（生理学专业论文）马鹿（cervus+elaphus）鹿茸角化细胞生长因子（kgf）：基因克隆、序列分析及转录模式研究.pdf

i 东北林业大学硕士学位论文 摘要 作为成纤维细胞生长因子( f g f s ) 家族的第七个成员，角化细胞生长因子( k g f ) 是一种特异性作用于上皮细胞的有丝分裂原。基于k g f 促细胞增殖、分化和创伤修复 的重要作用，为了能够深入研究鹿源k g f 在鹿茸角的快速生长和再生过程中可能具有 的重要作用。本研究以新鲜鹿茸组织为材料，利用r t - p c r 方法首次从马鹿鹿茸组织中 分离和克隆出k g f 基因，并对其基因c d s 区进行生物信息学分析。在此基础上，利用 半定量r t - p c r 方法研究鹿茸中包括k g f 在内的多种生长因子转录模式的空间变化。 结果显示： ( 1 ) 马鹿k g f 基因c d s 区为5 8 5 b p 长d n a 片段，编码一条含1 9 4 个氨基酸的多肽。 ( 2 ) 对人、马鹿、小鼠、猪、羊、和狗k g f 基因的生物信息学分析显示：在上述物 种中，k g f 基因转换与颠换线性回归曲线：y = 一0 4 4 9 2 5 + o 3 7 2 7 8 x ( 序= 0 8 6 1 1 5 ) 。 基于k g f 基因d n a 序列和氨基酸序列分别重建分子系统进化树表明相对其他三个物 种，鹿、羊、猪具有更近的进化关系( 自举值 8 6 ) ，这与k g f 基因功能域二级结构的 预测结果相符。不同物种k g f 等电点和带电荷( p h 7 0 ) 不同，6 个物种中，人具有 最低的等电点( 9 1 7 3 ) 和电荷( 1 0 7 0 6 ) ，最高的为猪，分别为9 4 3 6 和1 2 7 3 3 检索 结果：基于已有2 6 9 6 种基序的p r o s i t e 数据库对k g f 基因基序分析显示，k g f 具其中4 6 种，除f g f 家族特征性基序，信号肽基序，与物质能量代谢相关的基序外，还有转录调 控相关基序的存在，如亮氨酸“拉链”特征结构( l e u c i n ez i p p e rp a t t e m ) 、“锌指”( z i n c f m g e r ) 结构、锌指c 2 h 2 型功能域、“锌指”r j n g 一型特征结构和“锌指”p h d 一型特征结 构，这提示k g f 很可能参与到基因调控过程中，而有关这方面的研究还未见报道。不 同物种k g f 基因具基序种类存在不同，比较l g f 和d k g f 发现，h k g f 比d k g f 在 1 0 5 1 0 7 a a 处多一个5 核酸酶识别位点i 特征结构，但在1 5 9 1 6 2 a a 处少一个c a s e i n 激酶i i 磷酸化位点，并且两者在1 11 1 1 9 a a 处的酪氨酸激酶识别位点结构有差异。 ( 3 ) 利用半定量r t - p c r 方法研究k g f 与i g f 1 、i g f 2 、b m p 2 、b m p 4 等多种生 长因子在同一鹿茸上，包括角柄处( a ) 、近端生长点( b ) 、中间生长点( c ) 、远端生 长点( d ) 、中间部位( e i ) 等9 个不同位点转录表达水平。结果显示：b 脚s 在所 有被检测位点无转录表达；i g f 一1 、i g f 2 在9 位点上的转录表达量具有相似的量变 走势，而k g f 在d 、g 两个位点与上述二者不同；i g f 一1 在近端生长点( b ) 位点无 转录表达；i g f 2 的总体转录表达水平高于i g f i 。 上述结果和分析数据为研究k g f 在鹿茸再生过程中的功能提供重要基础数据。 关键词：马鹿；鹿茸组织；角化细胞生长因子；基序；生化性质；转录模式分析 东北林业大学硕士学位论文 a b s t r a c t a sas p e c i f i cm i t o g e nf o re p i t h e l i a lc e l l s ，k e r a t i n o c y t eg r o w t hf a c t o r ( k g fo rf g f - 7 ) ，t h es e v e n t h m e m b e ro ff i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r s ( f g f s ) f a m i l y , c o u l di n d u c ep r o l i f e r a t i o n ，d i f f e r e n t i a t i o na n d m o t i l i t y , a n de n h a n c ee p i t h e l i a lw o u n dr e p a i r t oc l a r i f yt h ep o s s i b l er o l e sk g fm a yp l a yi nd e e ra n t l e r d e v e l o p m e n ta n dr e g e n e r a t i o n ，f o rt h ef i r s tt i m ei nt h i st h e s i