（应用化学专业论文）混合细菌及紫外诱变对低品位黄铜矿浸出研究.pdf

摘要 混合细菌及紫外诱变对低品位黄铜矿浸出研究 作者简介：王建伟，男，1 9 8 3 年2 月生，师从成都理工大学汪模辉教授， 2 0 0 8 年7 月毕业于成都理工大学应用化学专业，获得工学硕士学位 摘要 随着生物冶会技术的不断发展，浸矿中起主要作用的各浸矿菌成为了研究的 重点。由于各菌株对亚铁离子、元素硫及其它会属离子的作用不同，混合菌株具 有优势互补作用，因而混合细菌浸矿成为当今研究的热点之一。氧化亚铁硫杆菌 ( t 。f ) 是浸矿的主导菌种，在一定条件下，中等嗜热菌( t a ) 能增强t f 菌的浸 矿作用。 本文从酸性温泉中选育出中等嗜热菌进行了初步的生理研究，确定培养基为 9 k + 胰蛋白胨。将t f 菌和t a 菌混合得混合菌t m ，对其混合条件进行研究， 用紫外线对细菌诱变、再辅以化学药剂的复合诱变，得出以下结论：t f 菌和t a 菌最佳混合比例为1 ：2 ；紫外诱变时间为1 2 0 s 、间距3 0 c m ，低温处理有利于诱 变正突变的形成；复合诱变亚硝酸钠处理时间l o m i n 效果最好。 在黄铜矿的细菌浸出实验中，通过正交实验优选了t f 菌和t m 菌的浸矿条 件，比较了单一菌和混合菌浸出效果的差异，以及紫外诱变和复合诱变前后浸出 效果的差异。结果表明，t f 菌浸矿条件为矿浆浓度5 ，接种量1 0 ，p h 值2 0 ， 温度3 0 ；t m 菌浸矿矿浆浓度1 0 ，接种量5 ，p h 值2 0 ，温度3 0 。t f 菌 诱变前后铜浸出率为1 4 6 5 和2 0 1 4 ，后者提高了大约3 8 ；t m 茵诱变前后铜 浸出率分别为1 8 2 5 和2 5 7 2 ，后者提高了约4 0 。复合诱变较单一紫外诱变 t f 菌和t m 菌对铜浸出率变化不大，但能有效的降低正突变修复率。 关键词：混合菌紫外诱变复合诱变j 下突变黄铜矿 成都理l ：人学硕十论文 s t u d yo nb i o l e a c h i n go f l o w g r a d ec h a l c o p y r i t e m u t a t e db ym i x e db a c t e r i aa n du t r a v i o l e t - r a y i n t r o d u c t i o no f t h ea u t h o r ：w r a n g j i a n w e i ，m a l e ，w a sb o mi nf e b m a r y ，19 8 3 w h o s et u t o rw a sp r o f e s s o rw a n g m o h u i h eg r a d u a t e df r o mc h e n g d uu n i v e r s i t yo f t e c l l l l o l o g yi na p p l i e dc h e m i s t qm 面o ra 1 1 dw a sg r a l l t e dt h em a s t e rd e g r e ei nj u n e ， 2 0 0 8 a b s t r a c t w i t ht h ed e v e l o p m e mo fb i 0 1 e a c h i n g ，p e o p l ep a ym o r ea _ t t e n t i o nt ot h eb a c t e r i a w h i c hp l a yi m p o r t a n tr o l ei nt h ec o u r s eo f b i o i e a c h i n g t h eb a c t e r i ad e r i v et h ee n e 唱y r e q u i r e df o ri t sg r o 、v t hf r o mt h eo x i d a t i o no ff e 2 + ，s o ，a n do t h e rm e t a li o n s t h em i x e d b a c t e r i ac a nr a i s et h eb i o i e a c h i n gr a t e ，t h u sm i x e db a c t e r i ab i 0 1 e a c h i n gh a sb e c o m eo n e o fh o tr e s e a r c hf i e l dt o d a y t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n s ( t f ) i so n eo ft h ei m p o 九a n t b a c t e r i ai nt h ec o u r s eo fb i 0 1 e a c h i n g ，i ns o m e s p e c i a lc o n d i t i o n sm o d e r a t e l y t h e 姗o p h i l i cb a c t e r