（动物遗传育种与繁殖专业论文）小鼠卵母细胞体外成熟过程中热应激对胞质成熟的影响.pdf

符号说明 h s ：h e a ts t r e s s ，热应激 p m s g ：p r e g n a n tm a r es e r u mg o n a d o t r o p i n ，孕马血清促性腺激素 h c g ：h u m a nc h o r i o ng o n a d o t r o p i n ，人绒毛膜促性腺激素 f s h ：f o l l i c l es t i m u l a t i n gh o r m o n e ，促卵泡素 l h ：l u t e i n i z i n gh o r m o n e ，黄体生成素 g v ：g e r m i n a lv e s i c l e ，生发泡 g v b d ：g e r m i n a lv e s i c l eb r e a k d o w n ，生发泡破裂 i v m ：i nv i t r om a t u r a t i o n ，体外成熟 i v f ：i nv i t r of e r t i l i z a t i o n ，体外受精 c o c s ：c u m u l u s o o c y t ec o m p l e x e s ，卯丘卵母细胞复合体 d o s ：d e n u d e do o c y t e s 裸卵 c b ：c y t o c h a l a s i nb ，细胞松弛素b b s a ：b o v i n es e r u ma l b u m i n ，牛血清白蛋白 f c s ：f e t a lc a l fs e r u m ，胎牛血清 e g f ：e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r ，表皮生长因子 c g s ：c o r t i c a lg r a n u l e s ，皮质颗粒 c g f d ：c o r t i c a lg r a n u l e - f r e ed o m a i n ，无皮质颗粒区 f i t c - - l c a ：f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e l e n sc u l i n a r i sa g g l u t i n i n ，异硫氰酸荧光素 标记的扁豆凝集素 p hp r o p i d i u mi o d i n e ，碘化丙锭 m t o c s ：m i c r o t u b u l eo r g a n i z i n gc e n t e r s ，微管组装中一心 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研 究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要 贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本 人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规 定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质 本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可 以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：舷 一缪名 日 期：乏2 立：占炒 山东农业大学硕士专业学位论文 中文摘要 炎热的夏季，动物暴露于高温环境时，生育能力下降。牛的妊娠率可 由凉爽季节的5 0 - - 5 5 下降至炎热季节的l o 一2 0 。将超数排卵后的母 鼠暴露于高温，然后与公鼠交配，发现热应激显著降低收集到的下常胚胎 的比率。由此可见，高温能够对卵母细胞以及胚胎造成损伤并引起胚胎发 育阻滞。但是，在小鼠卵母细胞体外成熟过程中，热应激对卯母细胞以及 随后孤雌胚胎发育能力的研究较少。 本文以1 8 2 3 同龄昆明小鼠为实验模型，将卵母细胞在体外不同温 度条件下( 3 7 4 0 ) 成熟培养，然后在证常的培养条件( 3 7 ) 下孤雌 激活及胚胎培养，系统研究了体外成熟过程中的热应激对卵母细胞以及孤 雌胚发育能力的影响。此外，本文还使用了纺锤体互换技术研究了热应激 对卵母细胞核以及胞质成熟的影响。结果表明： 1 卵母细胞体外成熟过程中的高温( 3 8 5 4 0 ) ，对核成熟没有影响。 2 当卵母细胞在3 8 5 c 成熟培养时。对卵裂率以及囊胚率没有影响。 但是，当温度升高到3 9 c 和3 9 5 时，对卵裂率没有影响但是显著降低 囊胚率。当温度升高到4 0 c 时，所有的胚胎都阻滞在2 细胞期。 3 。利用核移植技术将3 7 和4 0 条件下成熟卵母细胞的纺锤体进行 互换，来研究4 0 c 体外成熟卵母细胞的低发育率是由胞质还是核因素引 起。