（生理学专业论文）海马自发同步化活动机制及ca3ca1突触联系研究.pdf

d i s s e r t a t i o nf o rm a s t e rd e g r e e 2 010 u n i v e r s i t yc o d e ：10 2 6 9 s t u d e n ti d ：51 0 81 3 0 0 0 5 9 e a s tc h i n an o r m a l u n i v e r s i t 、 r e s e a r c ho nm e c h a n is moft h es y n c h r o n i z e d s p o n t a n e o u sa c t i v i t ya n dc o n n e c t i v i t yb e t w e e n c a 3 - c alr e g i o n si nh i p p o c a m p u s a c a d e m i c ：s c h o o lo fl i f es c i e n c e c a n d i d a t e ：一 y 垫y 垫g m a y ，2 0 1 1 华东师范大学学位论文原创性声明 郑重声明：本人呈交的学位论文海马自发同步化活动机制及c a 3 c a l 突 触联系研究，是在华东师范大学攻读移博士( 请勾选) 学位期间，在导师 的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献 的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名：搁睡日期：加f 年歹月夕日 华东师范大学学位论文著作权使用声明 海马自发同步化活动机制及c a 3 c a l 突触联系研究系本人在华东师 范大学攻读学位期间在导师指导下完成的砚左博士( 请勾选) 学位论文，本论 文的研究成果归华东师范大学所有。本人同意华东师范大学根据相关规定保留和 使用此学位论文，并向主管部门和相关机构如国家图书馆、中信所和“知网”送交 学位论文的印刷版和电子版；允许学位论文进入华东师范大学图书馆及数据库被 查阅、借阅；同意学校将学位论文加入全国博士、硕士学位论文共建单位数据库 进行检索，将学位论文的标题和摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合 理复制学位论文。 本学位论文属于( 请勾选) ( ，j1 经华东师范大学相关部门审查核定的“内部”或“涉密”学位论文书， 于年月日解密，解密后适用上述授权。 ( ) 2 不保密，适用上述授权。 导师签名本人签名塑厘 沙f 年5 月2 矿日 拯雁硕士学位论文答辩委员会成员名单 。i i i i i i i i i i i il itr l l l l lr i i i i l r l l l l l l l l r f y 19 0 4 17 2 姓名职称单位备注 林龙年教授华东师范大学脑功能基因组学研究所主席 梅兵研究员华东师范大学脑功能基因组学研究所委员 赵政副研究员华东师范大学脑功能基因组学研究所委员 薛小琳讲师华东师范大学脑功能基因组学研究所秘书 华东师范大学硕士学位论文海马自发同步化活动机制及c a 3 一c a i 突触联系研究 海马自发同步化活动机制及c a 3 c a l 突触联系研究 中文摘要 目前关于自发节律性活动的产生及锥体细胞的同步化机制的探讨，主要观点 有两种：( 1 ) 大脑中存在少量的p a c e m a k e r 细胞，它们可以产生自发活动，从 而带动群体细胞的同步化活动；( 2 ) 另一主要观点认为自发节律性活动的产生 是由神经环路中群体细胞共同相互作用带动大量细胞同步化活动的。如g a b a 能 的中间神经元的轴突存在大量分枝，通过这些分枝可以增强对局部范围内的群体 锥体细胞的同步化抑制。 针对大脑的节律性活动的研究主要集中在两个方面：( 1 ) 神经细胞节律性 活动的细胞化学机制( 2 ) 节律性活动如何产生，传播并影响群体细胞的同步化。 而关于这两方面的研究主要集中在离体海马脑片及在体多通道记录。海马脑 片的制备往往是在剥离海马后，利用振动切片机将其切成4 0 0 t , t m 厚的薄片，多 用于突触水平的研究。而切取脑片的这一过程会损坏大量的纤维，导致突触连接 的通路被阻断，从而破坏了海马内部复杂的环路，影响单个神经细胞的信号输入 与输出。在体多通道研究可以记录到动物清醒状态下，海马对多信号输入的整合 处理结果，更符合生理水平的研究。而本实验选用的实验材料是离体完整海马， 记录到自发产生的低频节律性振荡。该实验材料的选择，保证了海马内部复杂环 路的完整性，也排除了其他脑区信号输入的干扰，更有利于研究海马自发活动产 生的根源。 1 g a b a a 受体活动介导的海马c a 3 c a l 区的同步性自发活动 目前关于海马的节律性活动的研究，主要集中在两个方面，一是海马细胞节 律性活动产生的机制，另一方面是节律性活动的传播及如何影响群体细胞的同步 化。