（生物物理学专业论文）fcm检测低能n注入对活性污泥微生物菌群的影响.pdf

郑州大学硕七学位论文f c m 检测低能n + 注入对活性污泥微生物菌群的影响 摘要 活性污泥是生物处理污水系统的功能主体，其生物活性的高低主要取决于微 生物菌群结构和功能。由于活性污泥中的微生物大部分处于活的但不可培养 ( v i a b l eb u tn o n c u l t u r a b l e ，v b n c ) 状态，传统培养方法仅能检测活性污泥中微生 物数量的l - 1 5 。本试验利用荧光原位杂交技术( f l u o r e s c e n ti ns i t uh y b r i d i z a t i o n ， f i s h ) 和流式细胞术( f l o wc y t o m e t r y ，f c m ) 对低能n + 注入活性污泥微生物菌 群的影响进行了原位检测研究。 基于1 6 sr r n a ，设计了活性污泥中主要细菌类群i x - 、p 、丫变形杆菌 ( p r o t e o b a c t e r i a ) 亚纲、c f ( c y t o p b a g a - f l e x i b a c t e r i u m ) 类群、h g c ( g r a m - p o s i t i v e w i t hh i g hg + cd n a c o n t e n t ) 类群的特异探针，利用流式细胞术对原活性污泥样 品中各细菌类群进行检测，结果显示，优势菌群是变形杆菌类群，相对丰度为 5 8 3 ，其中甜、1 3 、卜变形杆菌亚纲分别为1 7 8 、1 9 8 、2 0 7 ，其次是 c f 类群( 2 1 6 ) ，h g c 类群( 1 9 9 ) 。 流式细胞术检测低能盯注入后活性污泥中菌群变化的结果显示：较低剂量 ( 5 x 1 0 ”n + c m 2 ) 注入时，活性污泥微生物菌群的结构变化不大；较高剂量注入 时活性污泥微生物菌群的结构变化较大，其中，1 x 1 0 1 5n + c m 2 注入剂量下y 变形 杆菌亚纲类群的细菌相对含量增加较多，5 x 1 0 1 5n + c m 2 注入剂量下a 变形杆菌亚 纲类群的细菌相对含量增加较多。较高剂量注入下活性污泥菌群的结构变化较大 是不同微生物菌群对低能n + 注入敏感性差异的直接反映，这提示我们在活性污泥 的菌群诱变工作中采用多剂量诱变的策略有可能拓宽变异谱。 关键词：活性污泥，微生物菌群，荧光原位杂交，流式细胞术，低能离子束 郑州大学硕士学位论文f c m 检测低能n + 注入对活性污泥微生物菌群的影响 a b s t r a c t a c t i v a t e ds l u d g ei st h ek e yf u n c t i o n a le l e m e n to fb i o l o g i c a lw a s t e w a t e r t r e a t m e n tp l a n t sw h i c he m p l o ya l la c t i v a t e ds l u d g ep r o c e s s ，a n di t sb i o l o g i c a la c t i v i t y d e p e n d sl a r g e l yo nt h em i c r o b i a lc o m m u n i t yo fa c t i v a t e ds l u d g e b u tt r a d i t i o n a l c u l t i v a t i o n b a s e ds t u d i e sc o u l dd e t e c to n l yl t o1 5 o f m i c r o o r g a n i s mi na c t i v a t e d s l u d g e ，s i n c et h em a j o r i t yo fm i c r o o r g a n i s m si nt h ee n v i r o n m e n ta r ev i a b l eb u t n o n c u l t u r a b l e s t a t e t h e r e f o r e ，i t i s i m p o r t a n t t o a p p l y t h em e t h o d so f c u l t i v a t e d i n d e p e n d e n tm o l e c u l a rb i o l o g yt o r e s e a r c ha c t i v a t e ds l u d g em i c r o b i a l c o m m u n i t y t h eb a c t e r i c a lc o m m u n i t ys t r u c t u r e si na c t i v a t e ds l u d g ew e t ea n a l y z e db y ac o m b i n a t i o no ff l u o r e s c e n ti ns i t uh y b r i d i z a t i o