（动物遗传育种与繁殖专业论文）我国四个鲤鱼种群的遗传多样性分析.pdf

上海海洋大学学位论文原创性声够嘞 学位论文作者签名：压宁杰绳 上海海洋学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅或借阅本人授权上海海洋大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密 口 ，在年解密后适用本版权书。 不保密 口 学位论文作者签名： 日期：年月日 指导溯签名：新缸 日期：土f 。年r 月巧日 渔渔洋太堂博硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名工作单位职称备注 徐跑淡水中心研究员主席 傅洪拓淡水中心研究员委员 董在杰淡水中心研究员委员 许学勤江南大学副教授委员 俞菊华淡水中心研究员委员 委员 委员 谢婷婷淡水中心研究实习员秘书 答辩地点淡水中心答辩日期 2 0 1 0 一6 2 上海海洋大学硕士学位论文 我国四个鲤鱼种群的遗传多样性分析 摘要 鲤鱼是世界上重要的淡水养殖鱼类之一，经过自然选育和人类的遗传选育形 成了众多自然种群和人工选育品种，因此分析和了解其遗传变异对鲤鱼种质资源 的保护和遗传性状的改良具有重要的意义。 核糖体内转录间隔区1 ( i t s 1 ) 介于核糖体d n a ( r d n a ) 的1 8 s 和5 8 s 之 间，是非编码区序列，最终不加入成熟核糖体，其受到的选择压力较小，进化速 度快，能提供比较丰富的核苷酸变异位点和信息位点，适合物种间和种群水平上 的系统发生研究。本课题以黑龙江野鲤、黄河鲤、建鲤和荷包红鲤作为研究对象， 从尾鳍中提取d n a ，参考g e n b a n k 数据库里金鱼( c a r a s s i u sa u r a t u s ) 、欧鳊 ( a b r a m i sb a l l e r u s ) 等鲤科鱼类核糖体序列设计引物，进行p c r 扩增，并对产物进 行序列测定。研究表明四个种群间存在中等的遗传分化，遗传距离随着地理距离 的增加而逐步增大，四个种群主要的遗传变异来源于种群内部；由i t s 1 序列构建 的系统进化树分析，四个种群分为南北两大分支，北支由黑龙江野鲤与黄河鲤组 成，南支则包括建鲤和荷包红鲤；另外，通过与g e n e b a n k 数据库中鲤鱼的欧洲亚 种i t s 1 序列的比对，本研究获得了一个可以鉴别鲤鱼亚洲亚种和欧洲亚种的微卫 星标记( a g g a ) 3 4 ，黑龙江野鲤也不属于鲤鱼的亚洲亚种，而应该是鲤鱼亚洲亚 种和欧洲亚种之间的遗传交流桥梁或是两个亚种混合区，对这两个亚种i t s - l 序列 的二级结构预测表明，重复序列导致的i t s 1 序列长度的改变并没有造成二级结构 整体结构的变化，只是导致了局部内环、凸起和发夹结构的改变。 本课题还应用a f l p 分子标记，对这四个鲤鱼种群进行了遗传变异的分析。 结果发现：四个种群的多态性位点百分较高为5 4 3 8 ，遗传相似系数为 i = 0 8 6 4 0 8 9 9 ( 遗传距离d s = 0 1 0 6 0 1 4 6 ) ，黑龙江野鲤遗传变异最高，而黄河鲤鱼 最低，四个鲤鱼种群的相似性指数均处于中度多态偏高水平，3 1 1 9 的遗传变异 来自各种群间，6 8 8 1 的遗传变异来自种群内，总的遗传分化指数g ，为o 1 7 8 5 0 ， 四个鲤鱼种群间有极显著的遗传分化( p 0 0 1 ) ，各种群在当前的生存环境中种质 资源良好，能较好地生存繁衍，具有一定的种群稳定性：u p g m a 聚类分析表明， 黑龙江野鲤种群和黄河鲤种群聚为一支，构成了北方群体：建鲤和荷包红鲤两个 种群聚在一起，构成了南方群体；而建鲤经历连续多代的人工选育后，已经逐渐 i 上海海洋大学硕十学位论文 分化，与亲本荷包红鲤的亲缘关系逐渐变远，开始形成自己稳定的遗传结构。 关键词鲤鱼，核糖体转录间隔区1 ( i t s 1 ) ，a f l p ，遗传多样性 上海海洋大学硕+ 学位论文 g e n e t i cd i v e r s i t yo ff o u rd o m e s t i cp o p u l a t i o n so fc o m m o n c a r pc y p r i n u sc a r p i ol a b s t r a c t c o m m o nc a r pc y p r i n u sc a r p i ol i so n eo ft h em o s te x t e n s i v ec u l t i v a t i o nf i s h s p e c i e sa n di m p o r t a n tf r e s h w a t e rf i s hi nt h ew o r l d b e c a u s eo f t h en a t u r a ls e l e c t i o na