（化学工程与技术专业论文）装填分率对溶菌酶溶液膜结晶过程的影响研究.pdf

摘要 装填分率对溶菌酶溶液膜结晶过程的影响研究 摘要 x 射线衍射是确定蛋白质结构的最有效方法，需要有适合做衍射分析的 蛋白质晶体。然而，许多生物大分子晶体常常难以成长，一般小分子结晶的 方法都不适合于大分子的晶体生长。因此，获得质量完美的蛋白质晶体成为 蛋白质结构测定的主要瓶颈，需要探索新的结晶方法以制备蛋白质等生物大 分子晶体。用膜结晶技术结晶蛋白质可得到适合于衍射分析的大尺寸蛋白质 晶体。 本文采用三种不同装填分率的聚偏氟乙烯中空纤维微孔膜组件，分别对 溶菌酶溶液膜结晶过程进行实验研究，考察了不同装填分率下结晶溶液及洗 脱液流速对溶剂跨膜通量和溶菌酶晶体质量的影响。结果表明，由于膜组件 中纤维分布不均，导致低装填分率( 1 2 4 ) 下结晶溶液流速在合适范围内的升 高并不能有效提高跨膜通量，而对高装填分率( 2 4 7 ) 下溶剂跨膜通量的影 响不大；不同装填分率下溶剂跨膜通量都随着洗脱液流速的升高而增大。在 较低的装填分率下，控制合适的结晶溶液流速及洗脱液流速均可以结晶制得 质量较好的晶体。 采用相同的三种不同装填分率膜组件，分别对溶菌酶溶液真空膜结晶过 程进行实验研究，考察了不同装填分率下膜下游真空度及结晶液流速对溶剂 跨膜通量和溶菌酶晶体质量的影响。实验发现，在调节适宜真空度( 1 2 4 及 1 8 6 装填分率的膜组件为0 6 k p a ，2 4 7 装填分率为0 2 k p a ) 以保证溶剂跨 膜通量的情形下，为了提高真空膜结晶过程所得晶体质量，可以选择将结晶 溶液流速放缓，并在沉淀剂中添加d m s o 和丙三醇。 此外，本章尝试研究聚四氟乙烯板式膜组件进行渗透膜结晶实验，实验在 基于可制得尺寸、晶型较好的基础上，选择不同的溶菌酶浓度和洗脱剂浓度 北京化工大学硕上学位论文 进行实验研究。结果表明：4 n a c i 作为沉淀剂条件时，最佳溶菌酶浓度为 2 0 m g m l ，洗脱剂m g c l 2 浓度为2 0 ，结晶溶液跨膜通量适宜，可制得高质 量溶菌酶晶体。 关键词：装填分率；溶菌酶；膜结晶；跨膜通量 n 摘要 t h ee f f e c to fp a c k i n gd e n s i t yo nm e m b r a n e c r y s t a l l i z a ，t i o no fi j y s o z y m e a b s t r a c t x r a yd i f f r a c t i o ni sag o o dm e t h o df o rd e t e r m i n i n gt h e3 ds t r u c t u r eo fa p r o t e i n ，t h ep r o t e i nc r y s t a l sf o rx r a yd i f f r a c t i o na r en e e d e d u n f o r t u n a t e l y , m a n y m a c r o m o l e c u l e sa r er e l u c t a n tt oc r y s t a l l i z e ，a n du s u a l l y , t h e i rl a t t i c ei sn o tr e g u l a r e n o u g ht op r o v i d ed i f f r a c t i o nd a t a g e n e r a l l y , t h ec r y s t a l l i z a t i o nm e t h o d so fs m a l l m o l e c u l e sa r en o ts u i t a b l ef o rt h ec r y s t a l l i z a t i o no fb i o m a c r o m o l e c u l e s t h e r e f o r e ， a c c e s st oap e r f e c tp r o t e i nc r y s t a lh a sb e c o m et h em a i nb o t t l e n e c ko ft h es t r u c t u r e d e t e r m i n a t i o no fp r o t e i n s i t sn e c e s s a r yt od e v e l o pan e wm e t h o do b t a i n i n ga p e r f e c tp r o t e i nc r y s t a l c r y s t a l so fb i o m a c r o m o l e c u l e s ，w h i c ha r es u i t a b l ef o r x r a yd i f f r a c t i o n ，c a nb eo b t a i n e db ym e m b r a n ec r y s t a l l i z a t i o nt e c h n o l o g y t h ep v d fh o l l o wf