我们发现离体完整海马可以自发产生低频节律性振荡( 0 8 2 h z ) ，而且同 时记录的局部场电位和全细胞记录显示，这种自发活动在同时记录的c b ；i c a l ， c a 3 c a 3 及c a 3 c a i 锥体细胞之间是同步化的。灌流液中加入g a b a a 受体阻 断剂b i c u c u l l i n e 可以显著性降低自发活动的频率，而不影响锥体细胞的同步化。 i l l 通道胞外阻断剂z d 7 2 8 8 也可以降低自发活动的频率，仍不影响锥体细胞自发 活动的同步化。而在加入a m p a 受体阻断剂d n q x 后，低频自发活动消失。总 华东师范大学颀二t 学位论文海马自发同步化活动机制及c a 3 c a l 突触联系研究 之，离体完整海马自发产生的低频振荡，是a m p a 受体依赖的，而且这种自发 活动的产生与g a b a a 受体和m 通道的作用密切相关。 2 海马c a 3 与c a i 之间的突触联系 关于海马不同细胞间的突触联系的研究主要在海马脑片上进行的，一般是突 触前给予单个或串刺激，分析突触后的反应。而脑片制备的过程中大量的纤维被 切断，导致突触联系受损。但完整海马内部的网络环路及突触联系保持完整，这 更有利于单独分析单个c a 3 锥体细胞与c a l 锥体细胞之间的联系概率。我们在 这种实验材料的基础上，记录了1 0 对细胞，其中3 对有明显的突触后兴奋性反 应，反应幅度一般在2 p a 。这一概率明显高于在脑片上记录到的突触联系概率。 在我们所建立的离体完整海马模型上，可以更精确的记录c a 3 c a l 之间的投射 概率，对于海马功能的研究提供更好的基础。 关键词：海马，振荡，g a b a a 受体，中间神经元，锥体细胞，同步化活动 i i 华东师范人学硕士学位论文海马自发l 叫步化活动机制及c a 3 c a l 突触联系研究 r e s e a r c ho nm e c h a n i s mo f t h es y n c h r o n i z e ds p o n t a n e o u s a c t i v i t ya n dc o n n e c t i v i t yb e t w e e nc a 3 - - c a lr e g i o n si n h i p p o c a m p u s y a n gy a h ( p h y s i o l o g y ) d i r e c t e db yd r z h i mw a n g a b s t r a c t a tp r e s e n tt h e r ea r et w ol i n e so fs t u d i e sc a r r i e do u to no r i g i no ft h es p o n t a n e o u s o s c i l l a t i o ni nb r a i na n dm e c h a n i s mo ft h es y n c h r o n ya c t i v i t y ：( 1 ) al i t t l ep a c e m a k e r c e l l s ，w h i c hc a ng e n e r a t es p o n t a n e o u so s c i l l a t i o na n dd r i v eo t h e rp y r a m i d a lc e l l s ；( 2 ) g r o u pc e l l si nt h en e t w o r kd o i n gs a m et h i n ga tt h es a m et i m ea n dt h e nd r i v eo t h e r p y r a m i d a lc e l l s r e s e a r c ho nt h eo s c i l l a t i o n si nb r a i nm a i n l yc o n c e n t r a t e so nt w op o i n t s ：( 1 ) t h e c e l l u l a ro rn e u r o c h e m i c a lb a s i so fo s c i l l a t i o n sa n d ( 2 ) t h en e u r a la s s e m b l yb yw h i c h o s c i l l a t i o n sp r o p a g a t ea n ds y n c h r o n i z eo v e ral a r g es c a l e s t u d i e sa b o u tt h e s et w o p o s s i b i l i t i e sa r em a j o ro nh i p p o c a m p u si nv i t r oa n di n t r a c e l l u l a rr e c o r d i n gi nv i v o t h e h i p p o c a m p u si su s u a l l yc u ti n t