（生理学专业论文）小鼠胚胎干细胞notch1基因沉默对dvl1和jnk3表达的影响.pdf

郑州大学2 0 0 7 届硕士学位论文 中文摘要 小鼠胚胎干细胞n o t c h l 基因沉默对d v l - i 和 j n k - 3 表达的影响 研究生李佳 导师邢莹 郑州大学医学院生理学教研室 郑州4 5 0 0 0 1 摘要 胚胎干细胞( e m b r y o n i cs t e mc e l l s ，e s c s ) 是一种高度未分化细胞，它具有发 育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官。e s c s 研究的科学价值在于 这种能够自我更新具有多分化潜能的干细胞，在胚胎发育、移植治疗、基因治疗 以及新药开发等方面都有着广阏的应用前景，利用干细胞技术来治疗疾病将是未 来医学的发展方向。 n o t c h l 基因在许多组织细胞中表达，包括中枢神经系统、胰腺、造血细胞 等，它编码一种跨膜受体蛋白，参与调节各种各样细胞分化及发育的信号转导途 径，并影响了多种生长发育过程。在e s c s 中存在一种“旁侧抑制”即位于e s c s 表面的n o t c h l 可与邻近细胞表面的配体d e l t a 结合，抑制其下游b h l h ( b a s i c h e l i x - l o o p - h e l i x ) 家族神经分化基因如m a s h l 、n e u r o d 等的转录，从而抑制 e s c s 向神经细胞转化。因此，当n o t c h i 下调后，可以使e s c s 从“旁侧抑制” 中释放出来，进而促进e s c s 向神经细胞分化。 鉴于上述，本实验旨在构建特异性n o t c h l 的小干扰r n a ( s m a l li n t e r f e r i n g r n a ，s i r n a ) 真核表达载体抑制小鼠e s c s 中n o t c h l 基因的表达，并检测 d i s h e v e l l e d ( d v l ) 1 和c - j u nt e r m i n a lk i n a s e ( j n k ) - 3 基因的m r n a 表达变化，试 图从信号转导途径分析n o t c h l 表达受到抑制后对e s c s 功能的影响。 方法： 1 构建n o t c h l 基因的s i r n a 真核表达载体：根据g e n b a n k 提供的n o t c h l 基因 的核苷酸序列，按照a m b i o n 公司网站的s i r n a 设计工具设计两对双链 郑州大学2 0 0 7 届硕士学位论文 中文摘要 s i r n a ，先克隆入t 载体，经筛选，鉴定，测序后，双酶切靶基因，再亚克 隆入s i r n a 载体p s i n s i u 6 中构建重组体p s i n s i - u 6 - 1 和p s i n s i - u 6 - 2 ，筛选， 并用限制性内切酶酶切进行鉴定 2 通过脂质体l i p o f e ：c m r n i n e2 0 0 0 瞬时转染小鼠e s c s4 8 小时，同时在瞬时转染 的基础上，利用该载体带有新霉素抗性筛选系统，用g 4 1 8 筛选出阳性克隆， 并用r e a l - t i m ep c r 技术检测n o t c h l ，d v l 。1 和i n k - 3m r n a 的表达。 结果： 1 构建t d , 鼠n o t c h l 基因s i r n a 真核表达载体p s i n s i - u 6 - 1 和p s i n s i - u 6 - 2 ， 经限制性内切酶酶切和d n a 测序证实与设计完全一致。 2 重组载体，空载体通过脂质体l i p o f v c t a m i n e 2 0 0 0 瞬时转染小鼠e s c s 4 8 小时， r e a l - t i m ep c r 检测n o t c h lm r n a 的表达，结果显示：未转染组和空质粒组 n o t c h lm r n a 的表达均无明显变化，而重组载体p s l n s i - u 6 一l 和p s i n s i - u 6 - 2 两组n o t c h lm r n a 的表达明显下调。 3 p s i n s i u 6 1 的r n a 干扰效果较p s i n s i - u 6 - 2 强。 4 转染后，用r e a l - t i m ep c r 检测了d v l 1 和j n k - 3m r n a 的表达，结果显示： d v l 1 和j n k - 3m r n a 的表达均上调。 结论； 1 构建的小鼠n o t c h l 基因s i r n a 真核表达载体p s i n s i u 6 - 1 和p s i n s i - u 6 2 ， 可显著抑制小鼠e s c s 中n o t c h l 基因的表达，从而使d v l - 1 和j n k - 3 基因的 m r n a 表达水平上调。 2 由d v l 1 和j n k - 3 两基因的m r n a 表达变化可以推测在n o t c h l 抑制后，分 化的小鼠胚胎干细胞功能是受到保护的。 