（生理学专业论文）芹菜素和木犀草素对缺血再灌损伤神经元的作用及机制研究.pdf

浙江大学硕：l ：学位论文摘要 芹菜素和木犀草素对缺血再灌损伤神经元 的作用及机制研究 浙江大学医学院生理学 硕士研究生方露玫 导师张雄副教授 摘要 目的：探讨黄酮类化合物芹菜素及其肝脏代谢产物木犀草素对缺血复灌损伤神经 元的作用以及可能的作用机制。方法：原代培养的海马神经元经氧糖剥夺2 小时 再灌注2 4 小时处理( o g d r ) 或者急性高浓度谷氨酸处理，分别检测细胞活性， 乳酸脱氢酶漏出率和细胞凋亡率，经o g d r 处理的神经元还进一步检测了一氧 化氮合酶活性( n o s ) 及钠泵活性。在动物模型上采用p u l s i n e l l i 四血管阻断法对 s d 大鼠施行1 0 分钟全脑缺血和2 4 小时复灌，检测钠泵活性。结果：经o g d r 处理后，海马神经元的活性显著地降低，乳酸脱氢酶漏出率和细胞凋亡率均显著 地增高。在o g d 期间给予的芹菜素或木犀草素，在1 0 1 0 0i _ t m o l l - 1 浓度范围内 均能剂量依赖地逆转这些改变；但这两种化合物均不能逆转急性谷氨酸( 1 0 0 i j l m o l l - 1 ) 处理造成的神经元损伤。进一步的实验发现，芹菜素和木犀草素均不 能通过改变n o s 活性而保护o g d r 损伤的神经元。但在细胞和动物实验中，芹 菜素或木犀草素均能增强o g d r 后的钠泵活性，利用钠泵抑制剂能阻断这两种 化合物的神经元保护作用。结论：芹菜素和木犀草素能减轻o g d r 所致的神经 元损伤，其机制可能与两者保护神经元细胞膜上的钠泵活性有关。 关键词：芹菜素；木犀草素；缺血；钠泵；神经元 i i i 浙江人学硕l ：学位论文 英文摘要 e f f e c to fa p i g e n i na n dl u t e o l i no ni s c h e m i a r e p e r f u s i o n i n d u c e dn e u r o nl n 一一 - z h e j i a n gu n i v e r s i t ys c h o o lo fm e d i c i n e c a n d i d a t ef o rm a s t e r sd e g r e e ： s u p e r v i s o r ： a b s t r a c t p h y s i o l o g y l u m e if a n g a s s o c i a t ep r o f x i o n gz h a n g o b j e c t i v e ：t w of l a v o n e s ，a p i g e n i n a n di t s h e p a t i c m e t a b o l i t e l u t e o l i n ，h a v e c o n s i d e r a b l en e u r o p r o t e c t i v ee f f e c t sb yi t sa n t i o x i d a t i v em e c h a n i s m h o w e v e r , i ti s s t i l lu n c l e a rw h e t h e ra p i g e n i na n dl u t e o l i nc a np r o t e c tn e u r o n sa g a i n s to x y g e n g l u c o s e d e p r i v a t i o n r e p e r f u s i o n ( o g d r ) i n d u c e di n j u r yb yo t h e rm e c h a n i s m s m e t h o d s ： a f t e rt w oh o u r so x y g e n - g l u c o s ed e p r i v a t i o na n d2 4h o u r sr e p e r f u s i o nt r e a t m e n to r a c u t eh i g hc o n c e n t r a t i o no fg l u t a m a t et r e a t m e n ti np r i m a r yc u l t u r e dh i p p o c a m p a l n e u r o n s ，t h en e u r o nv i a b i l i t y , s u r v i v a lr a t ea n da p o p t o s i sr a t ew e r ee v a l u a t e db ym t t a s s a y , l a c t a t ed e h y d r o g e n a s e ( l d h ) l e a k a g ea s s a ya n dh o e c h s ts t a i n i n g , r e s p e c t i v e l y a c t i v i t i e so fn