n 、析mf l o wc y t o m e t r y t h eb a c t e r i c a lc o m m u n i t ys t r u c t u r e so fa c t i v a t e ds l u d g es a m p l ef r o maa e r a t i o n b a s i nw e r ea n a l y z e d 、i mo l i g o n u c l e o t i d ep r o b e ss p e c i f i cf o rt h ea l p h a ，b c t a ，o r g a m m as u b c l a s s e so fp r o t e o b a c t e r i a ，f o rt h ec y t o p h a g a f l e x i b a e t e r i u mg r o u p ，f o r g r a m p o s i t i v ew i t hh i g hg + cd n a c o n t e n t t h es h o w st h a tt h ed o m i n a n tb a c t e r i a l c o m m u n i t yw a sp r o t e o b a c t e r i a 、j v i t i ia r e l a t i v ea b u n d a n c eo f5 8 3 r e s p e c t i v e l yu - 、 p 、7 - p r o t e o b a c t e r i a w e r e1 7 8 、1 9 8 、2 0 7 ；c f g r o u p w a s 2 1 6 ；h g c g r o u p w a s1 9 ，9 t og i v eu sau s e f u lr e f e r e n c ef o ri m p r o v i n gt h ea c t i v a t e ds l u d g eb i o l o g i c a l a c t i v i t yb yt h el o we n e r g y b e a mi m p l a n t i n g t h ec h a n g e so f m i c r o b i a lc o m m u n i t i e s o fa c t i v a t e ds l u d g ed u r i n g3 0 k e v 旷b e a m i m p l a n t i n gw g l ea n a l y z e db yf i s ha n d f c m t h er e s u l t ss h o w e dt h a tu n d e rt h el o wd o s eo f5 x 1 0 1 4n + c m 2 ，t h ec h a n g e so f b a c t e r i a lc o m m u n i t i e si na c t i v a t e ds l u d g ew e r ev e r ys m a l l ；u n d e rt h eh i g hd o s e st h e c h a n g e so f b a c t e r i a lc o m m u n i t i e si na c t i v a t e d s l u d g ew e r er e l a t i v e l yl a r g e ， r e s p e c t i v e l yr e l a t i v e l yb a c t e r i a ln u m b e ro fy - p r o t e o b a c t e r i ai n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y u n d e rt h ed o s eo fl x l 0 1 5n + c m 2a n dr e l a t i v e l yb a c t e r i a ln u m b e ro fc t - p r o t e o b a c t e r i a i n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yu n d e rt h ed o s eo f5 x 1 0 1 5n + c m 2 t h ec h a n g e so fb a c t e r i a l c o m m u n i t i e si na c t i v a t e ds l u d g eu n d e rl o we n e r g yn + b e a mi m p l a n t i n gp r o v e dt h a t i i 郑州大学硕士学位论文f c m 检测低能n + 注入对活性污泥微生物菌群的影响 d i f f e r e n tb a c t e r i a lg r o u p sh a dd i f f e r e n ts e n s i t i v i t yt ol o w e n e r g yn + i tc o u