（神经生物学专业论文）酵母双杂交筛选nogo66的结合分子及功能研究.pdf

第二军医大学博士学位论文酵母双杂交筛选n o g o 6 6 的结合分子及功能研究本研究以位于n o g o 分子r e t i c u l o n s 同源区的n o g o 6 6 为诱饵蛋白，酵母双杂交筛选成人脑c d n a 文库，获得了n e c d i n 、g a p d h 和t r a p ，s 亚基等候选结合蛋白。通过p 一半乳糖苷酶活力检测和免疫共沉淀，验证了这些蛋白与n o g o 一6 6 在酵母中确实存在结合。将n e c d 汤缺失突变后进行一半乳糖菅酶活力定量检测发现n e c d i n 蛋白中间段m a g e 同源区两侧氨基酸序列对n e c d i n 与n o g o 6 6 问的结台至关重要。缔选获得转染n 。g o - a 的h e k 2 9 3 稳定株，以此稳定转染细胞株和动物组织进行免疫共沉淀同样可以检测到n e c d i n 、g a p d h 与n o g o a 两者间的结合。脊髓背根袢经节和海马神经元进行免疫荧光染色后激光共聚焦扫描显微镜观测结果发现，n e c d i n 、g a p d h 与n o g o - a 在神经元胞浆区和突起中高度共存。以上结果表明n e c d i n 、g a p d h 与n o g o a 存在生理性结合。将n o g o a 与n e c d i n 共转染h e k 2 9 3 细胞后进行免疫荧光染色发现，n o g o a可以将n e c d i n 滞留在胞浆区从而减少其入核。细胞分化观察显示，过表达n o g o - a确显抑制n e c d i n 对p c i 2 细胞的促分化作用，提示n o g o 以与n e c d i n 闯的结合可能参与调节n e c d i n 对p c l 2 细胞的促分化作用。关键词lr e t c u l o n s ，酵母取杂交，m a g e 结构域，激光共聚焦扫描显微镜第。二军医大学博士学位论文s c r c e n i n gn e wb i n d i n g p a r t n e r so fn o g o - 6 6b yy e a s tt w o _ h y b r i ds y s t e ma x o n a lr e g e h e r a t i o nm a yb ei n h i b i t c d 埘c n sm y e i i na n dn e h 一g l i a ls c a rt h a ta r i s e sf m mt h el e s i o n e dt i s s u ed r a m a t i c a l i * a m o n gw h i c hs e v 它r a lp r o t e i n sh a v e b e e ni d e n t 洒e d鼬c o m p o e n t st h a tc a ni n h b “o u t g r o w t ho fa x o n m y e l i n - a s s o c i a t dg l y c o p r o t e i n ( m a g ) ，o l i g o d e n d r o c ”em y e l j ng l y c o - p r o t e i n( 0 m g p ) a n dn o g oa r ea l ip r o t e i sw i t hs 垃n 墒c a n tn e u r i t eo u 蟾r o w t hi n h i b “o r ya c t i 订啦s t u d y 伽ln 明r i t eo u t g r d w 曲 n h i b i t o r sm a yb et h e r a p e u t i c a l 却b e n e n c i a lf o rp a t i e n t sw i t hn e n t ei n j u r yo rs o m en e u r o d e g e n e r a t i v ed i s e a s e ss u c ha sa i z h e i m e r s8 n dp a r 埘n s o n sd i s e a s e h o w e v e bt h em e c h a n i s mr e s p o n s i b kf o rn o g o 一纽d u c e dg r 们v t hi n h i b i | i o nr e 珥a i n se l u s 慨i np r e s e n ts t u d y t h eh u m a nb r a i nc d n ai i b r a r yw a ss c r e e n e du s i n gy e a s tt w o h y b r 主ds y s t e m ，a n ds “e r a ln e wi n t r a c e 珏u l a rb i n d i n 争p a r t n e r so fn o g o - 6 6p r o t e i nh a v eb e e ni d e n t 讲e d n e c d i na n dg a p d hw