n d a r t i f i c i a l b r e e d i n g ，m a n yg e o g r a p h i c a lp o p u l a t i o n s a n ds t r a i n so fc o m m o nc a r p c o m m o nc a r pc y p r i n u sc a r p i ol h a v eb e e nf o r m e d t h e r e f o r e ，k n o w l e d g eo fg e n e t i c v a r i a t i o na n dp o p u l a t i o ns t r u c t u r eo fe x i s t i n gs t r a i n sc o m m o nc a r pc o m m o nc a r p c y p r i n u sc a r p i ol i sa b s o l u t e l yn e c e s s a r yf o ra n ye f f i c i e n t f i s hm a n a g e m e n ta n d c o n s e r v a t i o np r o g r a m f i r s tr i b o s o m a li n t e m a lt r a n s c r i b e ds p a c e r sa r el o c a t e d i ne u k a r y o t i cr r n a b e t w e e nt h e18 sa n d5 8 sr r n ac o d i n gr e g i o n s b e c a u s eo ft h e i rr e l a t i v e l yh i g h v a r i a b i l i t ya n df a c i l i t yo fa m p l i f i c a t i o n ，a n da r ep r e s e n ti na l lk n o w n n u c l e a rr r n ao f e u k a r y o t e s ，t h e s es e q u e n c e sa r eu s e f u lf o rp h y l o g e n e t i ca n a l y s i sa m o n g r e l a t e ds p e c i e s a n d o ra m o n gp o p u l a t i o n sw i t h i nas p e c i e s h e i l o n g j i a n gc a r p ，y e l l o wr i v e rc a r p ，j i a n c a r pa n dh e b a or e dc a r pw e r es t u d i e di no u rr e s e a r c h w eh a v es e p a r a t e da n dp u r i f i e d d n af r o mc a u d a lf i nt i s s u e s ，f r o mw h i c hi t s - 1w a sa m p l i f i e da n ds e q u e n c e d w e d e s i g n e dp r i m e r sb a s e do nt h e i t ss e q u e n c e so fc a r a s s i u sa u r a t u sa n da b r a m i s b a l l e r u sp r o m u l g a t e db yg e n b a n k t h es t u d ys h o w e dt h a t f o u rc o m m o nc a r p p o p u l a t i o n sh a v et h em e d i u ml e v e lo fg e n e t i cd i v e r s i t y , a n dm o s tg e n e t i cd i v e r s i t yw a s w i t h i np o p u l a t i o n p h y l o g e n e t i ct r e es h o w e dt h a tf o u rc o m m o nc a r pp o p u l a t i o n sw e f t c l u s t e r e di n t ot w om a j o rc l a d e sb a s e do ng e n e t i cd i s t a n c e h e i l o n g j i a n gc a r pa n dy e l l o w r i v e rc a r pp o p u l a t i o n sw e r ec l u