（生理学专业论文）性腺激素和促性腺激素释放激素受体在绵羊垂体发育过程中的表达.pdf

中国农业大学博士学位论文 摘要 摘要 促性腺激素释放激素( g n r h ) ，是一种神经、免疫、内分泌三大调节系统互相联系的重要的 信息分子下丘脑g n r h 和性腺激素能够通过它们在垂体上的受体( 即雄激素受体( a r ) 、雌激素 受体( e r s ) 和g n r h r ) 调节垂体激素的周期性释放和垂体的发育在绵羊胚胎发育期和性成 熟前，a r 、g n r h r 的在垂体的表达变化还未见报道。我们前期工作己证明了e r a 在胎羊垂体 发育中表达变化规律本论文以胎羊和羔羊垂体为材料用原位杂交、免疫组化、r t - p c r 等方法 来研究a r 、e r a 、g n r h - r 在垂体发育中表达变化及其相互关系取得了以下几个方面研究结 果。 1 用免疫组化方法首次研究了妊娠6 0 d ，9 0 d ，1 2 0 d 的胎羊和羔羊( 新生，2 0 月龄) 垂体 中a r 表达情况结果表明：a r 免疫阳性反应( a r - i 0 定位在细胞核，1 3 5 1 - - 1 7 0 5 胎羊垂体 细胞表达a r - i r ，a r - i r 无明显性别差异。在雄性羔羊垂体中，a r 表达呈现出明显的变化，3 月 龄时阳性比例最高( 1 9 8 6 - 1 - 1 0 3 ) ，到6 月龄显著降低至最低水平，8 1 8 + 1 1 7 ( p 如0 5 ) a r - i r 主要在促性腺激素细胞和促乳素细胞。l h 和a r 双染细胞占a r - i r 细胞的比例，由妊娠6 0 d 时 到新生明显升高( p o 0 5 ) 。这些结果表明a r 对于胎羊的腺垂体促性腺激素细胞和促乳素细胞的 功能有重要作用。 2 首次研究了胎羊和新生羔羊垂体中a r 与e r a 的共表达情况。结果表明：a r - h 和e r a - j r 主要在促性腺细胞核内表达。双染细胞比例随妊娠日龄明显升高妒 0 0 5 ) 这些结果表明a r 和e r a 与胎羊腺垂体促性腺细胞功能有密切关系 3 用免疫组化方法首次研究了2 7 月龄羔羊垂体中e r a 的表达情况在扣7 月龄，有8 7 9 - - 0 0 2 0 一1 1 8 0 0 0 4 的垂体细胞表达e r a ，在6 月龄时表达水平最低。垂体中a r 和e r a 在 性成熟期表达最少，这一规律变化可能有助于垂体对性腺功能的调控。 4 用原位杂交和r t - p c r 方法研究y 4 , 尾寒羊垂体中g n r h - rm r n a 的表达变化结果表 明：g n r h - r 在垂体中呈团索状散在分布在整个垂体。g n r h r 主要在生长激素细胞，促性腺激 素细胞和促乳素细胞表达。从妊娠6 0 d ，胎羊垂体中已有g n r h - r m r n a 的表达，随妊娠日龄增 加，表达量显著升高，到妊娠1 2 0 d 时有一高峰。垂体中g n r h 受体m r n a 和性腺激素受体的 共表达研究结果表明：g n r h rm r n a 的原位杂交显色的阳性部位在胞质，a r 和e r a 的免疫组 化阳性部位在胞核。g n r h r 和a r 、e r a 存在一定比例的双染。这提示性腺激素和g n r h 在垂 体中存在一定的相互作用。 关键词：促性腺激素释放激素受体，雄激素受体，雌激素受体，绵羊，垂体 中国农业大学博十学位论文摘要 a b s t r a c t g o n a d o t r o p i nr e l e a s i n gh o r m o n e ( c n r h ) ，at e n - p e p t i d ei n f o r m a t i o nm o l e c u l et h a tl i e s i n i m m u n e - n e u r o - e n d o c r i n en e t w o r k ，m a yh a v ear o l ea sam o d u l a t o ro f t h ea c t i v i t yo f d i v e r s es y s t e m si n t h eb r a i na n dm a n yp e d p h e r a lo r g a n sb ys p e c i f i cr e c e p t o r s h y p o t h a l a m i cg n r ha n ds e xh o r m o n e s r e g u l a t et h er e l e a s ea n ds y n t h e s i so ft h eg o n a d o t r o p i n sf r o mt h ep i t u i t a r yg l a n