e r ec o n 6 r m e dt oi n t e r a c tw “hn o g o au s i n gt h em e t h o do fi m m u 丑o p r e e i p i t a “o ni v v oa n dv “r o b o t hn e c d 血a n dg a p d ha r eh 童g h 玲c o - l o c a l i z e dw i t hn o g o ai nc e l ib o d ya n dn e h r i t e n o g o _ ar e t a i n e dn e c d i ni nc y t o p i a s m i cr e g i o o fh e k 2 9 3c e l l s - o v e r e x p r e s s i o no f n o g o - a8 t t e n t u a t e da c c e l e r a t e de f f e c ti n d u c e db yn e c d i ni np c i 2c e u s a ut o g e t h e bt h ea d u l th u m a nb r a i c d n al i b r a r yw e r es c r e e n e dw 嘞n o g o - 6 6a sb a “u s i n gy e a s t 抑o - h y b r i da n ds e v e r a ic a n d i d a t e sw e r eo b t a i n e d t h ep h y s i c a la s s o c i a i o nb e t w e e nn e c d i no rg a p d hw i t hn o 譬o - aw e r ef u r t h e rc o f i 珊e d m e a n l v h i l e ，t h ep r o t e i n p f o t e i ni n t e r a c t i o nb e t w e e nn o g o aa 矬dn e c d i nw e r ed “e c t e di ny e a s t o u rd a t ai n d i c a t e dt h a tn o g o am a yr e t a i n e c d j 丑如c y l o p l 8 s m aa n da t t e n t u a t e d8 c c e l e r 越t e dd 柏f e r e n t i a t i o ni n d u c e db yn e c d i ni np c i 2c e l i s t h ea b o v er e s u i t sh a v en o tb e e nr e p o r t e d k e yw o r d s ：r e t i c u l o n s y e a s t 似o - h y b r i d m a g e ，l a s e rc o n f o c a lm i c r o s c o p y第_ = 二霉聪大学搏士学位谚文英文缩写i 英文缩写n g f f n e 羚e g w 谯角醴。 )e n s ( c e m r a ln e r v o u ss y s t e m )p n s ( p e r i p h e f 神n e r v o u ss y s t e 鞲1 )刚s ( 戎 i e u o 毡s )r h d ( r e t i c u l o n sh o m o l o g yd o m a i n )鑫p l ( g l 箩e 。s 雾p h o s 然蛊t i 醐i 菇哙1 )m a g ( m y e l i n 啮s s o c i a t e dg l y c o p 黼t e 沮)o m g p ( o i i g o d e n d r o e y 把m y e l 沁g l v c o 芦a t e i n )a p p( 韪托琴 o 怒掣珏f s p l i o 豫浃)m l c ( m y o s i nl i g h tc h a i n )p e l 2 ( 如蹿馥鞫狳o e 孵。整a c 。珏 骚端p 1 4 p $ k ( p h o s p ha f i d y i i n o s i t o l 4 p h o s p h a t e 一5 一k i n a s e )p c i 2 ( 俄曲e o c h 姻揿o e m 嘲c e l l l )p i 玛( 如。s p h 趣d y l i n o s i t o l 4 ，5 南i s 辩。嘲曩_ 辩e r ( 钳诅o p l a s m 沁他t i c m u m )a 叠( 一 l l 嚣y i 或d ；e 辨i d e )a d ( a 1 z h e i m e r s )a 己s ( a 越y o 扫j 3 p h i 。】掇e 强js c i 渤s 转)m s ( m u l 矗p l es g l e r 。