l dm a k eu s t ou s em a n yd o s e so fn + w h e nw ee n g a g ei na c t i v a t e ds l u d g em i c r o b i a lc o m m u n i t y b r e e d i n g k e yw o r d s ：a c t i v a t e ds l u d g e ，b a c t e r i a lc o m m u n i t y ，f l u o r e s c e n ti ns i mh y b r i d i z a t i o n , f l o we y t o m e t r y ，l o we n e r g yi o nb e a m i i i 郑州大学硕士学位论文 f c m 检测低能n 十注入对活性污泥微生物菌群的影响 引言 活性污泥法是当今世界各国广泛使用的污水处理工艺之一，而活性污泥是污 水处理厂曝气池内有机污染物质转化的主体，其生物活性的高低主要取决于其中 的微生物菌群结构和功能，因此，活性污泥微生物菌群研究一直是环境科学、生 态学和环境工程等领域的研究重点。由于环境中大部分微生物都处于一种活的但 不可培养( v b n c ) 的状态，传统纯培养分离方法鉴定的微生物只占活性污泥中 微生物的l - 1 5 。上世纪8 0 年代后期，随着免培养的现代分子生物学技术的出 现，以1 6 sr r n a 为基础的荧光原位杂交技术和新型的流式细胞术开始应用到活 性污泥环境微生物菌群研究，活性污泥中菌群的复杂性和多样性以惊人的速度被 人类认识，大量传统检测方法未能发现却在活性污泥中起关键作用的微生物逐渐 被发现。 荧光原位杂交( f l u o r e s c e n ti ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) 可以在单细胞水平 上对不同类群的细菌进行原位的定性定量分析，使荧光染料标记的寡核苷酸探针 和完整的固定细胞内的目标核酸( 如r r n a ) 特异结合，通过荧光显微镜或流式 细胞术进行检测。流式细胞术( f l o wc y t o m e t r y ，f c m ) 是对处在液体中的细胞 或其他生物微粒逐个进行多参数快速( 1 0 3 细胞，秒) 定量分析和分选的技术，具有 自动而快速、客观、直接和同时检测多参数的优点，可以很好的避免显微术人工 计数的主观性偏差。f i s h 和f c m 都是最近发展起来的现代生物技术，弥补了传 统培养方法的局限性，可以快速、客观、直接地检测环境微生物的类群结构。在 国内外研究中已有广泛应用，尤其是在土壤和水生环境微生物上，但对活性污泥 微生物菌群的研究还相对较少。 本文利用f i s h 和f c m 结合研究低能耐对活性污泥菌群结构的影响，首先 优化了杂交过程中的探针浓度和杂交时间的试验条件，在此优化基础上，检测活 性污泥中小、p 、丫- 变形杆菌亚纲、c f 类群、h c r c 类群的相对菌群含量，并检 测低能n + 注入后活性污泥中菌群结构的变化。 郑州大学硕十学位论文f c m 检测低能n + 注入对活性污泥微生物菌群的影响 1 文献综述 1 1 活性污泥 1 9 1 2 年英国人c l a r k 和c a g e 发现对废水迸行长时间曝气会产生污泥并使水 质明显改善，其后a r d e n 和l a c k e t t 进一步研究，发现由于实验容器洗不干净， 瓶壁留下残渣反而使处理效果提高，从而发现活性微生物菌胶团，定名为活性污 泥。 i i 1 活性污泥法的基本流程 1 9 1 6 年英国建成第一座污水处理厂，图1 1 为活性污泥处理工艺基本流程图。 废水 图1 1 活性污泥基本工艺流程 f i g ，1 1 。t h ef l o wc h a r to f a c t i v a t e ds l u d g ep r o c e s s 活性污泥法是由初沉池、曝气池、二沉池、曝气系统以及污泥回流系统组成。 流程中，活性污泥为主体，通过回流污泥和初沉池出水一起进入曝气池，互相混 和接触，废水中可生物降解的有机物质被微生物所利用，在利用过程中，进水 b o d 5 得以降低，而活性污泥量增加。从曝气池流出的混合液( 活性污泥和废水的 混合体) ，进入二沉池予以固、液分离，分离后上层水排出系统，底层污泥部分 回流到曝气池，大部分则排出，进行进一步消化处理i i 。 1 1 2 活性污泥的性质和组成 活性污泥是活性污泥处理系统中的主体作用物质，在废水生物处理中有着广 泛的应用，通过处理系统中活性污泥微生物的新陈代谢作用，把废水中的有机物 分解为无机物，从而达到净化废水的目的。活性污泥法污水的处理效果同组成活 郑州大学硕士学位论文f c m 检测低能n + 注入对活性污泥微生物菌群的影响 性污泥中微生物的种类、数量及其活性有关。 良好的活性污泥具有很强的分解有机物的能力和良好的沉降性能，絮凝体的 大小约为0 0 2 0 2 m m ，多为黄褐色，微具土壤味，密度约为1 0 0 5 9 c m 2 ，含水率 9 9 左右。活性污泥由有机物及无机物两部分组成，组成比例因污泥性质的不同 而异。