s ，k g fg e n e ( a c c e s s i o nn o a y 9 2 3 8 5 8 ) w a s c l o n e df r o m9 0 一d a yd e e ra n t l e ro fr e dd e e r ( c e r v u se l a p h u s ) b yt w os t e pr t - p c rm e t h o d b o t hk g fd n a a n da m i n oa c i d ss e q u e n c e so fh u m a n ，r e dd e e lm o u s e ，s h e e p ，d o ga n dp i g ，w e r eu s e df o rf o l l o w i n g b i o i n f o r m a t i ca n a l y s i sa n ds e m i - q u a n t i t a t i v er t - p c rm e t h o d w a sf u r t h e ru s e dt o e x p l o r es p a c i a l t r a n s c r i p t i o n a ld y n a m i c so fs u c hg r o w t hf a c t o r sa sk g f , i g f i ，i g f 一2 ，b m p 一2 ，b m p 一4 r e s u l t ss h o w e d ： ( 1 ) k g fg e n eo fr e dd e e rc o n t a i n s5 8 5 b pc d sr e g i o ni nl e n g t h ，w h i c hc o d e sf o rap u t a t i v e19 4 a a p o l y p e p t i d e ( 2 ) b i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i ss h o w e d ：t h el i n e a rf i t c u r v eo fk g fg e n et r a n s i t i o na n dt r a n s v e r s i o n a m o n gt h es i xs p e c i e s ：y = 一0 4 4 9 2 5 + 0 3 7 2 7 8 x ( = o 8 6 115 ) ；t h em et r e e st h a tw e r er e c o n s t r u c t e d b a s e do nk g fg e n ea n dp o l y p e p t i d es e q u e n c e ，i n d u c e dt h a tc o m p a r e dw i t ho t h e r t h r e es p e c i e s ，t h e h e r e d i t a r yd i s t a n c eo fr e dd e e r ，s h e e pa n dp i gs h o u l db ec l o s e ( b o o t s t r a p 8 6 ) ，t h i sr e s u l tw a sc o n s i s t e n t w i t ht h ef u n c t i o n a ld o m a i n sf o r e c a s tr e s u l to fk g fg e n es e c o n d a r ys t r u c t u r e ；f o ra n yt w os p e c i e s ，n e i t h e r i s o l e c t r i cp o i n to rc h a r g ea tp h7 0o fk g fw a se q u a l ，t h e r e i n t o ，i s o l e c t r i cp o i n t ( 9 17 3 ) a n dc h a r g ea tp h 7 0 0 0 7 0 6 ) o fh u m a nw a sl o w e s t ，a n dt h ep i gw a sh i g h e s t ，9 4 3 6a n d1 2 7 3 3s e p a r a t e l y ；g e n es e a r c h i n g r e s u l t s ：b a s e do n2 6 9 6m o t i f si nt h ep r o s i t ed a t ab a n k ，k g fm o t i f sw e r ea n a l y s e d k g fi n c l u d e d4 6m o t i f s ， t h e r e i n t o ，f g ff a m i l ys i g n a t u r e s ，s i g n a lp e p t i d er e l a t e ds i g n a t u r e s ，a n dm e t a b o l i s mr e l a t e ds i g n a t u r