i b e rm i c r o p o r o u sm e m b r a n em o d u l e sw i t ht h r e ep a c k i n g d e n s i t i e sw e r ee m p l o y e dt os t u d yt h ei n f l u e n c e so ft h ef l o wv e l o c i t i e so f c r y s t a l l i z a t i o ns o l u t i o na n ds t r i p p i n ga g e n to nm e m b r a n ec r y s t a l l i z a t i o no f l y s o z y m e i tw a sf o u n dt h a t ，d u et ot h ed i f f e r e n tf i b e rd i s t r i b u t i o no f m e m b r a n e s m o d u l e s ，t h ei n c r e a s eo f f l o wv e l o c i t yo fc r y s t a l l i z a t i o ns o l u t i o ni nt h ea p p r o p r i a t e r a n g ec a n ti m p r o v ee f f e c t i v e l yt h et r a n s m e m b r a n ef l u xa tal o w e rp a c k i n g d e n s i t y ( 12 4 ) ，a n dm o r e o v e r , i th a dl i t t l ee f f e c ta tah i g h e rp a c k i n g d e n s i t y ( 2 4 7 ) t r a n s m e m b r a n ef l u xi n c r e a s e da sf l o wv e l o c i t yo fs t r i p p i n ga g e n t i n c r e a s e da td i f f e r e n tp a c k i n gd e n s i t y f o rt h em o d u l ew i t hl o w e rp a c k i n gd e n s i t y , h i g hq u a l i t yc r y s t a l sh a v eb e e np r e p a r e du n d e r t h ep r o p e rf l o wv e l o c i t i e so f c r y s t a l l i z a t i o ns o l u t i o na n ds t r i p p i n ga g e n t t h em e m b r a n em o d u l e sw i t ht h es a m et h r e ep a c k i n gd e n s i t i e sw e r ee m p l o y e d t os t u d yt h ei n f l u e n c e so fv a c u u mt i g h t n e s so fd o w n s t r e a ms i d ea n dt h ef l o w v e l o c i t i e so fc r y s t a l l i z a t i o ns o l u t i o no nm e m b r a n ec r y s t a l l i z a t i o no fl y s o z y m e t h e r e s u l t ss h o w e dt h a ta d j u s t i n gt h ev a c u u m ( 0 6 k p af o rm e m b r a n em o d u l e sw i t h i i i 北京化工大学硕士学位论文 12 4 a n d18 6 p a c k i n gd e n s i t y , a n d0 2 k p af o rm e m b r a n em o d u l ew i t h2 4 7 p a c k i n gd e n s i t y ) t oe n s u r et h et r a n s m e m b r a n ef l u x ，i no r d e rt oi m p r o v et h e q u a l i t yo fc r y s t a l s ，t h ef l o wv e l o c i t i e so fc r y s t a l l i z a t i o ns o l u t i o ns h o u l db e s l o w d o w n ，a n dt h ea d d i t i v e ss u c ha sg l y c e r o la n dd m s o c a r lb ea d d e di n t ot h e c r y