转录及转录后加工.ppt

第五章,转录及转录后加工,生化教研室肖建英,第一节转录的基本原理第二节DNA指导下的RNA聚合酶第三节与转录起始和终止有关的DNA结构第四节转录后加工过程及其机制,主要内容：,转录(transcription)生物体以DNA为模板合成RNA的过程。,转录,第一节转录的基本原理,一、基本概念,参与转录的物质,原料:NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:DNA酶:RNA聚合酶(RNApolymerase,RNA-pol)其他蛋白质因子,转录与复制的相似之处：都是酶促的核苷酸聚合过程；都以DNA为模板；都需依赖DNA的聚合酶；聚合过程都是核苷酸之间生成磷酸二酯键；都从5至3方向延伸成新链多聚核苷酸；都遵从碱基配对规律但转录忠实性要低于DNA复制。转录与复制都受到严格的调控,二、转录与复制的异同,转录和复制的区别,引物有无高度进行性中途不停止可一段一段复制,一、原核生物的RNA聚合酶,大肠杆菌(E.coli)的RNA聚合酶是由4种亚基、和(sigma)组成的五聚体蛋白质，分子量为480kD。2合称为核心酶(coreenzyme)；在试管内能催化NTP聚合生成RNA。亚基加上核心酶(2)称为全酶（holoenzyme)。,第二节DNA指导下的RNA聚合酶,大肠杆菌RNA聚合酶组分,RNA聚合酶,核心酶(coreenzyme),全酶(holoenzyme),RNA聚合酶,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合,RNA聚合酶,真核生物的RNA聚合酶,种类,定位核仁核质核质转录产物45s-rRNAhnRNA5s-rRNA,tRNA,U1-13snRNAU6snRNA，（U6除外）非UsnRNA对鹅膏蕈碱反应耐受极敏感中度敏感,二、真核生物的RNA聚合酶,RNA聚合酶,转录模板,DNA分子上转录出RNA的区段，称为结构基因(structuralgene)。DNA双链按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，称为模板链(templatestrand)，也称作反意义链或Watson链。相对的另一股单链是编码链(codingstrand)，也称为有意义链或Crick链。,5GCAGTACATGTC33cgtcatgtacag5,5GCAGUACAUGUC3,NAlaValHisValC,DNA,转录,mRNA,翻译,肽,DNA模板、转录产物mRNA和氨基酸序列之间的关系,编码链,模板链,53,35,模板链,编码链,编码链,模板链,结构基因,不对称转录(asymmetrictranscription),在DNA分子双链上某一区段，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录；模板链并非永远在同一条单链上。,第三节与转录起始和终止有关的DNA结构,一、原核生物的启动子和终止子,（一）启动子结构,原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)，包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。,RNA聚合酶结合模板DNA的部位，称为启动子(promoter)。,RNA聚合酶保护法,开始转录,TTGACAAACTGT,-35区,(Pribnowbox),TATAATPuATATTAPy,-10区,原核生物启动子保守序列,RNA-pol辨认位点(recognitionsite),-35区-10区+1trpTTGACAN17TTAACTN7AtRNAtrpTTTACAN16TATGATN7ALacTTTACAN17TATGTTN6ArecATTGATAN16TATAATN7AaraCTGACGN18TACTGTN6A最大一致性TTGACATATAAT383629402530373728412944,X/45,被RNA聚合酶保护的DNA区段碱基序列分析,1、Pribnow框：,10区，保守序列为TATAAT。