da n dd e v e l o p m e n to f p i t u i t a r yb yt h e i rr e c e p t o r ( g n r h 一& a i le r s ) t od a t e u os t u d i e sh a v ed o c u m e n t e dl o c a l i z a t i o no f g n r h ra n da ri nf e t a ls h e e pp i t u i t a r ya n dc e l lt y p e se x p r e s s i n gt h e m i ti sn o ty e tc l e a rw h e t h e re r a n da rw e r ec o - e x p r e s s e di nt h es h e e pf e t u sp i t u i t a r ya n dh o wa b o u tt h ep a n e mo fa re x p r e s s i o n d u r i n gd e v e l o p m e n t t h e r e f o r e ，t h ea i m so ft h es t u d yw e r et oe l u c i d a t et h eo n t o g e n yo fa e r a , g n r h - ra n dc e l lt y p e se x p r e s s i n gt h e mi nt h ea n t e r i o rp i t u i t a r yo fs h e e pf e t u sa n dl a m b s t h er e s u l t s a r ea sf o l l o w ： w ef i r s t l yi n v e s t i g a t e dt h eo n t o g e n yo f a ri nt h ea n t e r i o rp i t u i t a r yo f s h e e pf e t u sd u r i n gd a y6 0 ，9 0 ， 1 2 0o f g e s t a t i o n ，n e o n a t e ，a n dm a l el a m b sa g e da l2 7m o n t h su s i n gi m m u n o h i s t o c h e m i s t r y t h er e s u l t s s h o w e dt h a ta ri m m u n o r e a c t i v i t y ( a r - i 0w a sn u c l e a r ；, 1 3 5 1 t 0 1 7 0 5 a r - i rw a sd e t e c t e di n a n t e r i o rp i t u i t a r yo fs h e e pf e t u s ，t h e r ew e r en os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e si nt h en u m b e ro fa r i rb e t w e e n t w og e n d e r sa tf e t a la n dn e o n a t a ls h e e p a t2 ，7m o n t h so l d , t h e r ew e r es i g n i f i c a n tc h a n g e si nt h e p e r c e n t a g eo fa r - i rc e l l si nm a l el a m b s , i tw a sh i g h e s i 越3m o n t ho l d ( 1 9 8 6 4 - 1 0 3 ) a n dt h e n s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e dt o8 1 8 1 1 7 a t6m o n t ho l d ( j p o 0 5 ) t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a te r ai si m p o r t a n ti nr e g u l a t i o no fs e c r e t a r y f u n c t i o no f a n t e r i o rp i t u i t a r yi ns h e e pl a m b t h ee x p r e s s i o n so fg n r h - rm r n ai nt h ea n t e r i o rp i t u i