a + k + 一a t p a s ea n dn i t r i co x i d es y n t h a s ef n o s ) w e r ea l s om e a s u r e di n o g d rt r e a t e dn e u r o n s m a l es p r a g u e d a w l e yr a t sw e r et r e a t e dw i mt e nm i n u t e s g l o b a lc e r e b r a li s c h e m i aa n df o l l o w e d2 4h o u r sr e p e r f u s i o ni n d u c e db yp u l s i n e l l i s 4 - v e s s e lo c c l u s i o n ，a n dt h ea c t i v i t yo f n a + k + a t p a s ew a se s t i m a t e da f t e ri r r e s u l t s ： t r e a t m e n tb yo g d rm a r k e d l yr e d u c e dn e u r o n a lv i a b i l i t y , i n c r e a s e dl d hl e a k a g e r a t ea n da p o p t o s i sr a t e a p p l i c a t i o no fa p i g e n i no rl u t e o l i n ( 10 10 0i - t m o l l - 1 ) d u r i n g o g di n h i b i t e do g d ri n d u c e dn e u r o ni n j u r ya n da p o p t o s i si nad o s e - d e p e n d e n t m a n n e r , b u tm e yc a n n o tr e v e r s et h ei n j u r yi n d u c e db ya c u t eg l u t a m a t et r e a t m e n t ( 10 0 i - t m o l l _ ) f u r t h e r m o r e ，a p i g e n i na n dl u t e o l i nd i dn o ta f f e c tt h ea c t i v i t i e so ft o t a ln o s a n di n d u c i b l en o sd u r i n go g d rs i g n i f i c a n t l y , b u tp r e s e r v e dt h ea c t i v i t yo f n a + k + 一a t p a s e s u p r e s s e db yg l o b a li s c h e m i a r e p e r f u s i o n o ro g d rt r e a t m e n t i n h i b i t i o no fn a + k + - a t p a s ew i t ho u a b a i na t t e n u a t e dt h ep r o t e c t i v ee f f e c ta f f o r d e db y i v 浙江人学硕一i ：学位论文英义摘要 a p i g e n i na n dl u t e o l i n c o n c l u s i o n s ：t h ed a t ap r o v i d et h ee v i d e n c et h a ta p i g e n i na n d l u t e o l i nh a v en e u r o p r o t e c t i v ee f f e c ta g a i n s to g d ri n d u c e di n j u r ya n dt h ep r o t e c t i v e e f f e c tm a yb ea s s o c i a t e dw i t ht h e i ra b i l i t yt oi m p r o v en a + k + - a t p a s ea c t i v i t ya f t e r o g d r k e yw o r d s ：a p i g e n i n ；l u t e o l i n ；i s c h e m i a ；n a + k + a t p a s e ；n e u r o n v 浙江人学硕 ：学位论墨一一堕堕旦 - - _ - - _ _ - - _ _ _ i _ _ - _ _ _ _ 一一 英文缩写 a p i a d p a m p a a t p d a p i d m e m f b s f i t c 心心 g l u h e p e s i 瓜 k a l d h l n a m e l u t 队p 