Pribnow框是RNA聚合酶的牢固结合位点，简称结合位点。,的存在保证原核生物RNA聚合酶只能与启动子区而不是其它区域形成稳定的二元复合物。,2、Sextama框：,35区，保守序列为TTGACA。Sextama框是RNA聚合酶中的识别位点，也是RNA聚合酶的初始结合位点。,Pribnow框与Sextama框之间的碱基序列并不重要，但两个序列之间的距离十分重要；天然启动子这段距离多为1520bp，距离的大小可能是决定启动子强度的因素之一。实验表明：两个序列之间的距离为17bp时，转录效率最高。,3、CAP位点：（乳糖操纵子的启动子序列）,CAP即分解代谢物基因激活蛋白(catabolitegeneactivationProtein)也称环腺苷酸受体蛋白（CRP）。,CAP分子内有两个结构域：羧基末端结构域是DNA结合区；氨基末端结构域是cAMP结合位点。CAP与cAMP的结合能提高CAP对双链DNA的亲和力；CAP与启动子（CAP位点）的结合是激活乳糖操纵子转录的必要条件。,乳糖启动子中有两个CAP结合位点：一个在7050位点，称位点；一个在5040位点，称位点。,位点包含一个反向重复序列，是强结合位点；位点是弱结合位点。,（二）终止子结构,提供转录终止信号的序列称为终止子（terminator）。终止信号存在于RNA聚合酶已经转录过的序列之中。,原核生物终止子分为两类：一类是不依赖于因子的转录终止；一类是依赖因子的转录终止；,两类终止子有共同的序列特征：在转录终止点之前有一段间断的回文结构。,两类终止子碱基组成的不同点：不依赖因子回文结构富含G-C下游富含A-T依赖因子G-C含量较少下游无特征,转录方向,3,3,5,TCGGGCGAGCCCGC,CGCCCGAGCGGGCT,AAAAAATTTTTT,3,3,5,5,DNA,模板链,编码链,AAAAAAUUUUUU,5,TTTTTT,DNA,模板链,编码链,转录产物,3,不依赖因子的终止子,转录方向,3,3,5,TAAGTAGATTCATC,CTACTTAGATGAAT,AGCTACTCGATG,3,3,5,5,DNA,模板链,编码链,AGCTACUCGAUG,5,TCGATG,DNA,模板链,编码链,转录产物,3,依赖因子的终止子,二、真核生物的启动子,类启动子分两部分：405称为近启动子，决定转录起始的位点；16540称为远启动子，影响转录的频率。,真核生物的三种RNA聚合酶，每一种都有自己的启动子类型。,（一）RNA聚合酶的启动子,即rRNA基因的启动子，称类启动子。,（二）RNA聚合酶的启动子,1、帽子位点（capsite）：即转录起始位点，其碱基大多为A。,2、TATA框：又称Hogness框，由含有TATA的67个核苷酸组成，保守序列为TATA（A/T）A（A/T）。但TATA框的两侧富含G-C碱基对。,TATA框位于25附近，精确决定转录起始位点。其序列的完整与准确对维持启动子的功能是必需的。,即mRNA基因的启动子，称类启动子,3、CAAT框：,位于75附近，保守序列为GGNCAATCT。头两个G非常重要，一但突变，转录效率大大下降。CAAT框控制着转录起始的频率。,4、GC框：,位于110附近，以5CCGCC3序列为特征。,5、增强子（enhancer）：,能结合反式作用因子，决定基因的时间和空间特异性表达，增强启动子转录活性的DNA序列。,增强子作用特点：增强效应十分明显：使转录频率增加百倍或千倍。增强效应与其所处的位置和取向无关：增强子以53或35排列对启动子都有作用。大多为重复序列：长约50bp，适合与反式因子结合，内部常有一个核心序列，为增强效应所必需。增强效应具有严密的组织和细胞特异性。没有基因专一性。许多增强子受外部信号的调控。,真核生物RNApol的启动子,（三）RNA聚合酶的启动子,即tRNA基因的启动子，称类启动子。,类启动子位于转录起始点下游，称下游启动子或内部启动子。,类启动子包括：A盒、B盒A盒靠近5方向；B盒靠近3方向。,类启动子需要的转录因子包括：TFC、TFB、TFA，前两者是共同的，后者为5SrRNA基因转录所需。