结果发现将4 0 体外成熟卵母细胞的纺锤体移植到去核3 t c 体外成 熟卵母细胞胞质，重构卵孤雌激活后发现能发育到4 细胞，比例与3 7 纺锤体互换组的差异不显著，这说明3 7 胞质能部分改善4 0 核质体的 发育。这些结果说明，热应激卵母细胞的低发育能力主要是由胞质引起的， 小鼠卵母细胞体外成熟过程中的热应激对胞质成熟的影响 即热应激主要破坏卵母细胞的胞质成熟。 4 当卵母细胞在3 7 3 9 成熟培养时，卵丘细胞对卵母细嚣趣的发育 有一定的保护作用，d o s 的发育能力显著低于c o c s 。但是当温度升高到 4 0 时，不管是否含有卵丘所有的胚胎都阻滞在2 一细胞期。 5 比较3 7 和4 0 下成熟卵母细胞反应胞质成熟的一些指标发现： 两个温度下成熟的卵母细胞都能形成正常mi i 纺锤体，其中i f 常纺锤体和 平头纺锤体的比例没有差异；4 0 成熟培养后获取的m i i 卵母细胞中具有 部分极化线粒体分布的卵母细胞，所占的比例显著高于对照组；4 0 成熟 的m i i 卵母细胞中，c g s 迁移不完全比例增加。 关键词：卵母细胞：热应激：体外成熟；孤雌激活i 纺锤体；小鼠 2 山东农业大学硕士专业学位论文 e f f e c to f h e a ts t r e s so ut h ec y t o p l a s m i cm a t u r a t i o no f m o u s eo o c y t ed u r i n gi nv i t r om a t u r a t i o n a b s t r a c t e l e v a t e da m b i e n tt e m p e r a t u r eh a sl o n gb e e nr e c o g n i z e da sam a j o rf a c t o r r e s p o n s i b l ef o rt h er e d u c e df e r t i l i t yo rc o n c e p t i o nr a t e si nf a r ma n i m a l sd u r i n g h o ts e a s o n s i nc a t t l e ，f e r t i l i z a t i o nr a t ea n de m b r y ov i a b i l i t yf i r el o w e ri nh o t s e a s o n st h a ni nc o o ls e a s o n s ；c o n c e p t i o nr a t e sc a nd e c r e a s ef r o m5 0t o5 5 i n c o o l e rs e a s o n st o1 0 - - 2 0 i nt h eh o ts u m m e r i t sr e p o r t e d e dt h a t ，w h e nf e m a l e m i c ew e r eh e a t - s t r e s s e da t3 5 cf o r1 0ha f t e rh c gi n j e c t i o n ( o o c y t e m a t u r a t i o ns t a g e ) ，r e s u l t e di na s i g n i f i c a n td e c r e a s ei nt h eo v e r a l ld e v e l o p m e n t r a t ea f t e rf e r t i z a l i t i o n b u tt h e r ei sl i t t l ei n f o r m a t i o na v a i l a b l eo ni nv i t r o p a r t h e n o g e n e t i cd e v e l o p m e n to fm o u s eo o c y t e st h a tw e r ee x p o s e dt oh e a t s t r e s sd u r i n gi nv i t r om a t u r a t i o n i nt h i ss t u d y , k u n m i n gm o u s eb e t w e e n18 2 3d a y so l dw e r eu s e da sa m o d l e t h ee m b r y od e v e l o p m e n ta f t e ra c t i v a t i o nw e r ec o m p a r e da m o n g m o u s eo o c y t e st h a th a db e e nm a t u r e du n d e rd i f f e r e n tt e m p e r a t u r e ( 3 7 4 0 ) t oi n v e s t i g a t et h ee f f e c t so fh e a ts t r e s so nn u c l e a ra n d c y t o p l a s m i c c o m p o n e n t sd u r i n g i n v i t r om a t u r a t i o nu s i n gan