例如，城市污水处理系统中的活性污泥，其有机成分占7 5 8 5 ，无机成 分仅占1 5 2 5 。活性污泥中有机成分主要由生长在活性污泥中的微生物组成【3 1 。 活性污泥中的微生物主要由细菌、放线菌、真菌以及原生动物和后生动物等构成， 其中细菌是最主要成分。原生动物以细菌为食物，后生动物以细菌和原生动物为 食物。它们之间构成了一个相对稳定的生态系统和食物链。 细菌是活性污泥的组成和净化功能中心，是活性污泥有机相的最主要成分。 活性污泥上的细菌以好氧、异养型细菌为主，其中主要有动胶杆菌属( z o o g l o e a ) 、 假单胞菌属( p s e u d o m o n a ss p p ) 、芽孢杆菌属( b a c i l l u ss p p ) 、小球菌属 ( m i c r o c o c c u ss p p ) 、黄杆菌属( f l a v o b a c t e r i u ms p p ) 、产碱杆菌属似l c a l i g e n e s s p p ) 、无色杆菌属似c h r o m o b a c t e rs p p ) 、产气杆菌属( a e r o b a c t e rs p p ) 、棒状杆菌 属( c o r y n e b a c t e r i u ms p p ) 、八叠球菌属( s a r c i n as p p ) 、螺茵属( s p i r i l l u ms p p ) 、诺 卡氏菌属( n o c a r d i as p p ) ；q , 4 1 。 活性污泥中的许多细菌具有凝聚、绒粒化的性能。如动胶菌属、埃希氏大肠 杆菌、产碱杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、黄杆菌属等都具有絮凝能力。因 此，在活性污泥中，细菌通常以菌胶团形式存在，只有少数以游离状态存在。所 谓菌胶团，就是由细菌以及细菌分泌的胶质组成的绒粒，它是一个相当复杂的微 生物群落l 。 1 2 活性污泥微生物菌群的研究方法及进展 活性污泥是污水处理厂曝气池内有机污染物质转化的主体，其生物活性的高 低从根本上决定了一个污水处理厂的污水处理能力，而活性污泥的生物活性又主 要取决于其中的微生物菌群结构和功能。活性污泥中的微生物主要由细菌、放线 菌、真菌以及原生动物和后生动物等构成，其中细菌是最主要成分。因此，活性 污泥微生物菌群研究一直是环境科学、生态学和环境工程等领域的研究重点。 2 0 世纪8 0 年代之前，活性污泥菌群的研究主要以传统分离培养法为主。该方 郑州大学硕士学位论文f c m 检测低能n 十注入对活性污泥微生物菌群的影响 法从活性污泥中发现的主要优势菌群有：动胶杆菌属、假单胞菌属、螺菌属、产 碱杆菌属、黄杆菌属、不动杆菌属( a c i n e t o b c t e r ) 、短杆菌属( b r e v 西a c t e r i u m ) 、 和丛毛单胞菌属( c o m a m o n a s ) 等【6 8 1 。但是后来大量研究发现，在活性污泥中 经典纯培养方法能够培养的细菌数量只占活性污泥微生物总数的1 1 5 【9 】。 因此，对活性污泥菌群新研究方法的探索是2 0 世纪8 0 年代的当务之急。 2 0 世纪8 0 年代后期，随着以1 6 s r r n a 为主要基石的细菌分子分类学的发展， p c r 技术、电泳技术、克隆文库技术、荧光原位杂交( f i s h ) 和流式细胞术( f c m ) 等免培养的分子生物学技术( c u l t i v a t i o n - i n d e p e n d e n tt e c h n i q u e ) 逐渐成为研究活性 污泥菌群的主要手段，活性污泥中菌群的复杂性和多样性也以惊人的速度被人们 认识，大量传统检测方法未能发现却在活性污泥中起关键作用的微生物陆续被发 现，如：具有除磷作用的红环菌( r h o d o c y c l u s ) 类似菌、小月菌( m i c r o l u n a t u s s p p ) 、 类乃f ，扭妒砌e m 的棒状菌、俊片菌( l a m p r o p e d i as p p ) 等“o 。1 2 l ；具有脱氮作用的 反硝化生丝微菌属( h y p h o m i c r o b i u m ) 、固氮弧菌属( a z o a r c u ) 相关菌、硝化 螺菌( n i t r o s p i r a ) 类似菌等【1 3 - 1 5 1 ；与污泥泡沫有关的诺卡氏菌形放线菌 ( n o c a r d i o f o r ma c t i n o m y c e t e s ) 、丝状菌( m i c r o t h r i xp a r v i c e l l a ) 和n o s t o c o i d a l i m i c o l a 等1 1 6 1 。 免培养技术的出现和完善，使环境微生物学家能够直接使用污泥材料研究和 了解活性污泥菌群的结构和丰度，活性污泥中许多建立在1 6 s r r n a 基础上的新 的微生物类群被人类认识，这大大加深了人们对活性污泥菌群结构的认识。