,三、原核生物和真核生物转录起始位点的结构差异,图5-4P155页,原核生物与真核生物启动子比较,原核生物和真核生物转录及抑制剂,第四节,原核生物转录的起始原核生物转录的延长原核生物转录的终止与新合成RNA链的释放真核生物的转录RNA生物合成抑制剂,转录起始需解决两个问题：RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。,一、原核生物转录的起始,4.10区DNA双链解开1217bp，形成开放的二元启动子复合物（模板酶）。,2.RNA聚合酶全酶(2)与模板35序列结合，形成闭合的二元闭合启动子复合物。,转录起始过程,1.因子辨认转录起始点（-35区的TTGACA序列）,3.RNA聚合酶向10区转移，并与之牢固结合。,5-pppG-OH+NTP5-pppGpN-OH3+ppi,5.在RNA聚合酶亚基催化下形成第一个磷酸二酯键，形成三元复合物（模板酶RNA）。,6.当三元复合物中RNA长69个核苷酸时，因子从全酶解离下来，进入延长阶段。,RNA聚合酶有两个核苷酸结合位点：一个是起始核苷酸位点；一个是延长核苷酸位点。一般只有嘌呤核苷酸填充了起始位点，才能形成第一个磷酸二酯键。,二、原核生物转录的延长,1.亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；,2.在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。,(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi,3.碱基配对原则：A-U，T-A，G-C4.延长中的转录复合物也叫转录空泡。随着RNA聚合酶前移，转录产物RNA不断移出转录空泡，已转录完毕的DNA双链又重新复合而不再打开。5.原核生物的转录和翻译偶联进行。,转录空泡(transcriptionbubble)：,RNA-pol（核心酶）DNARNA,5,3,DNA,原核生物转录过程中的羽毛状现象,核糖体,RNA,RNA聚合酶,依赖因子的转录终止非依赖因子的转录终止,三、原核生物转录的终止和新生RNA链的释放,指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。,分类,（一）依赖因子的转录终止,1969年，Roberts发现了能控制转录终止的蛋白质，即因子。它由相同的6个亚基组成六聚体，分子量200kD。,因子具有NTP酶活性和解螺旋酶活性，是促使转录三元复合物解离的根本原因。因子的NTP酶活性依赖于单链RNA的结构。,因子依赖性终止子含有一个反向重复序列，使RNA末端形成一个发夹结构，导致转录延宕，因子得以发挥作用，终止转录。,（二）非依赖因子的转录终止,DNA模板接近转录终止的区域内，有较密集的A-T配对区或G-C配对区，且G-C配对为回文结构。转录产物RNA的3-末端有若干个连续的U。连续U区的5-端前方碱基形成茎环结构或发夹结构。这种二级结构是阻止转录继续向下游推进的关键。,转录方向,3,3,5,TCGGGCGAGCCCGC,CGCCCGAGCGGGCT,AAAAAATTTTTT,3,3,5,5,DNA,模板链,编码链,AAAAAAUUUUUU,5,TTTTTT,DNA,模板链,编码链,转录产物,3,茎环结构使转录终止的机理,使RNA聚合酶变构，转录停顿；密集A-U配对使转录复合物趋于解离，释放RNA。,四、真核生物的转录,（一）转录起始,真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化。转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，而需依靠众多的转录因子，与模板结合形成转录起始前复合物，其起始过程比原核生物复杂得多。,转录起始点,TATA盒,CAAT盒,GC盒,增强子,转录起始前的上游区段,AATAAA,切离加尾,转录终止点,修饰点,外显子,翻译起始点,内含子,OCT-1,OCT-1：ATTTGCAT八聚体,TATAbox：启动子核心序列，-25bp区段。