2 m k 8 0 1 v i 缩略词 英文全称 a p i g e n i n a d e n o s i n ed i p h o s p h a t e a - a m i n o 一3 - h y d r o x y 一5 一m e t h y l - 4 一i s o x a z o l e p r o p i o n i ca c i d a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e 4 ，6 d i a m i d i n o - 2 - p h e n y l i n d o l e d u l b e c c o sm o d i f i e de a g l em e d i a f e t a lb o v i n es e r u m f l u o r e s e c e i ni s o t h i a c y a n a t e g l i a lf i b r i l l a r ya c i d i cp r o t e i n g l u t a m a t e 4 一( 2 - h y d r o x y e t h y l ) - 1 一p i p e r a z i n e e t h a n e s u l f o n i ca c i d i s c h e m i a r e p e r f u s i o n k a i n i ca c i d l a c t a t ed e h y d r o g e n a s e n 0 0 - - n i t r o - - l a r g l n i n em e t h y le s t e r h y d r o c h l o r i d e l u t e o l i n m i c r o t u b u l e a s s o c i a t e dp r o t e i n2 ( 5 r ，lo s ) - ( + ) - 5 - m e t h y l 一10 ，11 一d i - h y d r o - 5 h d i b e n z o c y c l o h e p t e n - 5 ， 10 - i m i n eh y d r o g e nm a l e a t e 中文全称 芹菜素 二磷酸腺苷 0 【氨基羟甲基恶唑丙酸 三磷酸腺苷 4 6 二脒基2 苯基吲哚 胎牛血清 异硫氰酸荧光素 胶质纤维酸性蛋白 谷氨酸 4 羟乙基哌嗪乙磺酸 缺血再灌注 红藻氨酸 乳酸脱氢酶 左旋硝基精氨酸甲酯 木犀草素 微管相关蛋白2 5 甲基二氢二苯并环庚烯 亚胺马来酸 浙江人学硕l ：学位论文 缩略词 m t t n m d a n o n o s t n o s i n o s e n o s n n o s o g d r p b s p s t h a t r i t c 3 - ( 4 ，5 一d i m e t h y l t h i a z o l 一2 - y 1 ) - 2 ，5 - d i p h e n y l t e t r a z o l i u mb r o m i d e n - - m e t h y l - d - a s p a r t i ca c i d n i t r i co x i d e n i t r i co x i d es y n t h a l s e t o t a ln i t r i co x i d es y n t h a s e i n d u c i b l en i t r i co x i d es y n t h a s e e n d o t h e l i a ln i t r i co x i d es y n t h a s e n e u r o n a ln i t r i co x i d es y n t h a s e o x y g e n - - g l u c o s ed e p r i v a t i o n r e p e f f u s i o n p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e p e n i c i l l i n s t r e p t o m y c i ns o l u t i o n t h r e o h y d r o x y a s p a r t a t e t e t r a m e t h y l r h o d a m i n ei s o t h i o c y - a n a t e 噻唑蓝 n 甲基d 天冬氨酸 一氧化氮 一氧化氮合酶 总一氧化氮合酶 诱导型一氧化氮合酶 内皮型一氧化氮合酶 神经元型一氧化氮合酶 氧糖剥夺再灌注 磷酸盐缓冲溶液 青霉素链霉素溶液 苏羟天冬氨酸 四甲基异硫氰酸罗丹 明荧光素 v i l 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得浙逛太堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：音蚕友 签字日期：伽o 年弓月，日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解浙江太堂有权保留并向国家有关部门或机构 送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权浙逛太堂可 以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：舀露友 签字日期：讪0 年弓月歹日 撇名：膨以 签字日期：c 3 l 。