s t a l l i z a t i o ns o l u t i o n s a tl a s t ，t h ep t d et a b u l a t em e m b r a n em o d u l e sw e r ee m p l o y e dt or e s e a r c ht h e m e m b r a n ec r y s t a l l i z a t i o no fl y s o z y m e t a k i n gi n t oa c c o u n tt h es h a p eo fl y s o z y m e c r y s t a l sa n d t h ec r y s t a ls i z ed i s t r i b u t i o n ，w h e nt h ep r e c i p i t a n t s ( n a c l ) c o n c e n t r a t i o ni s4 ，t h eo p t i m a lo p e r a t i n gc o n d i t i o n si st h ei n i t i a ll y s o z y m e c o n c e n t r a t i o no f 2 0 m g m l ，t h es t r i p p i n gs o l u t i o n ( m g c l 2 ) c o n c e n t r a t i o no f2 0 k e y w o r d s ：p a c k i n gd e n s i t y ；l y s o z y m e ； m e m b r a n e c r y s t a l l i z a t i o n ； t r a n s m e m b r a n ef l u x i v 符号说明 符号说明 i x 北京化工大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声 明的法律结果由本人承担。 作者签名：日期：墨里二地 关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文的规 定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北京化工大 学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可 以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在土年解密后适用本授 权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。 作者签名：越盘 日期：2 口加易i o 导师签名：垂2 竺2 日期： 2 殳& 垒： 第一章绪论 1 1 蛋白质结晶 第一章绪论 在十九世纪后半叶的科学研究中蛋白质结晶技术作为从混合物中提纯蛋白 质的种方法，因其提纯蛋白质纯度很高，逐渐从多种提纯方法中脱颖而出。 上世纪三十年代后半期，b e m a l 和c r o w f o o t 利用x 一衍射技术研究蛋白质晶体， 得到了蛋白质结晶新的应用。直至今天，x 衍射技术仍用于蛋白质结构与功能的 研究。 上世纪八十年代，重组d n a 技术的发展为晶体生长研究和x 射线结晶学提供 了强大的推动力，蛋白质结晶的应用及研究也发生了根本性的转变。这是由于重 组技术的发展首次允许研究者利用到足够多的不常见和不确定的蛋白质。x 射线 结晶学的应用要求太分子晶体具有足够大的尺寸( 太于0i m m ) 和完美的质量以 获得更精确的衍射数据。目前，经x 衍射分析研究的蛋白质多数来自重组技术。 可以说重组技术的进步促进了结晶学的发展，极大地推动了x 衍射结晶学的应用 并增加了对生物化学家、分子生物学家的吸引力。 11 1 蛋白质结晶的常规方法 常规的蛋白质结晶方法有4 种：批量结晶、蒸发扩散结晶、湖液扩散结晶和 透析结晶叽如图i - 1 所示。 釉鬣。 十b 螂 到# ( 1 ) 批量结晶 婴磕霸 | i 。 图i - i 常规的蛋向质结晶方法 f i g 1 - 1 t h ec o n v e n t i o n a l m e t h o d so f p r o t e i nc r s t a l l i z a t i o n 北京化工大学硕士学位论文 批量结晶是最简单的蛋白质结晶方法，如图1 1 ( a ) 所示。将所要结晶的蛋白 质与结晶剂按要求的浓度在实验开始时混合起来，以达到要求的过饱和度。实验 样液的体积在5 0 “l 几个毫升左右。由于批量结晶的样液体积较大，所以此法并 不适用于对最佳结晶条件的探索实验。此法进一步改进的方法叫微量分批结晶技 术，n a o m i 等【4 】在对葡萄糖异构酶结晶时，利用微机控制微量分液器( i m p a x 将结 晶液滴体积降低到仅有l 2 1 x l ，为了防止溶液蒸发带来的体积变化，液滴的结晶 过程在低密度( p = o 8 3 0 9 2 9 e r a 3 ) 油层( 如液体石蜡) 下进行，如图1 1 ( b ) 。 