i a ( t a ) c a nr e i n f o r c et h eb i o l e a c h i n ga b i l i t yo f t f i nt h i st h e s i s ，as t r a i no ft aw a si s o l a t e df - r o ma c i dh o ts p r i n g ，a l l dap r e l i m i n a d ， i n v e s t g a t i o n w a sm a d eo ni t ，t h em e d i u mw a sa sf o l l o w s ：9 k + t 巧p t o n e t h em i x e d b a c t e r i a ( t m ) w a sm a d eb yt fa n dt a t h em i x e dc o n d i t i o n 、v a ss t u d i e d ，a n dt h e b a c t e r i a 、e r em u t a t e db yu t r a v i o l e t - r a y ，t h e nt h em e t h o do fc o m p o u n dm u t a t i o nw i t h c h e m i c a l sw a su s e d w ec o m et ot h ec o n c l u s i o nt h a tt h em i x i n gr a t i oo ft h em os t r a i n s ( t fa 1 1 dt a ) j s1 ：2 ，t h eb e s tm u t a t i o nt i m ei s12 0 s ，a i l dt h eu vi r r a d i a t i o nd i s t a i l c ei s 3 0 c m t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tl o wt e m p e r a t u r et r e a t m e n tw a sb e n e 6 c i a lt oi n c r e a s e p o s i t i v em u t a t i o nr a t e t h eb e s tt i m eo fc o m p o u n dm u t a t i o nw i t l ln a n 0 2i s10 m i n t h ep r o c e s so fb i o l e a c h i n gc h a l c o p y r i t eh a sb e e ns t u d i e di n t h i sr e s e a r c hb y c o m p a r i n gt h ec h a l c o p y r i t el e a c h i n gp e r f b r m a n c eo fs i n g l es t r a i n sa n dm i x e db a c t e r i a t h ee f f e c to fp r e a n dp o s tu v m u t a g e n e s i sa n dc o m p o u n dm u t a t i o nh a v eb e e ns t u d i e d t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ep u l pd e n s i t yo f5 ，i n o c u l a t i o n 锄o u l l t10 ，p h 2 0 ，a n d3 0 a r et h eb e s tc o n d i t i o nf o rt fa n da l s ot h ep u l pd e n s i t yo fl0 ，i n o c u l a t i o n 锄o u n t 5 ，p h 2 0 ，a n d3 0 f o rt m t h el e a r c h i n gr a t ew i t hp r e a 1 1 dp o s tt fi s1 4 6 5 a n d 2 0 14 ，i n c r e a s i n gb y38 y e ：tt h el e a r c h i n gr a t ew i t hp r e - a n dp o s tt mi s18 2 5 a n d 2 5 7 2 ，i n c r e a s i n gb y4 0 c o m p a r i t i o nb e t w e e nt fa 1 1 dt mo n l ym u t a e db yu v a b s t r a c t m u t a g e n e s i sa n d ，c o m p o u n dm u t a t i o n ，i t 、) ，a sf o u n dt h a tl e a c h i n gr a t eh a dl i t t l ec h a