关键词：e s c s ，n o t c h l ，s i r n a ，r n a i ，r e a l - t i m e p c r ，d v i 1 ，j n k - 3 i i 郑州大学2 0 0 7 届硕上学位论文 英文摘要 n o t c h ls i l e n c ei nm o u s ee m b r y o n i cs t e mc e l l si m p a c t s d i s h e v e l l e d 一1a n dc - j u nt e r m i n a lk i n a s e - 3 se x p r e s s i o n p o s t g r a d u a t e l ij i a t u t o r x i n g3 ( m g d e p a r t m e n to f p h y s i o l o g y ，m e d i c a lc o l l e g eo f z h e n g z h o uu n i v e r s i t y z h e n g z h o u , 4 5 0 0 0 1 ，e r c h i n a a b s t r a c t a sak i n do fh i g h l yu n d i f f e r e n t i a t e dc e l l s ，e m b r y o n i cs t e mc e l l s ( e s c s ) h a v e d e v e l o p m e n t a lt o t i p o t e n c ya n d c a nd i f f e r e n t i a ti n t oa l lt y p e so fa d l d ta n i m a l st i s s u e s a n do r g a n s t h ev a l u eo f e s c sr e s e a r c hi st h a tt h e s es e l f - r e n e w a la n dp l u r i p o t e n ts t e m c e l l s 啪b ew i d e l yu s e di ne m b r y o n i cd e v e l o p m e n t , r e p l a c e m e n tt h e r a p i e s 。g e n e t h e r a p i e sa n dd r u gd i s c o v e r y s os t e mc e l lt e c h i q u e sf o rt h e r a p e u t i cu a l et h e p r o s p e c t i v et e n d e n c yo f m e d i c a l s c i e n c e n o t c h lg c n ee x p r e s s e si nm a n yc e l lt i s s u e s ，s u c ha sc e n t r a li i _ e i v o u ss y s t e m ， a b d a m i n a ls a l i v a r y # a n d , h e m a t o p o i e t i cc e l l s ，e r e t h eg e n ee n c o d i n gas i n g l e - p a s s t r a n s m e m b r a n er e c e p t o rp r o t e i nh a sb e e ni n v o l v e di nt h er e g u l a t i o no ft h es i g n a l i n g p a t h w a yo fa l ls o r t so fc e l l s d i f f e r e n t i a t i o na n dd e v e l o p m e n ta n dh a sa l li m p a c to n m a n yg r o w t ha n dd e v e l o p m e n tp r o c e s s t h e r e i sa l a t e r a li n h i b i t i o n i ne s c s ： n o t c h lr e c e p t o ri nt h es u r f a c eo fe s c s , i nc o m b i n a t i o nw i t hi t sl i g a n dd e t a li nt h e s u r f a c eo fa na d j a c a n tc e l l i n h i b i t st h et r a n s c f i p t i o no fi t sd o w n s t r e a mn e t v d i f f e r e n t i a t i o ng e n e s ，s u c ha sm u s h l ，n e n r od ，w h i c ha l et h em e m b e r so