u m b e ro fe x p e r i m e n t s i n v o l v i n gar e c i p r o c a lt r a n s f e ro ft h en u c l e u s ( c h r o m o s o m es p i n d l ea p p a r a t u s ) b e t w e e n3 t ci nv i t r o m a t u r e do o e y t e sa n d 4 09 c i nv i t r o m a t u r e do o c y t e s t h er e s u l t sa r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 o o c y t e sm a t u r e da tap h y s i o l o g i c a l l yr e l e v a n te l e v a t e dt e m p e r a t u r e ( 3 8 5 4 0 1 h a dn oe f f e c t so nn u c l e a rm a t u r a t i o n 2 h e a ts t r e s sa t3 8 5 h a dn oe f f e c t so ne m b r y od e v e l o p m e n t e x p o s u r e d o o c y t e st ob o t h3 9a n d3 9 5 cd i dn o ta l t e rt h en u m b e ro fe m b r y o st h a t c l e a v e db u tr e d u c e dt h en u m b e ro fe m b r y o st h a t d e v e l o p e d t ot h e b l a s t o c y s ts t a g e i nc o n t r a s t ，w h e ne x p o s u r e dt o4 0 c a l lt h ec l e a v e d e m b r y o sb l o c k e da t2 c e l ls t a g e 小鼠卵母细胞体外成熟过程中的热应激对胞质成熟的影响 3 t oi n v e s t i g a t ew h e t h e rt h i sp o o rd e v e l o p m e n to fh e a ts t r e s so o c y t e si sd u e t oan u c l e a ro ra c y t o p l a s m a t i cf a c t o r , w ed e s i g n e df i l le x p e r i m e n ti nw h i c h t h emi ic h r o m o s o m es p i n d l ew a se x c h a n g e db e t w e e n3 t ca n d4 0 c m a t u r e do o o y t e sb yn u c l e a rt r a n s f e r t r a n s f e ro f t h es p i n d l ea p p a r a t u sf r o m 4 0 m a t u r e do o c y t e st ot h e3 7 c y t o p l a s m i ce n v i r o n m e n tr e s u l t e di na d e v e l o p m e n tr a t ea st h es a m ew i t hr e c i p r o c a lt r a n s f o ro ft h ec h r o m o s o m e s p i n d l eb e t w e e n3 7 m a t u r e do o c y t e s t h e s er e s u l t si n d i c a t et h a tt h ei o w d e v e l o p m e n t a lc o m p e t e n c eo f4 0 c m a t u r e do o c y t e si sc a u s e db yt h e c y t o p l a s m i cc o m p o n e n tr a t h e rt h a nt h en u c l e a rc o m p o n e n t t h a ti st os a y h sm a i n l yi n f l u e n c e st h ec y t o p l a s m i cm a t u r a t i o no f o o e y t e s 4 w h e no o c y t e sw e r em a t u r e da t3 7 3 9 ( 2 ，t h ea p p e a r a n c eo fc u m u l u sc e l l h a dp r o t e c t i v ee f f e c to nc l e a v a