t a r yo fs h e e pw e r ei n v e s t i g a t e du s i n gi n s i t uh y b r i d i z a t i o na n dr t - p c r t h er e s u l t ss h o w e dt h a tg n r h - rm r n aw a sl o c a t e di ns o m a t o t r o p e s ， n 中国农业大学博士学位论文 摘要 g o n a d o t r o p e sa n dl a c t o t r o p c s r t - p c rd e t e c t i o nr e s u l t sr e v e a l e dt h a tt h ee x p r e s s i o n so fm r n af o r g n r h - rs i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e df r o md a y6 0t op o s t n a t a l 1 1 1 er e s u l t so ft h ec o - l o c a l i z a t i o no fa ro r e r aa n dg n r h rm r n as h o w e dt h a ta r - i ra n de r a - i rw e r ei nn u c l e ia sb r o w n , p o s i t i v er e a c t i v i t yi n i s hf o rg n r h rm r n aw a sc y t o p l a s ma sb l u e c o - l o c a l i z a t i o no fa ra n dg n r h ro re r 口a n d g n r h rw a sd e t e c t e di na n t e r i o rp i t u i t a r yc e l l s t h e s er e s u l l ss u g g e s tt h a ta i 乙e r aa n dg n r h - r i n t e r r e l a t e i nr e g u l a t i o n o f f u n c t i o n o f a n t e r i o r p i t u i t a r y i ns h e e p k e yw o r d s ：g o n a d o t r o p i nr e l e a s i n gh o r m o n er e c e p t o r , a r ；e r a , s h e e p ，p i t u i t a r y i l i 中国农业大学博十学位文中缩写词中英文对照 a p e s a r e r d g a ，【- b g a r b s p s p f i t c g a r - i g g - t r i t c b c i p n b t d a b e d l _ a l b d d b d a c t h a r e f s h g n r h l h m a p k p c n a p r l t e r p t s h d e p c s s c 文中缩写词中英文对照 3 - a m i n o p r o p y i - t r i e t h o x y s i l a n e a n d r o g e nr e c e p t o r e s t r o g e nr e c e p t o ra l p h a g o a ta n t i _ m o n g ei g g1 a b e l e dw i t hb i o t i n g o a ta n t i - r a b b i ti g gl a b e l e dw i t hb i o t i n s t r e p t a v i d i n i a b e l e dw i t hh o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e f l u o r e s c e i n i s o t h i o c y a n a t e c o n j u g a t e d s t r e p t a v i d i n r h o d a m i n ec o n j u g a t e dg o a ta n t i - r a b b i tl g g 5 - b r o l n o _ 4 - c h l o r o _ 3 _ i i l d “y lp h o s p h a t e 4 _ - n i t r ob l u et e