与批量结晶不同，其他的扩散结晶或透析结晶都是通过未饱和的大分子溶液 和装有结晶剂容器体系之间的交换平衡，并逐步达到结晶所要的过饱和度。 ( 2 ) 蒸发扩散结晶 蒸发扩散结晶是最常使用的蛋白质结晶方法，实验类似悬滴法，如图1 1 ( c ) 所示。液滴( 约2 - 4 0 r t l ) 加有要结晶的适当的缓冲液、大分子物质、结晶剂等。池 液( 体积约1 - 2 5 m l ) 中除不含所要结晶的蛋白质大分子外，其他成分和液滴的相 同。但是其结晶剂的浓度高于液滴中的浓度。挥发性物质( 水及有机溶剂) 的扩散 不断进行，直到液滴的蒸汽压与池液的蒸汽压相等时为止。换句话讲，蛋白质分 子浓度受到池液浓度的影响逐步提高以致过饱和而最终结晶。d a v i d 等【5 j 通过使 用单分子层镀金玻璃盖玻片改善了液固界面对蛋白质结晶过程中成核及生长的 影响。以溶菌酶、口，乳清蛋白、奇异果甜蛋白及过氧化氢酶为实验对象得到了 比用普通盖玻片为液滴载体更大的蛋白质结晶。而a l a b a m a 大学的大分子晶体学 研究中心设计出一种装置，可用计算机对悬滴法蛋白质的蒸发扩散速度进行在线 控制，从而得到了可供结构分析用的高清晰度的蛋白质分子大结晶f 6 】。 ( 3 ) 液液扩散结晶 液液扩散结晶又叫自由界面扩散结晶。如图1 1 ( d ) ，在毛细管中的样品液( 约 为1 0 ) x 1 ) 和结晶液因于浓度梯度的存在而在界面处发生自由扩散，从而导致蛋白 质溶液的过饱和及后来的结晶。 ( 4 ) 透析结晶 透析结晶中小分子的结晶剂与大分子蛋白质之间由半透膜分开( 如图 1 1 ( e ) ) ，存在的浓度梯度使得小分子结晶剂通过半透膜达到内室，而蛋白质则无 法通过半透膜，从而使膜内溶液的过饱和度增高并形成蛋白质分子结晶。此方法 的优点是在于寻找最佳的结晶条件过程中，半透膜内的蛋白质可以重复使用。但 是，透析结晶限制了p e g 等结晶剂的使用。由于p e g 使得膜内的水分被析出的 速度远大于其渗入膜的速度，从而利于蛋白质分子沉淀的生成。 1 1 2 蛋白质结晶的一般过程 2 第一章绪论 蛋白质属于生物大分子，其结晶的通常过程与盐、一些有机小分子等结晶过 程一样，可分为3 个阶段进行：( 1 ) 形成稳定的晶核；( 2 ) 由晶核生长为晶体；( 3 ) 生长结束。 ( 1 ) 成核指溶解在溶液中的分子或非晶态的低聚体，如二聚体、三聚体等， 以过饱和度为驱动力聚合在一起形成热力学稳态的点阵结构。d r e n t h 等【7 】研究发 现，溶液体系的自由能在蛋白质结晶后期降低了1 2 2 4 k j m o l ，结晶蛋白质与非 特异性蛋白质聚集物及非晶态的蛋白质沉淀物不同，后者在从过饱和溶液中形成 的过程当中并未有表面积和体积之间的竞争。所以，其形成的速率要比结晶快得 多。从过饱和溶液中形成晶态聚合物，并不肯定最终会形成宏观上的晶体。这种 晶态聚合物必须超过特定的尺寸( 临界尺寸) ，才会继续生长形成晶体；如其不足 临界尺寸，则会发生白溶现象，最终无晶体形成。 ( 2 ) 生长当体系中有稳定的晶核形成后，在适宜的条件下( 通常与成核条件 并不相同) ，晶核开始快速生长。由于晶体的生长是在固体液体界面上进行，所 以固液界面的结构和行为，对于生长机制会起到决定作用。b o i s t e l l e 等【8 1 认为蛋 白质晶体的生长机理应服从h a r t m a n 和p e r d o k 的周期性键链p b c ( p e r i o d i cb o n d c h a i n ) 理论，即晶体是由周期性键链组成，晶体生长速率与键链方向有一定关系， 生长速率最快的方向即为化学键链最强的方向。后来其他学者在对蛋白质分子结 晶的研究中运用j o h n s o n m e h l a v r a m i k o l o m o g o r o v ( j m a k ) 理论对其作出了相应 的解释【9 】。 ( 3 ) 生长停止晶体生长的停止可能由多种原因引起，其中最明显的一个原 因就是由于蛋白质溶质分子在溶液中浓度的降低，使得固、液相的物质交换达到 一个平衡。在这种状态下，继续添加一定的溶质会使晶体继续生长。但是，有些 蛋白质晶体生长到一定大小后，即使溶液体系中仍存在生长驱动力，也将不再生 长。f e h e r 等【l o l 以溶菌酶蛋白为研究对象，证明了其四方晶体晶格的累积张力作 用是使晶体不再继续生长的主要原因。 总之，蛋白质结晶过程类似于凝聚过程，就是在一定的溶剂条件下，极力降 低分散相的溶解度，使溶质处于过饱和状态。在合适的饱和状态下，溶质分子通 过扩散、旋转、碰撞等的运动形式形成晶核。然后，溶质分子以相互碰撞的作用 方式有序而反复地堆砌到晶核上。在蛋白质分子堆砌的过程中就是从溶液中析出 的过程，是晶核形成、晶核生长的过程。因此，蛋白质结晶机理主要由两个因素 决定，一方面是结晶溶液中的溶解度，即热力学平衡因素；另一方面是控制晶核 形成和晶核生长，即动力学因素【i 。 北京化工大学硕士学位论文 1 1 3 蛋白质结晶过程的影响因素 蛋白质晶体生长是一个复杂的物理化学过程，晶体的质量会受到多种因素的 影响。不同的生长方法，或同一生长方法中不同的生长条件都会直接影响到晶体 的生长过程。