s i s )n i m p ( n o g o i n t e r a c t i l l gm i o c h o n d r i a lp r o t e i n )耐b p ( 掰弦l 亟b 囊s e 辨艳运)a d ( a c t i v a t i o nd o m a i n )b d ( b i 勰i n gd o m 茄n )辫缝生长銎子中舷卒串经系统周围糖经系统浆袋蛋爨家族r 1 n s 同源域禧蒸佬磷l 蠢酰飘醉髓鞘相关糖蛋白少突胶质细胞髓端糖蛋白淀粉棒蓠髂蛋自肌球黻白轻链壤镰缨照瘗缀窿暴磷船僦肌醇4 磷酸* 5 - 激酶p c i 2 缎跑磷藤醴腿酵4 ，5 = 磷酸激酶内威潮瑟+ 淀粉襻多靛阿尔藏海默氏病飘娄缩蠼 n u c )矗丑dn 醢d e 曼哟t 鞋砖s | 嚣赫瓤餐t h e 嘟柚薹| s 豳髀瞪巍冀tn o g o 矗掰姆抟缸遮辩霉撼泌添c y t o p i a s m i cr e g i n n s 、p e 王2 棚弧w e 雌量疆n s 粒棼t e 癌雏驹掰b i 艄髓。狂sw i 攮毒x p 磷s i o 藕sv e e 。r 珏矗n 髓娃氇a n dm y c - n o g o - a ，c e i l sw e 坤t a t e dw i t hn g f ( 5 0 n g m i ) t h e n ，t r a h s f e c t e dc e l l sw e r ei 璩m 毛重鞋舢骞组i 拜霉d ? 2 ha 量挺r 垂精鞋s e 迅嚣j 融el 蝴蓼h 程f 融r 鬈e 蛙珏锺d 话黜dd 蠡m e 沁r 醛d i f l 沁r e n t i a t e dc e u sw e r em e a s u r e da n dt h er a t i oo fn e h r i t 蟹l e n g t hw j t hc e l lb o d yd i a m e t e rw e 撑箍鼓盘秘醴s 扭撼蛙罐l 魏懿er 姻挂瓤趣d i 霉a t e d 锤鑫圣姆e 懈p 黼s 舞珏醒龄瞌嚣程霉箍t 娃襄瓣a c c e l e l a t e de f i b c ti n d u c e db yn 躲c d i ni np c i 2c e l l s 毒、辩嚣配9 3 蒯l 魏甥s 据b l ye x 争辩s 糖嫩y e 恭e 黔缓舯粉l 融| e d 曩羽酶e d 渊趋e tt h 肆n ，c e l ll y s a t e sw e r ei m m u n o p r e c i p i t a t e dw i t ha n 协g a p d hm o n o c i o n a l耳n t i b o d y 至n 拯粉e 娃。nb e 垂轷e e 珏n 。塞9 - a 盛廷dg a p 珏w 鑫sd e 妻e 。妊d a l s o ，t h 霉鞠幽塔枣珏挣鞋墨i 鞋t e 愀娃。卦w a sd e t e c f e di ht h et i s s u el y s a t e s t h ep r i l n a r 了c u l t u l e dh i p p o c a m p a ln e u r o nw e r ed o u b l e ”i i n m h n o s t 矗j 辩e d 帮i 也a n “一n 9 9 。aa b t i 缸o d y f 雩e n ) a 静d 宴赶t i g a p 挣牲鼗l l 蛀b 8 d y( r e d ) + t h bm e r g e di m a g e si n d i c a t e 曲a t ! 妯g o * a 矗n dg a p d ha r eh i g h l yc o l o c a l 娩特di n8第一二翠医大学鞯士学挝沦文摘要( 孛英文)c y t o p i a s m i ca n dn e u r i t er e g i o n s t h ea b o v er e s u l t ss u g g e 8 tt h a tg a p d hm a yi n t e r a c tw i t hn o g o 呔p h y s i e a l l y a l it o g e t h e r t h ea d u l th u m a nb r a i nc d n ai i b r a l 了w e l 屯s c r e e n e dw i t hn o g o 一6 6a sb a i tu s i 戤鬈y e a s tt 1 o h y b r i da n ds e v e r a lc a n d i d 馥t e sw e l o b t a i n e d 。t h ep h y s i c a la s s o e i a t i o nb e t w e e nn e c d i no rg a p d hw i t hn o g o aw e r ef u r t h e rc o n f i r m e d m e a w h i l e t h ep r o 托i n p l 。