e sw e r e v e r yi m p o r t a n t i na d d i t i o n ，t r a n s c r i p tr e g u l a t i o nr e l a t e ds i g n a t u r e sw e r ea l s oi n v o l v e d ，s u c ha sl e u c i n e z i p p e rp a r e m ，z i n cf i n g e rr i n g - t y p es i g n a t u r e ，z i n cf i n g e rc 2 h 2t y p ed o m a i ns i g n a t u r e ，z i n cf m g e r p h d t y p es i g n a t u r e i ti n d u c e dt h a tk g fm a yp a r t i c i p a t ei ng e n er e g u l a t i o np r o c e s s ，h o w e v e r ，t od a t e t h e r eh a v en o tb e e na n ye v i d e n c e st os u p p o r tt h i sv i e w p o i n t ；t h et y p e so fk g fg e n em o t i f s v a r i e di n d i f f e r e n ts p e c i e s c o m p a r a t i o no fh k g fa n dd k g fs h o w e dt h a tt h e r ew a sa5 - n u c l e o t i d a s es i g n a t u r e1a t 10 5 - 10 7 a as i t eo fh k g f , n o tac a s e i nk i n a s ei ip h o s p h o r y l a t i o ns i t ea t15 9 16 2 a as i t eo fh k g f , h o w e v e r d k g fw a sc o n t r o v e r s a r y , m o r e o v e r , f o rb o t ho f t h e mt y r o s i n ek i n a s ep h o s p h o r y l a t i o ns i t eh a db e e nv a r i e d ( 3 ) t h es e m i - q u a n t i t yr t - p c rw a su s e dt o s t u d ym r n at r a n s c r i p t i o n a lm o d e lo fk g f , i g f 一1 i g f - 2 ，b m p 一2 ，b m p 4o np e s t i l e ( a ) ，p r o x i m a lg r o w t ht i p ( b ) ，i n t e r m e d i a n tg r o w t ht i p ( c ) ，d i s t a lg r o w t h t i p ( d ) ，a n dm i d d l er e g i o n s ( e - i ) o ft h es a m ea n t l e rt i s s u e t h er e s u l t ss h o w e d ：b m p sh a dn ot r a n s c r i p to n e a c hs i t e t h ev a r i a t i o no fi g f 一1a n di g f 一2t r a n s c r i p t sl e v e lc o u l dt e n dt ob ec o n s i s t e n to ns i t ea i ， h o w e v e r , k g fa ts i t eda n ds i t egw a sd i f f e r e n tf r o mi g f - l a n di g f 一2 t h e r ew a sn oi g f - 1t r a n s c r i p ta t p r o x i m a lg r o w t hs i t e ( b ) t h et o t a lt r a n s c r i p t sl e v e lo fi g f - 2w a sh i g h e rt h a ni g f 一1 a l lr e s u l t sa n dd a t aa b o v ec o u l df u r t h e rp r o v i d ei m p o r t a n tb a s e m e n tf o rs t u d y i n gt h er o l eo fk g fi n a n t l e rr e g e n e r a t i o n k e y w o r d s ：r e dd e e r ；a n t l e rt i s s u e ；k g f ；m o t i f s ；b i o c h e m i c a lc h a r a c t e r s ；t r a n s c r i p t i o n a lp a t t e ma n a l y s i s i i 东北林业大学硕士学位论文 研究进展 角化细胞生长因子( k g f ) 角化细胞生长因子( k e r a t i n o c ”eg r o 州hf a c t o r ，k g f 或f g f 7 ) 属成纤维细胞生 长因子( f i b r o b l a s tg r o 叭hf a c t o r ，f g f ) 家族。