fb h l h ( b a s i ch e l i x l o o p - h e l i x ) g e n ef a m i l y f u r t h e r m o r et h ea c t i v en o t c h lr e c e p t o ri n h i b i t s e s c s sd i f f e r e n t i a t i o ni n t on e u r a lc e l l s s oa f t e rn o t c h l sd o w nr e g u l a t i o n , e s c sc a n b er e l e a s e df r o ml a t e r a li n h i b i t i o na n db ep r o m o t e dt od i f f e r e n t i a t ei n t on e u r a lc e l l s t h e r e f o r e ，t h ea i mo ft h i ss u r l yi st oc o n s t r u c te n k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o ro f s i r n a ( s m a l li n t e r f e r i n gr n a ) s p e c i f i cf o rn o t c h la sam o l e c u l a rt a r g e tt o o l t o i n h i b i tn o t c h lm r n ai nm o u s ee s c s a n dd i s c u s st h ef u n c t i o no fm o u s ee s c sa f t e r 1 1 1 郑州大学2 0 0 7 届硕士学位论文英文摘要 n o t c h li n h i b i t i o nb yd e t e c t i n gt h em r n ae x p r e s s i o no f d i s h e v e l l e d ( d v l ) - la n dc - j u l l t e r m i n a lk i n a s e ( 胍) - 3 m e t h o d s ： 1 t bc o n s t r u c tt h es i r n a e x p r e s s i o nv e c t o ro fn o t c h l ：a c c o r d i n gt ot h eg e n s o m e s e q u e n c e so f n o t c h lg e n er e t r i e v e df r o mg e n s a n k , a m b i o n , s i r n ad e s i g nt o o l s o nw e b w a su s e dt od e s i g nt w op a i r so fd o u b l es t r a n d ss i r n a 1 1 1 es i r n a f r a g m e n t sw e r ec l o n e di n t o te x p r e s s i o nv e c t o r a f t e rb e i n gi d e n t i f i e db y s e q u e n c i n g t a r g e tg e n et e m p l a t ew a sd i g e s t e dw i t hc l ai b a m hi t h e nt h e d i g e s t e df r a g m e n t sw e r es u b c l o n e di n t op s 玳s i - u 6e x p r e s s i o nv e c t o r a n d i d e n t i f i e db yd i g e s t i n g 2 t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d sw e r et r a n s i e n t l yt r a n s f e c t e di n t om o u s ee s c sf o r4 8 h o u r sb yl i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 , m e a n w h i l e ( 3 4 1 8w a su e s e dt os e l e c t e dt h ep o s i t i v e c e l lc l o n e s a tl a s tt h em r n ae x p r e s s i o no fn o t c h l d v l 1a n dj n k - 3w e r e d e t e c t e db yr e a l t i m ep c r r e s u l t s ： 1 n l ep s i n s i - u 6 - 1a n dp s l n s