o t e i ni n 协r a c t i o nb e t w e e nn o g o - a 往n dn e c d i nw e r ed e t e c t e di ny e a s t ，o h rd 建t ai d i c a t e dt h a tn o g o - am a yr e t a i nn e c d i ni nc y t o p l a s m aa n da t t e n t u a t e da c c 畦e r 建t c dd i f 耗r 曾n t i a t i o ni n d u c e db yn e c d i hi np c i 2c e i 瓤t h ea b o v er e s u l t sh a v en o tb e e nr e p o r t e d 9第二军嚣夫学媾士学位沧穿i i i 前言中枢神经损伤后再生障碍给人类社会造成的损失蹙巨大的，中枢神经系统损伤修复豹相关研究也自然成为了医学科磷领域昀一大难点和热点。长期以来，认为中褪禧经系统稀经元在发霄袋熬后即丧失了爵生熊力。上个世纪秘，以牛津大学的c a ja i 等人为代表的些科学家基于对某些实验现象的观察对此提出了露疑，稔翳诀轰袋鸯成熟簿中拣褥经系绫穆经元褥生长的露露嚣壤中可憨存在蓑襻缀突再生的抑制因素( d a v i ds ，a g u a y oa 。j 。，1 9 8 1 ) 。零个实验室在随后的实验中涟实孛褪耱疑系绫鑫囊、懿鞲籁粹经损伤区狡震疤痕申存在这静静稍 篁羹，著醚娥发现了众多具有神经爽生长抑制作用的蛋白( 蝴e nm s ，2 0 0 0 ；g r a n d p r et ，2 辔0 0 ；p 委毒囊ar 。，2 9 喀印。现己发现彩种因子具有神经突生长掷制作用，神缀髓损后损伤匿周围形成的胶展癌可班挪制枣孛经突再生，在胶矮癌中发现了酗8 s c i n e 。孛褪褥经系统髓鞲也可以抑制轴襄蒋生，从中擞现的具有神缀突生长抑制作用的分予除n o g o 外还有少突菠囊缨藏熬鞘耱蛋自( 0 掘孽) 、髓鞘挺关耱蛋照 ，3 于e 培养蘸r 弦滤文库菌落质粒，经酶切憋定，定量约为2 肛g h l 。先后三次扩增文库，合并盾获撂足够质粒用于转化筛选。2 。6 。酵母缎魅转讫1 ) 酵母感受态细胞的制备( 小规模转化用)熬取 3 个2 3 疆搬囊径嚣酵霹蘩落与5 秘y p 或对应瓣营养筛选s d )培养基中；3 0 3 0 0 r p m 培养到稳定态( o d 6 0 0 1 5 ) 转接到另瓶5 0 m 1 y p d( 或对应的整券筛选s d ) 培养基中，o d 6 0 0 0 2 o 3 ；3 0 3 斟n 培养约3 k ，6 一e 4 0 6 时驭出。室溢褰心4 0 0 印m3 m i 娃，弃上清，缨藏重基予2 5 m l 无菌水中；室温离心4 0 0 0 r p m3 m i n ，弃上清；薰悬予1 5 m lp h 7 sl t e ，o 1 ml i a c 中。2 ) 酵母转亿( 小簸模)准备p e 0 l i a c 溶液l o m l ；在1 5 m 1e p p e n d o f 管中依次加入o 。1 飚质粒( 如袋共转纯，尉薅静覆耱各热入 瓣，l o 游 汹幽 鱼耩溅a ，溪匀；麓a0 戚酵母感受态蹦胞和o 6 m lp e g 忱i a c ，v o t e x 混匀；3 0 2 0 0 r p m 培养3 0 m i n ；加入7 叫d m s o ，轻轻混匀；4 2 热冲击1 5 m 协，期间不对轻轻揲匀；冰浴l 2 麓记；毒逮离心l 嚣，骥薄上潼，矮0 。2 m j 疆i 重悬缀髓；藩枣予逶姿懿营莠缺陷s d 平板上。2 7 。h 争h y b i i d 文毒转讫1 ) 诱饵质粒转化絷二军医大学博_ “学位论文采用小规模酵母感受态制备方法和小舰模酵母质粒转化方法。转化时加入诱饵质粒0 1 ”g ，转化后派布于s dh i s ，平板上。2 ) 文库艨粒转化率测试采用小规模酵母感受态制备方法和小规模酵母质粒转化方法，将已经转化了 秀镡囊越豹壬 疆8 1 9 酵母联蚕酵母感受泰爨瞧，分聚佼翅5 p g ，o 5 鹕，0 0 晕g ，o 0 0 5 肚g 文库联粒转化，统计各质粒量转化出的菌落数，估算文库转化出足够克隧数( 5 x 1 0 6 ) 时所需要的质粒量。3 】文瘁溪粒转诧挑取1 3 个2 3 m m 直径的已经转化了诱饵质粒的h 【y 8 1 9 酵母菌落于1 0 0 m ls du r a 鞭i s 一滚体培养基中；3 0 3 0 0 糟m 培养剿稳定态( 0 d 6 l 。5 ) ；转接到另一蕊l 0 0 0 m ls dt m h i s 一培养熬中，0 d 6 一o 2 o 3 ；3 0 3 0 0 r d m墙养约3 h r ，o d 6 0 0 = o 4 o 6 时取出。塞温离心4 o r p m3 m i n ，奔上清，细胞熬悬予5 0 妇n 无菌承中；黧瀑离心4 0 0 0 r p m3 越i n ，夯上涛；重悬予8 m lp h 7 。5l x j 琶，o 1 ml i a c 中；准备1 0 0 m lp e g 几i a c 溶液；在感受态细胞中依次加入文库质粒4 0 嵋，2 n l l1 0 m g m l 髓精d n a ，混匀；加入6 0 m lp e g 几i a c ，v o t e x 混匀：3 0 2 0 q 攀m 培养3 0 戚n ；熬入7 蹦d m s 0 ，轻轻混匀；4 2 热冲袁耄2 0 趣强，期闻不时轻轻摇匀；冰浴l 2 m i n ；4 o r p m3 m i n 离心，弃上清，闻2 0 m lt e 熏懋细胞；涂布于1 0 0 块1 5 c m 直径的s du r a h i s t r p 平板上，3 0 培养3 5天。