为了 深入了解免培养法发现的大量新菌群的生理特性和作用机制，上世纪9 0 年代后 期许多模拟活性污泥菌群生存环境的现代培养技术开始发展1 1 7 1 ，现已成功培养 了一部分传统分离培养技术不能培养的新培养物【1 9 1 ，这无疑将把人们对活性 污泥菌群的研究推向一个新的层次。 1 2 1 传统的分离培养方法 传统的分离培养法是将定量样品接种于高浓度营养物的选择性培养基中，对 生长的菌落计数，并通过观察各种微生物的生理生化特性及形态构造等进行种属 分类鉴定。作为微生物研究的经典手段之一，分离培养方法在研究活性污泥菌群 过程中起到十分重要的作用。 1 9 6 4 年d i a s 等采用平板分离法从活性污泥的7 个样品中分离了3 0 0 多个菌株， 郑州大学硕士学位论文f c m 检测低能n + 注入对活性污泥微生物菌群的影响 其中最占优势的是动胶杆菌属和丛毛单胞菌属 6 1 。1 9 7 1 年b e n e d i c t 等从实验室和 城市污水处理厂的两种活性污泥样品中培养、挑取1 2 9 个菌落，经鉴定主要有不 动杆菌属、产碱杆菌属、短杆菌属、丛毛单胞菌属、黄杆菌属、假单胞菌属等【8 1 。 此法要求比较简单，很适合用来分离一些具有一定功能的微生物，还常用于 一些科研工作者的初步研究。但是此法有很大的局限性：培养基对某些菌群的 选择性；某些细菌和其它细菌之间有共生现象，不能单独生长( 此类细菌占至 今未能培养微生物的很大一部分) ；很多细菌具有难以分辨的相似形态、生理 生化特性。所以，此方法不能真实的反映活性污泥菌群结构，尤其是对那些具有 重要功能仍未能培养的菌群的检测 9 】。 1 2 2 生物标记物法 生物标记物法( b i o m a r k e r ) 是在分类学上通过细胞特有的脂肪酸、呼吸醌 等“环境样品信号”来表征、区分和鉴定细菌属、种和株等的方法。此方法可以避 免形态观察方法带来的人为误差，从而进行定性定量分析。 1 2 2 1 脂肪酸图谱分析术 常用的脂肪酸图谱法可分为两种：磷脂脂肪酸( p l f a s ) 图谱法和全细胞脂肪 酸甲酯( w c f a - f a m e s ) 图谱, 法t 2 0 l 。前者的优点是准确、可靠：而后者的优点是 提取简捷，所需样品量少。脂肪酸异丙酯( f a p e s ) i 虱谱法是最近发展的一种脂肪 酸图谱法，采用强度更低的试剂( 酸性异丙醇) 和更简便的处理方法将提取的脂肪 酸异丙基化，分析的对象是脂肪酸异丙酯。脂肪酸通常具有属的特异性，不同微 生物具有不同的脂肪酸种类和数量，因此，可以通过脂肪酸图谱分析来快速有效 监测群落的微生物结构变化。 w e r k e r 等同时采用m i d i f a m e 图谱法和f a p e s 图谱法分析了城市污水处 理厂活性污泥中的菌群结构，结果发现二者相似但存在一定的差别，可期待用校 正因子的方法来比较两种方法的差别，研究还说明，脂肪酸异丙酯( f a p e s ) 具有 简便、灵敏、可重复的特点，对环境微生物群落结构的分析有很大的应用前景1 2 0 l 。 c o n r a d 等对2 个污水处理厂的活性污泥絮凝体进行脂肪酸图谱比较分析，结果 发现菌群结构有所差异，但脂肪酸图谱相似1 。 脂肪酸图谱法虽然能够快捷有效的从环境样品中提取脂肪酸进行微生物群 落结构的分析，但也有一定的局限性：对微生物的分类水平较低，不能鉴定到 郑州大学硕士学位论文f c m 检测低能n + 注入对活性污泥微生物菌群的影响 种：对标记脂肪酸有强烈的依赖性：复杂的环境微生物样品中不同微生物种 属之间脂肪酸组成的重叠和外来生物污染容易导致一定的偏差。 1 2 2 2 醌类图谱分析术 醌类图谱( q u i n o n ep r o f i l e ) 法是以特征化合物醌为标记来解析微生物群体组 成的方法。有两类主要的呼吸醌：泛醌( u b i q u i n o n e ，u q ) j ! 1 辅酶q 和甲基萘醌 ( m e n a q u i n o n e ，m k ) 即维生素k 1 2 2 1 。不同的微生物含有不同种类和分子结构的醌， 因此，醌的多样性可定量表征微生物的多样性，醌图谱的变化可表征群落结构的 变化。 h i r a i s h i 等比较了增强型生物除磷( e b p r ) 类型或一般类型、自然污水或人 工污水、处理厂规模或实验室规模不同情况下的活性污泥菌群结构的生物醌图 谱，发现泛醌( q ) 和甲基萘醌( m k ) 的摩尔比( m k q ) 总体上为0 4 5 5 0 9 8 1 ， 数据显示e b p r 和一般活性污泥中的主要组成菌都是属于p 变形杆菌的含q 8 菌 种，其次是属于高g + c 的革兰氏阳性菌( h c r c ) 的放线菌门】。 虽然此方法是一种可靠的分析方法，然而也存在一定的局限性，它不能反映 具体某个属或种的变化。 1 2 3 现代分子生物学法 2 0 多年前，以1 6 sr r n a 为主要基础的p c r 技术、电泳技术、克隆文库技术、 荧光原位杂交和流式细胞术等免培养的分子生物学技术开始应用到活性污泥菌 群的研究，真实反映了环境样品中菌群的结构和丰度，避免了传统方法在菌群检 测中低丰度易培养细菌被高估的局限性，促进了活性污泥菌群高度多样性的研 究。