g ea n db l a s t o c y s tr a t e ，t h ed e v e l o p m e n tr a t e o fd o ss i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e dc o m p a r e dt oc o c s i nc o n t r a s t ，w h e n o o c y t e sm a t u r e da t4 0 c t h ec u m u l u sc e l lh a dn oe f f e c t so nd e v e l o p m e n t a sa l lt h ee m b r y o sb l o c k e da t2 - c e l ls t a g ew i t ht h es a m er a t e 5 w h e nc o m p a r e dt h ep a r a m e t e r so fc y t o p l a s m i cm a t u r i t yo fo o c y t e sw h i c h m a t u r e da t3 7 a n d4 0 w ef o u n dt h a t ：h sh a dn oe f f e c to ns p i n d l e o r g a n i z a t i o n ，a sb o t hg r o u po fo o c y t e sc a nf o r mn o r m a ls p i n d l es h a p ew i t h t h es a n l er a t e ；p a r t i a lp o l a r i z e dm i t o c h o n d r i a ld i s t r i b u t i o no fh so o c y t e s w e r em o r et h a nt h a to fc o n t r 0 1 t h eh so o c y t e ss h o w e di n c r e a s e dp a a i a l m i g r a t i o no fc g st y p e k e yw o r d s ：o o c y t e s ；h s ；i v m ；p a r t h e n o g e n e t i ca c t i v a t i o n ；s p i n d l e ； m o u s e 4 山东农业大学硕士专业学位论文 1 前言 动物暴露于高温环境时，生殖能力下降( h a f e z ，1 9 6 4 ；e d w a r d s ，1 9 7 4 ) 。 胚胎致死是热应激引起的最重要的生殖表现，因为由很多原因引起所以人 们了解的很少。在哺乳动物包括牛( p m n e ye t a l ，1 9 8 9 , e a l ye t a l ，1 9 9 3 ) ，猪 ( t o m p k i n se ta 1 ，1 9 6 7 ) ，绵羊( d u t te ta i ，1 9 6 3 ) 近发情时热应激对胚胎致死 的有害作用比对发情后要严重的多。这些结果表明，成熟中的卵母细胞很 容易受热应激的影响。近年来，虽然关于热应激对配予以及胚胎发育的影 响的报道很多，但说法不一，而且在小鼠上大部分研究都是对母鼠进行热 应激来研究热应激对发育的影i - j ( m o z a w ae ta 1 ，2 0 0 2 ；t a k a y ae t a 1 ，2 0 0 4 ) ，因此有必要对小鼠卵母细胞体外成熟过程中的热应激影响卵母 细胞的确切机制进行详细的研究。我们设计了下面的实验，通过对小鼠卵 母细胞体外成熟过程中进行热应激，研究体外成熟培养过程中的热应激， 对卯母细胞以及随后孤雌胚胎发育能力的影响。 1 1 卵母细胞的成熟 卵母细胞的成熟是涉及核、质、膜、卵丘细胞和透明带等成熟的一个 复杂的、动态的生物学过程( m a r t i n oe ta 1 ，1 9 9 4 ) 。在卵母细胞成熟过程中 有许多代谢事件发生，除了进行剧烈的m r n a s 转录、蛋白质合成外，还 有其他一些物质的降解( k r i s h e re ta 1 ，1 9 9 8 ；y a n ge ta 1 ，1 9 9 8 ) 。卵母细胞成熟 在形态上表现为纺锤体形成，核仁致密化，染色质高度浓缩形成染色体， 第一极体释放，细胞器重组，卵丘，颗粒细胞扩展、膨胀、液化和透明带 软化等( m a r t i n oe t a l ，1 9 9 4 ) 。 概括来讲，可将卵母细胞的成熟分为核成熟和胞质成熟两部分：核成 熟指的是卵母细胞减数分裂的恢复、进行到第二次减数分裂的中期；伴随 着卵母细胞的核成熟，胞质也会发生许多与成熟有关的变化，涉及为卵母 细胞激活、原核形成和着床前发育而进行准备的过程为卵母细胞受精和着 床前胚胎发育做准备( e p p i ge ta 1 ，1 9 9 4 ；e p p i g ，1 9 9 6 ) ，我们称之为脆质成 熟。