截至2 0 0 6 年该家族已知有2 5 个成员。 1 9 8 9 年，k g f 首次从m 4 2 6 型人类胚胎的肺脏成纤维细胞中被提纯并鉴定出，其分子 量约2 6 2 8 k d 。许多类型的细胞，例如，间充质细胞，被激活的1 ，6 t 细胞和对c d 8 敏 感的t 淋巴细胞都能够产生k g f ( b o i s m e n u & h a v r a n1 9 9 4 ；w e i 甜口，2 0 0 5 ) 。在行使 促生长发育功能时，k g f 与成纤维细胞生长因子家族的其他成员共享靶细胞膜表面f g f 受体( f g f r ) 的几种亚型，并需要肝素和硫酸乙酰肝素蛋白多糖来发挥生物学效应 ( j o l n s o n “口，1 9 9 3 ；o m i t z & i t o h 2 0 0 1 ) ；但k g f 仅与其中一种亚型f g f i 匕i i i b 特异 性结合来调控细胞的各种生理功能( o m 池酊口，1 9 9 6 ；i g a u r a s h i 酎口，1 9 9 8 ；s h e r 酊口， 2 0 0 3 ；s t e i l 试ge f 口z 2 0 0 3 ) 。 不同于f g f 家族中的其他生长因子可作用于成纤维细胞和内皮细胞，目前研究发 现k g f 仅作用于上皮细胞，能够调节多种不同组织中上皮细胞的增殖和分化。g a l i a c y 等( 2 0 0 3 ) 证实k g f 通过促细胞转移作用等几种机制促肺脏上皮的修复并保护其免受 各种伤害。k g f 还具有保护胸腺上皮以及化疗或辐射治疗后修复胸腺损伤的潜能 ( a l p d o g 柚“以2 0 0 5 ) ，且被发现能调节角膜上皮和角膜基质的伤口愈合( c a 玎i n g t o n & b o u l t o n2 0 0 5 ) 。由于k g f 是通过促进细胞增殖来阻止细胞编程性死亡的，目前已有人 开始研究利用k g f 治疗化疗所导致的口腔溃疡，而且实验表明k g f 能有效地治疗多种 口腔溃疡( f i l l c h r u b i n2 0 0 4 ) 。 1 1k g f 的两种作用途径：旁分泌和自分泌 众所周知，k g f 由间充质细胞等产生( 如成纤维细胞) ，与仅由上皮细胞表达的酪 氨酸激酶受体k g f r 相结合调控上皮细胞的生长发育( w e m e r1 9 9 8 ；b e e r 酊口，2 0 0 0 ) ， 并通过调控皮肤中角化细胞增殖和分化的动态平衡来维持正常的表皮组织结构( a n g e l & s z a b o w s k i2 0 0 2 ) 。大量研究进一步表明k g f 主要通过旁分泌途径来促进角化细胞的 转移和增殖，并能保护细胞抵御y 一辐射和氧自由基( r o s ) ( g i l l i s 酎口f 1 9 9 9 ；m i c h e l s o n p f 盘，1 9 9 9 ；a n d r e a d i sp f 日，2 0 0 0 ；s 1 0 n i n ap f 口，2 0 0 1 ：k a r v i n e n 口f 以z 2 0 0 3 ) ， 同日寸它也 通过旁分泌途径来刺激创口处的上皮再生。1 9 9 8 年，w e m e r 利用原位杂交技术和免疫组 东北林业大学硕士学位论文 织化学染色技术来研究小鼠伤口处创伤组织的k g f 及其受体的表达分布，证实了k g f m r n a 存在于伤口真皮层的成纤维细胞中，而k g f 受体的转录及其蛋白质产物则存在于 伤口边缘表皮层的角化细胞中( w e m e r 鲋以1 9 9 2 ；w r e m e r1 9 9 8 ) 。h o v e y 等( 2 0 0 1 ) 深 入研究了k g f 在反刍动物上皮一基质细胞相互作用介导乳腺发生过程中的作用，这也为 k g f 的旁分泌途径提供了新的证据。近期，d a b e l s t e e n 等( d a b e l s t e e n 甜口z 2 0 0 5 ) 通过 一系列的实验来研究烟草( s m o k e l e s sr t o b a c c o ，s t ) 对口腔的成纤维细胞表达h g f 、k g f 和g m c s f ，以及对角化细胞和成纤维细胞增殖的影响，该项研究启示我们在s t 病灶处、， h g f 和k g f 很可能作为促上皮增生中的一个旁分泌生长因子发挥着重要作用。 值得注意的是，k g f 本身表达也受其下游作用分子靶标的反馈调控。例如，在创伤 形成后，一些表达早期炎症因子( 包括i l 1 ) 的分叶核淋巴细胞和巨噬细胞能够渗透至 伤口处。