n g e b u tc o m p o u n dm u t a t i o nc a nr e d u c et h er e p a i rr a t eo f p o s i t i v em u t a t i o no b v i o u s l y k e y w o r d s ：c h a l c o p y r i t e m i x e db a c t e r i a u v m u t a g e n e s i sc o m p o u n dm u t a t i o n p o s i t i v em u t a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得盛壑堡王太堂或其他教 育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 籼黼虢五连弗 肛j 月 7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解盛都堡王太堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权盛鳌堡王太堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：五 学位论文作者导师签名 芦少年r 月；j 日 第l 章绪论 第1 章绪论 2 0 世纪中期，随着工业化的进程，重有色会属工业规模越来越大。在相当长 的时间旱，人们只着眼于金属产量的增加，忽视了环保，在一些工业发展较快的 国家，环境污染事件频繁发生。我国重点控制的1 2 种危害严重的污染物中，重 金属占6 种。如电镀行业每年排放大量的含铜、镍、锌、铬、铁等多组分重金 属危险废弃物，由于重金属废弃物处理技术难度大，国内外尚无有效的深度回收 治理方法。发达国家仍以消纳性处置为主，即用水泥固结重会属污染物后填入海 里，由于未产生化学结合，固结力不牢，近年来已被证明存在二次污染隐患。不 锈钢酸沈废液是另一类难于处理的重金属污染源，这些重金属污染物大多只经过 稀释便直接排放下水，对生态环境和人体健康构成了严重威胁，同时造成有价金 属流失。 “绿色冶金技术是指采用无污染的清洁工艺，从生产源头预防污染。国 内外一些成功的例子表明，研究“绿色冶金”技术是实现重有色冶金可持续发展 的有效途径，是冶金学家和企业家的明智选择。目前发展迅猛的“绿色冶金技 术主要有以下两种： 1 植物采矿 科学研究证明，植物在千百万年漫长的进化演变过程中，已经练就了一身非 凡绝招，许多植物有累积某些金属元素的能力。如堇菜好锌、香薷含铜比较丰富、 烟草含铀特别多，还有紫云英含硒、苜蓿含钽、石松含锰格外丰富。有些植物能 累积稀有会属，如铬、镧、钇、铌、钍等，被称为“绿色稀有金属库”。它们对 稀有金属的聚集能力要比一般植物高出几十倍、成百倍，甚至上千倍。比如铬， 在一般植物中用光谱检测也很难发现，而凤眼兰却能在根上累积铬，其含量可达 到o 1 3 。 自然界可以聚集矿物的植物还有很多。海洋中的海带，吸收了海水中的碘， 只要我们把海带烧成灰，便可以从它的灰份中提炼出大量的碘来；有一种名叫紫 甘信的牧草，它具有吸收金属钽的特殊本领，将4 0 公顷的紫甘信烧成灰，就可 以提炼到2 0 0 克的钽；我们常吃的玉米，也能把土壤中的金子吸收到颗粒中贮藏， 把玉米种在含会的土壤罩就可富集会，从1 0 0 0 公斤的玉米晕可以得到l o 克的黄 会；向同葵吸收的钾、车前草吸收的锌、黄藤草吸收的锡。烟草中吸收的锂等， 其灰份中相应盒属的含量可达到工业品位。 2 细菌冶金 一提到细菌，人们往往会想到那些危害人类健康的细菌，如霍乱菌、结核菌 等，然而并不是所有的细菌都是坏东西，有不少细菌还是人类的好朋友。如酵母 成都理l ：人学硕十论文 菌能为我们酿出美味的葡萄酒，能发酵做出松软的大馒头。有的细菌能将石油变 为蛋白质，将空气中的氮变为氮肥，真有“点石为金，变废为宝”的神通呢! 由 于细菌具有这种特殊的功能，它已成为人类用来战胜疾病、征服自然的工具，人 们还利用细菌“吃 金属的本领，丌创了从矿石中提取金属的新技术。 1 9 0 5 年，德国的德罩斯顿的大量自来水管被阻塞了，拆修时发现管内沉积了 大量铁术。科学家在显微镜下从铁末中找到了一种微小的细菌，这种细菌能分解 铁化合物，并把分解出来的铁质“吃下去”。这些“贪吃”的细菌因“暴食而 死，铁术沉积在管内。该类菌分布广泛，在富含铁的水中尤为普遍。铁细菌能把 水中溶解的亚铁氧化成高铁形式，沉积于菌体内或菌体周围，并从中取得能量同 化c o ：进行自养生活，铁细菌常在水管内壁附着生长，形成结瘤，所以它们不仅 能造成机械堵塞，而且还能形成氧差电池腐蚀管道，并出现“红水”，恶化水质 【2 】 o 能“吃 铁的细菌的发现，引起了各国冶金学家的极大兴趣。它们设想在矿 山大量繁殖能“吃”金属的细菌，通过细菌直接来提炼各种金属，这样就比从矿 石中冶炼金属方便多了。于是一门新兴的技术微生物冶金便产生了。 