最近的研究也多以1 6 sr r n a 序列分析的分类系统为基础，从a 、p 、t 变形 杆菌( p r o t e o b a c t e r i a ) 亚纲类群、c f ( c y t o p h a g a - f l a v o b a c t e r i u m o f b a c t e r o i d e t e s ，c f ) 类群、h g c ( g r a m - p o s i t i v ew i t hh i g l l g + cd n a c o n t e n t ) 类群 等细菌类群来研究活性污泥的菌群结构。 f u h s 和c h e n 利用传统分离培养法研究认为，属于y 变形杆菌亚纲的不动杆菌 是活性污泥中除磷的优势菌( 占总培养菌落的3 0 6 0 ) 1 2 4 1 。但是，w a g n e r 等 利用分子生物学方法研究发现，不动杆菌数量很少( 仅占总细菌的i o o - 1 0 ) ， 并没有聚磷作用，只是由于其易培养性被高估了【2 5 1 ，同时，发现在活性污泥中 大量存在的是p 、a 变形杆菌和h g c 。大量研究表明，p 变形杆菌是活性污泥中 郑州大学硕士学位论文 f c m 检测低能n + 注入对活性污泥微生物菌群的影响 丰度最大的类群，其次有a 一、7 - 变形杆菌亚纲类群、h g c 类群、c f 类群和放线菌 ( a c t i n o b a c t e r i a ) 、绿弯菌( c h l o r o f l e x i ) 、硝化螺旋菌( n i t r o s p i r a ) 和浮霉菌 ( p l a n c t o m y c e t e s ) 等【1 1 2 ”。 1 2 3 1p c r 及其相关技术 1 2 3 1 1t r f l p 末端限制性片段多态性( t e r m i n a l r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m t - r f l p ) 法是由r f l p 发展而来的方法，又称为1 6 sr r n a 基因的末端限制性片 段，是将p c r 引物中的一条加以荧光标记，对扩增产物用限制性内切酶进行切 割并电泳，根据片断的大小不同以及标记片断种类和数量的不同来分析群落的结 构及组成。 现在很多研究人员利用t - r f l p 来研究活性污泥的微生物菌群结构，还用来 监测因环境改变而引起的菌群变化 3 2 1 。t s u n e d a 等以亚硝酸盐还原酶基因( n i t r i t e r e d u c t a s eg e n e ，n i r s ) 为基础对一个序批反应器( s b r ) 的反硝化聚磷菌 ( d e n i t r i f y i n gp o l y p h o s p h a t e a c c u m u l a t i n go r g a n i s m s ，d n p a o s ) 进行r f l p 分析， 发现一个占7 0 所有克隆的n i r s 克隆，其序列相似于红环菌类群的两类细菌： t h a u e r am e c h e r n i c h e n s i s ( 8 3 相似性) 和a z o a r c u s 肋肠眇i c u s ( 8 3 桂 似性) t 3 3 】。 1 2 3 1 2e r i c p c r e r i c p c r 实际上是一种长引物r a p d 技术。e r i c 序列( e n t e r o b a c t e r i a l r e p e t i t i v ei n t e r g e n i cc o n s e n s u ss e q u e n c e ) 是首先在肠道细菌基因组中发现的长为 1 2 6 b p 的非编码保守重复序列，该序列在细菌染色体上分布的多态性允许设计特 异引物对其进行扩增而形成具有种、属、菌株特异性的指纹图谱，已经被广泛应 用于纯培养细菌的鉴别、分类、基因组多样性和系统进化等方面的研究刚。陈 敏等人用e r i c p c r 指纹图谱技术检测了活性污泥菌群结构及其变化，结果表明， 在缺氧池和好氧池之间，各个采样点的e r i c p c r 图谱差异不大，悬浮污泥在各构 筑物之间交流充分；同一采样点的图谱在不同采样时期具有明显差异【3 5 1 。 e r i c p c r 的局限性：不能提供关于种群组成的信息；重现性差；由 于长度相同的d n a 片断其序列不同，可能会高估样品问的相似性。e r i c p c r 与 其他分子生物学技术相结合使用可能更加准确地反映微生物群落结构。 1 2 3 1 3d g g e t g g e 郑州大学硕十学位论文 f c m 检测低能n + 注入对活性污泥微生物菌群的影响 变性腽度梯度凝胶电泳( d e n a t u r i n g t e m p e r a t u r eg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s d c r g e f r g g e ) 是依据双链d n a 片断熔解行为的不同，分离p c r 产物中长度相同 但序列不同的d n a 标记片断( r r n a 或r d n a ) 。从理论上讲，d g g e f i g g e 指纹图 上的一个条带就代表一个微生物类群( 分类水平可达种) 。