i - u 6 2r e c o m b i n a n tp l a s m i d si d e n t i f i c a t e db yt h e r e s t r i c t i o ne n z y m e sa n dt h es e q u e n c ea n a l y s i sc o m p l e t e l yc o i n c i d e dw i t ht h e d e s i g n 2 t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d sw e r et r a n s i e n t l yt r a n s f e c t e di n t om o u s ee s c sb y l i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 , a n dg 4 1 8i n d u c e dt h e i re x p r e s s i o nf o r2 4h o u r s d e t e c t e db y r e a l - t i m ep c 凡t h em r n a e x p r e s s i o nl e v e lo fn o t c h ld e c r e a s e dr e m a r k a b l yi n t h eg r o u p so f p s i n s i u 6 一la n dp s i n s i - u 6 - 2 ，b u tt h ec o n t r o lg r o u p sh a v en oe f f e c t o n e s c s 3 t h ee f f e c to f r n a io f p s i n s i - u 6 1w a s m o r ep o w e r f u lt h a np s i n s i - u 6 2 4 a f t e rt r a n s f e c t i o u , t h em r n ae x p r e s s i o no fd v i la n d k - 3b o t hi n c r e a s e d d e t e c t e db yr e a l t i m ep c r c o n e l u s i o n s ： 1 t h es i r n ae u k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp s i n s i u 6 1a n dp s l n s i u 6 - 2a g a i n s t m o u s s en o t c h lm r n ah a sb e e ns u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e da n dt h er e c o m b i n a n t v e c t o re f f e c t i v e l yi n h i b i t e dt h ee x p r e s s i o no fn o t c h ii nm o u s ee s c s ，f u r t h e r m o r e i v 郑州大学2 0 0 7 届硕士学位论文 英文摘要 t h em r n a e x p r e s s i o no f b o t hd v l 1a n dj n k - 3i n c r e a s e d 2 i t 湖b ei n f e r r e df r o mt h ee h 趾g eo f d v l - 1a n dj n k - 3 7m r n ae x p r e s s i o nt h a tt h e f i m e t i o no f d i f f e r e n t i a t i n gm o u s ee s c sw 黜p r o t e c t e da l c xn o t e h li n h i b i t i o n k e y w o r d s ：e s c s ，n o t e h l ，s i r n a ，r n a i ，r e a l - t u n ep c r ，d v l 1 ，j n k - 3 v 郑州大学2 0 0 7 届硕士学位论文小鼠胚胎干细胞n o t c h l 基因沉默对d v l 1 和j n k - 3 表达的影响 小鼠胚胎干细胞n o t c h l 基因沉默对d vi - | 和 j n k - 3 表达的影响 研究生李佳 导师邢莹 郑州大学医学院生理学教研室 郑州4 5 0 0 0 1 引言 胚胎干细胞( e m b r y o n i cs t e me e l i s , e s c s ) 是一种高度未分化细胞，它具有发 育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官1 9 9 8 年，美国的t h o m s o n 等成功地建立了人类e s c s 系f l 】，e s c s 的建系成功轰动了全球，研究和利用e s c s 成为当前生命科学领域的核心问题之一。