p 年；月厂日 浙江人学硕+ i ：学位论文 致谢 致谢 衷心感谢尊敬的导师张雄老师对本课题所给予的精心指导，感谢导师多年来对 本人学习、工作和生活上的关怀和帮助。导师严谨的科学态度、广博的理论知识 及丰富的科研经验使学生终生受益。 衷心感谢夏强教授对本课题实验工作的鼎立支持，感谢夏强教授对本人学习、 生活上的关心和帮助。 衷心感谢我的父母，我的弟弟多年来对我的支持和大力帮助。 衷心感谢浙江大学城市学院生物技术系丁悦敏老师对实验工作的支持和对本 人学习，生活上的关心和帮助。感谢浙江大学生理教研室王会平副教授、叶治国 老师多年来对本人学习、工作、生活上的指导和关心。感谢香港大学医学院b r u c e 教授在英文论文撰写和修改方面给予的指导和帮助。 感谢沈岳良教授、王琳琳老师、陈莹莹老师、虞燕琴老师、刘双双老师的指导 和帮助。衷心感谢生理教研室博士研究生钱令波在实验过程中及生活上给予的指 导和热情帮助。 感谢浙江大学生理教研室研究生刘书琴，医学院本科生张明明，方玉婷，姚春 蕾在我实验及生活中给予的帮助。 感谢生理教研室研究生沈佳，崔洁，孙丽娜，苏方，茹筱晨的热情帮助。 最后衷心感谢所有帮助本课题完成的老师、同学和朋友。 浙江人学硕 ：学位论文序言 蔑专 缺血性脑梗塞已成为当今世界致死致残的最主要疾病之一【l 】。此病主要出现 在6 5 岁以上的人群中，在全球范围内，每年有4 6 0 万人死于此类疾病，其中1 3 出现在发达国家，其余发生在发展中国家。我国是脑梗塞高发地区，据统计，我 国每年新发生的病例约为1 3 0 一1 5 0 万例，死亡人数近1 2 0 万，而四分之三左右的 幸存者也留有不同程度的偏瘫、失语和大小便障碍等后遗症。因此如何防治脑梗 塞的问题是目前急需解决的重大课题。 脑梗塞导致的脑缺血损伤涉及复杂的病理生理机制，而且神经元对缺氧的敏 感及不可再生性给临床治疗带来了相当的困难，不过近年来，脑梗塞的治疗已有 了很大的进展，具体表现在：早期时间窗内的溶栓治疗及介入技术；神经保护剂 的应用；恢复期的神经康复等。然而仍有很多问题存在，如早期溶栓被认为是目 前有效的治疗方法，但受到较短的溶栓时间窗及医院条件的限制，所以从该项治 疗中受益的病人并不多；而神经保护剂在应用中也存在着很大的局限性：如药物 的治疗窗非常短，难以到达缺血区，严重的不良反应，临床试验效果不明显等1 2 4 1 。 黄酮类化合物是一类天然存在的强抗氧化剂，它们能有效的减轻缺血再灌后 自由基对细胞的损伤。我们前期的研究发现杭白菊提取物能有效的减轻脑缺血损 伤，本研究在此基础上进一步观察了杭白菊主要成分之一的芹菜素及其肝脏代谢 产物木犀草素对缺血再灌注损伤神经元的作用，并从非抗氧化途径探讨了它们对 细胞膜n a + ，c a t p 酶活性，兴奋性氨基酸毒性和一氧化氮合酶活性这三个方面 的作用机制。旨在为脑缺血损伤的防治提供更好的药物及治疗靶点。 i l 浙江人学硕i ：学位论文 芹菜素和木犀草素对缺血再灌损伤神经元的 作用及机制研究 浙江大学医学院生理学 硕士研究生方露玫 导师张雄副教授 引言 随着人类平均寿命的延长，人口逐渐老龄化，这使高发于老年人的脑梗塞的 患病率逐年升高，目前它已成为当今世界致死致残的最主要疾病之一【1 1 。在我国， 脑梗塞与心脏病，癌症一起并称中国人的三大头号杀手【5 1 。据统计，我国每年新 发脑梗塞的病例约为1 3 0 一1 5 0 万例，死亡人数近1 2 0 万，而四分之三左右的幸存 者还留有不同程度的偏瘫、失语和大小便障碍等后遗症。 脑是人体对缺氧最为敏感的器官，脑组织缺血将会导致局部脑组织及其功能 的损害，其损害程度与缺血时间长短及残存血流量多少有关，短期不完全性缺血 只引起可逆性损害，而长时间的完全缺血或严重缺血会引起梗死【6 】。临床上治疗 此类疾病的原则是及时恢复缺血区的血液供应，使缺血脑组织重新得到氧的供应， 提供代谢所必需的营养物质并清除代谢废物同。及时恢复血液再灌注将有利于减 轻脑缺血损伤，至少使某些可逆性损伤获得功能上的恢复。 脑缺血后神经元损伤的机制是一个复杂的病理生理过程，至少涉及以下几种 不同的机制：能量障碍，兴奋性氨基酸中毒，梗死周围去极化，钙离子内流，炎 症及细胞凋亡等，它们彼此重叠并相互联系。 a 能量代谢的障碍 缺血缺氧时，细胞氧化磷酸化的能力下降，三磷酸腺苷( a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e ， a t p ) 的合成减少，使n r ，k + a t p 酶的功能下降。n a + k + a t p 酶也称钠泵或钠 浙江人学硕i ? 