s t e r e di no n ec l a d e ，j i a nc a r pa n dh e b a or e dc a r p p o p u l a t i o n s w e r ec l u s t e r e di na n o t h e rc l a d e b yc o m p a r i n gt oe u r o p e a nl i n e a g e ( c y p r i n u sc a r p i oc a r p i o ) a n da s i a nl i n e a g eo fc o m m o nc a r p ( c y p r i n u sc a r p i o h a e m a t o p t e r u s ) i no e n b a n k ，am i c r o s a t e l l i t e ( a g g a ) 3 - 4c a nh e l pd i f f e r e n t i a t et h e a s i a nc o m m o nc a r p cc a r p i oh a e m a t o p t e r u sa n dt h ee u r o p e a nc o m m o nc a r p ，c c a r p i oc a r p i ow a si d e n t i f i e d i ts h o w e dt h a tt h ea m u rc a r pc o u l db en o tp u r ea s i a n 上海海洋大学硕士学位论文 l i n e a g e ，cc a r p i oh a e m a t o p t e r u s ，b u tt h eg e n e t i cl i n k e ro rm i x t u r ez o n eb e t w e e nt h e e a s ta s i a na n dt h ee u r o p e a nc o m m o nc a r p t h ee x p a n s i o na n dc o n t r a c t i o no fv a r i a b l e d o m a i n sd u et ot h ei n s e r t i o no fm i c r o s a t e l l i t ed i dn o tr e s u l ti nd r a s t i cr e a r r a n g e m e n t so f c o m m o nc a r pi t s 一1s e c o n d a r ys t r u c t u r e a f l pm a k e rw a su s e dt oe v a l u a t et h ec u r r e n tg e n e t i cv a r i a b i l i t yo ff o u rc o m m o n c a r pt o o t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h ee r c e n t a g eo fp o l y m o r p h i cl o c iw a s5 4 38 g e n e t i ci d e n t i t i e so ff o u rp o p u l a t i n sw e r ef r o mo 8 6 4t oo 8 9 9 ，g e n e t i cd i s t a n c e sw e r e f r o mo 10 6t oo 14 6 f o u rc o m m o nc a r pp o p u l a t i o n sh a v et h em e d i u ml e v e lo fg e n e t i c d i v e r s i t y , t h eh e i l o n g j i a n gc a r pp o p u l m i o nh a dt h eh i g h e s tg e n e t i cd i v e r s i t y , a n dt h e y e l l o wr i v e rc a r pp o p u l a t i o nw a st h el o w e s t a m o n gt h ef o u rp o p u l a t i o n st h ea v e r a g e g e n ed i f f e r e n t i a t i o nc o e f f i c i e n t ( g f ) w a s0 1 7 8 5 0 t h eg e n e t i cd i v e r s i t yw a s6 8 8 1 w i t h i np o p u l a t i o na n d31 19 a m o n gt h ep o p u l a t i o n ，t