4 ) 文库菌体收集当文库转化的越落大小为l 斑n 直径发右时，将平投扶蠼箱中取如，故入4冰箱中3 镰，让平板冷却变硬；每块平板加入2 3 m ll 琵丽涂布棒蒋平板上的菌落刮下来并收集到离心管里，4 0 0 0 印m 离心3 m i n ，弃上淆，合并所有籀二辈遥大学撼士警位论文 v 糖凝秘方法沉淀，加入大约与菌体等体积的保菌液，保存于一7 0 。2 。8 。翰o - 姆b 蜮d 文库筛选1 ) 转化后文库的滴度测定取出1 “1 转化后的文麾按如下比例稀释：1 o 、1 1 0 2 、1 1 0 4 、1 1 0 6 、l 1 0 8 ，劳涂布于s pu 淞珏i s 一露p 一平竣中；绞计并佶算萁漆发。2 ) s do a lu r a h i s t r p “l e u 平板上的文库筛选羧搀扩溪螽戆1 1 w 。一毋b 蠢d 文痒熬滚痰鞠磐疼联霰蘧落数，售舞遗黪霉文摩体积。按每个1 5 c m 平扳2 1 0 6 的菌落数涂于s dg a lu r a h i s t r p l e u 。平板上，3 0 烘箱中培养5 t 8 天。3 保存藏落挑取能在s dg a lu 晡h i ft 珂l e 平板上生长的菌落转接在s dur a _ h l f飘分平投上，懿体下一步分辑。钔筛选骰阳性对保存的麓落逐一进行8 一半乳糖营酶活力的测定，髓内显蓝色鹣菌落，p 一拳疑糖蕾酶滔经隽阳性；朱髓色酶为锻鬻经。2 9 酵母转化予b 半乳糖替酶活力的测滗敬一袋w h a 勰雏滤羝，覆盖子藕庭辨选择瞧s p 壤莽基上f 碳源为拳毳糖) ，用灭菌牙签从选择性培养熬平板上挑取酵母转化子菌落( 直径1 2 m m ) 点到滤纸上，3 0 培养2 天，然后小心取出浸入液氮中( 黼落面朝上) ，约3 0 s e c 后致窭，量室瀣3 5 m i 珏，将滤纸( 菌落覆羲上) 馥于窝z b u & 鼹一嚣l 溶滚( 1 0 0 翻zb u 髓r 中加入1 6 7 m l2 0g l 的x 唱a i ，o 2 7 m lp 一巯基乙醇；zb u f r e r 含6 0 m m o i l黎军医大学祷蔓“学位论文l v 材辩和方法n a 2 h p 0 4 ，4 0 m m 0 1 ，l n a h 2 p 0 4 ，1 0 m m o l 忍k c l ，1 m m 0 1 几m g s 0 4 ) 预湿的滤纸上，3 0 培养o 5 8 h ，检验菌落是否显蓝色，8 h 内显蓝色的菌落b 一半乳糖营酶活性麓鼯壤。2 1 0 酵母质粒抽提撼取单个瓣母蓥体在s pu r a h i s 骑p ”墙莠基中3 0 0 堪鞠，3 0 培养2 4 h r ；菌体离心后转移副1 5 m le p p e n d o f 管中；加入2 0 0 m i 酵母裂解液( 2 髓i t o n x 1 ，1 0 s d s ，1 0 0 m mn a c l ，1 0 m mt r i s ( p h 8 。o ) ，1 m mb d t a ) ，v o r t e x 混匀，加入，2 9 酸处理鹣婶。4 5 0 。5 5 蝴豹玻璃珠，籀o 泌黔，氯镄，异戊醇，v o 赡e x 充分振荡5 m i n ；液氮冷冻l o m i n ，在室温下受融，再次v o r t e x 振荡5 m i n ；1 2 0 0 0 m转速下室温离心1 0 m i n ，将上清转移别新的1 5 m l 离心管中，加2 0 “l3 mn 啦l l o v 0 1 ) ，5 每无承乙簿( 2 。5 v o i ) ，一7 0 渌莓6 0 m 融1 2 0 0 0 氆戮疑心i 强妇，7 0 乙醇洗涤沉淀，室温晾干，溶解予2 0 m 无菌水中，2 0 冻存。2 1 1 ，1 w o _ h y b r i d 阳性克隆朗鉴定铺备待电转亿的大晒释壤d h l 2 s 感受态细胞，取l n l 酵母餍粉麟a 籀箍液与4 0 u l 置于冰上的感受惑细胞混合，然后移入o 1 c m 电击杯进行电击。电击参数为；2 ，4k u2 0 0 q ，2 5 西。通过p c r 获撂文瘁矮入片段，p b 4 2 a d 载体上游引物为5 f _ c c a g c c 丁c n 硌c t g a g t g g a g a t g 一3 ，下游弓 物为5 。et i t o g e ga a g a a g t c c a a a g c t 3 ，反应条件2 0 u l 体系，9 4 变性1 m i n ，6 0 复性】m 弧7 2 延搀3 m 遁循环2 5 次，然后凌发应终系中期入a i u i5 u n 玩l o b u 髓f2 脚，酶切】确，3 电泳检测，酶留图谱褐黼表示插入片段相同。鉴定过的阳性克隆用p b 4 2 a d 载体上游引物进行测序，序列送到n c b ig 鞠b 8 呔数撂簿晓较。2 1 2 酵母转化子的6 半乳糖苷酶的液体测活籍= 军医丈学博士学整论文 v 毒辩和方法按照m a t c h m a k e r 文库的使用说明进行。接种单克隆转化子于5 m ls d ( 一l 。