CAAT盒GC盒增强子,转录起始前的上游区段,参与RNA-pol转录的TF,TFF,A,B,由RNA-Pol催化转录的PIC,H,E,TBP,TAF,TFD-A-B-DNA复合物,TATA,A,B,TBP,TAF,TATA,H,E,PIC组装完成，TFH使CTD磷酸化,（二）转录延长,真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。,RNA-pol前移处处都遇上核小体。,转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。,RNA-Pol,RNA-Pol,RNA-Pol,核小体,转录延长中的核小体移位,转录方向,（三）转录终止,1、RNA聚合酶转录出rRNA前体3末端后，继续向下游转录超过1000个bp时，存在一个18bp的终止序列。2、RNA聚合酶转录模板的下游存在一个终止子，是位于GC丰富序列之中的TTTT。RNA聚合酶有内原性的转录终止功能。3、RNA聚合酶的转录没有明确的终止信号。,原核生物与真核生物转录的区别,原核生物真核生物,RNApol一种高度分工起始转录因子没有需要（各不同）延长核小体影响没有有启动子以外序列没有有且复杂转录产物多顺反子单顺反子场所转录与翻译偶联不偶联转录终止两种终止子不明确,五、RNA生物合成抑制剂,概念：能阻断、抑制或者干扰核酸的代谢过程，最终抑制转录的一类化合物，称RNA生物合成抑制剂。,分三类：1、嘌呤和嘧啶类似物，抑制核酸前体的合成；2、通过与DNA结合而改变模板的功能；3、与RNA聚合酶结合而影响其活力。,（一）利福霉素及利福平,作用：抗结核药物，特异地抑制细菌RNA聚合酶的活性，因而抑制细菌RNA的合成。,机制：利福霉素可与RNA聚合酶的亚基结合，并阻止起始位点的填充，抑制二核苷酸RNA的形成；利福平则阻止RNA聚合酶的移动，抑制头三个核苷酸的形成。因此，利福霉素和利福平都是RNA链合成起始过程的抑制剂。,（二）利迪链菌素,作用：与细菌的RNA聚合酶亚基结合，抑制转录过程中RNA链的延长反应。,转录后加工过程及其机制,第五节,mRNA的前体加工rRNA的前体加工tRNA的前体加工RNA的剪接和RNA催化活性RNA编辑,真核细胞每种转录产物都是各种RNA的前身，即无活性，亦无功能。真核初级转录产物必须在胞核内经过适当加工，使之变成具有活性的成熟RNA后，由胞核运至胞质才能执行翻译功能。真核细胞转录作用和翻译作用无论在空间上还是时间上都是彼此分开进行的。原核细胞mRNA不需加工，tRNA和rRNA加工。,真核细胞与原核细胞转录产物的区别：,一、mRNA的前体加工,1、5端形成帽子结构(m7GpppNp)2、3端加上多聚腺苷酸尾巴(polyAtail)3、中部剪接除去内含子4、链内部核苷酸的甲基化,hnRNA转变成mRNA的加工过程包括：,修饰的化学反应：,5-端的修饰在核内完成，且先于中段剪切。,5帽子分Cap0、Cap1、Cap2。,（一）5-端加上帽子结构(mGpppNp）,帽子0结构,图5-9帽子p161,mRNA帽子的生理功能：,促进某些RNA的合成。,帽子结构参与翻译起始，帽0结构是核糖体识别mRNA所必需的；核糖体上有帽结合蛋白。,帽子结构增加mRNA的稳定性，保护mRNA防止其受5核酸外切酶的降解。,（二）3-端加上多聚腺苷酸尾巴(polyA)。,polyA的出现不依赖DNA模板。加尾信号：3-末端出现AAUAAA及下游的GU丰富区。在两序列之间由特异的核酸内切酶切除多余的核苷酸，然后加上polyA。尾部修饰和转录终止同时进行。3-端修饰也在核内完成，并先于mRNA中段的剪接。polyA的有无及长短是维持mRNA作为翻译模板的活性，以及增加mRNA本身稳定性的因素。,mRNA3-端的多聚腺苷酸化可被冬虫夏草素（3-脱氧胸苷）所阻止；即冬虫夏草素是多聚腺苷酸化的特异抑制剂。,二、rRNA前体的加工,原核细胞与真核细胞的rRNA前体都需加工：,1、原核细胞rRNA基因与某些tRNA基因构成混合操纵子。大肠杆菌共有7个转录单位，每个转录单位由16SrRNA、23SrRNA、5SrRNA及一个或几个tRNA基因组成。,图5-10p163,大肠杆菌rRNA前体加工过程,2、真核细胞rRNA基因为串联重复序列：由18SrRNA、28SrRNA、5.8SrRNA基因组成一个转录单位，彼此被间隔区分开。