h e s eg e n e t i cd i v e r g e n c eh a d a c h i e v e dav e r yv e r ys i g n i f i c a n tl e v e l ( p 0 01 ) u p g n at r e es h o w e dt h a tf o u rc o m m o n c a r pp o p u l a t i o n sw e r ec l u s t e r e di n t ot w om a j o rc l a d e s m o r e o v e r , s o m eg e n e t i c d i f f e r e n t i a t i o nw e r ef o u n db e t w e e nj i a nc a r pa n dh e b a or e dc a r pp o p u l a t i o n s ，i ts h o w e d t h a tj i a nc a r ph a v eg r a d u a l l yf o r m e ds t a b l eo w eg e n e t i cs t r u c t u r eb ym u l t i - g e n e r a t i o n a r t i f i c i a lb r e e d i n g k e y w o r d sc o m m o nc a r pc y p r i n u sc a r p i ol ，f i r s ti n t e m a lt r a n s c r i b e ds p a c e r ( i t s - 1 ) ，a f l p , g e n e t i cd i v e r s i t y i v 上海海洋大学硕士学位论文 目录 引言1 第一章d n a 分子标记及其在鲤鱼群体遗传学中的应用2 1 等位酶4 2 线粒俸d n a 5 3 限制性片段长度多态性6 4 随机扩增多态性d n a 8 5 扩增片段长度多态性1 1 6 微卫星1 4 7 单核苷酸多态性l7 8 表达序列标签。l8 第二章四个鲤鱼种群i t s 1 序列的遗传变异分析2 0 l 材料和方法2 0 2 结果2 4 3 讨论3 0 4d 、结31 第三章四个鲤鱼种群遗传多样性的a f l p 分析3 3 1 材料和方法3 3 2 结果3 5 3 讨论4 0 4 ，j 、结4 l 全文小结4 2 参考文献4 3 附录5 3 致谢5 5 鲤鱼( c y p r i n u sc a r p i ol ) 属脊索动物门( c h o r d a t a ) 、硬骨鱼纲 ( o s t e i c h y e s ) 、鲤形目( c y p r i n i f o r m e s ) 、鲤科( c y p r i n i d a e ) 、鲤属 ( c y p r i n u s ) 。鲤鱼是世界最主要的经济淡水鱼类之一，主要自然分布 于欧亚大陆的广大地区。另外，上世纪为了控制水体中的浮游植物和 微生物，改善水质，美洲国家引进了鲤鱼，使得鲤鱼已扩散美洲等地。 而在我国，经过漫长的自然选育，形成了许多自然鲤鱼品种，如 荷包红鲤、兴国红鲤、元江鲤、黑龙江野鲤和黄河鲤等；而2 0 世纪7 0 年代以后，全国性鱼类育种研究的规划和协作推动了我国鲤鱼育种工 作的发展，又形成了多个人工选育鲤鱼杂交种：如丰鲤( 兴国红鲤早 散鳞镜鲤艿) 、荷元鲤( 荷包红鲤早元江鲤艿) 、芙蓉鲤( 散鳞镜鲤 早兴国红鲤舌) 和新品种：如建鲤、松浦鲤等。 众多自然和人工选育鲤鱼种群的存在，使得部分种质资源遭受了 破坏，因此本研究在核糖体d n a 层次上，运用d n a 测序技术，同 时结合a f l p 分子标记技术对我国四种主要经济鲤鱼种群进行遗传 多样性分析，以了解为这四种主要经济鲤鱼的种质资源现状，并为其 种质资源的合理开发和保护提供理论基础。 上海海洋火学硕士学位论文 第一章d n a 分子标记及其在鲤鱼群体遗传学中的应用 鲤鱼( c y p r i n u sc a r p i o ) 属脊索动物f - j ( c h o r d a t a ) 、硬骨鱼纲( o s t e i c h y e s ) 、 鲤形目( c y p r i n i f o r m e s ) 、鲤科( c y p r i n i d a e ) 、鲤属( c y p r i n u s ) 。鲤鱼广泛分布于 世界各地，并且是欧洲和亚洲的主要养殖淡水鱼类之一。之前的研究认为，鲤鱼 存在欧洲和亚洲亚种，而中国的鲤鱼大都属于亚洲亚种【l 。9 1 。在我国，鲤鱼养殖已 有2 4 0 0 多年的历史，经开发利用和遗传改良，已经形成了众多地理种群和人工 选育品种。 遗传变异是生物的重要特征之一，它一定程度上决定着生物在自然或人为条 件下的存在和发展，因此遗传变异的研究是种群结构研究的重要组成部分，越来 越多的被应用于种质资源学的研究，以期取得更为准确和全面的资料。