1 1 微生物冶金研究意义 1 1 1 微生物冶金研究的历史 微生物湿法冶金( b i o h y d r o m e t a l l u 娼y ) 是指利用某些特殊微生物的代谢活动 或代谢产物从矿物或其它物料中浸取金属的过程，根据微生物所起的作用可分为 生物浸出、生物吸附和生物累积。“。其中生物浸出倍受关注。生物浸出是借助于 微生物的作用把有价金属从矿石溶浸出来，使其进入溶液的过程，它是综合了湿 法冶金，矿物加工，化学工程，环境工程和微生物学的多学科交叉领域h 1 。其研 究和应用领域包括铜、铀、钴、镍、锌等金属硫化矿的浸出、难处理金矿的预氧 化、海底锰结核、结壳浸出、从炉渣烟狄、尾矿、污泥等二次物料中回收金属和 浸出除杂如煤矿脱硫、高岭土除铁、铁矿除磷、橡胶脱硫等瞄一_ 1 。 微生物冶金技术的应用有着悠久历史，在2 0 0 0 年以前的古希腊和罗马时代， 已有用微生物从矿石中提取金属铜的记载m 。1 0 1 ，纪元前六、七世纪的山海经 中就有“石脆之山，其阴多铜，灌水出焉，北流注于禺，其中多流赤者”的记载； 在中国唐、宋年代就有了官办的湿法炼铜工厂，我国的北宋时期就有用酸水浸铜 ( 胆水浸铜) 的规模生产。西方学者也承认用金属铁从铜溶液中置换铜是古代中国 人的发明1 。1 6 7 0 年，西班牙人从奥罩廷托矿坑水中回收细菌浸出的铜标志着 细菌浸矿的开始。1 7 6 2 年西班牙人在r i ot i t o 矿利用矿坑水浸出含铜黄铁矿中 的铜，只是当时并没有意识到细菌在起作用n 邑。”。在当时对微生物在其中的作用 第1 章绪论 一无所知的情况下，不自觉的应用着他们。 人们对细菌浸出的真正认识以及微生物在矿业中的应用还是2 0 世纪2 0 年代 末的事。1 9 2 2 年r u d 0 1 f 等人首次报道了使用未鉴定的细菌浸出铁和锌的硫化矿 物一引。1 9 4 7 年，c 1 0 m e r 首先发现了一种可将f e 扣氧化成f e 3 + 的细菌，认为该茵 在会属硫化矿的氧化和某些矿山坑道水的酸化过程起着重要作用u 制。1 9 5 1 年 t e m p l e 力和h i n k l e ”州从煤矿的酸性矿坑水中首先分离出一种能氧化金属硫化物 的细菌，并命名为氧化亚铁硫杆菌( t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i a a n s ) 。1 9 5 4 年， l c b r y e r 与j v b e c k 在u t a hb i n g h a mv a n y o n 铜矿坑水中找到了氧化亚铁硫 杆菌与氧化亚硫硫杆菌。他们的实验室研究结果表明氧化亚铁硫杆菌能够浸出各 种硫化铜矿及辉铝矿。1 9 5 8 年，美国k e n n e c o t t 铜矿公司o t o h 矿首先将细菌浸 铜工艺应用于工业生产中，获得成功，取得了第一个有关细菌浸出技术的专利川， 从而推动了生物冶金技术的发展。1 9 6 6 年，加拿大用细菌浸铀获得成功，1 9 6 7 年s i l v e r m a n j 州提出了著名的金属硫化物细菌浸出的直接作用和间接作用模型。 此后，世界上许多国家开展了微生物在矿业工业中的应用研究，目前铜、锌、 金、铀等的生物浸出已经工业化。生物浸出产出的铜，铀和金分别占世界产值的 1 5 ，1 3 ，2 0 心3 。除此外，钴、稼、钼、镍、铅的生物浸出实验已经在实验室 广泛的进行，被硫化物封闭的金聚合体( 铂金，铼，铷，钯，锇，铱等) 的微生物 处理也已开展了试验研究瞳。 1 1 2 铜矿生物浸出研究的意义 铜大部分呈硫化物和氧化物状态存在与矿物中，少量为自然铜。自然界产出 的铜矿物有2 4 0 种之多，常见的硫化矿物有黄铜矿( c u f e s ：) 、辉铜矿( c u ：s ) 、铜 兰( c u s ) ，斑铜矿( c u ；f e s 。) 等；氧化矿物有孔雀石( c u c 0 3 c u ( 0 h ) 2 ) 、硅孔雀石 ( c u s i 0 ：，) ，蓝铜矿( 2 c u c 0 ：；c u ( o h ) ：) 、赤铜矿( c u ：0 ) 和胆矾( c u s o 。5 h ：o ) 等。在世 界已探明的铜资源中，据初步统计，其中斑岩铜约占6 0 以上，砂岩铜约占2 5 ， 含铜黄铁矿约占5 以上，其他各类铜矿约占1 0 心引。 从国家分布来看，世界铜矿资源主要集中在智利、美国、赞比亚、扎伊尔、 加拿大、秘鲁等国。在我国，目前己探明的铜金属基础储量约为6 4 2 8 万吨，但 是贫矿多，富矿少，而且品位偏低，其中铜矿石铜品位大于2 者约占我国铜矿 石的6 ，品位小于1 的约占7 0 左右。同时全国正在生产的铜矿山在开采过程 中，都产生了大量的表外矿、废矿和尾矿，因此低品位矿石、废石、难处理( 选 冶) 矿石都亟待开发心“圳。迄今世界各国通过运用生物湿法冶金从低品位原料中 回收铜会属已经达到了前所未有的规模，国外部分矿山公司从低品位及废铜矿石 细菌浸出的工业情况见表1 1 ： 成都理i ：人学硕+ 论文 表卜1 国外典型生物提铜矿山2 5 1 矿山所在地 规模( 阴极铜t a )运营年份 1 2 浸矿细菌的种类及其应用 1 2 1 浸矿细菌的种类 目前己分离的浸矿菌种有二十多种，但真正有潜在开发价值的菌种不多。