学位论文 引言 钾泵，是真核细胞膜上的最主要的一类蛋白质，其每一次活动得水解1 分子a t p 并将3 个n a + 运至胞外，同时将2 个k + 泵入胞内，因而在跨膜转运中产生细胞内 高k + ，胞外高n a + 的状态，这对于细胞渗透压的维持、细胞体积的调节和可兴奋 性细胞的膜静息电位的恢复和保持等都是必须的【8 】。研究发现n a + k + a t p 酶与临 床许多疾病密切相关，它不仅可以作为原始病因参与某些疾病的发生，还是很多 疾病的重要环节，决定其发展及转归。尤其是在缺血性脑梗死时，早期就有 n a + k + a t p 酶活性的下调【9 】。能量代谢障碍还可使梗死灶周围产生去极化反应最 终导致梗死面积的扩大【l o “】。能量不足还会降低线粒体的呼吸链递氢功能，使a t p 生产进一步减少，严重时可出现线粒体肿胀、外膜破碎和基质外溢等病变【1 2 ，1 3 】。 p h 降低和胞浆游离c a 2 + 的增加引起磷脂酶活性增高使溶酶体膜磷脂被分解，结 果使溶酶体肿胀，破裂和大量溶酶体酶释放从而导致细胞及周围组织的溶解，坏 死【1 4 】。因而能量代谢障碍在脑缺血病理发展中具有非常重要的地位，而且是诱导 发生脑缺血损伤早期的主要原因。 b 兴奋性氨基酸 谷氨酸是脑内主要的神经递质，大量研究显示缺血期间积聚的谷氨酸引起的 兴奋毒性在缺血性神经细胞损伤中起着重要作用。谷氨酸离子通道型受体有三种 类型：n 甲基一d 天冬氨酸( n m d a ) 受体、海藻氨酸( k a ) 受体和0 【氨基3 羟基 5 甲基4 异恶唑( a m p a ) 受体。其中n m d a 受体对c e + 具有通透性，是介导 谷氨酸兴奋性毒性的主要通道。缺血时间愈长，脑间质谷氨酸的峰值浓度愈高， 神经病理学和神经学损伤愈严重【”】。谷氨酸造成的神经元毒性作用主要包括两个 方面：一是通过激活n m d a 受体，引起神经元持续去极化，介导c a 2 + 大量内流， 甚至使细胞内钙库贮存的c a 2 + 释放增加，导致细胞内c a 2 + 超载，激发一系列瀑布 样病理生理过程，进一步导致神经元的凋亡及坏死【1 6 1 ；二是参与脑内多种代谢过 程，使三羧酸循环受阻，a t p 生成减少而进一步加重细胞的损伤。 c 钙离子超载 脑缺血发生后存在严重的c a 2 + 紊乱。一方面，能量代谢障碍造成钠泵活性下 降，细胞去极化使钙通道开放，c a 2 + 内流增加，同时缺氧造成的钙泵功能下降和 2 浙江人学硕1 ：学位论文引占 n a + c a 2 + 交换异常影响c a 2 + 的外流和被摄取【5 1 ，造成大量c a 2 + 积聚在胞内。另一 方面，由于谷氨酸的积聚激活了n m d a 受体，使该受体调控的c a 2 + 通道开放引 起c a 2 + 内流【1 7 ，18 1 。c a 2 + 大量沉积在线粒体会干扰氧化磷酸化过程而加重能量障碍。 c a 2 + 作为主要的第二信使会促发胞质和胞核的一系列反应，如激活蛋白分解酶， 降解细胞骨架蛋白和基质蛋白以致细胞发生凋亡，导致组织损伤【1 9 】。钙超载还能 激活磷脂酶a 2 和环氧合酶，产生活性氧并抑制内源性清除系统加重脑损害，而活 性氧作为信号分子促发炎症反应和细胞凋亡【2 0 ，2 。 d 炎症反应 炎症反应在缺血性损伤所引发的继发性脑损伤中起着关键作用。脑缺血后， 胶质细胞会释放大量的致炎症细胞因子， 因子释放，白细胞黏附分子的表达上调， 细胞坏死后的胞内漏出物也可引起趋化 构成了缺血损伤向炎症性损伤转变的基 础，随后白细胞向缺血区的聚集和浸润导致继发性神经元损伤和梗死面积的扩大。 聚集的白细胞释放氧自由基、溶蛋白酶等造成组织坏死；当中性粒细胞迁移出血 管浸润到缺血组织，通过细胞因子的释放还可直接导致细胞毒性损伤 2 2 - 2 4 】。 e 一氧化氮 在脑缺血及再灌注损伤中，一氧化氮既有扩张血管、改善缺血组织血供、抑 制血小板凝集、减轻缺血再灌注损伤的保护作用【2 5 1 ，又有介导和加重缺血再灌注 损伤的毒性作用。目前认为，脑缺血早期，结构型内皮一氧化氮合酶( e n o s ) 活 性增强，能松弛血管平滑肌细胞，帮助血流量的维持；缺血中期后诱导型一氧化 氮合酶( i n o s ) 表达明显增加，产生的大量n o 介导缺血再灌注损伤，这可能也是 介导脑缺血后神经细胞损伤的主要机制之一【2 6 , 2 7 。n o 对神经元的损伤机制主要通 过产生大量的羟自由基和二氧化氮自由基，造成蛋白质、核酸、膜脂质的损伤及 抑制各种与线粒体电子传递有关的酶类，最终抑制线粒体呼吸的完成，还能减弱 氧化磷酸化过程从而阻止能量合成使细胞能量耗竭而死亡 2 8 】。 f 自由基 人体内的自由基主要有氧自由基、羟自由基、一氧化氮自由基、烷自由基、 脂质过氧化物自由基等。在脑缺血及再灌注状态下可产生大量自由基，自由基对 3 浙江人学硕十学位论文 引言 神经元的损伤机制主要包括：( 1 ) 使红细胞膜上的脂质发生过氧化反应，膜中层 的骨架蛋白交联及氧化而导致红细胞变形能力降低，刚性增加，全血粘度增高；( 2 ) 损害血管内皮细胞，破坏血管壁的完整性。损伤部位激活血小板导致其黏附、聚 集并产生释放反应，释放的内源i 生a d p 、血栓素a 2 可进一步导致血管收缩，血粘 度增高，从而进一步加重脑损伤 2 0 , 2 9 , 3 0 】。