科学技术 的进步赋予了人类越来越大的能动性。分子生物学技术的介入，特别是d n a 分子 标记技术的发展和应用，对鲤鱼遗传育种研究起到了巨大的推动作用。 遗传标记( g e n e t i cm a k e r ) 是指可追踪染色体、染色体某一节或某一个基因座 在家系中传递的任何一种遗传特性，亦指那些可明确反映遗传多样性的生物特征 1 0 l 。而d n a 分子标记作为一类生物普遍存在并容易检测的遗传标记，为遗传学 的研究开拓了广阔前景。随着近4 0 年分子生物学的发展，d n a 分子标记逐渐显 示出优越性：直接以d n a 的形式出现，非等位标记之间不存在上位效应及其他形 式的基因作用；不受环境和其他因素的影响；多态性几乎遍及基因组；表现为中 性标记；不影响目标性状的表达，与不良性状无必然连锁；许多分子标记呈共显 性；部分分子标记可分析微量的d n a 或古化石样品；结果稳定可靠，重复性好。 d n a 分子标记大多以电泳谱带的形式表现，依其所用的分子生物学技术，可 分为：i 型分子标记技术：已经知道所研究基因的功能，如限制性片段长度多 态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，i u l p ) 、等位酶( a l l o z y m e ) 和 表达序列标签( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g s ，e s t s ) ；i i 型分子标记技术：无须知道 研究对象的信息，如随机扩增多态性d n a ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ， r a p d ) 、扩增片段长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，a f l p ) 、 微卫星d n a ( m i c r o s a t e l l i t e s ) 。而其他一些d n a 分子标记，如单核苷酸多态性 ( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ，s n p ) 和缺失多态性( i n s e r t i o n s d e l e t i o n s ) 则具 备以上两型的特性。d n a 分子标记已经越来越多的应用于水产动物研究，如遗传 连锁图谱构建、q t l 定位和遗传进化分析等，表1 1 概括了这些分子标记的特点 和应用。 2 l 趟璺 蒌刹 掩 nnn 素 ：畔蚺蚺褂褂褂 融 喇| 陋喇喇喇 、 霉不匣u山帚账g蕊性最皿毒s水罂蛋咪墨口 牲匝帮蜊 妪求枯熏冥牲匦器煳 恒 j；fij刚s冥毒匦帮蜊 肇 塔求峨双 冥塔求栋毒，她匝器煳 恒 嚣求枯熏冥整匝器溜 恒 心酣杈垛冥蜒求枯嚣 妙壬 牲匦器蜊嚣求帐甘 暮 一一镫刹h 迎魍掣吲球长始帽 爵 一一督副一 啦璎掣吲球长增帽迎圈掣嘣球乓鞭帽 甜i i 啦缎蛆吲球长始帽 刹一h副一h 啦璎蛆吲乓始帽啦羽掣吲长鞭帽 爵 一一镫副h 啦爝掣嘣袄乓鞭帽 迎煅埝甘 塔求枯窿冥磐匝器埘 警 口内 斟 副h 迎卿赳吲球长驻帽 嗽 13pu一 掣怕蝻水塔 厶乙卜叫幺 山，l k 匣i d 厶 q 厶臣 厶，l z 留巨 掣怕输链扭辎斟 蝌蜷最世故懈 喇h 衽 掣怕嫡趟半鄙越郛轴 吞掣怕精鲆b暴埋 掣怕掩毯举鄙止掣器嗟 zo拉骐婿 溢掣妙 暖趔 牛* 籁函 副粼 剥糕 懈辎 璃妲 哦州 逍怕撩 醐掣舻 迥 腰蜷 啦羽 斗求 婶最 餐时婿 蹭蜷 m求吞 口。口再u=盘盘矗一矗=置u_o盘弓葺矗u留一iq-u嚣i再蛊uiu童_si盘i矗置z口-oo盘一 嬗恨lir越亲幢絮，科球譬-2拿奖巾奄z盆i-_ i - i o 鼻一 议袋逍扑书隧扑k类5始嫩 - 、 1 等位酶 1 1 等位酶标记原理及特点 等位酶【1 1 】( a l l o z y m e ) 是指核基因编码的不同的等位基因相对应的酶，可以 认为是同工酶的一种特殊形式，有时也叫等位同工酶。等位酶反应的是基因所表 达产生的蛋白，因此属于i 型分子标记【1 2 13 1 。因等位酶直接对应于等位基因，因 而上世纪6 0 年代以来一直是广泛应用的分子标记，尤其是在水产动物遗传育种 上的应用【1 4 。9 1 。氨基酸在不同等位基因多肽链的差异形成了等位酶，它可以反映 d n a 序列的变异。根据氨基酸活性的改变，编码的蛋白产物在凝胶电泳的电场 中产生了不同的迁移率。而等位基因的缺失差异和相对频率可以用来量化遗传变 异和在种群、物种以及更高分类水平上鉴别遗传单位。相应的数据分析方法和电 脑软件也建立发展起来，包括对等位基因频率、种群间的遗传多样性、基因多样 度的比率、基因分化系数、遗传距离的等参数的分析评价；软件有进行多种运算 的b i o s y s 1 【2 们、可进行系统发育分析的p a u p 2 1 】和p h y l i p 2 2 】等。