高 效浸矿菌剂的研制也一直是生物冶金研究致力追寻的目标，经过多年试验研究和 工业应用实践，总结出工业用浸矿菌株，可分为以下3 类心6 1 ： ( 1 ) 嗜中温细菌( m e s o p h i l e ) 。也是主要的浸矿细菌，最佳生长温度3 0 4 5 。主要包括氧化亚铁硫杆菌( t h i o b a c i l l u sf e r r 0 0 x i d a n s ) 氧化硫硫杆菌 ( t h i o b a c i l l u st h i o o x i d a n s ) ，氧化亚铁微螺菌( l e p t o s p i r i l l u mf e r r o o x i d a n s ) 。 ( 2 ) 中等嗜热细菌( m o d e r a t et h e 肋o p h i l e ) 。最佳生长温度4 5 5 5 ，依赖 黄铁矿、黄铜矿生长，绝大多数需要酵母提取液或某种有机物为营养物。它们通 常难以用于工业浸矿实践，除非采取某种促进生长的措施。 4 第1 章绪论 ( 3 ) 高温嗜热菌( e x t r e m et h e 肌o p h i l e ) 。最佳生长温度6 0 8 5 ，可快速代 谢硫铁矿、黄铜矿、磁黄铁矿，基本自养。对p h 耐性与氧化亚铁硫杆菌类似。 这类细菌可潜在地用于顽固硫化物的快速、高温浸矿，但细菌壁较脆弱限制了其 发展。近年来从酸性温泉分离得到的嗜酸热硫化叶菌( s u l f o l o b u sa c i d o c a l d 撕u s ) ， 已逐渐成为研究的热点。 当前所采用的菌大都从自然界分离驯化，存在浸矿周期长、生长速度慢、氧 化能力弱、适应力差等问题。并且实际浸矿体系中往往含有表面活性剂，各种重 金属离子等，当其含量超过一定浓度，将抑制细菌生长，甚至造成菌体死亡；此 外还受外界环境因素影响，限制了细菌冶金工艺的进一步工业应用。因此，从自 然界中不断选育新的优良菌株、混合细菌、细菌诱变以及采用遗传学的手段，采 用定向育种、诱变育种、杂交育种、细胞融合及基因工程育种等现代生物技术改 良菌种成为生物冶金技术的一个重要领域瞳引。 1 2 2 混合细菌浸矿研究现状 微生物离不开一定的环境，构成浸矿体系的往往是一些微生物群落，而并非 单一微生物。虽然在研究早期已有用混合培养细菌浸出金属硫化矿的报道，随后 的大量试验结果也表明混合菌对余属的浸出效率明显高于单一菌。”3 。但直到新 的试验技术尤其是分子生物学技术在极端微生物生态规律研究中的应用，才有充 足的试验结果作为佐证。通过对天然酸性矿水和矿石以及工业生物浸矿体系中的 微生物群落进行研究发现，浸矿菌群落结构具有惊人的多样。坦3 3 1 ，这就为混合菌 浸矿的应用提供了理论支持，也促进了人们对混合浸矿菌剂的开发和应用研究。 d o n a ti 和c u r u t c h e t 比较了纯的氧化亚铁硫杆菌、氧化硫硫杆菌以及两者混 合浸出铜兰的效果，结果混合菌浸出效果比单一菌高3 0 。川。张在海。惦1 等分别用 银离子和三价砷驯化氧化亚铁硫杆菌混合菌株后，再培养到既含银又含砷的亚铁 液体培养基中，发现将二者混合培养比单独培养氧化亚铁的速度要快，并且在这 样的固体培养基上产生更多菌落。h a r r i s o n ，k e l l y 及w o o d 。眠3 刀等人研究了其 它酸性菌株的特性及各浸矿菌株混合使用效果，认为由于各菌株对铁离子、元素 硫及其它金属离子的不同作用，混合菌株具有优势互补作用。 实际浸矿环境中的微生物体系是微生物群落。这些微生物间存在竞争，吞噬， 共生，协同关系，同时，微生物与浸出环境之间同样存在物质和能量的交换。从 以上研究来看，人们虽然注意到了微生物在生物浸出过程中的协同作用，并且可 以得到明显优良的混合浸矿菌剂，但到目前为止，研究得比较透彻的仍然是单一 菌浸矿机理尤其是氧化亚铁硫杆菌的浸出机理。在混合菌浸矿机理研究方面尽管 做了一些探索性的工作，但还远不能明确地阐明混合菌剂浸矿的生物化学分子机 制朝】。 成都理i ：人学硕+ 论文 1 2 3 紫外诱变育种 紫外线是一种最常用的、简便有效的物理诱变剂，其作用波长主要集中在 2 5 5 n m 附近，这与一般细菌的d n a 吸收光谱相+ 致，所以有较强的杀菌作用。蝴1 。 紫外线对细菌的有害作用是由于细胞中很多物质吸收紫外线。核酸、嘌呤、 嘧啶对紫外线辐射吸收能力特别强。d n a 和r n a 的吸收峰在2 6 0 n m 、蛋白质的吸 收峰在2 8 0n m ，所以紫外线可引起诸如d n a 链的断裂、d n a 分子内和分子间的交 联、核酸与蛋白质的交联、胞嘧啶和尿嘧啶的水合作用以及胸腺嘧啶二聚体的形 成等多种变化。其主要作用是胸腺嘧啶二聚体的形成。这种胸腺嘧啶二聚体的存 在，可以带来d n a 分子构型的扭曲，从而影响它的证常复制、转录，严重时可导 致个体死亡，在一般情况下则可能使d n a 的复制产生差错从而引起诱变效应。当 剂量选择和细菌样品处理适当时，可能导致遗传基因发生变异，从而创造新基因 引起体内生化途径的改变，发生正突变，产生新型菌株h 。 