许多研究证明，卵母细胞的核成熟和胞质成熟对于受精后j 下常的胚胎 发育是至关重要的( p l a c h o ta n dc r o z e t ，1 9 9 2 ；y a n ge ta 1 ，1 9 9 8 ) ，尤其是对 于核移植的卵母细胞而占，胞质的成熟直接关系到能否使供体核实现彻底 的再程序化、重构胚能否维持正常的分裂发育( k r i s h e re ta 1 ，1 9 9 8 ；y a n ge t 小鼠卵母细胞体外成熟过程中的热应激对胞质成熟的影响 a l 。1 9 9 8 ) o 在大多数哺乳动物中，具有减数分裂能力的卵母细胞当从卵泡环境中 释放出来、进行体外培养时能够自发完成核成熟( h a r t s h o m ee ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 培养小鼠早期腔前卵泡或来源于腔前卵泡的卵丘卵母细胞复合体，能够使 7 0 8 0 的卵母细胞到达mi i 期( e p p i ge ta 1 ，1 9 9 8 ；c o r t v r i n d te ta 1 ，1 9 9 8 ； l i ue ta 1 ，2 0 0 0 ) ，而且束源于新生小鼠卵巢的原始卵泡在适当的体外培养 条件下也能发育到成熟阶段( l i ue ta l ，2 0 0 1 ) 。但事实证明，体外成熟卵母 细胞获得的胚胎经移植后，其胎儿出生率较体内成熟卵母细胞获得的胎儿 出生率低得多，这种现象可能与体外成熟的卵母细胞的胞质成熟程度欠佳 有关( l i u e ta 1 ，2 0 0 1 ；e p p i ge ta 1 ，1 9 9 8 ) 。在体内成熟时，卵泡对核成熟 所提供的抑制影响使得核成熟和胞质成熟之1 日j 存在着最佳的平衡，细胞核 成熟与胞质成熟同步( n o g u e i r ae ta 1 ，2 0 0 3 ) ：但在体外培养时，卵母细胞 离开了卵泡的抑制环境，核质成熟出现了不同步，细胞核成熟的完成并不 能保证细胞质的完全成熟。 卵丘细胞是晟重要的卵泡体细胞，其通过缝隙连接与卵母细胞之间保 持密切的联系，在卵母细胞的成熟和受精过程中起着重要作用( f u k u ia n d s a k u m a ，1 9 8 0 ；f u k u ia n do n o ，1 9 8 9 ；z h a n ge ta 1 ，1 9 9 5 ) 。 早在1 9 8 0 年，f u k u i 和s a k u m a 在研究牛卵母细胞体外成熟时发现， 在体外培养之前去除卵丘对卵母细胞的成熟是不利的。1 9 9 4 年c h i a n 等的 研究也得出了与之相同的结论，于是认为卵丘在卵母细胞成熟过程中起到 了重要作用可概括为以下三点： ( 1 ) 维持卵母细胞处于减数分裂停滞期 早在1 9 3 5 年p i n e u s 和e n z m a r m 就发现，哺乳动物的卵母细胞在离丌 卵泡环境后能自发地恢复减数分裂，由此他们推测：来自卵泡液和卵泡细 胞的一些因子以一种旁分泌的方式抑制了卵母细胞的减数分裂成熟。1 9 9 0 年b u c e i o n e 等指出。卵母细胞与卵丘细胞之日j 的缝隙连接对卵母细胞的 生长和减数分裂的维持非常重要，目前我们已知的、在两种细胞之j 日j 转运 的物质中起减数分裂抑制作用的是嘌呤( 次黄嘌呤和腺嘌呤核苷，小鼠) 和环腺苷一磷酸( c a m p ) 。在哺乳动物卵丘细胞中的c a m p 能促进成熟 抑制因子的产生和激活，这些因子转运到卵母细胞，在卵母细胞内通过 6 山东农业大学硕士专业学位论文 c a m p 独立途径维持在活性状态( e p p i ga n dd o w n s ，1 9 8 4 ) 。有研究表明，能 升高细胞内c a m p 水平的物质将会抑制或延迟卵丘卵母细胞复合体 ( c u m u l u s o o c y t ec o m p l e x e s ，c o c s ) 的减数分裂恢复，而对裸卵 ( c u m u l u s d e n u d e do o c y t e s ，d o s ) 不起作用，所以卵丘细胞显然控制着 卵母细胞的减数分裂( d e k e le ta 1 ，1 9 8 4 ；b i l o d e a ue ta 1 ，1 9 9 3 ) 。 ( 2 ) 参与卵母细胞减数分裂恢复的诱导 现已证明，卵丘细胞在促性腺激素促进卵母细胞减数分裂恢复的过程 中起重要作用，可能的机制是：引发颗粒细胞来源的成熟诱导信号，其 能克服卵泡的抑制环境；中断卵丘细胞与卵母细胞之间的缝隙连接。在 成熟期间，卵丘卵母细胞之日j 的偶联发生了动力学上的变化，主要是卵丘 细胞内缝隙连接的丢失，它可能是通过中断从外部卵丘细胞到卵母细胞的 减数分裂抑制信号的转导束干涉卵母细胞减数分裂的恢复( e p p i ga n d d o w n s 1 9 8 7 ) 。 ( 3 ) 支持卵母细胞的胞质成熟 卵丘对于卵母细胞完成胞质成熟是非常重要的。在牛卵母细胞体外成 熟期间，d o s 不能利用培养液中添加的胱氨酸，而c o c s 的卵丘细胞能将 胱氨酸转变为半胱氨酸，促进卵母细胞对半胱氨酸的摄取。半胱氨酸能够 在卵母细胞内转变为谷胱甘肽( g s h ) ，在成熟卵母细胞内稳定的g s h 水 平能增加j 下常受精率和囊胚发育率( g e s h ie ta 1 ，2 0 0 0 ) 。