w ) 培莽液中，3 0 培养过夜后，转接到5m 】y p d 培养液中，使其超始0 d 雠为0 ，2 0 3 ，3 0 缵续培养4 ，5 小潜至0 d 6 在0 。5 妥0 + 8 之瓣。记录终止培养时确切的o d 6 0 0 值。取1 5 m l 培养物，离心收熊菌体，用zb u 髋r 洗一次，然后重悬在3 0 0 m 的z b u 鹏r 中，取l o o u l 到另一1 5 m l 离心管中，液氮冻融，然嚣在3 7 东浴中逐速漆籀。鸯霹入7 0 番zb u 自疑( 含e 。2 7 豹巯基乙醇) ，混匀后加入1 6 0 山新鲜配制的o n p g ( 4 m g m l ，溶于zb u 虢r ) 。混匀，置于3 0进行反应，待溶液变赞艏，加入4 0 0 m 的1 mn a 2 c 0 3 终止反成，记下反应时闽t 。离心敬上清测定0 d 猫。按蟊下公式诗算半嚣穗营酶的活力单位：p 一半乳糖苷酶活力单俄( u ) 一1 0 0 0 o d 4 2 0 ( t 0 5 o d 6 0 0 )2 + 1 3 。免疫焚毙法将细胞传代至2 4 孔板中，当细胞长至5 0 - 8 0 密度后，倒掉培养液，用o 0 2 m o l lp 8 s 漂洗5 m i n 3 次，4 多聚甲醛处理3 0 m i n ，o 0 2 m o 肌p b s 漂洗5 m 址3 次，o 4 曩i t o nx l 彰0 1 翔o l 忍鹣s 楚毽4 5 m i 琏，1 转s a 内，4 嚣 t o nx - 1 0 0 ，o ，0 2 m 0 1 lp b s ，3 7 3 h ，加一抗，4 冰箱中孵育2 4 4 8 h ，o 0 2 m o l lp b s漂洗5 m i n x 4 次，加交联荧光素的二抗3 7 孵育1 3 h ，o 0 2 m o l 几p b s 漂洗5 m i n4 次，予荧光显镦镜下残察。2 1 4 。b r d u 法测细胞增赡拳渡获霹数中裳琢j k 2 9 3 缨稳，含 0 嘲舞d m e m 孛重悬，调整缨麓密凄为1 1 0 5 m l ，取2 m 1 种植予3 5 m m 涂过多聚赖氨酸的魍料培养皿中( 每个培养孔内放置六张旅玻片) 。1 8 2 4 小时后，绷胞生长达到6 0 。7 0 融合，分组进行瞬时转荣。野始转墩3 6 嚣换麓鲜蚤瀣m 并麓入l o u m 终滚度兹b r d u ，3 小时屠翻撵培养液，用o 0 2 m o l lp b s 漂洗5 m i n 3 次，4 多聚甲醛处理3 0 m i n ，o 0 2 m o l 几p b s 漂洗5 m i n 3 次，2 n 的h c l 处瑷2 0 m i n ，o 0 2 m o l l p b s 漂i 先5 r n j n 3 次，籀二军医丈学媾土学位论文l v 利料秘方法加抗b r d u 单克隆抗体( 1 ：2 0 0 ) ，4 冰箱中孵育2 4 小时，o 0 2 m o l 几p b s 漂洗5 蕊n 4 次，加交联荧光的= 抗( 1 ：5 0 0 ) ，3 7 孵育1 3 小时，o 0 2 m o l l p b s漂洗5 m 蠢4 次后，荧光纛徽镜下鼹察。2 1 s h e k 2 9 3 细胞培养、转染与构建稳定株1 ) h e 9 3 绥庭培养在含1 0 胎牛血清的d m e m 培养液中，3 7 、5 c 0 2 的条件下培养。2 ) h e 嚣2 9 3 细胞稳定转染收获对数中期h e k 2 9 3 细胞，含1 0 的d m e m 中重悬，调整细胞密度为l 1 0 5 ，m 1 ，取2 m 1 种植予3 s h 曲塑料培养皿( n u n c ) 。1 天盾，蹦胞生长达到6 0 - 7 0 惑台。游2 糙蒺越及1 0 驻ll 毋o f e c t a 撙诬e 溶予2 】0 0 i l 无毅溃转m e 麓，撑将2 份d m e m 轻轻混匀，室温孵育3 0 m i n ，以利于d n a 一脂艨体混合物形成，然后加入0 8 m l 无血清d m e m 轻轻混匀。用2 m l 涎血清d m e m 冲洗细胞，麴a 魏a 。囊矮体混合耪，予5 c 岛瓣鬻赣3 7 。e 过寝。次震鸯鬟入l m l 双穆羹清的d m e m ，并在转录开始后1 8 t l r 换入含1 0 f c s 的新鲜d m e m 。髯于3 7 0 c 、5 c 0 2 孵育襁培养。转染厝4 8 1 1 r 左右，待细胞生长接近融合时弃墒养液，更换为合奏罐1 8 瓣全蘩蓁滚遴 予薅选，萝蠹选浓度谈对照试验。特对慧缝继憨完全杀张后，g 4 1 8 浓度降至2 0 0 “g m l 形成持缕筛选压力。约1 0 2 0 天后可见抗性克隆形成并增大，用吸管将单个克隆挑至培莽瓶，继续筛选扩增。单克隆长满瓶，戳l ：1 0 簧 弋备震。2 1 6 p c l 2 细胞培养、转染与分化观察1 ) p c 2 缨戆培葬在含5 胎牛血清、5 玛血清的d m e m 培养液中，3 7 、5 c 晚的条件下堑二军垂大学博士学位论文培养。2 ) 瞬时转染方法转染方法同上( 不加入g 阵1 8 筛选) ，开始转录4 8 1 1 r 后换新鲜无血清d m e m ，使细胞处于饥饿状态5 h r ，然后加入相腹细胞因子刺激1 0 一2 0 m i n ，冰上裂解并收簇绥照裂熬貔。