1 3 细菌浸矿机理研究 自5 0 年代发现浸矿细菌以来，细菌一矿物的作用机理一直是人们力图解决的 课题，1 9 6 4 年，s i l v e r n l a n 和e h r l i e h 提出了细菌浸矿作用机理的传统假说：直 接作用、间接作用，之后经过多年的研究和观测，人们提出了基于化学、电化学 和生物化学基础上的联合作用。2 0 0 1 年，t 曲u t s c h n 列认为用“接触”浸出代替“直 接”浸出更能反应细菌和硫化矿表面之间的作用。这一假说得到了很多学者的认 同。c r u n d w e l ln 3 1 ，对其进行了改进和总结提出了：直接作用、间接作用、复合作 用。此外，对于铜矿物的浸出目前还有电化学作用理论和初级次级反应机理圳， 一般也认为其为复合作用理论。 1 3 1 直接作用 直接作用是指细菌与矿物表面接触，通过酶的作用，直接氧化矿物并从中获 得能量，同时矿物晶格溶解，将金属硫化物氧化为酸溶性的二价金属离子和硫化 物的原子团，使其矿物溶解。在有水和空气( 氧气) 存在的情况下，以细菌浸出黄 铜矿为例，发生如下反应： c u f e s 2 + 4 0 2 堕吗c u s 0 4 + f e s 0 4 2f e s 2 + 7 0 2j 血丝呜 f e s 0 4 + 2 h 2 s 0 4 c u s + 2 0 2 纽玛c u s 0 4 6 ( 1 ) ( 2 ) ( 3 ) 第l 章绪论 图卜2 直接浸出机理示意图m 1 在这类反应中，细菌既不是反应物，也不是产物，而只是起着催化作用。而 这种催化作用可以理解为是一种“生物电池反应”。研究指出，细菌与矿物的接 触和吸附是直接作用的前提，细菌通过物理吸附或者化学吸附方式，多吸附在晶 体表面的离子镶句点、位错点上，使矿物表面形成腐蚀。细菌吸附在矿物表面， 氧化硫化物及由硫化物氧化产生的金属离子如亚铁离子、元素硫，为细菌的代谢、 生长提供能量，而化学氧化释放的电子则通过细胞壁到达细胞质膜，在那罩作为 电子的最终点与细菌呼吸的氧结合。 1 3 2 间接作用 间接作用是指矿石在细菌作用过程中产生的硫酸高铁和硫酸作用下发生化学 溶解作用。反应中产生的f e 2 + 在细菌作用下又被氧化成f e ”，形成新的氧化剂， 使间接作用不断进行下去。这类作用的特点是有f e 3 + 和f e 2 十在过程中起了桥梁作 用。以黄铜矿为例，发生如下反应： 4 f e s 0 4 + 0 2 + 2 h 2 s 0 4 鱼垒竺丝呜 2f e 2 ( s 0 4 ) 3 + 2h 2 0 2 s + 3 0 2 + 2h 2 0 丝丝b2 h 2 s 0 4 c u f e s 2 + 2f e 2 ( s 0 4 ) 3 垒旦g 熏型垒c u s 0 4 + 5 f e s 0 4 + 2 s ( 4 ) ( 5 ) ( 6 ) 在浸矿反应过程中f e 3 + 可以通过反应( 6 ) 消耗掉，通过反应( 4 ) ( 5 ) 生成f e 2 + ， f e 2 + 作为细菌的能源基质，促进细菌的生长和繁殖，如此循环进行，使黄铜中的 铜和铁溶解。反应机理示意图见图1 3 ： 7 成都理i ：人学硕十论文 图卜3 间接作用模型示意图柏1 在间接作用过程中，由于浸出体系的不同，存在着以下两个反应过程： ( 1 )在矿粒表面生成元素硫的产物层； ( 2 )在一定的p h 条件下，在矿粒表面生成铁的氢氧化物或铁矾的固体产物层。 则在此时又派生出两种间接反映模型：如图卜4 、图卜5 n 州所示 图卜4 生成硫模间接反应模型 妖钒层 图卜5 生成铁矾间接反应模型 1 3 3 复合作用 复合作用机制是指在硫化物细菌浸出中，既有细菌的直接作用，又有通过f e 3 + 氧化的间接作用。有些情况下以直接作用为主，有时则以间接作用为主，两种作 用都不可排除，这是金属硫化矿物细菌浸出所遵循的一般规律。诸多资料表明h 7 们1 ，黄铜矿的细菌浸出作用即为直接作用与间接作用的联合效果。方程式( 7 ) 一( 1 1 ) 描述了黄铜矿细菌浸出的复合作用： c u f e s 2 + 4 0 2 垒旦旦皇塑旦c u s 0 4 + f e s 0 4 ( 7 ) 第1 章绪论 4 f e s 0 4 + 0 2 + 2 h 2 s 0 4 丝丝! b2f e 2 ( s 0 4 ) 3 + 2h 2 0( 8 ) c u f e s 2 + 2f e 2 ( s 0 4 ) 3 鱼堡竺丝呜c u s 0 4 + 5 f e s 0 4 +2 s ( 9 ) 2 s + 3 0 2 + 2h 2 0 丝丝屿2 h 2 s 0 4( 1 0 ) 总反应式： 2c u f e s 2 + 8 5 0 2 查旦鱼丝：堑一专2 c u s 0 4 + f e 2 ( s 0 4 ) 3 +h 2 0( 1 1 ) 1 3 3 1 电化学作用理论 由于硫化矿是半导体，细菌和各种氧化剂吸附于矿物表面，在矿物表面形成 微电极对硫化矿的腐蚀具有浸出作用。混合硫化矿或不同硫化矿共生矿浸出时， 由于各种硫化矿的静电位不同形成原电池对硫化矿浸出有强化作用。 