os l i c ew i t h4 0 0 p r ot h i c k n e s sf o ri nv i t r os t u d i e s d u r i n gt h ep r o c e s so f t h ec u t t i n g , m a n yf i b e r sa r ed a m a g e d ，l e a d i n gt ob l o c k so fm a n y s y n a p t i cc o n n e c t i o n s a n dt h e nd a m a g et h ei n t e r n a ln e t w o r ki n f l u e n c i n gt h ei n p u ta n d o u t p u to ft h ep y r a m i d a lc e l l s m u l t i c h a n n e lr e c o r d i n gi nv i v oc a nr e c o r ds i g n a l i n t e g r a t i o no fm u c hi n p u t ，w h i c hi ss i m i l a rw i t l lp h y s i o l o g i c a ll e v e l i no u re x p e r i m e n t , w ec h o o s et h ew h o l eh i p p o c a m p u si nv i t r o ，a n dr e c o r ds p o n t a n e o u ss l o wf r e q u e n c y o s c i l l a t i o n s t h i sw h o l eh i p p o c a m p u sm o d e lc o u l dm a i n t a i nt h ei n t a c ti n t e r n a l n e t w o r ka n de l i m i n a t et h ei n t e r f e r e n c eo ft h ei n p u t sf r o mo t h e rb r a i ns t r u c t u r e ，s ot h i s m o d e lw a sf a v o r a b l et os t u d yt h eg e n e r a t i o no ft h es p o n t a n e o u sa n ds y n c h r o n y a c t i v i t y i g a b a ar e c e p t o r - a c t i v i t ym e d i a t e ss e l f - g e n e r a t e ds y n c h r o n yi nh i p p o c a m p a l c a 3 一c a lr e g i o n s a tp r e s e n tr e s e a r c ha b o u tt h eo s c i l l a t i o n si nb r a i ne l e c t r i c a l a c t i v i t i e sm a i n l y c o n c e n t r a t e so i lt w op o i n t s ：( 1 ) t h em e c h a n i s mo fg e n e r a t i o n ；( 2 ) t h en e u r a l 华东师范大学硕上学位论文 海马自发同步化活动机制及c a 3 一c a i 突触联系研究 a s s e m b l i e sb yw h i c ho s c i l l a t i o np r o p a g a t e sa n ds y n c h r o n i z e so v e ral a r g es c a l e w e f o u n dt h a tt h ew h o l eh i p p o c a m p u sc a ng e n e r a t es l o wf r e q u e n c yo s c i l l a t i o n ( o 8 2 h z ) ， a n ds i m u l t a n e o u sw h o l e c e l lr e c o r d i n g sf u r t h e rr e v e a l e dt h a tt h eo s c i l l a t i o n sw e r e s y n c h r o n i z e da m o n gc a i - c a l ，c a 3 一c a 3 ，a n dc a 3 - c a ln e u r o n s b ya p p l y i n g b i e u e u l l i n e - - - - ag a b a ar e c e p t o rb l o c k e r - - i nt h eb a t hs o l u