在皮肤伤口修复过程中，对这些细胞因子的时空表达状况的分析表明：受伤后 这些细胞因子的时程表达与k g f 的时程表达相关，并且在早期伤口中分叶核淋巴细胞、 巨噬细胞以及角化细胞是与成纤维细胞相邻近的，因此证实早期炎症因子( 包括i l 1 ) 可促进成纤维细胞中k g f 的表达量( w e m e r 甜以1 9 9 2 ：h u b n e r 酣口正1 9 9 6 ；w 色m e r l 9 9 8 ： g r o v e s & s c h m i d t l u c k e ，2 0 0 0 ：m a n l l 鲥口正2 0 0 1 ；w e m e r & s m 0 1 a2 0 0 1 ) 。最近一项研 究发现，角化细胞通过释放i l 1 卜一个促进成纤维纽胞增殖和细胞外基质生成的早 期炎症因子，来调节成纤维细胞中k g f 的表达。但是存在于k g f 与i l 1 b 旁分泌调控过 程中的固体底物( s 0 1 i ds u b s 仃a t e ) 的功能还不清楚( w i t t e & k a o2 0 0 5 ) 。同时，利用离 体皮肤模型也发现，在间充质一上皮相互作用过程中转录因子调节成纤维细胞中i l 1 介 导的k g f 和g m c s f 的表达。这些结果很清楚地证实k g f 在受伤皮肤再生过程中为上皮 和真皮细胞间的相互作用提供重要信号，但是在这些信号转导过程中k g f 与其下游因子 ( 如早期炎症因子和转录因子等) 之间详细的作用机制仍不清楚。 基于间充质一上皮相互作用途径的大量研究结果，我们认为k g f 主要通过旁分泌途 径发挥作用，而已有研究揭示k g f 还能通过另一种途径，即自分泌途径发挥作用。 m c g a r v e y 和s t e 锄s ( 1 9 9 5 ) 首次研究了正常细胞、胎儿细胞和前列腺癌细胞中的k g f 及其受体的表达状况，结果表明正常前列腺组织的旁分泌环很可能是在发生良性前列腺 增生和前列腺癌之后被自分泌环取代。s i d d i q i 等( 1 9 9 5 ) 使用r t - p c r 方法发现k g f 很 可能参与到人胰腺癌的异常的旁分泌和自分泌途径中。另一项关于正常卵巢表面上皮和 卵巢癌组织中k g f 的表达和活性的研究表明，在体内和体外实验中正常卵巢表面上皮都 表达高水平的k g f ，这意味着k g f 很可能是卵巢表面上皮的一个十分重要的自分泌刺激 物( p a r r o t te f 以，2 0 0 0 ：p a r r o t t 已f 口正2 0 0 1 ) 。 总之，在正常组织中旁分泌和自分泌途径都是k g f 发挥作用的重要途径，而在大多 数情况下，k g f 的自分泌作用途径通常是检测不到的。这些事实证实，在一些癌组织中 上皮细胞高量表达k g f ，并且也许由于增生或肿瘤的发生而使自分泌途径得到加强，但 是详细的机制仍有待于进一步的研究来探明。 东北林业大学硕士学位论文 1 2k g f 在细胞编程性死亡中的作用 已知k g f 能够促进上皮细胞的增殖( c a r r i n 酉o n & b o u l t 6 n2 0 0 5 ) ，但是它在细胞编 程性死亡中的作用却知之甚少。w i l m l a b e r 等( 2 0 0 3 ) 以c 5 7 b l 6 j 型小鼠为模型来研究人 重组k g f ( r h u k g f ) 在小肠上皮细胞编程性死亡中的作用。胃肠道外全面营养( t o t a l d a u r e n t e r a ln u t r i t i o n ，t p n ) 诱导的细胞编程性死亡与b c l 2m i 冰a 表达水平降低相关联， 而r h u k g f 能降低t p n 所诱导的上皮细胞编程性死亡并增加b c l 2 的表达水平。这样的结 果表明，r h u k g f 的使用可能对于t p n 的病人是有益的。且先前有报道称，k g f 作为良 性前列腺增生( b p h ) 基质细胞的一个有潜能的有丝分裂原能够刺激细胞的生长并抑制 细胞编程性死亡，因此k g f 可能也参与到b p h 的发生过程中( c r e s c i o l ie f 口f 2 0 0 2 ) 。 自由基，特别是氧自由基( r o s ) 已经被证实是细胞编程性死亡过程中的普遍调节 因子，它能改变细胞的氧化还原状态，而不正常的氧化还原状态很可能会破坏信号转导 途径从而导致细胞的死亡( h a d d a d2 0 0 4 ) 。w 色m e r 实验室先前的研究表明，k g f 能诱导 一些参与到去除r o s 毒化作用过程中的酶类的表达，并且已确定了几个这样的目标基因 来支持他们的假说。其中编码过氧化还原酶( p e r o x i r e d o x i n v i ) 和n 正2 ( m 7 e 2 r e l a t e d f a c t o r2 ) 的目标基因的表达与k g f 的诱导作用是密不可分的。p e r o x i r e d o x i nv i 这种酶能 去除过氧化氢和有机过氧化物的毒性( h o f m a i u l 舀口，2 0 0 2 ) 。