( 3 ) 细胞膜，细胞器膜的不饱和脂肪酸 发生脂质过氧化反应，磷脂被降解而变性，目前多数学者认为自由基引发的脂质 过氧化反应主要出现在缺血后再灌注的早期【3 1 1 ；( 4 ) 干扰和抑制蛋白质的合成， 破坏d n a 的结构【2 1 1 。 g 梗死周围去极化 脑缺血后缺血中心区的细胞由于钠泵活动的减弱出现低氧性去极化并且不能 复极【3 2 1 ，在部分缺血区，由于保留了部分再灌注，细胞可以复极但可对积聚的谷 氨酸产生反应导致去极化 3 3 , 3 4 】，这种去极化称为梗死周围去极化。无论低氧性去 极化还是梗死周围去极化均可造成细胞凋亡或坏死【2 7 1 。 a p i g e n i n o h o o h o h o 图1 芹菜素和木犀草素的化学结构式 f i g 1 c h e m i c a ls t r u c t u r eo fa p i g e n i na n dl u t e o l i n 芹菜素( a p i g e n i n ) 又名5 ，7 ，4 三羟基黄酮，木犀草素( l u t e o l i n ) 又名3 ，4 ，5 ，7 一 四羟基黄酮，它们是存在于多种植物中的含量较高的两种天然黄酮类化合物。而 且木犀草素是芹菜素在肝脏的主要代谢产物【3 7 1 ，所以两者几乎是不可分离的，同 4 浙江人学硕。 j 学位论文 引言 时在体内起作用。芹菜素和木犀草素都具有共同的2 苯基色原酮结构，区别主要 在于木犀草素在反映抗氧化活性的b 环上比芹菜素多一个酚羟基。对芹菜素和木 犀草素的结构分析及生物学研究都已证实它们具有显著的减少自由基的生成，抑 制脂质过氧化等的抗氧化作用，可以减轻氧化剂及自由基对细胞造成的损伤【3 5 ， 3 6 1 。我们实验室的前期工作发现从杭白菊中提取的总黄酮可以通过其抗氧化作用 而对大鼠缺血再灌注损伤大脑有显著的保护作用，且已经证实芹菜素，木犀草素 是杭白菊总黄酮中的两种主要成分，因而本研究通过建立原代培养的大鼠海马神 经元细胞的体外缺血再灌注模型一氧糖剥夺再灌注模型来分别研究芹菜素和木 犀草素对神经元缺血再灌注损伤的影响。另外，目前的研究把芹菜素，木犀草素 的生物学效应主要归因于它们的抗氧化特性，然而在缺血性器官损伤的病人中应 用强抗氧化剂并无显著疗效【3 8 1 ，这提示仅从抗氧化特性上并不能完全解释抗缺血 保护作用。所以我们分别从缺氧损伤的多个非抗氧化机制入手，探讨芹菜素和木 犀草素是否通过影响兴奋性氨基酸毒性、n o s 活性及钠泵活性等起作用。 浙江大学硕i j 学位论文材料和方法 1 材料和方法 1 1 实验材料 1 1 1 实验动物 出生2 4 h 内的清洁级s p r a g u e d a w l e y ( s d ) 大鼠，由浙江大学医学院实验动 物中心提供；清洁级雄性s p r a g u e d a w l e y ( s d ) 大鼠( 2 0 0 2 5 0g ) ，由浙江大 学医学院实验动物中心提供。 1 1 2 主要仪器 名称型号产地 二氧化碳培养箱 3 11 1t h e r m os c i e n t i f i c 公司 超净工作台h s 8 4 0 u苏州安泰空气技术有限公司 解剖显微镜x t l - 3 4 0 0 s t中国上海 倒置荧光显微镜 i x 7 0 日本o l y m p u s 公司 低温冰箱 b c d 2 2 0 b 中国上海 电子天平 a b 2 0 4 e瑞士m e t t l e r 公司 低温高速离心机 3 k 3 0德国s i a m a 公司 多功能酶标仪 m 2 0 0 瑞士t e c a n 公司 1 1 3 药品与试剂 木犀草素( 1 u t e o l i n ) ，芹菜素( a p i g e n i n ) ，多聚右旋赖氨酸( p o l y - d 1 y s i n e ) ， l 谷氨酰胺( l - g l u t a m i n e ) ，l 一谷氨酸( l - g l u t a m i ca c i d ) ，苏- 羟天冬氨酸 ( t h r e o h y d r o x y a s p a r t a t e ，t h a ) ，左旋硝基精氨酸甲酯( n0 0 n i t r o - l - a r g i n i n em e t h y l e s t e rh y d r o c h l o r i d e ，l - n a m e ) ，g 毒毛旋花苷乌本苷( o u a b a i no c t a h y d r a t e ) ，4 羟乙基哌嗪乙磺酸( 4 一( 2 - h y d r o x y e t h y l ) 一1 p i p e r a z i n e e t h a n e s u l f o n i ca c i d ， h e p e s ) ，阿糖胞苷( c y t o s i n ep d a r a b i n o f u r a n o s i d e ，a r a c ) 均购自s i g m a 公司； 鼠抗g f a p ( g l i a lf i b r i l l a r ya c i d i cp