e s c 研究的科学价值在于这种能够自我 更新具有多分化潜能的干细胞，在胚胎发育、移植治疗、基因治疗以及新药开发 等方面都有着广阔的应用前景，利用干细胞技术来治疗疾病将是未来医学的发展 方向。通过控制e s c s 生长环境向e s c s 转染某一种系细胞形成的决定基因，或 利用某种系特定启动子控制的抗药性基因富集转基因e s c s ，可获得特定种系的 较纯化的细胞，而且数目上不受限制。将这些细胞用于移植治疗，将给阿尔茨海 默病、帕金森病、脊髓损伤、糖尿病、心肌缺损、白血病等许多疑难疾病的治疗 带来新的希望【甜。 近代遗传学先驱m o r g a n 于1 9 1 7 年在果蝇体内发现某基因的突变可以使果 蝇的翅膀边缘出现一些切痕( n o t c h e s ) ，于是将该基因命名为n o t c h 【3 1 。随后的大 量研究表明，n o t c h 在许多物种中都有表达，包括无脊椎动物和脊椎动物，它通 过与邻近细胞间的相互作用来精确调控各谱系细胞的分化以及个体的发育。由于 n o t c h 分布和表达的广泛性以及其重要性，近年来n o t c h 成为发育学、干细胞生 物学、免疫学、血液学、肿瘤学等多个领域的研究热点之一。 n o t c h l 基因在许多组织细胞中表达，包括中枢神经系统、胰腺、造血细胞 等，它编码一种跨膜受体蛋白，参与调节各种各样细胞分化及发育的信号转导途 郑州大学2 0 0 7 届硕士学位论文小鼠胚胎干细胞n o t c h i 基阂沉默对d v l - l 和j n k - 3 表达的影响 径，并影响了多种生长发育过程。在胚胎神经系统的发育中有一种“旁侧抑制” ( 1 a t e r a li n h i b i t i o n ) ，即腹侧初始状态相同的单层外胚层细胞中，正在分化的神经 前体细胞周围的其它细胞不再向神经元分化，而发育成上皮细胞，这样就使神经 前体细胞从原来的单层细胞中分离出去。研究表明，这是一种n o t c h 蛋白剂量 依赖性的旁侧抑制作用，n o t c h 蛋白表达较少的细胞可以实现最初的命运选择分 化为神经细胞，而相邻的细胞表达较多的n o t c h 蛋白，则不能向神经细胞分化， 出现了命运的改变而向上皮细胞分化【4 】。当n o t c h 功能缺陷时，这种“旁侧抑 制机制”消失，神经元产生过多，导致胚胎死亡；与之相反，当n o t c h 分子因 基因突变而活化时，胚胎中神经前体细胞的分离受到抑制，而上皮细胞的分化则 不受影响。研究发现，几乎所有的e s c s 均高度表达n o t c h l 蛋白及m r n a 。 而e s c s 中也存在“旁侧抑制”【5 】即位于e s c s 表面的n o t c h l 可与邻近细胞 表面的配体d e l t a 结合，抑制其下游b h l h 家族神经分化基因如m a s h l 、 n e n r o d 等的转录，从而抑制e s c s 向神经细胞转化。因此，当n o t c h l 下调后， 可以使e s c s 从“旁侧抑制”中释放出来，进而促进e s c s 向神经细胞分化 6 1 。 r n a 干扰( r n ai n t e r f e r e n c e ，r n a i ) 是近年发现的一种重要基因沉默技 术，又称转录后基因沉默( p o s t t r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g ，p t g s ) 7 1 0 r n a 干 扰能在低于反义核酸几个数量级的浓度下，使目标基因表达降到极低水平甚至完 全剔除，从而产生缺失突变体表型，比基因敲除技术更快更简单【耵。其中最关 键的效应分子是具有2 1 2 3 n t 个碱基的小干扰r n a ( s m a l li n t e r f e r i n gr n a ， s i r n a ) ，它可以序列特异性地结合靶m r n a 序列，导致特异m r n a 的降解 9 1 。 s i r n a 表达载体可以转录产生短发卡状r n a ( s h o r th a i r p i nr n a ，s h r n a ) ，在 体内进一步被切割形成s i r n a 发挥干扰作用，能够稳定持续地维持较长时间的 基因沉默【1 0 】。 d v l 与n o t c h 信号转导途径关系密切，d v l 的氨基端能与n o t c h 受体的羧基 端直接结合，影响n o t c h 细胞内结构域( n o t c hi n t r a c e l l u l a rd o m a i n ，n i c d ) 的形 成，同时还能影响n i c d 向核内转移的过程。因此n o t c h l 的表达改变可以直接 影响d v l 1 的表达。d v l 1 亦是w n t 信号转导途径中的一个关键分子，它将来自 胞膜的信号传入w n t 信号转导途径的不同通路，在整个w n t 途径中起着信号分 流的枢纽作用。d v i 1 可以通过w n t p o l a f i t y 通路激活i n k 信号转导通路继而对 2 郑州大学2 0 0 7 届硕：学位论文小鼠胚胎干细胞n o t c h i 基丙沉默对d v l 1 和j n k - 3 表达的影响 神经元的可塑性和存活起重要作用。 