t i o n ，w ef o u n dt h a tt h e f r e q u e n c yo ft h es p o n t a n e o u so s c i l l a t i o nw a ss i g n i f i c a n t l yr e d u c e dt o0 1 0 2h z t h i sw a so b s e r v e di nb o t hc a la n dc a 3r e g i o n s b u tt h es y n c h r o n yo ft h ea c t i v i t y o v e l c a 3 - c a lr e g i o n sr e m a i n e da tt h el o wf r e q u e n c yo s c i l l a t i o n s h o w e v e r ， e x t r a c e l l u l a rb l o c k a d eo fg a b a sr e c e p t o r sb ys c h 5 0 911d i d n ta l t e rt h ef r e q u e n c y o ft h e s eo s c i l l a t i o n s e x t r a c e l l u l a rt r e a t m e n t o f z d 7 2 8 8 ， w h i c hb l o c k s h y p e r p o l a r i z a t i o n a c t i v a t e d ( i h ) c h a n n e l s ，a l s o s l o w e dd o w nt h eh i p p o c a m p a l o s c i l l a t i o n st o o 4h z ，w h i l ed i dn o ti n f l u e n c et h es y n c h r o n y a p p l y i n gt h ed n q x ， w h i c hi sa n t a g o n i s to ft h ea m p ar e c e p t o r s ，c a nb l o c kt h eg e n e r a t i o no ft h es l o w o s c i l l a t i o ni nw h o l eh i p p o c a m p u s s ot h eg e n e r a t i o no ft h es l o wo s c i l l a t i o ni nw h o l e h i p l x ) c a m p u sw a sd e p e n d e n to na m p ar e c e p t o r sa n dg a b a ar e c e p t o r sa n di h c h a n n e l sp l a y e da ni m p o r t a n tr o l ei nt h i sp r o c e s s 1 s y n a p t i cc o n n e c t i o nb e t w e e nc a 3a n dc a lp y r a m i d a lc e l l s a tp r e s e n tr e s e a r c ha b o u tt h es y n a p t i cc o n n e c t i o no ft h ed i f f e r e n tc e l l si n h i p p o c a m p u si sc o n c e n t r a t e do nt h es l i c e n o r m a l l y , a n a l y z et h ep o s t s y n a p t i ca c t i v i t y a f t e rp r e s y n a p t i cs t i m u l u s m o s tf i b e r sa r ed a m a g e dw h e nt h eh i p p o c a m p a ls l i c ei s p r e p a r e d w h i l ei nt h ew h o l eh i p p o c a m p u s ，t h en e t w o r ka n dt h es y n a p t i cc o n n e c t i o n o ft h eh i p p o c a m p u sa r ei n t a c t s oi ti sb e n e f i tt oa n a l y z et h er a t i oo ft h es y n a p t i c c o n n e c t i o nb e t w e e nc a 3a n dc a lp y r a m i d a lc e l l s w er e c o r d10p a i r so fp y r a m i d a l c e l l