晶体生长是按照它自身的规律进行的，不同的生长方法或条件间的 区别就在于造成蛋白质溶液过饱和状态的异同；在生长过程中，控制蛋白质溶液 在空间上和时间上形成的过饱和状态可以有效地改善晶体质量。尽管晶体生长过 程异常复杂，但生长的控制仍可以通过人为调节生长过程中的具体参数来进行。 蛋白质结晶过程的影响因素主要有以下几个1 6 , 1 2 , 1 3 j 。 ( 1 ) 蛋白质浓度 蛋白质浓度是一个极大的制约因素，其大小直接关系到晶体的生长。研究发 现，要生长出质量较好的蛋白质晶体，蛋白质母液的浓度一般偏低或者中等【1 4 j 。 通常最适宜的结晶蛋白质溶液浓度范围大概为5 3 0 m g m l t ”】。对于溶菌酶结晶过 程，晶体生长体系的最佳范围为1 0 3 0 m g m l 。在此范围内，蛋白质产生晶核较 少，能有足够的蛋白质使晶体得以长大1 1 6 j 。 ( 2 ) 蛋白质纯度 一般情况下蛋白质的纯度越高，实验过程越容易结晶：纯度越低，越不易 结晶。在低纯度下，样品中的杂质会影响微晶的形成和单晶的生长。一般情况下 纯度不应低于5 0 。杂质的存在影响晶核的形成的同时，存在杂质与待结晶的溶 质形成络合物的现象，其最终变成无序聚合的沉淀物，造成假晶现象。所以，蛋 白质的纯度是关系到能否结晶的决定因素【1 1 1 ，获得高纯度的蛋白质是对其进行 结晶的前提。l i n 等【1 7 】通过采用f p l c ( 快速液相色谱系统) 得到结晶级的蛋白质， 同时发现利用此法制得的蛋白质进行结晶，结晶的可重复性及所得晶体的衍射清 晰度都大大提高。 ( 3 ) 过饱和度 溶液的过饱和度是蛋白质进行结晶的驱动力，其本质就是饱和溶液的溶解度 ( 即该蛋白质的溶解度) 与过饱和溶液的实际溶解度之间的化学势的差值。过饱 和度是控制蛋白质结晶的主要因素，过饱和度的高低决定了结晶过程中成核及晶 体生长的快慢，从而控制晶体质量的好坏。为了得到适合于衍射分析的大分子晶 体，通常需要有低过饱和度以延迟诱导时间、降低成核数量。然而，为了能更好 地实现工业应用，诱导时间一般不能超过几小时，因此需要有较高的过饱和度。 临界过饱和度则通常受到很多参数影响，比如缓冲溶液、p h 、沉淀剂、搅拌、 晶种、冷却力热速率、外场等。高于临界过饱和度，可能会发生无定形沉淀【l 引。 4 第一章绪论 在过饱和度较低、盐浓度适中的区域内，液滴中只有少数较大的单晶体；随 着过饱和度的增加，溶液中的晶体数增加，单个晶体的体积减小，同时晶体分布 由个别区域向整个液滴分散。当过饱和度大于1 0 ，沉淀剂浓度较低时，除了很小 的一个区域部分外，液滴中基本上出现的是均匀分布的大量微晶；当沉淀剂浓度 升高，蛋白质分子快速聚合，会出现沉淀。制备适于衍射分析的高质量晶体的最 佳区域是亚稳区，该区域内溶液的过饱和度又不足以生成新的晶核，但已有的晶 体可以继续生长。当溶液的过饱和度刚刚高于亚稳区的上界时，因生成晶核导致 溶液中蛋白质浓度下降而直接进入亚稳区，已生成的晶核就可以慢慢地长大为晶 体，这应是最佳的蛋白质结晶条件【1 9 】。 ( 4 ) 温度 温度的变化会引起蛋白质溶解度的改变，一般来说，在低离子强度下通常是 随温度的增加蛋白质溶解度增大，在高离子强度下蛋白质的溶解度随温度的增加 反而减小。不同的蛋白质所需的结晶温度不同1 2 0 。例如，触珠蛋白在高温下才 能结晶，牛血清白蛋白在低温下才能结副1 1 】。研究表明，大多数蛋白质的结晶 是在4 - 2 2 范围内进行。某些蛋白质的盐溶液在低温时的溶解度趋向升高，而 在p e 及m p d 溶剂中的溶解度随温度的降低而降低。s a z a k i t 2 l 】对3 0 种常见蛋白质 的溶解度随温度的变化进行了研究，发现了这些蛋白质结晶的最适宜温度。有研 究指出溶菌酶溶解度随温度升高而增大，溶菌酶的结晶和温度有很大关系，适宜 的温度能通过实验得到溶菌酶更好的晶体形状和质量。 ( 5 ) p h 值 蛋白质为两性物质，结晶体系p h 值的变化对其结晶行为有着重要影响。大 多数蛋白质对结晶溶液的p h 值非常敏感，调节p h 值可以改变晶体的大小和形状。 一般情况下，溶液的p h 值在蛋白质的等电点附近时，有利于晶体析出，远离等 电点不利于结晶形成。例如，溶菌酶等电点在p i l l 0 5 1 1 2 之间，结晶容易形成。 对于有些蛋白质分子，! t 1 e c o l i 的闭环腺苷酸激酶，如果不考虑所得晶体的晶型， 则结晶可在较宽的p h 值范围内进行，但是如果涉及特定的晶型，则对p h 值的要 求非常严格，通常其波动范围不超过l 。一般来讲，越靠近最佳p h 值，晶形越单 一，所得晶体质量越高。另外，溶液p h 值的改变还可能引起蛋白质分子所带电 荷的改变，从而引起蛋白质溶解度的改变。一般来说，蛋白质分子所带的电荷越 高，它的溶解度越大，当纯电荷为零时它的溶解度最小【2 们。 ( 6 ) 沉淀剂种类 对于蛋白质的结晶，沉淀剂的作用主要在于对溶剂( 水) 的影响而非对蛋白质 分子的影响。