t r a z o l i u mc h l o r i d e 3 3 l _ d i a m i n o b e n z i d i n e e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a e c e t i ca c i d l i g a n db i n d i n gd o m a i n d n ab i n d i n gd o m a i n a d r e n o c o r t i c o t r o p i n a n d r o g e nr e s p o n s i v ee l e m e n t f o l l i c l e s t i m u l a t i n gh o r m o n e g o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n gh o r m o n e l u t e i n i z i n gh o r m o n e m i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e p r o l i f e r a t i n gc e l ln u c l e a ra n t i g e n p r o l a c t i n t r u n c a t e de s t r o g e nr e c e p t o rp r o d u c t t h y r o i d - s t i m u l a t i n gh o r m o n e d i e t h y l p r o c a r b o n a t e s t a n d a r ds a l i n ec i t r a t e 氨基丙基一三乙氧基硅烷 雄激素受体 雌激素受体口 生物素标记的羊抗鼠i g g 生物素标记的羊抗兔1 9 1 3 链霉亲和素标记的辣根过 氧化物酶 异硫氢酸荧光素标记的链 霉亲和素 罗丹名标记羊抗兔i g g 5 - 溴一一氯一l 吲哚磷酸盐 氯化硝基四氨唑蓝 二氨基联苯胺 乙二胺四乙酸 配体结合域 d n a 结合域 促肾上腺皮质激素 雄激素反应元件 卵泡刺激素 促性腺激素释放激素 黄体生成素 丝裂原活化蛋白激酶 增殖细胞核抗原 催乳素 断裂的雌激素受体产物 促甲状腺素 焦碳酸二乙脂 柠檬酸盐 独创性声明 本人声明所提交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包会为获得中国农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：季锈 时间： 碲珀，f 1 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名： 时间：姊卵，厂r ， 时间：加7 年月t 同 肜子， 髫协 孽渺 中国农业大学博十学位论文综述垂体概述及绵羊胎儿下丘腩垂体件腺轴 1 文献综述 1 1 垂体概述及绵羊胎儿下丘脑一垂体一性腺轴 1 1 1 垂体概述 垂体是一个卵圆形腺体，位于大脑底部的蝶骨窝内，经垂体柄与下丘脑腹面相连。垂体由两 部分组成，腺体部分称为腺垂体，神经部分称神经垂体根据垂体的形态，功能以及发育模式， 将哺乳动物的腺垂体分为远侧部、中间部和结节部三部分腺垂体来源于口外胚层，包括多种特 异性腺激素分泌细胞；神经垂体，来自于神经外胚层，包括神经部( 漏斗突) 、漏斗柄和正中隆起 因此，垂体是口腔顶部的外胚层和神经外胚层的密切结合而形成的 腺垂体的远侧部由细胞簇或细胞索组成，这些细胞簇与窦状毛细血管网密切联系。中间部与 神经垂体紧密联系，而垂体缝隙使中间部与远侧部分离腺垂体远侧部和中间部主要由六种特异 性腺激素分泌细胞组成：生长激素( g h ) 细胞、促甲状腺激素( t s h ) 细胞、促肾上腺皮质激素 ( a c t h ) 细胞、促黑激素( m s h ) 细胞、促性腺激素( 包括卵泡刺激素( f s h ) 和黄体生成素 ( l h ) ) 细胞和催乳素( p r l ) 细胞。各种垂体激素分泌细胞的形态和在垂体内的分布有明显的 差异。g h 细胞和p r l 细胞是嗜酸性细胞，细胞小而圆，大多数分布在远侧部的后外侧部分。p r l 细胞是高度变化的嗜酸性细胞，它们分散分布或楔入细胞索的细胞之间。a c t h 细胞、t s h 细胞 和促性腺激素细胞是嗜碱性细胞。a c t h 细胞分散分布在整个远侧部，根据物种的不同，细胞呈 球形、卵形或星形。t s h 细胞是体积较大、形状不规则的嗜碱性细胞，主要分布在远侧部的前内 侧区域。促性腺激素细胞是小的嗜碱性细胞，主要分布在远侧部后外侧区域，根据物种的不同， 细胞呈球形、卵形或星形这些细胞所分泌的激素在对机体的生长、发育、生殖、维持内环境的 稳定和适应内外环境变化等方面起着非常重要的作用( 谢启文，1 9 9 9 ) 。 