s , 3o ft h e mh a do b v i o u sp o s t s y n a p t i ce x c i t a b l ea c t i v i t ya n dt h ea m p l i t u d ew a s a b o u t2 p a t h i sr a t i oo ft h es y n a p t i cc o n n e c t i o nw a sh i g h e rt h a nt h a ti n t h e h i p p o c a m p u ss l i c e i nt h em o d e lo ft h ew h o l eh i p p o c a m p a lf o r m a t i o ni nv i t r o ，w e c o u l d a n a l y z et h er a t i oo f t h ec o n n e c t i o nb e t w e e nc a 3a n dc a la c c u r a t e l y , p r o v i d i n g t h e b a s i sf o r t h er e s e a r c ho nt h ef u n c t i o no f t h eh i p p o c a m p u s k 眄w o r d s ：h i p p o c a m p u s ，o s c i l l a t i o n ， g a b a ar e c e p t o r ,i n t e r n e u r o n , p y r a m i d a lc e l l ，s y n c h r o n ya c t i v i t y l v 3 讨论。2 8 4 课题研究意义及展望2 8 第三章文献综述3 0 1 哺乳动物海马网络环路3 0 2 海马中节律性振荡3l 2 10 振荡3l 2 2t 振荡3 1 v 华东师范大学硕上学位论文 2 3s h a r pw a v ea n dr i p p l e 3 哺乳动物海马环路中的中间神 3 1 中间神经元 3 2g a b a 受体 4 海马病理性研究 待发表文章目录 参考文献 致谢 华东师范大学颂：l 学位论文 海马自发同步化活动机制及c a 3 c a i 突触联系研究 图表目录 f i g 1离体完整海马自发活动示意图1 1 f i g 2 全细胞记录完整海马锥体细胞低频节律性活动1 2 f i g 3b i c u c u l l i n e 对离体完整海马c a l c a l 锥体细胞活动频率1 4 f i g 4b i c u c u l l i n e 对离体完整海马c a l c a 3 锥体细胞活动频率影响15 f i g 5 s c h 5 0 9 1l 对c a l - c a 3 锥体细胞活动频率的影响1 6 f i g 6z d 7 2 8 8 对c a l 锥体细胞活动频率的影响1 7 f i g 7z d 7 2 8 8 对c a 3 锥体细胞活动频率的影响1 8 f i g 8d n q x 对c a i c a i 锥体细胞活动频率的影响1 9 f i 吕9 离体完整海马c a 3 锥体细胞与c a i 锥体细胞突触联系。2 6 f i g 1 0c a 3 锥体细胞与c a l 锥体细胞突触联系模拟图2 7 、，i i 华东师范大学硕士学位论文 海马自发同步化活动机制及c a 3 - c a i 突触联系研究 第一章g a b a a 受体活动参与的海马c a 3 c a l 区的 同步性自发活动 摘要 幼年s d 大鼠的完整海马在离体条件下可以自发产生低频的节律性振荡 ( 翌h z ) 。利用全细胞记录的方法同时记录c a l 一c a l ，c a 3 一c a 3 及c a 3 一c a l 锥 体细胞，发现海马中绝大多数锥体细胞存在低频节律性同步化活动，这种同步化 现象不依赖于锥体细胞之间的距离而改变。d n q x 可以阻断自发活动的产生， 说明这种低频自发活动是依赖于a m p a 受体的。同步化研究的过程中我们使用 药物g a b a a 受体阻断剂b i c u c u l l i n e ，i h 通道胞外阻断剂z d 7 2 8 8 及g a b a b 受 体阻断剂s c h 5 0 9 1 1 ，结果显示b i e u e u l l i n e 可以大幅度降低自发活动的频率，说 明g a b a a 能的中间神经元对于自发的低频兴奋性活动也有一定的影响。z d 7 2 8 8 阻断m 通道后，也使自发活动频率下降，而对同步化影响较小。s c h 5 0 9 11 对海 马自发活动及其同步化没有显著性影响。 关键词：节律性振荡，g a b a a 受体，g a b a b 受体，中间神经元 前言 动物脑电活动中产生的节律性的波动，我们称之为振荡。动物处于不同状 态时，不同的脑区将产生不同的节律性振荡。如动物在运动，探索新事物及快速 眼动睡眠期间产生4 1 2 h z 的0 节律，再如动物在安静状态下产生1 5 0 2 0 0 h z 的 快速r i p p l e 节律。