葡萄糖不易被卵母 细胞代谢，但卵丘细胞能够代谢葡萄糖为丙酮酸或三羧酸循环中间体，它 能够传递到卵母细胞为其利用，提高卵母细胞的成熟质量( g e s h ie ta 1 ， 2 0 0 0 ) 。小鼠d o s 相对于c o c s 而言，代谢葡萄糖的能力很差，丙酮酸能 支持小鼠d o s 的成熟，而葡萄糖仅仅在卵泡细胞存在于培养液中时j 能 起到此作用( d o w n sa n du t e c h t 。1 9 9 9 ) 。 大多数哺乳动物卵母细胞在受精时卵丘细胞仍然存在，体外受精时卵 丘细胞通常是完整的。卵丘细胞对精子的有利影响能够通过以下几个方面 解释( t a n g h e e t a l ，2 0 0 2 ) ：( 1 ) 卵丘细胞能够吸引、捕获和选择精子，增 加围绕在卵母细胞周围的精子数目。卵丘细胞对精予的诱捕可能是通过精 子纠缠在卵丘细胞的透明质酸基质中完成的( b e d f o r de ta 1 ，1 9 9 3 ) 。卵丘 细胞还能够选择形态币常的精子，保留非获能和顶体反应的精子，引导超 小鼠卵母细胞体外成熟过程中的热应激对胞质成熟的影响 激活的精予到达卵母细胞的表面( c a r r e l le ta 1 ，1 9 9 3 ) 。( 2 ) 卵丘细胞能够为 精子获能、顶体反应和穿透卵母细胞创造一个合适的微环境。卵丘细胞可 能通过分泌特定的因子对精子起作用，也可能通过调整生化因子，如氧张 力或p h 对精予起作用( t a n g h ee ta 1 ，2 0 0 2 ) 。目前已知小鼠( a m i e le t a 1 ，1 9 9 3 ) 、人( t e s a r i ke t a l ，1 9 8 8 ；s u l l i v a ne ta l ，1 9 9 0 ) 、猪( b a l le ta 1 1 9 8 5 ) 的卵丘细胞能够在体外分泌蛋白质，卵丘细胞也可能从输卵管液和卵泡液 中或从有血清的成熟培养液中捕获蛋白质提供给卵母细胞。卵丘细胞在体 内也能产生类固醇，例如牛c o c s 体外成熟和体外受精后，可以从培养液 中检测到孕酮。有报道说，在许多哺乳动物如人( b r o n s o ne ta 1 ，1 9 9 9 ) 、 牛( g i r i t h a r a ne t a l ，1 9 9 9 ) 、马( c h e n ge ta 1 ，1 9 9 8 ) 、猪( j i a e ta 1 1 9 9 7 ) 、 仓鼠( l l a n o sa n d a n a b a l o n ，1 9 9 6 ) 和小鼠( h e r r e r oe ta 1 ，1 9 9 7 ) 中，卵丘 细胞产生的孕酮能够促进精子发尘卵质膜反应。( 3 ) 卵丘细胞能够阻止卵 母细胞内可能发生的一些不利于受精的变化，如阻止卵母细胞透明带硬 化。1 9 8 6 年d o w n s 等的研究表明，在小鼠卵母细胞体外成熟期间剥夺血 清和去除卵丘均能够使透明带耐受蛋白水解和精子穿透的能力提高。在猪 上，体外成熟静机械性脱去卵丘也能导致卵母细胞发生成熟前皮质反应， 透明带硬化程度提高( g a l e a t ie ta 1 ，1 9 9 1 ) 。由此可见。卵丘细胞能够通过 阻止卵母细胞透明带硬化而促进卵母细胞受精。 1 2 热应激对卵母细胞成熟和发育能力的影响 1 2 1 热应激对卵母细胞成熟的影响 许多研究表明，在卵母细胞成熟过程中进行热应激抑制卵母细胞核成 熟，导致随后的发育能力降低。核成熟开始后j 能发生胞质成熟，这对卵 母细胞获得受精以及发育到期的能力是必须的( e p p 培1 9 9 6 ；m o o re t a 1 ，1 9 9 8 ) 。将培养的牛g v 期卵母细胞( p a y t o ne ta 1 ，2 0 0 4 ) 或者在卵母细胞 成熟的早期阶段( e d w a r d s & h a n s e n1 9 9 7 ，r o t h & h a n s e n2 0 0 4 a ，b ) 暴露在 高温，破坏卵母细胞成熟过程。因此受精后胚胎发育能力也降低了。牛卵 母细胞在成熟培养的前1 2 h 进行热应激处理，后1 0 h 转入j 下常温度下培养。 结果发现4 0 、4 1 时大部分卵母细胞不能成熟至m i i 。4 0 时卵母细 胞阻抑在m i 、a i 、t i 和m i i 的比例接近，4 1 时成熟率由8 1 下降至 3 0 ，大部分阻抑在m i 期( r o t h & h a n s e n 2 0 0 5 ) 。 山东农业大学硕士专业学位论文 将小鼠g v 期卵母细胞在4 3 分别作用1 5 、3 0 m i n 、l h 、2 h 、4 h ，然 后转入正常的条件下成熟培养，结果发现短时i 日j 处理可加速g v b d 。作用 1 5 和3 0 m i n 后，正常培养1 h 有2 0 的卵发生g v b d ，对照组仅为l o 。 但是随着作用时问的延长，2 4 h 时大部分卵都不能发生g v b d ，显著降 低成熟率( k i me ta 1 。2 0 0 2 ) 。 b a u m g a m e ra n dc h r i s m a n ( 1 9 8 1 ，1 9 8 7 ) 报道，小鼠卵母细胞成熟过 程中热应激，增加了细胞遗传学异常卵母细胞的比率，包括卵母细胞阻抑 在m i 期，核构型发生退化。