4 0 年过去了， 等位酶数据已非常丰富，揭示了自然种群的大量变异，探讨并回答了种群的交配 式样、小尺度的种群遗传结构、大尺度的物种变异式样等问题 2 3 - 2 5 】。 等位酶技术已相当成熟，它的基本要求是按个体提取具有活性的酶然后电泳、 染色。特异性酶染色可以得到可见的等位酶带谱【2 6 , 2 7 】。为正确解释等位酶的带谱， 通常需要了解每一种等位酶变异的遗传基础【2 8 2 9 1 ，如果熟悉一种酶的一般带型， 则一个种群只要随机挑选2 0 3 0 个个体就足以估算某一种酶每一个位点的等位基 因数目。为达到最低限度的统计可信度，应用等位酶标记时，要求至少分析l o 2 0 个独立分离的多态性位点。不同的生物类群具有丰富的等位酶变异，一般而言， 有5 0 弱的位点为多态性位点，而多态性位点中大于3 个等位基因的位点并不多 见【3 0 1 。 等位酶标记操作简单，花费少，统计方法标准，并有大量的前人研究资料可 供参考。但是对于一些狭域分布的地方种群，往往缺乏多态性位点，无法进行等 位酶分析【3 u ；等位酶的统计分析中通常假设其不同基因型为选择中性，这也不够 科学，等位基因频率的地理差异就可能是自然选择的结果1 3 2 1 ，所以等位酶标记也 存在一定的局限性。 1 2 等位酶标记在鲤鱼群体遗传研究中的应用 k l a u sk o h l m a n n 等【3 5 】运用等位酶标记对11 个德国和5 个外国鲤鱼种群进行 4 上海海洋人学硕士学位论文 了分析。他们的8 种等位酶表明：东亚鲤鱼与德国国内种群遗传变异比较大 ( d = 0 1 3 3 ) ，而这些鲤鱼明显分为两支，其中德国国内鲤鱼种群和以色列种群构 成了欧洲亚种，越南种群、黑龙江种群和日本鲤鱼种群构成了亚洲亚种在欧洲亚 种内部比较时，莱茵河的几个鲤鱼种群则与其他种群存在明显的差异。薛明等【3 3 j 则以淮河鲤鱼野生群体和养殖群体为对象，比较了8 种等位酶的遗传变异，结果 表明，2 个群体的多态座位比例( 2 4 ) 和位点平均等位基因书( 1 3 ) 均相同， 位点平均杂合度分别为o 0 9 7 和o 0 8 6 ，养殖群体低于野生群体，人为作用已经造 成淮河鲤鱼遗传多样性的降低。 2 线粒体d n a 2 1 线粒体d n a 标记原理及特点 对脊椎动物的研究表明，线粒体d n a 序列的变异积累速度比核d n a 要快很多 3 4 1 。线粒体d n a 序列突变率较快可能是因为复制时修复机制的缺乏p 5 j 和单倍型线 粒体基因组严格的母系遗传形成了较小的种群体系造成的【3 6 】。除了复制和转录的 启动地控制区( d 1 0 0 p ，大小为lk b 左右) 外，整个线粒体d n a 都转录。线粒体 d n a 中的非编码区( 如d 1 0 0 p ) 比编码区( 如细胞色素b 基因【3 7 j ) 展现出更高水平 的变异，可能是因为功能限制的减少和宽松的选择压力。测定线粒体d n a 的全 序列或部分基因片段序列，用有关的软件进行排序，找出变异位点或单倍型类型， 即可了解个体间、群体间或种间的异同情况，如进一步进行分子系统树构建或其 他分析，则可揭示群内、群间及种间的聚类情况和系统分化、系统发育情况或过 程。 由于线粒体d n a 是非孟德尔遗传模式，因此在进行遗传研究时必须将其看 做是单位点【3 7 】。而且线粒体d n a 是母系遗传，性别的倾向性偏差可能会导致用 线粒体d n a 数据进行系统发育和种群结构研究结果可与核基因组信息的分析不 一致【3 6 ，3 引。此外，线粒体d n a 标记也和其他d n a 分子标记一样容易遇到问题， 如复原突变( 已经变异的位点又变异回复至原来的状态) 、平行替换( 突变发生在 不同群体的同一位点) 以及变异率不一或突变热点( 一些位点的突变率与同一区 域的其他位点相比存在大量的差异) 。 2 2 线粒体d n a 标记在鲤鱼群体遗传研究中的应用 近年来，鲤鱼在线粒体d n a 全序列或部分序列的分析工作已经做了很多。 c h a n gy s 等【3 d n a16 ，5 7 5b p 全长序列。t h a ib t 等【4 0 j 分析了多种鲤鱼线粒体d n a 的d - o o p 区和m t a t p a s e 6 m t a t p a s e 8 序列的遗传变异，研究表明，d - l o o p 区的变异明 显高于m t a t p a s e 6 m t a t p a s e 8 序列，越南、日本k o i 和中国的红鲤亲缘关系 很近，而中国鲤鱼和印度尼西亚鲤鱼群体间关系很远，与之前的欧亚鲤鱼亚种分 类不相符。m a b u c h ik 等【4 l 】对1 1 个日本鲤鱼种群的1 6 6 个个体的线粒体d n a 的 d - o o p 区进行了分析，获得了2 8 个单倍型序列，与之前的欧洲鲤鱼序列比对后验 证了亚洲鲤鱼来源于欧洲鲤鱼。g r o s sr 等【4 】对欧洲和东亚鲤鱼亚种的多个种群进 行了线粒体d n a 的n d 3 4 和n d 5 6 基因的p c r r f l p 分析，并获得了可以鉴 定这两个鲤鱼亚种的多个酶。