清醒动物及活动状态的动物往往产生 5 h z 的节律性振荡， 而处于深度睡眠或癫痫状态的动物往往产生低频节律性振荡【l 】。这些研究证明 g h z 的低频脑电振荡由新皮层产生，通过丘脑皮层环路调节的。0 振荡和丫振 荡是动物在不同行为状态下，海马产生的不同频率振荡，两种不同频率的振荡及 它们之间的相互作用对于空间位置信息的编码有着重要的意义，另外0 振荡和y 振荡对于学习过程中记忆的形成至关重要，而高频率的r i p p l e 振荡有助于记忆 的巩固。通过影响突触前和突触后神经元的活动，0 振荡和7 振荡可以调节突触 可塑性，这是短时程记忆和长时程记忆形成的先决条件【2 l 。一个0 循环或许就包 含一个信息量，以时相锁定的方式完成相邻信息的转换。这种循环模式可以将信 息短暂的分散或汇聚，从而进行多种信息的处理。0 振荡可以将同一时间与感觉 1 华东师范人学顾j 二学位论文 海马自发同步化活动机制及c a 3 c a i 突触联系研究 和记忆相关的细胞的活动进行整合，进而影响动物行为的变化，如感觉刺激引起 0 波的改变，0 波的时相与运动活动相互关联及记忆的编码和提取【3 】。 目前关于海马振荡的产生，同步化调控机制的研究仍然存在很多的争议。主 要存在两种观点：( 1 ) 存在少数p a c e m a k e r 细胞，可以自发产生节律性振荡， 从而带到群体细胞的同步化活动。2 0 0 9 年，b o n i f a z i 等人在利用全细胞记录，动 力学成像技术及功能性联系的重构等技术在早期发育的海马脑片中发现了所谓 的“h u bn e u r o n 。这是一类g a b a 能的中间神经元，它们在调节早期海马自发节 律性活动同步化方面发挥重要的作用【4 】。( 2 ) 另一种观点认为神经网络环路中 群体细胞相互作用局部产生同步化，从而带动其他细胞的同步化。g a b a 能的中 间神经元本身就可以相互联系形成不同的内部环路，从而产生节律性振荡【5 1 。 神经网络在生理或病理条件下会产生节律性振荡，这一研究往往集中在实验 材料海马脑片上进行。大部分研究认为g a b a 能的中间神经元环路在产生不同类 型的节律性活动中发挥着重要的作用，尤其是中高频率的振荡。然而多数离体研 究都基于限定的实验条件下，如药物诱导或强直刺激。如不同浓度的乙酰胆碱类 似物在离体海马脑片上可以诱导出不同频率的振荡。a n d r 6f i s a h n 及其同事在海 马脑片c a 3 区诱导出4 0 h z 的y 振荡，而g a b a a 受体的阻断剂b i c u c u l l i n e 和a m p a 受体的阻断) i u n b q x 可以阻断这种诱导的节律性活动，说明抑制性活动和兴奋性 的的突触活动均参与了这种诱导活动的产生，而且皮层下胆碱能的投射通过诱导 快速振荡参与海马学习记忆的调节 6 1 。 p a p a t h e o d o r o p o u l o sc 及其同事在5 5 0 9 r n 厚的腹侧海马脑片上记录到低频 ( 2 h z 左右) 自发场电位活动。1 0 1 x m 的a m p a 受体阻断齐u c n q x 可以阻断这种低频 自发活动，说明兴奋性谷氨酸递质参与了这种低频自发活动的产生。5 斗m 的 b i e u e u l l i n e 同样阻断了海马脑片上低频自发活动的产生。实验结果说明海马局部 环路中的g a b a 能的中间神经元的同步化活动引起锥体细胞快速超极化而伴随 产生自发同步化活动【7 】。 大量的实验均证明，中间神经元在调节锥体神经细胞环路的不同频率的振荡 及锥体细胞快波簇状放电的恢复中发挥着重要的作用。1 9 9 8 年y z h a n g 的海马脑 片实验证明用低浓度的氯化铯灌流大鼠脑片，可以诱导海马c a l 锥体细胞产生低 频( g h z ) 的振荡。这种振荡是由g a b a a 受体介导的超极化引起的，是由g a b a 能的中间神经元环路中各个神经元之间相互作用产生的，可能与缝隙连接( g a p j u n c t i o n ) 密切相关例。 2 华东师范大学硕上学位论文 海马自发i 司步化活动机制及c a 3 - c a i 突触联系研究 t w o n g 及其同事利用不同年龄的c 5 7 b i 6 小鼠完整海马模型，证明了小 鼠海马的g a b a 能的抑制性节律是在出生后两周左右形成的。他们分离的年幼 和成年的小鼠完整海马及较厚的脑片均能产生自发节律性的场电位( 1 4 h z ) 。 这种场电位在小鼠出生后1 0 天左右开始出现，1 5 天左右达到稳定并且一直持续 到成年。出生后1 1 1 4 天的小鼠的完整海马的这种节律性场电位与c a 3 的复杂 环路和g a b a 能的抑制性中间神经元网络密切相关i i 州。 1 材料和方法 i i 实验动物 s p f 级( s p e c i f i cp a t h o g e nf r e e ) 幼龄s p r a g u ed a w l c y 大鼠( 简称s d 大鼠) ， 一般年龄在出生后1 3 1 8 天。