表卜2 生物浸出介质中某些硫化矿的电化学顺序” 矿物名称电化学顺序 黄铁矿 惰性 黄铜矿 镍黄铁矿 方铅矿 磁黄铁矿 闪锌矿 活泼 1 3 3 2 初级次级反应理论 除了上述所说的细菌浸出的直接、间接和复合作用机理，研究者k e l l y ( 1 9 7 9 ) 又提出了初级次级反应机理引。该机理认为，细菌浸出是分阶段进行的，初级过 程主要包括各种气体在水溶液中的溶解及其水相迁移、细菌生长、细菌在矿物表 面的附着( 吸附) 作用、无机溶质的液相迁移及与细菌的相互作用等等：次级过程 主要为初级过程的产物( f e 3 + 和h ：s 0 ) 与浸出体系的反应，元素硫的次级氧化等。 例如：砷黄铁矿( f e a s s ) 和黄铁矿( f e s ：) 的细菌氧化是分阶段进行的，首先是砷黄 铁矿和黄铁矿被氧化成硫酸亚铁和亚砷酸，此反应发生于细菌细胞壁与矿物接触 界面( 初级反应) ，接着是初级反应产生的f e 2 + 和( a so ：，) 3 。被氧化( 次级反应) ，此反 9 成都理。i ：人学硕十论文 应发生于溶液中，但部分f e 2 + 可以再回到附着细菌的细菌周质区被氧化，因此矿 物的分解在初级反应时就己发生，次级反应则只决定分解产物的去向以及进一步 氧化分解产物。 1 4 课题的提出 1 4 1 课题来源 本课题来源为导师所承担的科研项目： 高等学校博士学科点专项科研基金项目( 2 0 0 5 0 6 1 6 0 0 9 ) 1 4 2 论文研究的目的和意义 我国铜金属贮量虽然有6 0 0 0 多万吨，但贫矿多、富矿少，矿石品位偏低，因 而总的来说，我国的铜资源并不丰富。此外全国正在生产的铜矿山在采、选过程 中都产生了大量的表外矿、废石和层矿，这些难选冶和低品位铜资源用常规的方 法均不能经济地回收，如前所述，生物浸出技术由于其污染小、投资少、见效快、 工艺简单等优点，是处理低品位、复杂矿甚至高品位矿而取代传统冶炼工艺的新 技术。 微生物浸出技术在我国铜矿的开发利用方面具有很大的潜力和广泛的应用前 景。但是，微生物浸出也有其不可回避的缺点，主要是：浸出速度慢、浸出率低； 浸矿微生物适应性差以及微生物的再生能力差等，致使在工业应用上受到很大的 限制。因此，深入系统地丌展微生物浸出体系过程中多因素相互作用的研究，开 发高效、适应性强的有益共生混合菌剂，对推动我国原生矿的资源丌发具有重要 意义。 1 4 3 论文研究目标和内容 基于以上原因，本文主要内容为研究确定氧化亚铁硫杆菌和采自彭州温泉菌 的最佳混合比例及p h 条件，培养出优良的浸出低品位黄铜矿混合菌株。利用紫 外线对实验菌诱变，确定诱变照射最佳条件，获到具有更高浸出率，更强适应能 力的黄铜矿微生物浸出混合菌株，并对其进一步的复合诱变进行初探。 1 0 第2 章实验材料和研究方法 2 1 实验材料 2 1 1 实验矿石 第2 章实验材料和研究方法 试验用矿石采自西昌会理拉拉铜矿，碎至2 0 0 目。经x 射线衍射分析和元素 分析结果见表2 一l 与图2 1 。 表2 1 矿样多元素分析结果 元素名称c u f e s i o ： s a l ：0 ：； c a 0 m g o t i 0 ： 含量( ) 0 3 21 7 1 24 1 4 4o 8 59 5 94 3 2 1 3 lo 9 2 2 - t h e t a ( 。 图2 1 黄铜矿x _ 射线衍射图 成都理i ：人学硕十论文 2 1 2 菌种 本实验所用菌： 氧化亚铁硫杆菌( t f ) ，我校材料与化学化工学院实验室储存。 中等嗜热菌( t a ) ，采自四川彭州某酸性温泉( 5 0 1 ，p h = 1 8 ) 。 氧化亚铁硫杆菌和温泉菌所得混合菌( t m ) 。 2 1 3 培养基 9 k 液体培养基( 培养t f 菌和混合t m 菌) 表2 29 k 液体培养基成分 9 k + 0 0 2 5 的胰蛋白胨培养基脚3 ( 培养t a 菌) 9 k ( 1 0 0 0 m 1 ) + s ( 1 0 9 ) ( 确定混合比例条件使用) 2 1 4 实验药剂及实验仪器 本实验研究中所需要的主要仪器及设备见表2 3 ，所用的试剂药品均由国内 化学药剂厂生产，其类别和产品等级见表2 4 。 1 2 第2 章实验材料和研究方法 表2 3 主要实验仪器 表2 4 主要化学试剂 成都理l ：人学硕 ：论文 2 2 研究方法 2 2 1 细菌培养及驯化 2 2 1 1 摇瓶培养 取培养基1 0 0 m 1 置于2 5 0 m 1 的锥形瓶中，用稀硫酸调节p h 为最佳值。取1 0 m l 混合菌样置于培养基中，放在恒温振荡器中，设定温度为：3 0 ，转速为1 4 5 r m i n 。 按同样的方法逐次减少接种量进行转移培养。经过多次的转移驯化培养，试验用 浸矿菌种得以充分的生长，使其活性增大并趋于稳定。将部分菌液储存在4 冰 箱中，定期转移培养，作为浸出试验用菌株，在细菌生长对数期接种，进行浸出 试验。 2 2 1 2 固体培养 固体培养基分为三部分制作： ：基本盐液2 5 0 m l + 琼脂1 5 9 ，p h 7 0 ； ：基本盐液7 5 0m 1 ； ：无菌的硫酸亚铁晶体。 硫酸亚铁为经细菌滤膜真空抽滤除菌，再经冷冻干燥保存的晶体。对， 进行高温灭菌。待冷却至8 0 时，混和后再倒入。