通过k g f 上调p e r o x i r e d o x i n v i 的表达能够诱导角化细胞抵抗r o s ( a u f d e mk e l l e r 甜以正2 0 0 4 ) ，并阻断r o s 所介导的 细胞编程性死亡。此外，n r f - 2 作为一个转录因子可作用于编码去除r o s 毒性的酶类和 一些具有抗氧化作用的蛋白的基因，并且在受伤表皮的角化细胞中这些基因会由于k g f 的诱导作用而高水平表达( b r a 眦甜以，2 0 0 2 ) 。因此k g f 能够通过上调n r f - 2 从而增强去 除r o s 的毒性作用来阻碍r o s 诱导的细胞编程性死亡。 总之，k g f 作为有丝分裂原不仅促进细胞增殖，而且能够抑制分别由t n p 和r o s 诱 导的两种细胞编程性死亡。由此我们猜想k g f 很可能参与到肿瘤发生、衰老与死亡等过 程中，这方面的研究意义重大。目前已知，k g f 在这两个过程中都是通过向上调节另一 种物质的表达来发挥抑制作用的，但要弄清其中的细节仍需大量的深入研究。 1 3k g f 的医学应用及给药方法 k g f 可成功延缓化疗和辐射治疗所引起的人类口腔粘膜疾病和各种实验动物组织 损伤( f i i l c h r u b i n2 0 0 4 ) 。表皮再生过程很复杂，在这一过程中残余的上皮细胞开始 增殖来重建成一个完整的上皮组织( k a n z l e r 甜以1 9 8 6 ；s t e e n f o s1 9 9 4 ) 。在皮肤的伤口 处k g f 表达量的增加对于创口的表皮再生十分重要，因此在许多实验动物中外源性k g f 很好地激发这一再生过程( a b r a h a m & k l a g s b m n1 9 9 6 ) 。当前，k g f 已被成功地应用于 一些临床实践来治疗辐射和化疗所引发的口腔和小肠粘膜溃疡( f a 玎e l le f 以2 0 0 2 ) 。 东北林业大学硕士学位论文 k g f 能很有效地降低几种口腔粘膜疾病的发生和持续，对一些患有固体肿瘤疾病的病人 也进行了类似的研究。基于上述事实，k g f 的其它临床应用价值仍值得进一步的研究。 k g f 还能够被应用于基因治疗中。在一项研究中，编码k g f 受体的k s a m 基因被转 导入血液细胞系中，k g f 有效地诱导能够表达k s a m 基因的血液细胞的增殖，而对未成 熟母细胞的分化或耗竭并无明显的诱导作用。k g f 能克服血液细胞基因治疗的两大问 题：低转导效率和细胞因子对于分化的诱导作用。体外实验的数据对于临床研究具有重 要意义( k a m a t a “以2 0 0 2 ) 。k o p p 等( 2 0 0 4 ) 构建了能稳定表达k g f 的可无限增殖的 h a c a t 角化细胞和k m s t - 6 成纤维细胞。而h a c a t 细胞分泌的转基因k g f 生长因子被证 明是直接刺激伤口愈合过程中一个主要因子。 此外，k g f 除了具有有丝分裂原功能，很多体内和体外实验研究已经证实：k g f 是不同类型上皮细胞中的一个有潜能的存活因子( w e m e r1 9 9 8 ；f i n c h & r u b i n2 0 0 4 ) 。 例如，k g f 保护正常的胸腺生成和胸腺微环境，能增强骨髓移植后胸腺微环境的功能， 从而导致增强免疫功能( m i n 舀盘正2 0 0 2 ；r o s s i “以2 0 0 2 ) 。高浓度k g f 的存在也会保 护肺上皮细胞，使其避免由于氧浓度过高而导致的细胞死亡( p a j l o s m 鲥口，1 9 9 5 ；r a y 臼 以2 0 0 3 ；w e m e r1 9 9 8 ：f i n c h & r u b i n2 0 0 4 ) 。k g f 的这种细胞保护作用很可能与机体 的免疫系统相关联，如前所述早期炎症因子作为k g f 的一种上游调节因子通过旁分泌途 径来刺激k g f 的表达，但是k g f 参与到哪些免疫途径中? 这些过程中k g f 的下游因子是 什么? 这些问题都亟待解决。 1 4k g f 在肿瘤发生过程中的作用 肿瘤发生的过程是非常复杂的，其机制并不清楚。而我们已经知道生长因子能够影 响肿瘤细胞的发生，移动和侵袭( n g u y e ne f 以2 0 0 2 ) 。许多的证据表明，k g f 参与到 各种癌症的发生过程，如乳腺癌，前列腺癌和人胰腺癌( s i d d i q i 百a f 1 9 9 5 ；v e l a g a l e t ip f 口z 2 0 0 3 ) 。m c g a n ，e v 和s t e 锄s ( 1 9 9 5 ) 的实验揭示k g f 对腺癌( a d e n o c a r c i n o m a s ) 的 生长起促进作用，进一步的分析表明，正常前列腺组织中旁分泌环会被b p h 和腺癌的自 分泌环所取代。此外，k g f 在人的胰腺癌中表达并参与到异常的旁分泌和自分泌途径中 ( s i d d i q ie f 口f 1 9 9 5 ) 。另外，大多数的卵巢瘤都是来源于卵巢表面单层上皮细胞，k g f 又是上皮细胞的特异性有丝分裂原，这就提示k g f 直接或间接地影响卵巢瘤的发展，此 项假说已被证实。