因而，指纹图谱不但直 观反映了微生物群落的结构和多样性，还可方便判断出优势菌或功能菌。 此方法已经广泛应用于活性污泥菌群的研究 3 6 - 3 9 1 。o n u k i 等对一个添加乙酸 盐s b r 反应器的活性污泥中除磷的菌群结构进行p c r - d g g e 分析，发现红环菌属 ( 属于p - 变形杆菌) 相关菌是积磷菌。并利用这种p a o s 的特异探针进行荧光原位杂 交( f i s h ) 和d a p i 染色，研究进一步说明红环菌属相关菌确实有聚磷作用【帅】。 l i m p i y a k o m 等以1 6 sr d n a 为基础对东京8 个污水处理厂的1 2 个活性污泥样品中 氨氧化细菌( a o b ) 的群落结构进行d g g e 分析，结果显示，每个处理厂低氨浓 度的污水d p n i t r o s o m o n a ao l i g o t r o p h a 类似细菌占优势，仅在一个相对高氯化氨浓 度的a 2 0 系统中恢复至l j n i t r o s o m o n a se u r o p a e a - 和n i t r o s o m o n a sc r y o t o l e r a n s 类似 序列，在每一个a 2 0 和a o 系统都发现m t r o s o m o n a sc o m m u n i s 类似序列，但在一 个a s 系统几乎没有发现，总之，污水特性和运行参数都会影响a o b 群落结构【4 ”。 该法回收的d n a 片断，通过测序后与基因序列数据库中的已知序列比较， 可以确定其种系发育位置，还可设计成探针，用荧光原位杂交( f i s h ) 技术监 测微生物菌群的变化。但是d g g e 对有多个不同碱基序列差异的d n a 片段的分离 有一定局限性，可能低估了环境微生物的种群多样性。 1 2 3 1 4s s c p 单链构象多态性研究( s i n g l es t r a n dc o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s m ，s s c p ) 方法， 是指呈复杂空间折叠构象的单链d n a 或r n a 片段，当有一个碱基发生改变时，空 间构象便发生改变，空间构象有差异的单链分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小 不同。因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳( p a g e ) ，可以非常敏锐地将构象上 有差异的分子分离开。 s a b i n e 等用该法研究活性污泥菌群结构和演替，并同传统的培养方法比较指 出s s c p 方法避免了传统培养的费时费力以及误差大的干扰，适合对微生物群落结 构和演替的分析旧。d a b e r t 等利用s s c p 法研究b i o a u g m e n t a t i o n 对e b p r 实验室反 应器的活性污泥除磷作用的影响，发现p a o s 和g a o s 的竞争是e b p r 启动成败的 郑州大学硕十学位论文f c m 检测低能n 十注入对活性污泥微生物菌群的影响 关键【4 3 】。 1 2 3 1 5r t p c r 实时荧光定量p c r ( r e a l - t i m ep c r ，i m p c r ) 技术，是指在p c r 反应体 系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个p c r 进程，最后通过标准 曲线对未知模板进行定量分析的方法。 2 0 0 5 年l i m p i y a k o m 等用该法对活性污泥的氨氧化细菌进行定量检测，并结 合使用p c r d g g e 、1 6 sr r n a 测序分析研究了氨氧化细菌的群落结构，结果表 明，氨氧化菌总数会随季节变化，而菌群结构没有变化，检测到的主要菌群 1 5 】 与2 0 0 4 年进行d g g e 检测的结果基本一致。 由于该技术不仅实现了p c r 从定性到定量的飞跃，而且与常规p c r 相比， 它具有特异性更强、有效解决p c r 污染问题、自动化程度高等特点，目前已得 到广泛应用。 1 2 3 1 61 6 sr r n a 序列比较 尽管p c r 产物经d g g e 等电泳技术后的凝胶条带可以通过回收测序进行菌 群分类初步分析，然而通过建立细菌1 6 sr r n a 文库的方法可以进行更为深入的 分析。r r n a 序列比较是通过比较分析缓慢进化的r r n a 分子成分，从而在微生 物系统发育上进行分类。其主要步骤包括：样品中总d n a 的提取；建立基 于丸噬菌体的d n a 克隆文库；以种类特异性的1 6 sr r n a 探针筛选文库； 测序；序列的比较分析。目前，该法在活性污泥微生物菌群检测方面已有很广 泛应用 4 5 - 4 7 】。 k o n g 等通过利用该法在活性污泥中发现十变形杆菌的一个多形球杆菌 ( c o c c o b a c i l l i ) 新分支，并进行f i s h 研究发现此新类群广泛分布，在9 个e b p r 类型( 占总细胞数的1 0 5 0 ) 和4 个一般类型( 1 1 0 ) 中显著出现4 6 1 。