r o t e i n ) 一抗，结合有异硫氰酸荧光素( f l u o r e s e c e i n i s o t h i a c y a n a t e ，f i t c ) 的羊抗兔二抗，结合有四甲基异硫氰酸罗丹明荧光素 6 浙江人学硕 ：学位论文材料和方法 ( t e t r a m e t h y l r h o d a m i n ei s o t h i o c y a n a t e ，t r i t c ) 的羊抗鼠二抗购于c h e m i c o n 公司； 兔抗m a p 2 ( m i c r o t u b u l e a s s o c i a t e dp r o t e i n2 ) 一抗购于s a n t ac r u s 公司；噻唑蓝 ( 3 一( 4 ，5 一d i m e t h y l t h i a z o l 一2 y 0 2 ，5 一d i p h e n y l t e t r a z o l i u mb r o m i d e ，m t t ) 购自a m r e s c o 公司；n e u r o b a s a lam e d i u ml i q u i d ，b 一2 7s e r u m f r e es u p p l e m e n t ，胎牛血清( f e t a l b o v i n es e r u m ，f b s ) 均购自g i b c o 公司；d u l b e c c o sm o d i f i e de a g l em e d i a ( d m e m ) ， 青霉素链霉素溶液( p e n i c i l l i n s t r e p t o m y c i ns o l u t i o n ，p s ) 购自p a a 公司；胰酶 溶液( t r y p s i n e d t as o l u s i o n ) 购自p r o m o c e l l 公司；乳酸脱氢酶( 1 a c t a t e d e h y d r o g e n a s e ，l d h ) 测试盒，a t p ( a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e ) 酶测试盒，超微量 a t p 酶测试盒，考马斯亮蓝测试盒，一氧化氮合酶( n i t r i co x i d es y n t h a s e ，n o s ) 测试盒购于南京建成生物工程研究所；细胞凋亡h o e c h s t 染色试剂盒，细胞裂解 液购自碧云天生物技术研究所；其余试剂为市售分析纯。 p b s ( p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e ) 缓冲液( m m o l l - 1 ) p h 7 4 n a c l k c l 1 3 7 2 7 n a 2 h p 0 4 4 k i - 1 2 p 0 4 1 7 6 o g d ( o x y g e n g l u c o s ed e p r i v a t i o n ) 用细胞外液( m m o l l 。1 ) p h 7 4 n a c l1 3 7 k c l c a c l 2 5 4 1 8 m g s 0 4 0 8 h e p e s1 0 对照组细胞的细胞外液中添加5m m o l l - 1 的g l u c o s e ，其余成分不变。 1 2 实验方法 7 浙江人学硕j ：学位论文 材料和方法 1 2 1 海马神经元的原代培养 出生2 4h 内的s d 大鼠，由浙江大学医学院实验动物中心提供。在无菌条件 下，动物经酒精消毒后断头取脑放入冰浴处理的d m e m 溶液中，并在解剖显微 镜下分离出海马组织，小心去掉组织周围的脑膜，避免过度牵拉，以防损伤组织， 然后在0 2 5 的胰酶中3 7 消化1 5 1 6m i n 。用含1 0 f b s 的d m e m 终止消化 后，依次用大、中、小头的巴士德管进行3 次机械吹打以分离细胞，分别收集细 胞悬液后离心沉淀，离心前取适量混悬液用台盼蓝进行细胞计数，再把细胞重悬 于含2 0 体积分数的b 2 7 ，1 体积分数的双抗和0 5m m o l l 1l 谷氨酰胺的 n e u r o b a s a l 培养基中，并于培养初期添加谷氨酸至终浓度为0 2m m o l l - 1 ，然 后种植于用多聚赖氨酸包被过的培养板或玻片上。每隔3 天进行半量换液，纯培 养的神经元细胞在第一次换液时往细胞培养液里加入阿糖胞苷至终浓度5 l x m o l l - 1 ，混合培养的细胞不添加阿糖胞苷，培养l o 天后的细胞用于实验。谷 氨酸毒性实验中往细胞培养液内添加谷氨酸至终浓度为1 0 0p , m o l l - 1 ，同时按分 组要求加入芹菜素或木犀草素，按实验要求的时间点分别处理各组细胞，然后换 上不含谷氨酸的正常神经元培养基继续培养2 4 h 。 