促性腺激素可作用于卵巢表面上皮，它被假定是一些卵巢癌起始和发 展过程中的一个潜在作用因子。而有趣的是，f s h 和l h 刺激卵巢上皮细胞的作用是在 一定程度上通过提高一些自分泌生长因子如k g f 和h g f 等的表达来间接调控的( p a r r o t t e fn z 2 0 0 1 ) 。 k g f 的信号途径很可能在人乳腺癌细胞系中与雌性激素的局部表达相关联。一些研 究者利用r t - p c r 方法来研究芳香酶( a r o m a t a s e ) 细胞色素p 一4 5 0 m r n a s 的局部表达，此 酶可催化乳腺肿瘤中雌性激素的合成及刺激k g f 的表达。结果表明，大部分的乳腺肿瘤 4 东北林业大学硕士学位论文 具有制造芳香酶和k g f 潜力，它们都能够在乳腺肿瘤的生长过程中发挥重要作用( k o o s 刃口，1 9 9 3 ) 。通过研究含k g f 的n i h3 t 3 细胞( 小鼠成纤维细胞) 培养基，发现k g f 能 够增加具有雌性激素受体的乳腺癌细胞的能动多态性而对不含雌性激素受体的乳腺癌 细胞不起作用。此后，几项关于人源k g f 对具有雌性激素受体的两个乳腺癌细胞系 m c f 7 和t - 4 7 d 的影响的研究揭示了k g f 能够促进这两个细胞系的增殖和转移。而且它 们对k g f 的应答都是与剂量和时间相关的。上述研究表明人源k g f 促进人乳腺癌细胞的 转移和增殖，k g f 很可能是乳腺癌发展成能动的可转移的表型过程中一个重要的早期信 号( n g u y e ne f 口，2 0 0 2 ) 。 如上所述，k g f 很可能在癌症起始和发展过程中发挥重要作用，细致深入地研究 k g f 的信号途径对于癌症的预防和治疗具有重大意义。 2 鹿茸角的生长发育及相关分子机理的研究现状 鹿是有蹄的反刍类哺乳动物，鹿茸角是鹿科动物特有的标志，也是绝大多数鹿科动 物的雄性特征( 驯鹿雌雄均有角) 。鹿茸角每年再生和脱落一次，分为两个明显不同的阶段： 一是从新茸萌发到茸皮脱落阶段；二是从茸皮脱落到骨角脱落阶段。鹿茸就是鹿茸角生 长前一阶段尚未骨化的嫩角，它外面被覆有茸毛的皮肤，内含有胶质等前成骨组织，富含 血管和神经。鹿茸生长到后期，茸性皮肤脱落，完全骨化形成硬骨，称为鹿角。鹿茸和鹿角 统称为鹿茸角。 2 1 初茸的发育 最普遍存在的一种观点认为茸角是由额骨上的“芽基”发育而来的。当进入青春期 后，雄性激素水平的提高刺激了存在于额骨外脊末梢部分的所谓的“生茸骨膜” ( a m l e r o g e n i cp e r i o s t e u m ，a p ) 的生长( g o s s & p o w e l1 9 8 5 ) 。a p 上存在睾酮的特异性 识别位点( l i & s 毗i e1 9 9 8 ) ，但是研究却发现睾酮并不能直接作用于体外培养的a p 细 胞，而它诱导的i g f l ( i n s u l i n 一1 i k eg r o 叭hf a c t o ri ) 却能刺激这些细胞的增殖( “e f 以 1 9 9 9 ；s a d i 曲i 甜口，2 0 0 1 ) ，并且诱导芽基开始发育( s e m p e r e1 9 8 3 ；s u t t i e 刃口，1 9 8 4 ； s 埘i e 甜a ，1 9 8 8 ；s 们i e 甜口f 1 9 9 1 ) 。正常情况下，雌鹿因缺乏必需的激素水平，其a p 处于休眠状态，但能够通过注射外源雄性激素来诱导雌鹿形成芽基( k i e r d o r fe f 以1 9 9 5 ) 。l i 和s u 仕i e ( 1 9 9 4 ) 通过组织学方法确定了芽基的形成四个阶段：细胞膜内 的骨化阶段、转变过程中的骨化、芽基软骨内骨化和茸角软骨内的骨化。鹿茸角形成的 起始时间与覆盖于芽基远端的茸性皮肤的出现是同步的。初茸不分枝，且通过膜内及软 骨内成骨方式从角柄顶端发育而来( c h a p m a n1 9 7 5 ) o 接近繁殖季节时，鹿血浆睾酮含量升高，此时组织学研究表明初茸角开始发生骨化， 东北林业大学硕士学位论文 被覆在其表面的茸性皮肤逐渐脱落，留下坚硬的裸露的骨附着在芽基上。这种性激素水 平提高从而抑制骨生长的现象与人类青春期相似( 砌g g s 甜口，2 0 0 2 ) 。上述结果同时从 另外一个角度提示我们鹿茸的发生似乎和雌性激素相关。已知雄性动物骨骼中，睾酮经 常是通过由芳香化酶转化为雌激素来间接地发挥作用( r i g g sp f 口，2 0 0 2 ) 。g o s s ( 1 9 6 8 ) 首次提出雌激素而非雄性激素是鹿茸角生长过程中一个非常重要的调节因子。b u b e n i k 等( 1 9 7 5 b ) 随后验证了雄激素的拮抗剂对于鹿茸角的骨化具有抑制作用。并进一步发 现去势雄鹿的雌激素由鹿茸角组织合成，而雌鹿鹿茸的季节性生长循环是受由卵巢合成 的雌二醇的调节( l i n c 0 1 n & t y l e r l 9 9 9 ；b u b e n i c k 甜口正2 0 0 5 ) o 对初茸整个发育过程的研究主要集中于如下问题：( 1 ) 生茸骨膜是否真的具有组织 学特异性? ( 2 ) 芽基是否真的存在? ( 3 ) 如果存在，生茸骨膜是如何发育成为芽基? ( 4 ) 上述生长发育过程的分子机理是什么? 