c h o u a r i 等 对活性污泥中浮霉菌门的多样性进行1 6 sr r n a 序列分析，发现了4 个已知菌属 p i r e l l u l a ( 3 2 ) ，p l a n c t o m y c e s ( 1 8 4 * 0 ) 、g e m m a t a ( 3 8 铆和i s o s p h a e r a ( o 4 ) ，并 设计新特异探针进行f i s h 检测发现活性污泥中存在很多此类群的细菌 4 t i 。l i u 等通过对除磷活性污泥中的1 1 4 个克隆进行1 6 sr r n a 序列分析，并结合f i s h 研究发现，污泥中的多样性类群有：变形杆菌( 7 1 o ) 和黄杆菌( 2 3 7 ) ，还有新 类群p l a n c t o m y c e t a l e s ( 2 6 ) 、v e r r u c o m i c r o b i a l e s ( 1 8 ) 和f i r m i c u t e s ( o 9 ) t 3 0 1 。 郑州大学硕士学位论文f c m 检测低能盯注入对活性污泥微生物菌群的影响 1 2 3 2m i c r o a r r a y 技术 微阵列( m i c r o a r r a y ) 或生物芯片技术的引入增强了核酸杂交技术解析微 生物群落结构和多样性的能力。d n a 微阵技术含多种不同d n a 探针，可以对于 那些还没有可行探针信息的情况进行随机基因组杂交，从而检测出环境样品的复 杂菌群中的特异菌种，还可测定结构和多样性已知的群落的变化，更因其高度并 行性、微型性、自动化和快速检测的特点，显示出广阔的应用前景【艟一9 1 。 k i m 等以不同属的1 3 个菌株作为目标，建立d n a 微阵芯片对纯培养和混 合培养细菌进行实验，结果显示，不需要纯培养菌株的任何种系发育水平的序列 信息即可通过d n a 微阵芯片来检测特定菌种，对活性污泥样品中的特定菌种检 测也是一种快速特异的方法【4 s 1 。l o y 等为了检测b 变形杆菌的红环菌的数量，发 展了1 6 sr r n a 目标的7 9 个寡核苷酸探针的微阵列( r h c - p h y l o c h i p ) ，直接用 于活性污泥中红环菌目的多样性分析，试验表明可以检测相对丰度不到总菌数 l 的红环菌，另外，对未能培养的动胶杆菌、f e r r i b a c t e r i u m 、d e c h l o r o m o n a s 和s t e r o l i b a c t e r i u m 相关菌的分析证明r h c p h y l o c h i p 确实是一个研究环境微生 物菌群的新型有力工具【4 9 】。 1 2 3 3 荧光原位杂交技术( f i s h ) 及其相关技术 荧光原位杂交技术( f l u o r e s c e n t i ns i t u h y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) 是由g a l l 和p a r d u e 最早描述，其间经历了放射性标记探针阶段和荧光标记探针阶段。与放射性探针 相比，荧光探针具有以下优点：安全、简便、灵敏、快速、可同时检测几种微生 物。 核酸荧光原位杂交是指通过荧光标记的寡核苷酸探针特异地和互补核酸序 列在完整的细胞内结合，用显微镜和流式细胞术等荧光检测技术进行观察和分 析。核酸探针是通过比较1 6 sr r n a 序列和数据库中的序列进行设计，可在不同 水平( 类群、属、种等) 上进行目标细菌的原位检测。具体过程包括以下几步： 固定标本；预处理样品；用相应的探针进行杂交；洗掉未结合的探针； 信号的仪器( 普通荧光显微镜、共聚焦激光扫描显微镜或流式细胞仪) 检测及结 果分析。 影响f i s h 的主要因素有：细胞的通透性。一般需要用多聚甲醛等交联剂 对细胞进行固定，从而使细胞有较好的通透性。有时还需要再用有机溶剂、酸或 郑州大学硕士学位论文f c m 检测低能n + 注入对活性污泥微生物菌群的影响 酶进行处理1 5 0 1 。如果细胞的通透性不好，那么探针就很难进入到细胞内部从而 和靶序列杂交，导致结果的假阴性；靶位点的可结合性。细胞内的某些r r n a 靶序列会因为和核糖体蛋白的相互作用或是自身形成稳定的二级结构而阻止探 针和其结合。因此，要设计能和比较好的r r n a 靶位点互补的寡核普酸探针；原 位杂交的灵敏度。目前己经发展了许多方法来提高原位杂交的灵敏度，如多个单 一标记的探针5 ”、多标记探针【5 2 1 、酶联探针或检测系统【”i 。另外，高灵敏度的 照相系统也可以大大提高原位杂交的灵敏度：靶位点的特异性。随着数据库中 1 6 sr r n a 基因的增加，探针的特异性问题越来越被人们所重视，要设计分辨能 力很好的探针也越来越难。a m a n n 等人构建了最佳r d n a 探针分布图【9 l 。另外， 也可以利用a r b ( h t t p ：w w w a r b - h o m e d e ) 【矧或其它的软件根据数据库序列设计 比较合适的探针。