每皿倒入2 0 m 1 培养基。 将培养好的菌种用蒸馏水稀释1 0 0 倍后，按不同的实验条件分别进行接种，各接 种5 皿，每皿接种量0 1 m 1 ( 约2 3x1 0 。个) ，用弯曲的玻璃棒涂布均匀，置于 3 0 生化培养箱中培养。观察菌落形成并计算肉眼可见的菌落的平均数。图2 2 就是固体培养的t f 菌。 图2 2 固体培养t f 菌落 第2 章实验材料和研究方法 2 2 1 3 细菌混合培养 将培养好的氧化亚铁硫杆菌t f 和温泉菌t a 设计不同的混合比例： t f ：t a = l ：l 、l ：2 、2 ：l 三个不同比例，接种于培养基中，培养温度最 佳为3 0 ，测定细菌对f e 2 + 氧化及培养过程中p h 的变化，以确定最优混合比例 及p h 值。 2 2 1 4 紫外线诱变 取1 5 w 紫外灯，波长2 6 5 n m ，预热2 0 m i n 。在一暗箱中，将盛有菌液( t f 、 t a 、t m ) l o m l 、直径9 c m 的培养皿距紫外灯3 0 c m 钏，按不同时i 日j 进行辐射处 理。诱变后菌液避光于4 冰箱中处理1 2 小时，后置于培养箱中避光培养，得 富集的正突变菌株。 2 2 1 5 复合诱变初探 选择实验室保存的成熟菌种t f 菌作为复合诱变实验菌种，选择紫外+ 化学试 剂的方法进行实验。 将对数期术期的菌种，紫外照射后，倒入4m 1p h7 0 的0 1m 0 1 ln a n o ： 溶液，处理5 ，1 0 ，1 5 ，2 0 ，2 5 ，3 0m i n 。在上述处理时间内分别取2m l ，用p h 8 6 的0 0 7m o l l 的k ：h p 0 。7 m 1 中止反应。分别取2 m 1 培养于l o o m lp h2 o 的 9 k 培养基中，一定时间内测铁氧化率的差别。 2 2 2 摇瓶浸出 摇瓶浸出试验在恒温振荡器上进行。取培养基9 5 m l 置于2 5 0 m 1 的锥形瓶中， 称取一定量矿样放入锥形瓶中，调节矿浆p h 到实验设计的范围内，然后接种一 定量的活性菌液。控制摇床温度为3 0 ，转速设置为1 4 0 r m i n 。定期测定矿浆 的p h ，调节p h 在试验要求的酸度范围内，同时取矿浆上清液测定c u 扑、f e 外及总 铁的浓度。所有操作为无菌操作，试验用器皿都经灭菌，锥形瓶瓶口盖有棉纱， 取样时浸出液的损失用培养基补充。 2 2 3 细菌生理特性研究 最适宜温度的测定：菌株以相同的菌量接种到培养基中，分别置于不同的温 度条件下，培养l o o 小时，测定不同温度下细菌的亚铁氧化活性。 c u 2 + 浓度对细菌生长的影响：菌株以相同的菌量接种到用不同浓度c u 外的培养 基中，培养1 0 0 小时，测定细菌的亚铁氧化活性。 成都理i ：人学硕十论文 2 3 测试分析方法 2 3 1 原子吸收光谱分析 利用原子吸收分光光度计测量原子蒸汽的吸光度，可以定性地得出待测样中 的元素种类和定量地测出该元素的浓度。本试验用原子吸收法测定浸出液c u 2 + 的 浓度。 2 3 2 亚铁滴定测定 亚铁离子浓度用重铬酸钾滴定法测定。 重铬酸钾滴定法：取l m l 菌液，加入1 0 m 1 硫磷混酸( 硫磷混酸配比为：7 5 m 1 h ：s 0 ”7 5 m 1h ：，p o ，3 5 0 m 1 蒸馏水。加入2 的二苯胺磺酸钠卜2 滴，用l 6 0 0 m o l 几 的重铬酸钾溶液进行滴定。滴定终点为溶液由无色变为亮紫色，根据离子反应方 程式计算f e 扑的浓度。 反应离子方程式为： 6 h + + 6 f e 2 + + c r 2 0 7 2 - 专6 f e 3 + + c r 2 0 4 2 。+ 3 h 2 0 2 3 3x 射线衍射分析 用x 一射线衍射分析矿物及其浸渣的组成，缩分后取样上机分析。 2 3 4p h 测定 p h s 一2 5 指针式酸度计测定溶液p h 值。 2 3 5 细菌计数 用血小球计数法和平板计数法计算细菌总数量和活细菌数量。血小球计数板 计数时，若细菌浓度高于1 0 8 个m l ，则将其稀释后再计数，若细菌浓度低于1 0 6 个m l 时，则离心收集后再计数。 1 6 第3 章细菌基本生理特性及诱变生长的研究 第3 章细菌基本生理特性及诱变生长的研究 细菌的氧化活性和适应性直接影响浸出的速度和浸出率。不同的菌种有不同 的氧化能力和适应性，不同条件下、诱变前后培养的细菌具有不同的表面结构与 性能，在浸矿时表现出不同的浸出能力，从而具有不同的浸矿活性。 明确采自温泉的嗜热菌生理性质，及每种细菌的培养基温度、主要的营养物 质及其浓度、酸度、溶液中的溶解氧的浓度、会属离子浓度、混合细菌比例、诱 变条件等对细菌的生长和氧化活性有强烈的影响。因此，在浸矿过程中考察环境 温度，金属离子浓度，诱变时间对细菌活性的影响，可以为浸矿过程中细菌的选 择和浸矿条件控制提供依据。 3 1 温泉菌t 。a 的理化性质 该温泉菌生长温度为5 0 ，p h 为1 8 。经过实验证明，其不能在9 k 固体培 养基上生长，在9 k 液体培养基中能生长，只是生长不良，但如果在9 k 液体培养 基中添加o 0 2 5 的胰蛋白胨则在2