鉴于上述，本研究利用r n a 干扰技术，以n o t c h l 为靶基因，p s i n s i - h u 6 真 核表达载体为基础，构建针对n o t c h l 的s i r n a 表达载体，并转染胚胎干细胞， 旨在实现对e s c s 中n o t c h l 表达进行抑制，同时还检测了d v l - 1 和j n k - 3 基因 的m r n a 表达变化，试图从信号转导途径分析n o t c h l 表达受到抑制后对e s c s 功能的影响，为进一步将此技术应用于胚胎千细胞向神经细胞的定向分化研究， 以及用于细胞移植治疗神经系统疾病奠定基础。 郑州大学2 0 0 7 届硕上学位论文 小鼠胚胎干细胞n o t c h | 基因沉默对d v l - 1 和j n k - 3 表达的影响 材料和方法 1 实验材料 1 1 细胞 小鼠胚胎干细胞系( 由郑州大学医学院干细胞中心建立，鉴定并保存) 。 1 2 质粒 p g e m - te a s y 克隆质粒( 结构示意图见图1 ) 、p s i n s i - u 6 质粒( 结构示意图 见图2 ) 、 3 - a c t i n 质粒( 由郑州大学赵国强教授惠赠) 。 图1p g e m - te a s y 克隆质粒结构示意图 图2 p s i n s i - u 6 克隆质粒结构示意图 4 p r o m o t e r h u m a n u 6 ，引盯船曲s! 阱”丌聃盯俘玎 郑州大学2 0 0 7 届硕： 学位论文 小鼠胚胎干细胞n o t c h i 基因沉默对d v l 1 和j n k 3 表达的影响 1 3 菌株 e c o l ij m l 0 9 菌株( e h 郑州大学免疫与微生物教研室提供) 。 i a 主要试剂 高糖d m e m 培养基美国s i g m a 公司 胎牛牛血清美国g i b e o 公司 k n o c k o u td m e m 美国s i g m a 公司 l - g l u t a m i n 美国i n v i t r o g e n 公司 m t g 美国s i g m a 公司 非必需氨基酸( n e a 劬 美国i n v i t r o g e n 公司 琼脂糖美国s i g m a 公司 c l a i 内切酶大连t a k a r a 公司 b a m hi 内切酶大连t a k a r a 公司 e c o ri 内切酶大连t a k a r a 公司 t 4 连接酶大连t a k a r a 公司 a m v 逆转录酶大连t a k a r a 公司 细胞总r n a 提取试剂t r i z a l 美国i n v i t r o g e n 公司 小量质粒提取试剂盒杭州维他洁公司 胶回收试剂盒杭州维他洁公司 p e r f e c tr e a lt i m ep c r 扩增试剂盒 大连t a k a r a 公司 脂质体l i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 美国i n v i t r o g e n 公司 新霉素( 4 1 8美国g i b c o 公司 d l 2 0 0 0d n a m a k e r大连t a k a r a 公司 内对照3 - a c t i n 引物上海生物工程公司 n o t c hl 引物 上海生物工程公司 j n k - 3 引物上海生物工程公司 d v l1 引物 上海生物工程公司 n o t c h1 基因r n a i 寡核苷酸上海生物工程公司 1 5 主要实验仪器设备 医用净化工作台 苏州净化设备公司 郑州大学2 0 0 7 届硕：l 学位论文小鼠胚胎干细胞n o t c h i 基因沉默对d v l 1 和j n k - 3 表达的影响 c 0 2 培养箱 倒置显微镜 凝胶图像分析系统 p c r 扩增仪 荧光定量p c r 仪9 6 0 0 高速低温离心机 台式离心机 快速恒温数显水浴箱 s m f l 2 4 雪花制冰机 d y y - i i l 2 稳压稳流电泳仪 电泳槽 隔水式电热恒温培养箱 超纯水仪 高压自动消毒柜l i v e 5 0 纯水蒸馏仪s z - 9 3 型 手提式紫外灯 恒温振荡器( z d 8 5 ) 1 6 主要试剂的配制 1 6 1d m e m 培养基 法国j o u a n 公司 日本o l y m p u s 公司 g e n eg e n i u ss y n g e n e 德国b i o m e t r a 公司 美国p e r k ne l m e r 德国h e r a e u s 上海安亭科学仪器厂 常州国华电器有限公司 日本三洋 北京六一仪器厂 北京科普仪器厂 上海精密仪器厂 m i l l i p o r e - q 公司 h i r a y a m a ，日本 金叶，上海亚荣生化仪器厂 上海康华生物仪器厂 常州国华公司 将d m e m ( 高糖) 粉剂l x l 3 5 9 和3 7 4 9 n a h c 0 3 充分溶于1 0 0 0 m l 消毒三蒸 水中，用1 n n a o h 或i n h c i 调p h 值至7 1 ，o 2 2g m 滤膜过滤灭菌，分装到4 个2 5 0 m l 消毒盐水瓶，封好，4 保存。 