一般来讲，沉淀剂主要分为两大类：( 1 ) 盐类，如氯化物、磷酸盐、 硫酸盐等：根据阳离子主要划分为钠盐、铵盐、钾盐等；( 2 ) 有机类，包括：a ) 5 北京化工大学硕士学位论文 简单有机溶剂类，如乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇、叔丁醇等；b ) 高分子直链聚合 物，如聚乙二醇p e g 、聚乙烯醇p v a 、聚乙烯吡咯烷酮p v p 等；c ) 小分子多元醇 类，如2 甲基2 ，4 戊二醇m p d 等。实际工作中，通常使用混合沉淀剂实验效果 更好。 两类沉淀剂对蛋白质的作用机理完全不同。盐类沉淀剂破坏蛋白质的水化 层，减小蛋白质与水的结合能力，增大蛋白质与蛋白质之间的结合能力；有机类 沉淀剂能降低溶质的介电常数使它们之间的静电斥力与极性减弱【1 9 】。但是，各 种沉淀剂的目的都是增大蛋白质之间的吸引力，促进形成晶体的键的生成。 盐作为沉淀剂能修正蛋白质问的相互作用，某些盐也参与具体的相互作用， 这就导致形成不同形式的结晶。研究表明，硫酸根离子能够紧紧绑在溶菌酶分子 上，使得溶菌酶分子在硫酸铵存在下很不易结晶【l 引。对于溶菌酶的结晶，氯化 钠作为沉淀剂是更有效的。代等【2 2 】经研究发现，对于核糖核酸酶a 和t 4 溶菌酶来 说，由于无机盐沉淀剂在诱导结晶的过程中，会形成极性很强的溶剂环境，这将 促使蛋白质分子在完成分子堆积的过程中，倾向于在非极性区域间形成面积较大 的接触包埋，同时极性环境不利于盐键的形成，因此用无机盐做沉淀剂的晶型中， 分子表面会形成面积很大而且疏水性很强的接触面，而在这些接触面上盐键则分 布稀少。 有机溶剂沉淀剂在诱导结晶的过程中，会形成极性很弱的溶剂环境，并对各 类基团参与接触的机率影响不大。一个分子能和周围多个分子进行接触，形成多 个各种类型的接触面，并可能使参与接触的非极性残基和盐键在这些接触面没有 明显的分布倾向。而p e g 沉淀剂总体上与有机溶剂相似，其形成的溶剂环境极性 很弱，但p e g 诱导结晶机制优势类似于无机盐。这一特殊的诱导结晶机制很可能 导致用p e g 作沉淀剂的晶型分子堆积特征总体上倾向于用有机溶剂作沉淀剂的 晶型，但个别晶型与用无机盐作沉淀剂的晶型相似【2 2 】。经研究发现在p e g l 0 0 0 和6 0 0 0 存在条件下，成长的h e w l 的四角形晶体沿c 轴被拉长了，但是x 射线分析 表明他们的晶胞参数波动不超过0 5 ，并且衍射限制没有变化。像p e g 这样的水 溶性聚合物添加剂或许引起粒子对间的引力损耗。p e g 能与水结合，改变溶剂的 介电常数( d i e l e c t r i cc o n s t a n t ) 。般来说，p e g 分子量越高，p e g 在降低蛋白质溶 解度方面越有效。研究表明添加低浓度和分子量高的p e g 对于高离子强度下溶菌 酶的结晶是非常有利的，其影响随p e g 的浓度和分子量变化。因此，用p e g 做添 加剂时，在p e g 的浓度、离子强度和分子量之间存在着一个最佳选拶1 8 】。 ( 7 ) 压力 s a z a k i 等1 2 l j 用双光束干涉仪测定了高压下的溶菌酶蛋白四方结晶及正交结 晶的溶解度变化。实验表明，随着压力的增高其正交结晶的溶解度降低，四方结 6 第一章绪论 晶的溶解度逐渐增大。这可能是由于不同晶型蛋白质分子的疏水亲水程度不同， 随着压力的变化，与水的作用效果不同并反映出溶解度变化的不同。因此，已有 越来越多的研究者开始利用压力作为蛋白质结晶过程中的一个重要的调整参数 以得到目的产物。 ( 8 ) 沉淀剂浓度 沉淀剂浓度是另一个重要的制约因素，在蛋白质浓度不变的情况下，选择合 适的沉淀剂浓度非常重要。沉淀剂浓度过高，会使溶液处于成核区，甚至直接进 入沉淀区，即使蛋白质刚刚达到过饱和，高沉淀剂浓度依然使其直接生成很少的 沉淀。对于溶菌酶的结晶，降低沉淀剂n a c l 浓度n o 1 5 的范围时，即使蛋白 质初浓度达到1 0 0 m g m l ，结晶液储槽中仍是澄清的溶液，表明低离子强度溶液 中溶菌酶具有较高溶解度【2 3 】。对于以氯化钠作沉淀剂的溶菌酶结晶，研究指出 随n a c l 浓度的升高，溶菌酶的溶解度下降，对这种影响的一个易懂解释是：电 解质能携带主体水作为水合水，附着在它们的离子表面，电解质和蛋白质竞争主 体水来水合它们各自的表面，蛋白质变得部分脱水，因此其表面被其他的蛋白质 分子填充，使得结晶形成。对于用3 和5 ( w v ) n a c i 的批式溶菌酶结晶，所晶 体为棱柱状；而用浓度为7 5 的氯化钠时，晶体主要呈针状或海胆状【1 8 】。戴等1 2 4 】 用动态光散射法研究了不同浓度n a c i 对溶菌酶晶体生长前期溶液中聚集体状态 的影响。研究表明，在n a c i 浓度为0 o 5 m o l l 时，随着n a c i 浓度的升高，溶液中 大的聚集体逐渐减少，直至只存在几纳米大小的聚集体。 ( 9 ) 外加物理场 蛋白质的结晶，不仅与结晶体系的p h 值、离子强度、温度、重力场强度、流 体静压强、混合特性、结晶器的几何结构等条件有关，而且还与外部场的作用有 关。外部场( 如重力场、外部电场、磁场、电磁场、声场、机械场等) 对结晶过 程的影响是近年来国内外研究的热点，其中主要有以下几个方面： 重力场【2 5 】：重力场对蛋白质结晶过程的影响，一般是通过研究在微重力场 环境下生物大分子( 如蛋白质、酶等) 的结晶过程而获得的。