而赵莹莹等【4 2 j 则以9 个我国常见鲤鱼种群为对象，分 析了线粒体d n a 序列的1 6 sr r n a 、c y tb 和d o o p 序列片段，共获得了3 2 个变异 位点，认为兴国红鲤鱼与荷包红鲤在进化上属于不同分支，玻璃红鲤与兴国红鲤 亲缘关系更近。 3 限制性片段长度多态性 3 1 限制性片段长度多态性标记原理及特点 限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 是指由限制性酶切位点间的插入、缺失，重排或突变所引起的基因型间限制性片 段长度的变异。r f l p 标记是1 9 8 0 年由美国学者b o t s t e i n 建立的识别d n a 多态 性的一种方法【4 3 1 ，基本原理为：限制性内切酶酶切不同个体的基因组d n a 后， 通过电泳和s o u t h e r n 印迹转移将酶切后的d n a 转移到杂交膜上，选用一定的探 针与之杂交，从而显示出与探针含同源序列的酶切片段在长度上的差异性，具体 程序和方法见图1 1 。r f l p 的遗传本质是由单碱基的突变或结构重排( 插入、移 位、倒位等) 7 1 起的，是符合孟德尔遗传的共显性标记( 个体分析时，两个等位基 因都可以被观察到，因为它们大小差异往往较大，容易被标记) ，结果稳定可靠， 重复性好】。但是该标记多态性信息含量低，还需要知道序列的信息( 用于p c r 分析) 或探针的信息( 用于s o u t h e r n 杂交分析) ，操作过程复杂，因而使此技术 的应用受到了限制。 3 2 限制性片段长度多态性标记在鲤鱼群体遗传研究中的应用 z h o uj f 等【1 】对德国镜鲤、俄罗斯散鳞镜鲤、黄河野鲤和兴国红鲤四个种群线 6 上海海洋大学硕十学位论文 粒体d n a 的n d 5 n d 6 和d l o o p 区进行了p c r r f l p 方法分析，结果表明，德 国镜鲤和俄罗斯散鳞镜鲤分别属于欧洲和亚洲鲤鱼亚种。周建峰等【4 5 】以欧亚 a b a s es u b s t i t u t i o n sa tt h er e s t r i c t i o ns i t e s n 山l ；h 咖2 ： d i g e s tw i t h m s t d c t i o n 占 l b ，5 一函+ - ，、函6 f 一i a 乃 矗r 於n 口气晶分 g ie l e c t r o p h o n m l sa n d8 0 u t h e r nb l o t b i n s e r t i o n so rd e l e t i o n s ii：f2： r e s t r l c # o nd i g e s t 亡= = = 囫 = = = 】吻 o ie l e c l o p h o r e s i sa n d8 0 u t h e mb l o t 图1 1r f l p 标记的分子基础基因组d n a 由特定的限制性内切酶消化( 箭头所示) ( a ) 限制位点的碱基替换可以被敲除，限制性的缺失导致了电泳时片段的缺失或片段长度 的增加( b ) 基因座两个限制性位点间插入的片段导致了片段长度的增加可以由电泳显示， 最后用传统的特异性探钟s o u t h e r n 杂交方法进行检测 f i g 1 - 1m e l e c u l a rb a s i so fr f l p g e n o m i cd n ai sd i g e s t e dw i t hap a r t i c u l a rr e s t r i c t i o n e n z y m e ( a r r o w s ) ( a ) b a s es u b s t i t u t i o nw i t h i nt h er e s t r i c t i o ns i t ec a nk n o c ko u tt h es i t e l o s s o far e s t r i c t i o nw i t h i nt h el o c u so f i n t e r e s tl e a d st ol o s so fo n ef r a g m e n ta n di n c r e a s eo f f r a g m e n ts i z et h a tc a nb er e s o l v e db yg e le l e c t r o p h o r e s i s ( b ) l n s e r t i o no fap i e c e ( b l a c kb a r ) b e t w e e nt w or e s t r i c t i o ns i t e sw i t h i nt h el o c u sl e a d st oa ni n c r e a s