在华东师范大学脑功能基因组学研究所动物中心饲 养，繁殖。 1 2 实验试剂 。 1 2 1 人工脑脊液( a r t i f i c i a lc e r e b r o s p i n a lf l u i d ，a c s f ) ： n a c l1 1 9 m m k c l2 5m m c a c l 2 2 h 2 0 2 5m m m g s 0 4 7 h 2 0 1 3m m d g l u c o s e l lm m n a h 2 p 0 4 2 h 2 0 lm m n a h c o t2 6 2m m 1 2 2 细胞内液： k - g l u c o n a t e n a c l k c l m g c l 2 6 h 2 0 h e p e s 1 3 6 5 m m 9m m 1 7 5r a m 1m m 1 0m m 3 s i g m a s i g m a s i g m a p h 值：7 2 6 渗透压：2 8 5m o s m s i g m a s i g m a s i g m a s i g m a s i g m a 华东师范大学硕士学位论文海马白发同步化活动机制及c a 3 c a i 突触联系研究 e g t a a m p h o t e r i c i n 0 2m m o 5 m g m l 以上药物注明为s i g m a 公司产品外，其他为国产药物 1 3 仪器设备 p c l a m p l0 1 记录分析软件 a x o c l a m p 7 0 0 b 放大器 a x o n l 4 4 0 数模转换器 荧光显微镜 微电极操纵仪 振动切片机 防震台 蠕动泵 p c 1 0p u l l e r 单光子探测器( c c d ) 刺激器 s i g m a p h 值：7 2 6 渗透压：2 9 5m o s m 1 4 实验方法 1 4 1 离体完整海马制备 首先精确配制人工脑脊液( 配方见1 2 实验试剂) ，分为两份，一份用于制 备和孵育海马，另一份用于系统灌流。然后取幼年s d 大鼠，年龄为出生后1 3 1 8 天，腹腔注射2 5 戊巴比妥钠o 1 0 3 m l ，待幼鼠麻醉后，快速断头，剥开颅骨， 取其全脑，并将其转移至0 2 饱和的人工脑脊液中。4 c 条件下，在人工脑脊液浸 湿的滤纸上先将左右半球分离，一半继续置于0 2 饱和的人工脑脊液中孵育，另 一半置于滤纸上，先将前脑和脑干部分切除，然后从皮层中分离完整海马 ( f i g 1 a ) ，置于0 2 饱和人工脑脊液中继续孵育。相同操作分离另一半球的海 马。室温孵育1 - 2 小时后开始膜片钳记录。 1 4 2 离体海马局部场电位( l o c a lf i e l dp o t e n t i a l ) 记录 4 华东师范大学硕：仁学位论文海马自发同步化活动机制及c a 3 一c a i 突触联系研究 将一块完整海马放置于玻璃孵育槽中，持续灌流0 2 饱和的人工脑脊液。本实 验所用的场电位记录电极为玻璃电极( 中问灌注人工脑脊液) ，该电极是用外径 1 8 m m ，内径1 5 m m 的硼硅酸盐玻璃管( b o r o s i l i c a t eg l a s s ，k i m b l ec h a s e ) 在垂 直微电极拉制仪( m o d e lp c 1 0 ) 上拉制而成，电极尖端外径5 1 工n l 。在单光子探 测器( c c d ) 追踪下，两根电极在微电极操纵仪( m c l 0 0 0 e ，s i s k i y o u ) 的驱动 下缓缓移至海马辐射层，距离大于l m m ，记录海马c a l 辐射层局部场电位。 1 4 3 离体海马全细胞记录 全细胞记录中所用的电极也是玻璃电极，电极阻抗约在3 8 4 5 m q ，中间灌 注常规细胞内液。玻璃电极在微电极操纵仪的驱动下缓慢推入海马的c a i 锥体 细胞层，当电极接触到锥体细胞时，电极电阻变大，约1 2 1 8m q ，并出现内向 电流，此时给予电极内负气压将细胞膜吸住并形成高阻抗封接，通过 a m p h o t e r i c i nb ( s i g m a a l d r i c h ) 的穿孔作用或人工吸破细胞膜的方式进行全细胞 记录。 1 4 a 海马双细胞膜片钳全细胞记录( d u a lp a t c h ) 本实验中同时放置两根玻璃记录电极，之间的距离在2 0 0 1 x m 6 m m 的范围内。 c a l c a i 双细胞膜片钳记录的锥体细胞为两个c a l 区锥体细胞；c a 3 c a 3 双 细胞膜片钳记录的锥体细胞为两个c a l 区锥体细胞；c a 3 c a l 双细胞膜片钳记 录是根电极记录c a 3 锥体细胞，另一根电极记录c a l 锥体细胞。判断c a l 和c a 3 锥体细胞的依据有两个：( 1 ) 细胞的位置，( 2 ) 细胞的形态。 1 4 5 药物实验 该实验中所用的药物主要是神经递质的阻断剂，均以胞外灌流的方式加入。 