3 ) p c i 2 细胞分化观察纫照分化的评爨标撼怒，缨胞上商个以上的突起，萁长度大于细胞直径酌两倍。2 17 e 1 8 的s d 大鼠海玛神经元的威代培养无菌分鬻拦1 8s d 大鬣瓣艟，弃除软瓣膜，获磊蠢麓努繇开大麟皮层暴露海码组织，用眼科弯镊剥离海码，置于3 0 0 l4 0 c 解剖液：用显微剪翦碎，加入与解割液等量o 。2 5 的胰酶( s i g m a 公司) ，3 7 消化3 0 分钟，用吸臀将组织悬波转移至离心管，热入1 0 游精牛盘清d 酣e m5 m l 嗣火焰翻党的玻璃啜管轻轻欧打1 5 次，静鬣5 分钟，1 0 0 0 m 离心5 分钟，弃上清，加入1 0 的胎牛血清d m e m5 m l ，用火焰刨光蜘玻璃吸管吹打分散成单绷胞悬液，室濑下静胃5 分镑，取中层缀懑悬滚，藤入葺孛檀液都食( 2o 骆牛赢清5 0 u ，m l 毒霉素、5 0 u gm l 链霉素的d m e m ) ，计数1 1 0 5 接种于2 5u g m i 多聚赖氨酸( s i g m a 产晶) 包被的盏玻片上。二飘化碳培养箱内培养。4 小肘后换液，换为无血清培养罄，酃含l o b 2 7 的u r o b a s l 。殴蜃舔3 天换液1 次。培养7 天的享牵经元供转染用。2 。1 8 w e s t e r nb i o t 和免疫欺沉淀篱二军垂大学媾七举位论文 v 材越积方法1 ) 酵母细胞抽提物的制备酵母在s g 越u f i h 湾碲培募纂串手粥墙羚至a 5 为o g 1 o 。1 烈培养物离心牧祭，】0m i 无菌永洗一次。良下步骤鹚在4 道行。游母细腹重懋于lm 1 酵母娜胞裂解液( 2 0 0m mt r i s m h c lp h8 o ，4 0 0m m ( n h 4 ) 2 s 0 4 ，l om mm 薛1 2 ，lm m 嚣d t a ，l o g l y e e f o l ，7m mm e r c a p t o e 也a n o l ，2m mb e n z a n l i 应n e ，l m m p m s f ：2g 抽lp e p s t a t n a ，2g 詹n l l e u p e p t i n ，4g ，r n la 玎t i p a i n ) ，力日入1 6 9酸洗玻璃珠( 4 2 5 6 0 0m ，s 培m a ) 。程振荡器( v o r t e x - g e n i e 2 ) 上振1 0 1 5 次，每次3 9s ，蛹臻冰浴3 0s 。裂髌液1 4 ，0 0 0 f p m 离心1 5 m 抽，上清搭壤心1 5 越n 。2 ) h e k 2 9 3 细胞裂解物的制备弃去细胞焙养液，用p b s 洗两次。拔6 0 m m 培养皿o 5 m 1 ，1 0 0 n 蛳培养皿l 琏兹嚣量将镄蘧裂薅滚( 2 m m 戳s 一 c l 蹬s 0 ，1 5 0 程蹦穗e l ，5 9 m mn 娥o 0 2 n a n 3 ，0 5 去氧胆酸钠，1 n p 4 0 ，1 t r i t o nx 一10 0 ，2m me d t a ，2 5 m m 焦磷酸钠，7m mm e r c a p t o e i h a n o l ，2m mb e n z 锄i d i n e ，1m mp m sf ，2m l辫s t 馥迭a ，2彩m 嘲e 簿魏，咖 粼固斑) 均匀覆盖在缀惫袭嚣，在豫上放置2 0 m i n ；然后刮下细胞，收集到1 ，5 m l 离心管中，4 1 4 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，上清即为细胞裂解物。按辩簧分装成小份，保存于一7 0 。3 ) 免疫荚沉淀帮w e s t e mb l o t 检溅取2 0 0 肛l 酵母细胞裂解物或5 0 0 p i 细胞裂解物，加i p 抗体( 4g 每反应) 在4 振荡! 3h 。1 2 g 0 0 搿凑心2 强魏，在上涛中觳入3 0 氆臻蘩鼹袋瓣滚平鬻鹃5 0 p r o t e i n g - a g a r o s e ( r d c h e m o l e c u l a r b i o c h e m i c a l s ) 悬液，4 掇荡1 - 3h 。兔疫沉淀物用i pb u 圩e r ( 2 0m mt r i s h c lp h7 5 ，2m me g t a ，1 5 0m mn a c l ，1 瓣p 4 0 ，l m 醚狰彳 ) 洗三次。然蜃重悬在2 蛋鑫囊毫泳+ 艺襻缓净滚中，避行1 0 的s d s p a g e 电泳。湿法将蛋白条带转移到硝酸纤嫩豢膜上，用台5 脱脂奶粉的t b s t ( 1 0m mn i s ，h c l ( p h7 5 ) ，1 5 0m mn a e l ，o 1 t 、v e e n 一2 0 ) 溶液2 s簿二军医丈学撼士学槛论文l v 捌秘和方法封闭膜2 3 t l r ，一抗4 缩台过夜，用t b s t 室温沈膜四次，每次1 5 m i n 。用二抗于室温结合2 3 h f ，再用t b s t 洗滕四次，每次1 5 m i n 。用吸水纸吸尽多余的渡俸，魇s u p 髓s i 嚣蠢要c 己试赛显色。