垂体中间叶由密集的细胞形成板层，贴着神经垂体，与腺垂体有一隙之隔。中间叶的腺细胞 包括促黑素细胞激素细胞( m s h ) 和a c t h 细胞，以前者为主。此外中间叶还有大量的滤泡星 型细胞和较多的神经纤维。小鼠和大鼠的中间叶发达，人的不发达。 腺垂体的结节部是一个高度血管化的结构，类似套袖样包绕着垂体柄( m o r g a na n dw i l l i a m s , 1 9 9 6 ) 。结节部的头部背侧，与正中隆起的外层相邻，其尾部腹侧是凸起的远侧部。成年绵羊垂体 的结节部进入远侧部，形成带状结节部( s k i n n e ra n dr o b i n s o n , 1 9 9 5 ) 。资料显示，结节部可能是大 鼠垂体首先分化的位置，因为在胚胎发育早期，结节部似乎是五种垂体分泌细胞的i 艋时停留场所 ( n e m e s k e r ie ia 1 ，1 9 8 8 ) 。结节部由三种类型的细胞组成。第一种是。结节部特异性”细胞，集中 在腺体的头部背侧区域。这种细胞有发达的粗面内质网和高尔基体，可能具有分泌肽或蛋白类物 质的功能。第二种是远侧部样细胞，包括促性腺激素细胞和促甲状腺激素细胞，存在于与远侧部 相邻的腹侧区。第三种是滤泡细胞，细胞比较小，与远侧部的滤泡星形细胞相似，分布在整个腺 垂体内( b o c k e r se ta 1 ，1 9 9 6 ：m o r g a na n dw i l l i a m s ，1 9 9 6 ) ，无内分泌细胞的分泌功能。近年的研 中固农业大学博十学位论文综述垂体概述及绵羊胎儿下斤腑垂体件腺轴 究表明，乖体的结节部细胞上存在有褪黑激素的受体( m o r g a ne ta 1 ，1 9 9 4 ；m o r g a na n dw i l l i a m s 1 9 9 6 ) ，结常部在褪黑激素对催乳素分泌的光周期效应中发挥着内分泌媒介的功能( m o r g a na n d w i l l i a m s ，1 9 9 6 ) 。 1 1 2 绵羊胚胎下丘脑一垂体一性腺轴 在绵羊胚胎发育过程中，下丘脑一垂体一性腺轴是非常活跃的，到妊娠中期达到高峰，然后 出现一个抑制期一直持续到性成熟( b r o o k se ta 1 ，1 9 9 6 ) 。大鼠、小鼠胚胎下丘脑垂体性腺轴发 育较迟，到出生后和l o d 才起作用( f o w d e n ，1 9 9 3 ； r i c h a r d s ，1 9 9 3 ) 。k a p l a na n dg r u m b a c h 早 在1 9 7 6 年发现在胚胎发育中期去掉胚胎大脑导致胚胎性腺的严重发育不全。烧蚀胚胎垂体破坏 其功能，胚胎睾丸发育阻滞。g l u c k m a n 等( g l u c k m a ne ta 1 。1 9 8 3 ) 研究发现绵羊胚胎发育中期l h 和f s h 分泌的高峰值与促性腺激素细胞对外源性的g n r i - i 的反应性增加有关，而后期分泌水平 下降反应与促性腺激素类固醇激素负反馈环的成熟有关。 1 1 2 1g n r h 神经元发生 g n r h 神经元起源于嗅板，在胚胎发育早期沿着终神经嗅扳基部复合体( n e r v u s t e r m i n a l i s v e r m o n a s a lc o m p l e x ) 的通路向前脑目的地迁移( s e h w a n z e l f u l u l ae ta 1 ，1 9 9 2 ) 。绵羊胎 儿的嗅扳在妊娠2 2 2 6 d 发育，到3 5 d 才能检测到g n r h 神经元( c a l d a n ie ta 1 。1 9 9 5 ) ，此后，渐 进侵入脑内向视前区迁移。到5 0 d ，个别的g n r h 神经元末梢出现在正中隆起外层的背侧区，到 6 5 d ，在这一区域的许多部位都能观察到g n r h 神经元末梢。此后到9 7 d 期间，从正中隆起持续 延伸到垂体柄。到8 5 d ，g n r h 神经元表现出成年时期的形态特征m a t w u i w 等( 1 9 8 9 ) 用硅树 脂橡胶复合物灌注妊娠4 8 - 6 7 d 的胎羊血管来研究下丘脑一垂体门脉系统的发生，结果发现在垂 体、正中隆起、垂体柄之间有发育良好的广泛的毛细血管联系，他们在一个4 5 d 的未灌注的胎儿 中发现门脉微循环已经渗透到正中隆起。这些发现表明早在4 5 d 的绵羊胎儿，下丘脑的释放因子 就可以通过门脉系统直接转运到垂体。妊娠6 0 d 的胎儿下丘脑中可以通过免疫组化检测到g n r h ( g l u c k m a n ，1 9 8 1 ) 。