,每个重复单位之间的间隔DNA序列不转录，称为非转录间隔序列。,真核生物5SrRNA基因也是成簇排列的，中间隔以不被转录的区域，它由RNApol转录，加工成熟后构成核糖体大亚基。,不同生物的rRNA前体大小不同：哺乳动物为45S；果蝇38S；酵母37S；四膜虫35S,18S,5.8S,28S,18S-rRNA,5.8S和28S-rRNA,内含子,45S转录产物,剪接,终产物,rDNA,基因间隔,哺乳动物细胞rRNA前体加工过程,tRNA前体,三、tRNA前体的加工,原核与真核tRNA基因大多成簇存在。,tRNA前体的加工包括：剪切内含子核酸外切酶修剪3末端，逐个切去附加序列；加上CCA-OH的3末端，完成柄部结构。碱基修饰,tRNA的加工酶系包括：tRNA核苷酸转移酶、RNaseP、RNaseD、RNase等。,型：有CCA序列基因，原核生物绝大部分；型：没有CCA序列基因，为真核生物。,tRNA基因有两种：,原核生物与真核生物都有tRNA核苷酸转移酶，负责给型tRNA加上CCA3-OH末端，或修复发生损伤的型tRNA3-OH末端。,RNaseP、RNaseDRNase连接酶,1、剪切内含子：属于酶促反应，需要酶及ATP。,tRNA核苷酸转移酶,2、加上CCA-OH的3末端，完成柄部结构。,3、碱基修饰,四、RNA的剪接和RNA催化活性,真核不连续基因的初级转录产物中，外显子与内含子交替出现；转录后把内含子切除而把外显子连接起来产生成熟RNA分子的过程，叫RNA剪接（RNAsplicing）。,内含子5端与3端都存在保守序列，分别称为5剪接点（GU）和3剪接点（AG）。,内含子的分类,根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子分为四类。,I类：线粒体、叶绿体及低等真核生物细胞核的rRNA基因；II类：线粒体、叶绿体的mRNA基因；III类：大多数核mRNA的基因；IV类：tRNA基因。,（一）第类和第类内含子的自我剪接特征,5剪接点UGU3剪接点GAU近3保守序列PyPuPyPyTAPy5-P-Q-R-S序列有无能量输入第一次亲核攻击鸟苷酸保守A2-OH,类内含子类内含子,（二）rRNA的自我剪接,四膜虫rRNA剪接由鸟苷酸发动第一次亲核攻击，经过两次连续的转酯反应，将两个外显子连接起来，释放出线形内含子序列。,释放出的线形内含子序列再经过两次连续的转酯反应，释放出15核苷酸和4核苷酸的两个小片段，最终形成稳定的线形产物L-19。（linearminus19interveningsequence）,L-19是四膜虫35SrRNA剪接的最终产物，仍具有酶的活性和特征。,pG-OH(ppG-OH,pppG-OH),剪接过程的二次转酯反应(twicetransesterification),（三）RNA的催化功能,L-19具有酶的主要特征：专一性强，加快反应速度，反应前后酶分子保持不变，这种由RNA构成的酶称之为核酶。,核酶首先是美国Colorado大学Cech在研究四膜虫rRNA剪接机制时发现的。他一方面证明了四膜虫rRNA的剪接机制；另一方面证明了L-19分子的催化活性。,继而在1983年，耶鲁大学SidneyAltamn发现了第二个核酶，参与tRNA前体加工的RNaseP。1992年，加州大学的HarryNoller又证明了核糖体大亚基rRNA的催化活性。,四膜虫rRNA内含子的二级结构,四膜虫rRNA的剪接采用自我剪接方式,5-端核苷酸序列,最简单的核酶二级结构槌头状结构(hammerheadstructure),底物部分,通常为60个核苷酸左右同一分子上包括有催化部份和底物部份催化部份和底物部份组成锤头结构,除rRNA外，tRNA、mRNA的加工也可采用自我剪接方式。,核酶研究的意义,核酶的发现，对中心法则作了重要补充；核酶的发现是对传统酶学的挑战；利用核酶的结构设计合成人工核酶。,人工设计的核酶,粗线表示合成的核酸分子细线表示天然的核酸分子X表示一致性序列箭头表示切断点,（四）tRNA的剪接,tRNA分子的内含子首先由核酸内切酶（RNase）剪去。最后由RNA连接酶完成连接。,（五)mRNA的自我剪