他们也证明，在卵母细胞成熟过程中对母体 进行热应激，导致附植d 口后胚胎死亡率的增加。 哺乳动物卵母细胞减数分裂过程中的热应激，特异的破坏双价染色体 的分离过程，诱导染色体结构发生变化，失衡。将排卵 的小鼠卵母细胞 在体外不同的温度下( 3 8 5 - - 4 0 ) 成熟培养1 7 h ，发现热应激特定的破 坏双价染色体分离过程，通过将卵母细胞阻抑在mi 期，而阻止细胞进入 随后的成熟过程。热应激条件下到达mi i 的卵母细胞，都存在染色体失衡 现象。4 0 成熟的卵母细胞呈现染色体形态异常，包括改变了姐妹染色单 体的分离以及核的形成，而且只有5 0 的卵母细胞可成熟至mi i ，当温 度高于4 0 时，不能发生g v b d 。高温特异的抑制卵母细胞减数成熟过 程从m i 到后期i 的传递( m a r i ae ta 1 ，1 9 9 2 ) 。然而，e d w a r d s2 0 0 5 年报道 将牛卵母细胞在4 1 培养并不削弱卵母细胞核成熟( 排出第一极体) 和 胞质成熟( 皮质颗粒迁移到卵质膜) 能力。 本实验首次利用纺锤体互换技术来研究在小鼠卵母细胞体外成熟过 程中热应激对核质成熟的影响。 1 2 2 热应激对卵母细胞发育能力的影响 环境温度升高很久以来就被认为是热带和亚热带地区夏季家畜繁殖 力和妊娠率降低的主要因素。牛的受精率和胚胎存活率在凉爽季节都高于 炎热季节( m o n t ye la 1 ，1 9 8 7 ；h a n s e ne ta 1 ，2 0 0 1 ) ，妊娠率可由5 0 一5 5 下 降至1 0 - - 2 0 ( b a d i n g ae ta 1 ，1 9 8 5 ) 。体外的研究表明，将牛早期的2 8 细胞期胚胎暴露在高温下，降低其随后的发育能力。相反，经过胚胎基因 组激活后的肚胎则能比较耐受高温( e d w a r d se ta 1 ，1 9 9 7 ；j ue ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 胚胎致死是热应激引起的最重要的生殖表现，因为由很多原因引起所以被 小鼠卵母细胞体外成熟过程中的热应激对胞质成熟的影响 人们了解的很少。受精前后的高温环境对胚胎发育都有有害影响。取自热 应激母鼠的胚胎呈现发育延迟现象，对此种胚胎进行染色体分析发现，6 的胚胎为三倍体，2 为超倍体( b a u m g a r t n e r e ta 1 ，1 9 8 1 ) 。 热应激通过复杂的机制引起不育，包括作用于激素分泌( w o l f e n s o nd e ta 1 ，2 0 0 0 ) ，作用于胚胎( e d w a r d s & h a n s e n ，1 9 9 7 ；r i v e m & h a n s e n ，2 0 0 1 ) ， 也对卵母细胞产生损害。夏季收集的牛卵母细胞体外受精后发育到囊胚的 比率显著下降( r o e h a a e ta 1 ，1 9 9 8 ；r u t l e d g ej je ta 1 ，1 9 9 9 ；a i k a t a n a n iy m e ta 1 2 0 0 2 ) 。来自夏季热应激损伤的卵巢需要2 3 个发情周期才能获得有 发育能力的卵母细胞( r o t h ze ta 1 ，2 0 0 1 ) ，这表明，卵巢内的卵母细胞库在 卵泡发生的早期就能受热应激的损害。卵母细胞的成熟过程也很容易受热 应激的破坏。将初情期小母牛在刚丌始发情和受精过程暴露于热应激环 境，增加异常以及发育阻滞胚胎的比率( p u t n e yd je ta 1 ，1 9 8 9 ) 。同样的， 成熟过程中将c o c s 暴露在高温环境，降低卵裂率以及发育到囊胚的比率 ( e d w a r d sj le ta 1 1 9 9 7 ) 。 牛卵母细胞体外成熟培养的静1 2 h 分别在3 8 5 ，4 0 和4 1 条件 下，成熟的后1 0 h 、受精以及胚胎培养均在3 8 5 下进行。结果发现，4 0 和4 1 降低卵裂率，囊胚率以及b c ( 囊胚卵裂) 比率。对成熟后的卵 母细胞进行t u n e l 检测发现，热应激条件下随着温度的升高，卵母细胞 发生凋亡的比率升高。首次为生理范围内( 4 0 和4 1 ) 的高温促进哺 乳动物卯母细胞发生凋亡提供了证掘。z r o t h 揭示热应激引起卵母细胞发 生凋亡的机制：由热应激诱导的凋亡出g r o u p i i c a s p a s e s 活性调节，用 2 0 0 n m 的z d 莹v d f m k ( g r o u pi ic a s p a s e s 的抑制剂) 即可抑制凋亡， 阻止由热应激引起的胚胎发育能力下降。s l p 是神经鞘脂类的代谢物，可 通过与神经酰胺的静凋亡效应相抵消来抵抗凋亡( r o t ha n dh a n s e n ， 2 0 0 4 a ) 。向成熟培养基中添加5 0 n ms l p ，即使在热应激条件下卵母细胞 也能难常发育到囊胚。而且形成的囊胚与正常温度条件下形成的囊胚在发 育率，c a s p a s e 活性，总细胞数，凋亡细胞比率上都无差异( r o t ha n dh a n s e n ， 2 0 0 4 b ) 。 