1 6 2m e f ( m o u s ee m b r y o n i cf i b r o b l a s t ，小鼠胚胎成纤维细胞) 培养液 量取1 0 0 n i l 上述配好的高糖d m e m 液体，加入双抗调至1 0 0 u m l ，混匀后 再次调节p h 至7 2 ，经0 2 2 t t m 的滤器过滤至高压消毒过的血清瓶中，再添加 1 0 m 1 分装好的新生牛血清( n e w b o r nc a l fs e r u m 。g i b c o b r l ，需5 6 ，3 0 m i n 灭活) ，4 c 保存至使用，一般不超过2w 。 1 6 3e s c s 基本培养基 k n o c k o u td m e m ，o 1 5 r a m 单硫醇甘油( m t g ) ，2 r a ml - g l u t a m i n ，1 0 0 u m l 青霉素，1 0 0 p g m l 链霉素，0 1 m m 非必需氨基酸( n e a a ) ，l m m 丙酮酸钠，1 5 6 郑州大学2 0 0 7 届硕上学位论文小鼠胚胎干细胞n o t c h l 基因沉默对d v l 1 和j n k - 3 表达的影响 f b s 。 1 6 4p b s 配制 将8 5 9 n a c ! ，o 3 5 9 n a i l 2 i 0 4 2 h 2 0 ，2 6 9 8 9 n a 2 hp 0 4 1 2 h 2 01 0 0 0 m l 消毒 三蒸水充分溶解，调整p 8 值至7 2 ，过滤后分装于2 5 0 m l 的盐水瓶中，于室温 保存。使用前常规高压蒸汽消毒。 1 6 5 细胞消化液 o 2 5 胰蛋白酶o 0 2 e d t a ：称取o 2 5 9 胰蛋白酶置于烧杯中，先加入少 量无c a 2 + m 9 2 + p b s 调成糊状后，再添加p b s 至1 0 0 m l 混匀，4 过夜，次日称 取0 0 2 9e d t a 于胰蛋白酶溶液中，充分溶解后用n a h c 0 3 调p s 值为7 2 ， 0 2 2 1 t i n 滤膜过滤除菌，一2 0 保存 1 6 6 丝裂霉素c 工作液 将2 m g 丝裂霉素c 溶解于5 m l 灭菌超纯水中，配制成0 4 m g m l 的母液， 于4 c 避光保存。使用前，用m e f 饲养层细胞培养液稀释4 0 倍配成终浓度为 1 0 9 9 m l 的工作液，即5 m l 培养基加1 2 5 1 d 母液。工作液于4 c 避光保存( 例如用 黑纸包裹) ，不超过2 周。 1 6 70 1 明胶溶液 称取明胶l g ，加超纯水1 0 0 0 m l ，6 5 c3 0 m i n 水浴使明胶溶解，迅速用o 2 2 t t m 滤膜过滤消毒( 温度下降后难以过滤) 后于4 * 0 保存备用。明胶预先包被培养 瓶( 皿) 的处理方法：将0 1 明胶水溶液加入培养瓶( 皿) 内，能覆盖培养瓶( 皿) 底部表面即可，在室温下或培养箱内静置l h 以上。使用前，吸弃明胶溶液，p b s 洗涤一次。 1 6 8 双抗配制 取三蒸水1 6 0 m l ，加入青霉素钠1 6 0 万u ，混匀，弃去6 0 m l ，再加入链霉素 1 o g ，混匀后过滤分装，一2 0 冻存，备用。 1 6 9l b 液体培养基 每1 0 0 m l 去离子水中加入l g 胰蛋白胨，l g n a c l ，0 5 9 酵母提取物，用n a o h 调节p h 值至7 2 7 6 ，混匀后1 0 x 1 0 5 p a 高压灭菌1 5 m i n 。冷却后按选择需要加 入氨苄青霉素，终浓度为1 0 0 t t g m l 备用。 1 6 1 0l b 固体培养基 每1 0 0 m l 去离子水中加入l g 胰蛋白胨，l g n a c l ，l g 酵母提取物，琼脂糖 郑州大学2 0 0 7 届硕：t 学位论文小鼠胚胎干细胞n o t c h i 基因沉默对d v l 1 和j n k - 3 表达的影响 粉1 5 9 2 9 ，用n a o h 调节p h 值至7 2 7 6 ，1 , 0 x 1 0 5 p a 高压灭菌1 5 m i n ，温 度降至5 0 后将上述灭菌培养液在超净台中以每板约2 0 m l 倒入经1 6 0 ( 2 干烤 3 h 并冷却后的9 c m 玻璃培养皿( 氨苄青霉素抗性基因筛选培养基则在铺板前加 入氨苄青霉素，终浓度为1 0 0 i | g m 1 ) ，凝固后于4 保存。 1 6 1 15 0 x t a e i r i s2 4 2 9 ，冰醋酸5 7 1 m l ，0 5 me d t a ( p h = 8 o ) 1 0 0 m l ，加水至1 0 0 0 m l ，于 4 存放备用。 1 6 1 2x 琼脂糖凝胶 预制备y 体积的琼脂糖凝胶，可称取y x x ( m 亩琼脂糖，加入y ( m 1 ) i x t a e 电泳缓冲液，加热使熔解，冷却至约6 0 ( 2 加入e b 至终浓度0 5 i g m l ，倒入封好 胶带梳子的平板槽中，完全凝固后即可用。 