ei nt h ef r a g m e n ts i z e t h a tc a n b er e s o l v e db yg e le l e c t r o p h o r e s i s c l a s s i c a lm e a n so fd e t e c t i o nr e l i e so ns o u t h e r nb l o tu s i n g s p e c i f i cp r o b e s 7 囊 制性内切酶对该p c r 产物进行r f l p 分析，d d ei 、h a ei i i 、r a qi 和m b oi 内切 酶在亚种内部完全一致，而在亚种间存在差异，产生了能将亚种区分开来的诊断 性限制性酶切位点( d i a g n o s t i cr e s t r i c t i o ns i t e s ) 。在总共产生的3 种单倍型中，2 个亚种各自拥有一种单倍型。 4 随机扩增多态性d n a 4 1 随机扩增多态性d n a 标记原理及特点 随机扩增多态性d n a ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ，r a p d ) ，是 w i l l i a m s 等【4 6 】和w e l s h 掣4 7 1 于1 9 9 0 年同时发展起来的建立在p c r 扩增基础上 的一种新型分子标记。基本原理为：一系列人工随机合成的具有8 1 0 个碱基的核 苷酸单链为引物，对所研究的基因组d n a 全部进行p c r 扩增( 图1 2 ) ，扩增产 物经琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，经e b 或银染显色，来检测扩增产物的 多态性。由于引物很短而且相对退火温度比较低( 通常3 6 4 0 度) ，可能会扩增出 大量多态产物，每一个产物在凝胶电泳是会形成一个位点。遗传变异可以通过这 些位点的出现和缺失检测出来( 图1 3 ) 。r a p d 多态性是因为引物结合位点处的碱 基替换或位点间的缺失多态性造成的。 t g t g c t g t a c3 一g t a c a g c a c a 图1 2r a p d 技术的程序概迷两个序列相同的随机引物( 方格) 对基因组d n a ( 长线) 进行p c r 扩增 f i g 1 - 2s c h e m a t i cp r e s e n t a t i o no ft h er a p dp r o c e d u r e g e n o m l cd n a ( i n d i c a t e db yl o n g s t r i n g so fl i n e s ) i su s e df o rp c ru s i n gt w oa r b i t r a r ys h o r tp r i m e r so fi d e n t i c a ls e q u e n c e s u n d e rl o wa n n e a l i n gt e m p e r a t u r e s 8 上海海洋大学硕士学位论文 r a p d 标记是孟德尔的显性遗传标记( 图1 4 ) ，并以电泳条带出现缺席表现。 r a p d 的条带是由杂合子和纯合子造成的，虽然条带的亮度会不同，但是p c r 的 效率的变化导致了条带亮度的记录的困难。因此，从杂合子中鉴别显性纯合子变 得不可能。另外很难区别条带是不同等位位点还是一个等位位点上的不同等位基 因，所以研究中的位点数目会被错误地评估。在进行遗传学研究时，如果亲本是 纯合子的话，f l 代的r a p d 应该和父母亲本的条带总和相等，r a p d 多态性比例 在f 2 代群体中为3 ：l 【4 8 4 9 1 。 a b a s es u b s t i t u t i o n sa tt h ep r i m e rb in d i n gs i t e s 型吐可一 飞圆一厂 o 嗽 8 i n g l eb a s o m u t a t i o n b i n s e r t i o n d e l e t i o nb e t w e e nt w o 队p dp r i m e r s 寺i n s e r t i o n 色却 u p c r 图l - 3i m , p d 技术的程序简介( a ) 引物结合位点的碱基替换，尤其是3 ，末端的碱基替 换会导致r a p d 条带的增减( b ) 引物间的插入和减少会造成扩增片段长度的增减 f i g 1 3m o l e c u l a rb a s i so fr a p dp o l y m o r p h i s m ( a ) b a s es u b s t i t u t i o n si nt h ep r i m e r b i n d i n gs i t e s ，e s p e c i