在微重力场环境下， 重力场通常对结晶过程的晶体溶液体系的浓度分布，尤其是在生长晶体表面的浓 度分布产生特别影响，从而影响生物大分子的结晶成核与晶体生长，以及杂质进 入晶格。微重力场条件下蛋白质结晶的研究始于8 0 年代，这些实验通常是美、欧、 日等发达国家在轨道卫星或太空船上进行的，而国内的研究则通过使用轨道卫星 或与国外合作进行。大量的研究结果表明，在微重力场条件下生长的蛋白质晶体， 内部有序性都比地面生长的同种晶体要高很多，具有较大的粒度和较高的品质。 有报道称微重力可能不足以改变蛋白质肽链的构象，但微重力能够改善与蛋白质 分子联系较弱的有序水分子的空间排布状况，并且对溶剂结构也有影响，而溶剂 7 北京化工大学硕士学位论文 对稳定蛋白质晶体内分子有序排列起着重要作用，这应该是微重力改善蛋白质晶 体质量的重要因素。 电场：当成核过程受到外部电场或磁场影响时，沉淀结晶的推动力可用下式 表示【2 6 】：+ 矽：后r l n s + e , , , r e 2 ( 1 - - t ) 一v ( 1 - 1 ) 。8 n k t , 2 + a j 式中，为沉淀结晶推动力，刀为外场强度，s 为结晶过饱和度比，五= 乞s 。， 疋和占。分别为成核开始前结晶溶质和过饱和溶液的电导率或磁导率，l ，为溶质 的分子体积。 蛋白质分子带有不同的离子和极性基团，当施加外加电场时有一定几率会引 起带电分子在结晶体系中分布的变化，从而导致结晶行为的变化。t a l e b 等1 2 7 】以 溶菌酶蛋白为实验对象，研究了外加电场对其结晶的影响，结果表明，在外加电 场的作用下，溶菌酶蛋白的结晶成核速率较无外加电场时有所降低，但所得蛋白 质晶体变大。主要原因是由于外部电场使得结晶母液产生较大的蛋白质浓度梯 度，导致产生局部过饱和度，因此，在外部电场作用下，能产生较少的晶体数和 较大的粒度。同时，外部电场对晶体表面的滞流膜可能也会有较大的影响，从而 影响结晶的成核与晶体生长。另外，由于蛋白质分子包含不同的离子或极性基团， 因此，在外部电场作用下，蛋白质分子及其聚集体的环境也可能会发生改变，从 而影响其结晶过程【2 8 1 。 磁场：蛋白质分子的结晶受外加磁场影响，前人对其应用也进行了研究1 2 9 3 1 】， 发现磁场不仅能够影响结晶速率，而且可以通过抑制或加速某一生长方向的速率 来改变最终获得晶体的晶型。外部磁场对结晶过程影响的研究，主要包括磁场强 度、磁流体力学、磁场均一性等对结晶成核与晶体生长的影响。在外部磁场作用 下，结晶体系的稳定性、p h 值、导电性等都可能发生变化，从而影响结晶成核与 晶体生长过程，导致产品的晶形、粒度与分布、形状等发生改变。 目前，有关磁场对生物大分子结晶过程影响的报导尚不多。s a z a k i 等【3 2 】和 a t a k a 等【3 3 j 对不同磁场强度的磁场中溶菌酶和铁蛋白结晶的成核、晶体生长和晶 向作了研究，认为在大多数蛋白质溶液中，蛋白质分子抗磁性的各向异性，使得 外部磁场成为蛋白质结晶条件的一个有效参数。蛋白质分子的抗磁性是由肽键以 及氨基酸残基上的芳香环引起。外部磁场的作用往往导致结晶产品的数量、形状 等的改变。 声场：声场对结晶动力学有很大影响。张等f 3 4 】系统研究了声场对溶液成核、 溶液稳定性及晶体生长的影响，并深入探讨了其影响原因。原因主要是在过饱和 溶液中附加声场，会产生空化气泡，气泡的非线性振动以及气泡破灭时产生的压 8 第一章绪论 力，会使体系各点的能量发生一定变化。体系的能量起伏很大，使分子间作用力 减弱，溶液黏度下降，增加了溶质分子间的碰撞机会而易于成核，且气泡破灭时 除产生的压力外，会产生云雾状气泡，这有助于降低界面能，使具有新生表面的 晶核质点变得较为稳定，得以继续长大为晶核。 目前，超声波对结晶过程影响的研究主要集中于超声波对结晶成核过程的 影响，超声波的使用已经成为控制蛋白质沉淀结晶的过饱和度、过饱和溶液的介 稳性，以及结晶成核与晶体生长的一种有效方法。 ( 1 0 ) 添加剂 添加剂对蛋白质结晶过程的影响也必须引起注意。添加剂可能影响蛋白质分 子间的相互作用、热力学平衡、晶体的表面能及蛋白质结晶的成核过程【l 引。某 些情况下，添加剂可提高x 射线衍射质量，扩充衍射限制。一些研究已经表明添 加剂对溶解度的影响和分子间的相互作用力有很大关系【3 5 , 3 6 】。 s a u t e r 等【2 0 】研究了几种模型蛋白质和核酸结晶的添加剂，展示了在各种添加 剂存在条件下模型蛋白的活性变化，而蛋白质具体活性的改变经常反映结构上的 变化。研究表明非电解质添加剂d m s o 和丙三醇不仅能提高溶解度和斥力作用， 也能提高成核。此外，l u 等【1 8 】通过研究也发现，非电解质添加剂d m s o 和丙三 醇不仅能提高蛋白质的溶解度，而且对于高度饱和蛋白质溶液的暴露成核来说， 也能降低临界过饱和度& 。 ( 1 1 ) 洗脱剂 洗脱剂对于用膜结晶法结晶蛋白质的影响也不可忽略。不同种类的洗脱剂 对膜结晶过程的影响不同，同种洗脱剂的不同浓度对结晶过程的影响亦不相同。 调整洗脱剂的浓度可以调整结晶速度的快慢，控制过饱和速率，以更好地控制结 晶过程。