对于第一个问题，初茸来源于生茸骨膜( a p ) 已通过一系列移植试验得到了证实。 h a 咖i g ( 1 9 6 7 ) 的研究发现，将生茸组织移植到额骨的另一个部位后，鹿茸的形成将 发生在新位点，而不是起始位点。也有研究发现，将被覆于幼鹿芽基表面的骨膜移植到 前腿，可在前腿部长出芽基及鹿茸角( p r i c e & a 1 l e n2 0 0 4 ) 。近年来，l i 和s 删i e ( 2 0 0 1 ) 对马鹿生茸骨膜及初角茸的发育进行了大量的研究，他们认为生茸骨膜像胚胎组织一样 具有完全的自我分化能力，并且生茸骨膜的细胞层富含糖原( l i & s 嘣i e 1 9 9 8 ) ，这是胎 儿造骨细胞的典型特征。 第二问题是鹿茸再生发育的一个焦点问题。l i 等( 2 0 0 4 ) 研究发现，鹿茸的芽基与 哺乳动物肢体发育的芽基在组织和生理结构上并不相同，因此提出鹿茸再生的非芽基学 说，对此我们在后续内容( 2 2 2 ) 中还有相关论述。目前芽基学说和非芽基学说都需要 进一步的实验证据。 目前，人们无论是对繁殖周期中性激素还是局部因子调控鹿茸角发育的分子调节机 制都知之甚少。目前研究的一个重要对象是胰岛素样生长因子( i g f l ) 。此生长因子既 可以由肝脏等器官以激素的形式产生，也可由鹿茸局部组织产生作为生长因子来调节鹿 茸发育。但问题在于鹿茸角i g f l 组织表达量与雄性激素的组织浓度呈正相关，因此i g f l 可能是鹿茸角中晚期发育过程中的一个重要的调节因子，它分别在芽基的四个骨化过程 中刺激生茸细胞的增殖。近期，b a r l i n g 与同事( b a r l i n gp f 口正2 0 0 4 a ；b a r l i n g 彰a 正2 0 0 4 b ) 研究了存在于初茸角的皮肤和骨组织中的生长因子及其受体，已证实的生长因子有表皮 生长因子( e p i d e m a lg r o hf a c t o r ，e g f ) 、表皮生长因子受体e g f r 、成纤维细胞生长 因子2 ( 肋r o b l a s tg r o 叭hf a c t o r2 ，f g f 一2 ) 、成纤维细胞生长因子的受体，如f g f r l ， f g f r 2 和f g f r 3 ，骨形成多肽( b o n em o r p h o g e n e t i c sp r o t e i n s ，b m p s ) 2 、4 和1 4 及受 体b m p r l b 和a c t 砒i ，他们又提出了这些生长因子的信号途径存在于初茸角的软骨区 域和皮肤区域之间的假说( b a r l i n ge fa z 2 0 0 4 b ) 。这些尚需要进一步的实验证明。 6 东北林业大学硕士学位论文 2 2 鹿茸角的再生 鹿茸角的周期再生始于初茸的骨化和脱落。也受到生殖周期的系统性调节和局部因 子的调控。鹿茸角的生长与每年的繁殖周期和性激素浓度的周期性变化相关联，并且存 在内源性节律( w - e s t & n o r d a n1 9 7 6 ) 。性激素是调控鹿茸角生长周期最重要的一种系统 性调节因子。在春季睾酮激素水平很低鹿茸角正常脱落，冬末春初时去势将导致雄鹿鹿 茸角成熟前的脱落( j a c z e w s l ( i “以1 9 7 6 ) ，而此时加入外源性的性激素将阻止鹿茸角的 脱落和再生( f i e t c h e r1 9 7 8 ) 。在夏季鹿茸角生长迅速( g o s s1 9 8 3 ) ，此时雄性激素水平 也逐渐提高，直到繁殖季节达到顶点，鹿茸角的生长此时也就相应停止了。其它激素浓 度的改变也与鹿茸角生长周期相关，包括1 ，2 5 ( 0 h ) 2 d 3 ( d e re e m s 鲥口z 1 9 8 8 ； s e m p e r e 鲥以1 9 8 9 ) ，甲状腺素( s h i & b a r r e l l1 9 9 4 ) ，皮质醇( b u b e n i k 鲋口正1 9 7 5 a ；s u t t i e 甜以，1 9 9 5 ) 和泌乳刺激素( s e m p e r e 鲋以1 9 8 3 ；s u t t i e 酎以正1 9 8 4 ) ，但它们的功能仍是未 知的。 2 2 1 鹿茸角的脱落 雄鹿初茸角的脱落标志着再生循环的起始。在第二年春天，当鹿的血浆睾酮含量降 低时初角茸脱落，接着在暴露的角柄表面形成芽基，并逐渐再生形成成熟的分权茸。在 鹿茸角脱落之前，覆盖在远端芽基处的皮肤变亮，该区域轻微肿胀。鹿茸角在一天之内 就能脱落，这一事件受远端芽基中能够吸收骨的破骨细胞的影响( g o s s 甜以1 9 9 2 ) 。脱 落留下一个裸露的充满血液的凹面，几小时后就形成一个大的疤痕覆盖在凹面上。 k i e r d o r f 等( 1 9 9 3 ) 描述了这个区域的组织学改变，并发现鹿茸角脱落后破骨细胞在远 端的芽基处继续吸收骨，形成了一个光滑的平面，之后又进行骨的合成，来补充同脱落 的鹿茸角一起丢失的那部分芽基。 对于大多数种类的鹿，旧的鹿茸角脱落与新的鹿茸角再生是同步的，但像驯鹿和驼 鹿，鹿茸