高 。但是根据肿瘤的生物学特性来看 ， 紧密连接蛋白的降低或毁坏才会导致肿瘤的转移 ， 这些相互矛盾的观点需要进一步研究以阐述其机制 。Claudin 2 在胃癌中的表达鲜见报道 。我们的研究显示 ， Claudin 2 在胃癌中显著表达 ， 有研究 12显示Claudin 2 在胃癌的器官特异性表达中为 2. 1%， 在直肠癌中为 25. 3%。但它与临床病理学参数没有显著相关性 。在 Claudin 家族中 ， Claudin 3、Claudin 4 被认为具有重要临床意义 ， 尤其是产气荚膜梭状芽胞杆菌所产生的肠 毒 素 ( CPE) 可 作 为 一 种 新 的 化 疗 药 物 。Claudin 3、Claudin 4 是 CPE 的配体 ， 把毒素结合到Claudin 蛋白质上 ， 从而导致活体内的快速细胞毒性效应 ， 许多研究显示 ， CPE 可治疗胰腺癌及乳腺癌 13。到目前为止 ， Claudin 家族与癌症生存时间的研究报道甚少 ， 有报道 14显示有 Claudin 3 表达的胃癌患者其预后较好 。我们的研究显示 ， Claudin 4 阳性表达患者较阴性表达者在 4 年生存时间中的预后较好 ，本研究有一些局限 ， 虽然我们分析了 Claudin 家族的 4个成员在胃癌中的表达 ， 然而所获取的样本量较小 ， 但是可以作为 Claudin 蛋白在胃癌中的临床应用的前期研究 。总之 ， 我们的研究显示 Claudin 3 和 Claudin 4可作为胃癌进展及预后的一个可靠分子标志物 ， 在判定淋巴侵袭过程中 Claudin 3、Claudin 4 也具有重要意义 ， 并且 Claudin 4 也可以作为一种预后标志物 ， 需要进一步研究以揭示 Claudin 的具体作用及更长时间的随访研究 。参考文献 1 韩露艳 ， 费素娟 ， 陈复兴 ， 等 复方苦参对人末梢血 T 细胞杀伤胃癌细胞株 SGC 7901 作用的研究 J 国际免疫学杂志 ， 2009， 4( 13) : 262 266 2 SNCHEZ TILL E， DE BARRIOS O， SILES L， et al cate-nin/TCF4 complex induces the epithelial to mesenchymal tran-sition ( EMT) activator ZEB1 to regulate tumor invasiveness J Proc Natl Acad Sci U S A， 2011， 108( 48) : 19204 19209 3 EWITT K J， AGARWAL R， MORIN P J The Claudin gene fami-ly: Expression in normal and neoplastic tissues J BMC Cancer，2006， 12( 21) : 186 189 4 KODA R， ZHAO L， YAOITA E， et al Novel expression of clau-din 5 in glomerular podocytes J Cell Tissue Res， 2011， 343( 3) : 637 648 5 SZSZ M A Claudins as prognostic factors of breast cancer J Magy Onkol， 2012， 56( 3) : 209 212 6 SATAKE S， SEMBA S， MATSUDA Y， et al Cdx2 transcriptionfactor regulates claudin 3 and claudin 4 expression during in-testinal differentiation of gastric carcinoma J Pathol Int， 2008，58( 3) : 156 163 7 MATSUDA Y， SEMBA S， UEDA J， et al Gastric 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测量肿瘤组织的表观弥散系数 ( ADC) 值可间接获得细胞构成的信息 ， 提高肿瘤分级的准确性及对肿瘤实质的预见性 1 2。缺氧诱导因子 1( HIF 1) 通过转录调节众多下游靶基因 ， 最终促进肿瘤细胞增殖和血管生成 ， 是肿瘤处于缺氧状态下病理生理变化的 “公共通路 ”。在国内外的报道中 ， 还没有见到关于弥散成像与 HIF 1 表达关系的研究 。本文在 DWI 诊断水平上更好地反映了星形细胞瘤在缺氧环境下的生长 、浸润 、增殖能力及恶性度 ， 将有助于提高对星形细胞瘤病理级别判断的正确