1 荷包牡丹碱( b i e u e u l l i n e ) ：丫氨基丁酸的a 型受体“- a m i n o b u t y r i ca c i d 简称 g a b a r e c e p t o r ) 阻断剂 2 d n q x ( 6 ，7 - d i n i t r o q u i n o x a l i n e - 2 ，3 - d i o n e ) ：小氨基羟甲基恶唑丙酸 m a m i n o - 3 - h y d r o x y - 5 - m e t h y l - 4 - i s o x a z o l e p r o p i o n i ca c i dr e c e p t o r 简称a m p a 受 体) 的阻断剂 3 z d7 2 8 8 4 一( n - e t h y l - n - p h e n y l a m i n o ) 一1 ，2 一d i m e t h y l - 6 一( m e t h y l a m i n o ) p y r i m i d i n i u mc h l o r i d e ：超极化激活阳离子通道( 1 l a 通道) 胞外阻断剂 华东师范大学硕士学位论文海马自发j 司步化活动机制及c a 3 c a l 突触联系研究 4 s c h5 0 9 11 ( ( + ) 一5 ，5 - d i m e t h y l 一2 - m o r p h o l i n e a c e t i ca c i dh y d r o c h l o r i d e ) ：丫- 氨基丁 酸的b 型受体( 简称g a b a a 受体) 阻断剂 1 5 信号采集 电极记录信号由膜片钳放大器( a x o p a t c h7 0 0 b ，a x o ni n s t r ) 以5 kh z 的采 样频率进行采集，并通过模数转换卡( d i g i d a t a1 4 4 0 ，a x o ni n s t r ) 进行转换，最 终由电脑软件( c l a m p e x1 0 2 ，a x o ni n s t r ) 以5 kh z 频率进行采集和存储。 1 6 实验数据处理 1 6 1 互相关性分析( c r o s s c o r r e l a t i o n ) c r o s s c o r r e l a t i o n 分析反映的是两个神经元自发活动之间的相关性联系。这 种分析方法可以反映随机信号m 在时刻t 的值对随机信号n 在另一时刻t + t 的 值的比较相关性。如果对两个神经元自发活动进行c r o s s c o r r e l a t i o n 分析，分析 曲线中产生一明显峰值，则说明两细胞自发活动的相关性较高，峰值越高，相关 性强。 1 6 2 自相关性分析( a u t o - c o r r e l a t i o n ) 神经元自发活动产生e p s p 是随机事件，a u t o c o r r e l a t i o n 分析反映的是随机 过程m 在时刻t 的值与该过程在时刻t + t 的值之间的相关联程度。在神经元的 自发活动中，如果该过程的a u t o c o r r e l a t i o n 分析在t 时刻出现峰值，则说明该神 经元的自发活动中存在一个与峰值时刻对应的频率反应。 2 实验结果 2 1 离体完整海马c a l ，c a 3 锥体细胞自发活动的同步化 2 1 1 离体完整海马锥体细胞层局部场电位的同步化活动 对于海马节律性振荡的早期研究主要集中在胞外场电位的记录。所以实验的 过程中，我们首先记录完整海马的局部场电位，观察海马是否存在自发性活动。 我们将两根玻璃电极置于完整海马c a l 辐射层，同时记录两个位置的局部场电 位( l f p 1 和l f p 2 ) ( f i g 1 b ) 。海马c a l 区不同位置的l f p 自发活动具有节 律性，且具有很强的同步性。对完整海马多对胞外局部场电位记录结果显示， c a l 锥体细胞层局部场电位的同步化不依赖于位置而改变，记录到的2 6 对l f p 6 华东师范大学硕士学位论文海马白发同步化活动机制及c a 3 c a i 突触联系研究 均表现出很强的同步化。 海马锥体细胞层的l f p 是局部群体细胞活动的结果，而全细胞记录更能反 应单个细胞自发活动情况。为了精确探测离体海马单个锥体细胞的活动，我们同 时记录胞外局部场电位和全细胞记录单个锥体细胞( f i g 1 b ) 。结果显示同时记 录的局部场电位和单个锥体细胞的活动具有节律性且具有明显的同步化现象。 2 1 2 全细胞记录锥体细胞的自发活动同步化 1 9 7 3 年c a j a l 发现m 以来，大量关于学习记忆的研究都集中在海马脑片 上，这与海马的经典三级突触结构联系密切相关。海马的信号输入主要来至于内 嗅皮层的i i ，i i i 层，内嗅皮层的信号通过p e r f o r a n tp a t h w a y 传给海马的颗粒细胞 ( g r a n u l ec e l l ，简称g c ) ，d g 的颗粒细胞又通过苔状纤维( m o s s yf i b e r ) 与c a 3 锥