c u r c i o 等【3 7 】研究了用膜结晶方法结晶溶菌酶时，不同浓度氯化镁溶液作 为洗脱液时的影响，结果表明随氯化镁浓度的升高，溶剂跨膜通量随之增大，结 晶诱导时间相应减小。 ( 1 2 ) 离子强度 离子强度对蛋白质有一定影响，溶液离子强度的高低直接影响蛋白质分子的 溶解度，不同离子对蛋白质溶解度的影响不同，一般小的高电荷离子比大的低电 荷离子的影响大，盐对蛋白质溶解度的影响正比于离子所带电荷及其浓度【2 0 1 。 另外，金属离子能引起蛋白质的结晶，加速晶体的形成过程，特别是某些二价金 属离子能促进晶核长大。如在硫酸氨溶液中进行铁蛋白结晶，加入少量的镉离子 能形成菱形晶体。 ( 1 3 ) 反离子 9 北京化工大学硕士学位论文 蛋白质溶液中反离子的存在也会影响大分子结晶过程。特定的反离子会结合 到蛋白质的极性基团上，改变蛋白质分子的带电性，从而引起蛋白质溶解度的改 变。 ( 1 4 ) 其他因素 影响蛋白质分子结晶的其他因素还有：蛋白质的来源、细菌及真菌引起的污 染程度、进料液体积、流速及氧化还原环境等等。 1 2 膜结晶技术 1 2 1 膜结晶技术的产生背景 由于大分子蛋白质具有许多不同于无机物及小分子有机物的性质，这使蛋白 质的结晶过程变得复杂，一般用于小分子结晶的方法都不适合用于大分子的晶体 生长，因此，我们需要探索新的结晶方法以得到蛋白质等生物大分子的晶体。近 些年，为了改善生物大分子的结晶过程，人们在发现新的实用方法上作了很多努 力，对于蛋白质结晶，研究主要集中在促进非均相成核上，一般它被核电的、聚 合物修正的表面或外界的金属粒子诱导。p h e r s o n 等【3 8 】针对溶菌酶、伴刀豆球蛋 白b 、刀豆球蛋白、过氧化氢酶的非均相成核结晶对五十多种不同的矿物样品进 行了测试，发现使用常规结晶技术，每种蛋白质都有各自的一组矿物质作为底层， 它能在更低的过饱和度下促进晶体成核。 后来，c h a y e n 等f 3 9 】尝试用多孑l 硅支撑层作为一些目标蛋白质的诱导晶核形 成的载体( 溶菌酶、伴刀豆球蛋白a 、过氧化氢酶、藻胆蛋白、胰蛋白酶) ，获得 了成功，甚至在不低于自发成核的过饱和度下也有晶体析出。f e r m a n i 等【4 0 j 经研 究发现伴刀豆球蛋白a 在聚合物薄膜表面上在很短的诱导时间内就能发生结晶， 并且蛋白质浓度比标准蒸汽扩散技术所需的要低1 0 倍；和溶菌酶不同的是，薄膜 表面是否存在可电离基团这条件，很大地影响了伴刀豆球蛋白a 的结晶，因为 薄膜表面的荷电基团可能和蛋白质的一部分或特殊基团发生相互作用，这间接地 促进了分子碰撞和聚集体形成，而对溶菌酶结晶没有影响，可能是由于溶菌酶的 结构紧凑；研究也强调了位于薄膜表面的可电离基团对成核密度的影响，薄膜表 面的可电离基团的存在使得诱导时间和蛋白质浓度下降而成核密度升高。之后， f a l i n i 等【4 1 1 将经过化学修饰的云母片，作为溶菌酶、伴刀豆球蛋白结晶的非均相 成核表面，并开展了实验。以上这些虽然并不算膜结晶技术，但其中均蕴含了将 一种物质或膜作为非均相成核表面( h e t e r o g e n e o u sn u c l e a n ts u r f a c e s ) 结晶蛋白质的 思想。这些初步研究对膜结晶技术的提出提供了很大的推动力，膜结晶技术就是 在这种情况下出现的。 1 0 第一章绪论 1 2 2 膜结晶的基本原理 膜结晶是将膜蒸馏与结晶两种分离技术耦合在一起的过程，其原理是通过膜 蒸馏来脱除溶液中的溶剂，逐步浓缩溶液，使溶液达到过饱和而结晶。 p l ，b _ 料液侧主体分压；p 2 b _ 一透过液侧主体分压 p l ，。n - 一料液侧膜面分压；p 2 矿一透过液侧膜面分压 图1 _ 2 膜结晶的原理 f i g 1 - 2t h ep r i n c i p l eo fm e m b r a n ec r y s t a l l i z a t i o n 膜蒸馏所用的膜为不被待处理溶液所润湿的疏水微孔膜。膜的一侧与热的待 处理的溶液直接接触( 称为热侧) ，另一侧直接或间接地与冷的水溶液接触( 称为 冷侧) ，热侧溶液中易挥发的组分在膜面处汽化通过膜进入冷侧并被冷凝成液相， 其他组分则被疏水膜阻挡在热侧，从而实现混合物分离或提纯的目的。膜蒸馏是 热量和质量同时传递的过程，传质的推动力为膜两侧透过组分的蒸汽压差。实现 膜蒸馏需要有两个条件：( 1 ) 膜蒸馏的用膜必需是疏水微孔膜； ( 2 ) 膜两侧要 有一定的温度差存在或者膜两边溶液的浓度不同，从而使膜两边易挥发组分的分 压不同，以提供传质所需的推动力【3 9 , 4 2 。 膜结晶应用膜蒸馏的原理来脱除溶液中的溶剂，浓缩溶液，使溶液的浓度达 到饱和或过饱和，然后在晶核存在或加入沉淀剂的条件下，使溶质结晶出来，原 理如图1 - 2 所示。 北京化工大学硕士学位论文 1 2 3 膜结晶类型 图l _ 3 连续式( 动态) 渗透膜结晶装置 f i g 1 - 3c o n t i n u o u sm e m b r a n ec r y s t a l l i z a t i o na p p a r a t u s 常用的连续式( 动态) 膜结晶的装置，如图1 3 所示。实验配制的结晶溶液用 蠕动泵送入膜组件的壳程内；洗脱液被送入管程。壳程内