猪c o c s 在体外成熟4 2 h ，然后成熟的卵母细胞在4 1 5 分别热处理 0 h ，i h ，2 h 4 h 对照组在币常的情况下培养4 h 。随着热处理时阳的延 山东农业大学硕士专业学位论文 长，孤雌激活胚胎的卵裂率，囊胚率以及细胞数与对照组相比显著下降( j u e ta 1 2 0 0 6 ) 。 热应激泌乳奶牛的直肠温度可接近或超过4 1 c ( s e a t ha n dm i l l e r ， 1 9 4 6 ；m o n t ya n dw o l f f , 1 9 7 4 ；e a l ye ta 1 ，1 9 9 3 ) 。母体温度升高对削弱卵母 细胞发育能力产生的直接影响可能与体外将卵母细胞暴露于4 1 降低胚 胎发育能力( e d w a r d sa n dh a n s e n ，1 9 9 6 ，1 9 9 7 ；l a w r e n c ee ta 1 ，2 0 0 4 ) 的机理 一致( p u t n e y e ta 1 1 9 8 9 ) 。 然而，e d w a r d s2 0 0 5 年报道将牛卵母细胞在4 1 培养并不削弱卵母 细胞核成熟( 排出第一极体) 和胞质成熟( 皮质颗粒迁移到卵质膜) 能力。 而且，对热应激卵母细胞提前5 h 受精能改善热应激的对卵母细胞发育的 负面影响，达到与币常体外受精卵母细胞相似的囊胚率。 母体热应激引起的小鼠合子的发育阻抑不仅于体温升高有关，而是由 引起胚胎内h 2 0 2 浓度增加和g s h 含量下降的母体环境的变化有关。 t a k a y a ，2 0 0 4 年研究发现，当将母鼠暴露于3 5 士1 条件时，其直肠温度 为3 9 4 3 9 6 c ，注射h c g 后的1 0 h 内对母鼠进行热应激处理，然后进行 受精显著降低受精后收集到的j 下常合予的比率，降低了发育到桑囊胚的2 细胞比率。体温过高和高代谢率也能增加r o s ( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ) 的 产生。结合以上观点，这些发现表明，热应激诱导的氧化应激调控母体热 应激合子的发育缺失( m o z a w a ，e ta l ，2 0 0 2 ) 。 但是，在小鼠大部分热应激实验都是超排后在卵母细胞体内成熟过程 期问对母鼠进行热应激处理。受精后研究热应激对其发育能力的影响，体 外成熟过程中对卵母细胞进行热应激，然后进行孤雌激活或受精束研究热 应激对其发育能力影晌的报道很少。因此有必要进行详细的研究，束探索 小鼠卵母细胞体外成熟过程中的热应激对小鼠卵母细胞发育能力的影响 与体内的是否一致，并研究其机理看是否与体内热应激的机理相一致。 1 2 3 卵丘细胞在热应激中的作用 有研究表明，围绕着卵母细胞的卵丘细胞，能增加卵母细胞g s h 合 成能力( d e m a t o se t a l ，1 9 9 7 ；o e s h ie ta 1 ，2 0 0 0 ) ，保护卵免受高温( e d w a r d s & h a n s e n l 9 9 6 ，1 9 9 7 ) 以及氧化应激( t a t e m o t oe ta 1 ，2 0 0 0 ) 的影响。因此。卵 泡中的卵母细胞可能受卵丘细胞的保护，而免于氧化应激或者是热应激诱 小鼠卵母细胞体外成熟过程中的热应激对胞质成熟的影响 导的发生在输卵管内的氧化应激。 热应激对卵母细胞凋亡以及卵裂和随后发育能力的影响可能依赖于 卵母细胞与卵丘细胞形成的卵丘卵母细胞复合体。在小鼠中研究表明，卵 母细胞成熟的完成依赖于卵母细胞与卵丘细胞| 日j 的联系，来自卵母细胞的 旁分泌信号可以使卵丘细胞在促性腺激素的诱导下激活m a p k ，反过来使 得卵丘细胞产生卵母细胞成熟所需信号( s u ne ta 1 ，2 0 0 3 ) 。在牛上也是这 样，卵丘与卵母细胞之间的相互作用在调控9 日母细胞功能中起重要作用。 卵丘与卵母细胞之间缝隙连接的维持也参与成熟的抑制过程( t h o m a se t a 1 ，2 0 0 4 ) 。热应激破坏卵母细胞与卵丘之间的一种或多种相互作用，可能 是诱导卵母细胞发生凋亡，降低卵母细胞卵裂和随后发育能力的主要原因 ( r o t he ta l 一2 0 0 4 ) 。 成熟f i i 脱卵丘降低卵母细胞合成蛋白质的能力；而且将卵母细胞暴露 在4 2 时，d o 的蛋白质合成与c o c 相比下降的更明显( e d w a r d s & h a n s e n1 9 9 6 ) 。卵丘细胞通过缝隙连接与卵母细胞相互作用( b u c c i o n ere t a 1 ，1 9 9 0 ) ，可能是有些小的热保护分子比如g s h ( a r e c h i g ac fe ta 1 ，1 9 9 5 ) 通过缝隙连接进入卵内：或者是，卵丘细胞能提供细胞外的热保护物质或 者能产生调控分子可以激活卵内的热保护机制。虽然体外成熟可能增加成 熟过程中卵母细胞对热应激的敏感性，但是体外( 4 1 0 c c u l t u r et e m p e r a t u r e ； e d w a r d sa n dh a n s e n ，1