4 ) 动物组织中的免疫共沉淀和w e s t e mb 1 0 t 检测l 、动物缀织的专l 备选取体重约1 8 涎的雄性、雌性和产后2 h 戳s t a r 大甄，快速断头取下子宫和脑，麓于冰上匀浆3 0 次，4 1 2 o i p m 离心1 5 m i n ，将上清转移到另干净e p p e n d o r f 管，加入等体积的2 s d s p a g el o a d i n gb u 鼢( 含4 s d s ，根据需要含藏不含d t t ) ，1 0 0 掘热5 m 纽，待冷帮后进行蛋囟定量。2 、免痰印迹取1 5 l 样品进行1 0 s d s p a g e 电泳。2 1 9 。生鐾傣憨学方法d n a 序列翻译，酶切位点分析，d n a 序列的拼按利用d n a s t a rs u i t 和g c c软件完成。心源比较查询，保守结构域鞭测分别通过n c b i ( n a t i o n a lc e n t e rf o r转i 啦e c h 脯l o g yl n f o 玎n a t i o 娃)静毽 缀s e a 羚氛i n 誊丽络臌务完藏( h t t p ：w w n c b i n l m n i h g o v ，b l a s t ) 。多序列同源比较通过d n a s t a rm e g a a l i g n软件完成。2 2 0 统计学处理所有资料用平均值标凇误表示，用a n o v a 检验组脚的差异，两嚣之间的比较用s t u d e n t n e w m a f l - k e u l s 检验，以p ( o 0 5 为显鬻性标志。藜二军医大学博士学位论文v 结鬟、酵母双杂交筛选文瘁1 n o g o l 6 6 诱饵蛋白克隆的构建v 结果为了研究n o g o - 6 6 的细胞内相互作用伴侣，我们将n o g o 基因r h d ( r e t i c u l o nh o m o l o g yd o m 8 i n ) 区域内的n o g o 一6 6 编码区即人源n o g o a 的第1 0 2 4 1 0 9 0 位氮萋酸( f 嘻1 ) ，经e e o r l 鄯b a m h i 限镧往酶切后壳隧翻p g i l d 8 载体多克位点的e c o 胜和b a m h i 位点中，得到p g i l d a n o g o 一6 6 重组予( f i g 2 ) 。程该质粒中g 。6 6 与l e x a 宥荚固羚阕读框，哥淡表这b d k o g 。一筠鼓台鬃鑫。p g i l 鑫矮粒含有l e u c j n e 报告基因，可以弥补宿主酵母h l y 8 1 9 的l e u c i n e 营养缺陷，可溺终共转魏对熬营莽舞选。翻粼矬战袁i 捧瓣i 辩v 辩8 案譬b 嚣鹣臻e 豫i t l s 一# 掣砖轴一i l 一羚张$ 一l 酶l 黯l 妪d 王酾s 撩f i g 1s c h e m a t i cr e p r e s e n t 趣t i o no fn o g og e n e s a ，t h ec o m m o nc t e m l i n u se n c o d e s啪。f e t i c u l o n h o m o l o g yd o m a i n ( r h d ) ，w b e r e a st h en - t e r 糊i n a la r es p e c 姬cf o re a c hp a r 蠢o g u e8 n dh 8 v en oo b v i o h ss e q u e n c eh o n l o l o g i e st oo t h e fp r o t e i n 8 ，t h e6 6 一掰n i 硅03 0塑三垩垦查堂堡主兰垡堡苎! ! ! 墨a c i di u m e n a l e x t r a c e l l u l a rl o o pr e g i o nb e t w e e nt h et w op u t a t i v et r a n s m e m b r a n e ( 1 m )d o m a i n s ( c a l l e dn o g o 一6 6 ) a n ds t r e t c h e sw i t h i nt h en o g o a s p e c m cn 。t e m i n a ir e g i o nh a v eb e e nf o u n dt oi n h i b i tn e 删t eo u t g r o 州h b ，a m i n o - a c i ds e q u e n c ec o r r e s p o n d i n gt ot h ee m i r ep r e d i c t e dn o g o - 6 6l o o pf o rt h ep r o t e i n so f n o g oa n di t sf a m i l ym e m b e r s f i g 2c o n s t r u c t i o no fp g i l d a n o g o 6 6p l a s m i d a ，t h ec d n ae n c o d i n gn o g o 一6 6w a ss u b c l o n e di n t op g i l d ai n f r 锄ea