1 2 2 神经元的氧糖剥夺再灌注( o x y g e n g l u c o s ed e p r i v a t i o n r e p e r f u s i o n ，o g d r ) 神经元培养到第十天时将培养基换为预先经9 5 n 2 和5 c 0 2 混合气饱和的 o g d 用细胞外液，然后将细胞立即置于持续通有混合气体( 9 5 n 2 + 5 c 0 2 ) 的 密闭容器中，并继续通气3 0m i n 后夹闭通气口和出气1 2 ，在培养箱内培养。对照 组细胞的培养液则换成添加5m m o l l - 1 葡萄糖且含氧的细胞外液后置于培养箱 内培养。所有细胞经2h 培养后重新把细胞外液换回含b 2 7 的n e u r o b a s a l 培养基， 在培养箱内继续培养2 4h 。芹菜素，木犀草素，哇巴因等均在o g d 前加至细胞 外液中。 1 2 3 大鼠的全脑缺血再灌模型( i s c h e m i a r e p e r f u s i o n i r ) 采用改良的p u l s i n e l l i 四血管法来建立大鼠的全脑缺血再灌注模型。大鼠用水 合氯醛( 3 5 0 r a g k 水重) 腹腔注射麻醉后，用电针烧闭第一颈椎两侧翼小孔内的双 侧椎动脉，并分离双侧颈总动脉套环备用。缝合切口后待动物完全苏醒将其移至 r 浙江大学硕一f j 学位论文材料和方法 笼内饲养，缺血前的8 h 内禁食。2 4 h 后在大鼠完全清醒的状态下，用动脉夹同时夹 闭双侧颈总动脉1 0 m i n ，造成短暂的全脑缺血。大鼠在缺血后出现昏迷，翻正反射 消失，能自主呼吸，双侧瞳孔放大，痛觉反射消失，这些症状持续于整个缺血过 程中，凡未出现以上症状或这些症状未能持续整个缺血过程中的大鼠弃用。缺血 1 0m i n 后解除动脉夹，恢复脑血流，动物即逐渐恢复知觉开始活动，未见明显障碍， 凡缺血后有癫痫、偏瘫、惊厥等症状的大鼠均弃用。缺血后的大鼠在存活2 4h 后进 行大脑海马组织的分离，然后进行蛋白活性的测定。模型组的动物进行相同的手 术但不夹闭颈动脉。药物组的动物在缺血前的9 0 m i n 腹腔注射芹菜素、木犀草素。 对照组和模型组的动物则以同样剂量的o 5 的羧甲基纤维素钠来代替芹菜素和木 犀草素。 1 2 4m t t 比色法检测细胞存活度 根据活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能还原化合物m t t ( 3 一( 4 ，5 - d i m e t h y l t h i a z o l 2y 1 ) 2 ，5 一d i p h e n y l t e t r a z o l i u mb r o m i d e ) 为水不溶性的蓝紫 色结晶甲瓒而死细胞无此功能的原理，o g d r 诱导损伤后加入m t t ，使其终 浓度为0 5m g m l ，于3 7 在培养箱内与神经元孵育4h ，小心弃上清后每孔加 入4 0 0l a l 二甲基亚砜溶解甲瓒，利用酶标仪在4 9 0n l t i 波长下测定甲瓒的吸光度 值，反映细胞存活度。以对照组的细胞存活度为1 0 0 ，实验组细胞存活度( ) = 实验组吸光度值对照组吸光度值1 0 0 。 1 2 5 乳酸脱氢酶( 1 a c t a t ed e h y d r o g e n a s e ，l d h ) 漏出率的测定 根据细胞所含的l d h 能催化乳酸和氧化型辅酶i ( n a d ) 生成丙酮酸和还原型 辅酶i ( n a d h ) ，而丙酮酸与2 ，4 一二硝基苯肼反应生成2 ，4 一二硝基苯腙，后者在碱 性溶液中呈棕红色，从而通过比色法测定丙酮酸的含量能推算出l d h 的活力。细 胞损伤或死亡后胞内的l d h 会漏出到培养液中，收集细胞培养液，利用乳酸脱氢 酶测定试剂金，用酶标仪在4 4 0m 波长处测定吸光度值，此为培养液l d h 的活性。 神经元经细胞裂解后收集裂解液，测定l d h 活性，此为细胞l d h 活性。l d h 漏出 率( ) = 培养液l d h 活性( 培养液l d h 活性+ 细胞l d h 活性) x1 0 0 。 1 2 6h o e c h s t 3 3 2 5 8 染色测细胞凋亡率 9 浙江人学硕j ：学位论文材料和方法 h o e c h s t 3 3 2 5 8 是一种d n a 染料，能与细胞核d n a 结合并在3 5 0a m 波长的 激发光下呈现蓝色荧光。利用h o e c h s t 细胞凋亡检测试剂盒，将待测细胞用固定 液固定1 0m i n 后弃固定液，p b s 漂洗后加入染色液，然后再用p b s 漂洗后进行 封片，封片后在荧光显微镜下观察并计数。凋亡细胞显示核d n a 浓染、碎裂、 出现凋亡小体等典型的形态学改变。在5 0 0 倍放大下选择紧邻的5 个视野观察， 以凋亡阳性细胞数所占细胞总数的百分比为细胞凋亡率。 1 2 7 钠泵活性的检测 根据钠泵可分解a t p 生成a d p 及无机磷，测定无机磷的量可反应钠泵活力 高低的原理。将待测细胞弃上清后每孔加入2 0 0 “1 细胞裂解液，冰上裂解后收集 裂解液，用考马斯亮蓝法测定裂解液中的总蛋白含量，同时按照超微量a t p 酶测 试盒说明书进行神经元细胞中钠泵活性的测定，在6 6 0i l l i l 波长下的吸光度值代 表钠泵总活性，以钠泵总活性与总