2 实验方法 2 1 n o t c h ls i r n a 的设计 在g e n b a n k 中查找小鼠n o t c h l 的m r n a 全序列( g c n s a n k 登录号为 a f 5 0 8 8 0 9 ) ，按照t u s c h l 等【l l 】推荐的原则，用a m b i o n ( h t t p ：w w w a m b i o n c o r n t e c h l i b m i s c s i r n af i n d e r h l m l ) 提供的s i r n a 设计软件从n o t c h i 基因编码区中 寻找符合设计原则的靶序列( 5 2 4 5 4 2 和7 5 1 7 6 9 ) 。按照p s i n s i u 6 载体的要 求设计两对编码s i r n a 的h a i r p i ns i r n a 寡核苷酸单链，寡核苷酸序列两端包含 酶切位点，能直接与经相同酶切的p s i n s i u 6 载体连接，最后通过b l a s t 软件确 定与其它非相关基因无同源性。设计的s i r n a 寡核苷酸结构( 正义链) 为：b a m h i 的酶切位点+ 1 9 n t 的正向序歹l j + g n t 的间隔序列+ 1 9 n t 的反向序列+ 终止信号+ c l a i 的酶切位点，两端再加上保护碱基。由靶序列5 2 4 5 4 2 设计的s i r n a 寡核苷 酸片段命名为1 l 和1 2 ，由7 5 1 7 6 9 设计的命名为2 l 和2 2 ： b a m hig a l s t r a n d l o o p a n t i s e n s es t r a n dc l ai 1 15 t 1 口皿o a 啪a 蚺g - a r r a 弛口立蚰正直皿聪聃c 卫c i t g c 了1 而且联蕊直i c g g 3 1 25 i t 从c 卫篮a o c g 力r 鹏纵玎觚a 缸辽k j a 蜘卧t t g a g m c g g a c g a m l a 从瑚正c 弛6 c c - 5 2 15 a t r g a 皿g g a c a g a a c t g t g a a g a a a 刀立撼g 啦直t t t c t t c a c a g t t c t g t c ct 1 丌丌a t f 盥i o g g a 3 。 控5 - a t a a c c 碹凶c c t g t c t t g a c c t t c t i t 船盥盥a a a g a a g t g t c a a g a c a g g a a a a a a 硝c 豇邑g c c - 5 t 郑州大学2 0 0 7 届硕士学位论文小鼠胚胎干细胞n o t c m 基因沉默对d v l 1 和j n k - 3 表达的影响 2 2s i r n a 表达载体的构建 2 2 1 单链目的基因片断退火连接成双链d n a 在合成的h a i r p i ns i r n a 寡核苷酸单链中各加超纯水5 0 山，用力混匀。反应 体系为：正义链、反义链各1 3 5 m ，1 0 x d n a 退火缓冲液3 t t l ，充分混匀。反应 条件为：9 4 水浴4 m i n 后逐渐降温至7 0 ，再7 0 0 水浴1 0 m i n ，然后逐渐冷 却至室温。取退火产物3 m 电泳。 2 2 2 目的片段与质粒p g e m - t 的重组连接 反应体系为：退火产物3 5 t d ，p g e m - te a s y ( t 载体) 0 5 p 1 ，t 4d n a 连接 酶0 5 t d ，1 0 x t 4 d n a l i g a s e b u f f e r 0 5 m 充分混匀。1 6 ( 2 连接过夜( 8 1 6 h ) ， 连接后的重组体分别命名为p g e m - te a s y - 1 和p ( 3 e m - te a s y - 2 2 2 3 大肠杆菌感受态细胞制备 ( 1 ) 用无菌接种环挑取培养基上适量的宿主菌j m l 0 9 接种于含5 m ll b 液体培养 基的试管中，然后置于3 7 c 过夜振荡培养后，取2 m l 转入含5 0 m ll b 液体培养 基的锥形瓶中，3 7 c 振荡培养3 4 h ，使细胞浓度至o d 6 0 # 如4 。 ( 2 ) 取出锥形瓶置于冰水中冰浴1 5 m i n 。 ( 3 ) 将菌液移入一个清洁无菌预冷的5 0 m l 离心管中，于4 ，2 7 0 0 r p m 的条件下 离心1 0 m i n 。 ( 4 ) 弃上清，将细菌沉淀重悬于1 5 m l 冰预冷的0 i m 无菌c a c l 2 溶液中，冰浴 3 0 m i n 。 ( 5 ) 再次于4 1 2 ，2 7 0 0 r p m 离心1 0 m i n 。 ( 6 ) 弃上清，用2 m l 冰预冷的c a c h 轻柔的重悬菌体。 ( 7 ) 置于4 1 2 冰箱中4 6 h ，即为感受态细菌，可以用来转化。 2 2 4 重组t 载体的转化 ( 1 ) 将上述装有连接体系的e p 管置于7 0 c 水浴5 m i n ，使连接