t h o m a 等( t h o m ae ta 1 ，1 9 9 4 ) 研究发现：绵羊胚胎发育7 0 d 时皮下埋植g n r h 的类似物巴塞诺林( b u s e r e l i n ) ，从埋植即日到出生，胚胎l h 浓度的增加受到阻滞，伴随的是乖 体l h 和f s h 含量的减少。免疫组化方法揭示胚胎发育7 0 d 时皮下埋植g n r h 的类似物巴塞诺 林的羊羔出生时垂体缺乏l h 和f s h 阳性细胞；出生的雄性羊羔睾丸重量比对照减少4 0 ：每个 睾丸的支持细胞数量减少4 5 ：出生的雌性羊羔卵巢重量没有减少，形态也未改变，对母体的类 固醇激素的分泌无影响。结果说明在绵羊胚胎发育7 0 d 时g n r h 就可对促性腺激素细胞起调控 作用。 1 1 2 2 腺垂体促性腺激素的发生 腺垂体促性腺激素细胞所分泌的两种促性腺激素f s h 和l h 都是由a ，b 两条链构成的糖蛋 白激素，其中。链相同。1 3 链决定其生物学特异性。在妊娠7 0 d 的绵羊胚胎中可检测到含l h ， 2 中国农业大学博士学位论文综述垂体概述及绵羊胎儿下丘脯- 垂i t - 性腺轴 f s h 的。亚单位的细胞占整个腺垂体细胞的o 6 在1 3 0 d 时达到最高值。f s h - 1 3 在1 0 0 d 的胚胎 中方可检测到( t o m a se ta 1 。1 9 9 3 ) 相反。在妊娠5 0 d ，垂体中l h 细胞就能检测到，而l h - f s h 细胞则在8 9 d 后才能观测到。在9 9 - 1 2 0 d ，l h 细胞的比例在两性胎儿都是增加的，到妊娠结束时 一直保持较高，出生后没有变化( m e s s a o u d - t o u m ie t a l 。1 9 9 3 ) 在妊娠6 0 d ，l h b 免疫阳性细胞 仅在腺垂体的少数区域有表达。到1 0 0 d 时，在整个腺垂体可见均匀表达( s h e n ge ta 1 1 9 9 8 ) 在妊娠8 1 d ，可以检测到l h 的脉冲式分泌，在1 3 0 d 后。脉冲频率就降低了( m e s i a n oe ta 1 。1 9 9 1 ) 。 腺垂体促性腺激素的分泌于胚胎发育中期达到峰值，胚胎后期逐渐下降，并持续到出生期 ( p o m e r a n t za n dn a l b a n d o v , 1 9 7 5 ) 雌性血浆中促性腺激素分泌水平在整个妊娠期高于相同发育 时期的雄性，尤其在发育1 1 0 d 时，差异最大。 1 1 2 3 性腺的发生 绵羊胎儿生殖嵴和中肾在妊娠2 0 d 就能鉴定出来( m a u l e o n , 1 9 7 8 ；m c n a t t ye ta 1 。1 9 9 5 ) 。到 2 3 d 干细胞出现在生殖嵴中，到3 0 d 性腺的性别分化完成到4 0 d ，睾丸具有特有的生精柬，此时， 雄激素受体在裂隙和要发育成附睾的细胞中首次被检测到。绵羊胚胎睾酮分泌开始于妊娠3 0 d 的 雄性胚胎睾丸中，在7 0 9 0 d 增加到最高( 雄性高于雌性) 性腺对下丘脑一垂体的反馈调节存在 性别差异。在1 1 5 d 性腺切除导致雄性l h 水平升高而雌性没有( m e s i a n oe ta 1 ，1 9 9 1 ) ，这表明在妊 娠中期，睾丸对促性腺激素的分泌有负调节，而卵巢没有，提示存在性别差异。 中国农业大学博+ 学位论文综述促件腺激素释放激素受体研究进展 1 2 促性腺激素释放激素受体研究进展 促性腺激素释放激素( g o n a d o t r o p i nr e l e a s i n gh o r m o n e 。g n r h ) 是一种1 0 肽，1 9 7 1 年s h a l l y ( s h a l l y ，1 9 7 1 ) 和g u i l l e n m i n ( g u i l l e n m i n 1 9 7 1 ) 从猪下丘脑首先分离了g n r h 并由此获得诺贝 尔奖。至今，人们从各种脊椎动物和原索动物中已鉴别出2 3 种g n r h 的分子结构( m i l l a re ta 1 ， 2 0 0 4 ；m o r g a na n dm i l l a r , 2 0 0 4 ) 。人们已发现g n r h 广布于神经、内分泌、生殖、消化、免疫( 金 晓航和黄威权，2 0 0 0 ) 系统中。g n r h 是神经、免疫、内分泌三大调节系统互相联系的重要信号 分子( i n f o r m a t i o nm o l e c u l e ) 。脑内g n r h 主要通过下丘脑垂体性腺轴 ( h y p o t h a l a m u s p i t u i t a r y - g o n a d ma x i s ，h p g ) 调控生殖内分泌功能。g n r h 的功能是通过g n r h 受体 来介导的。近年来，g n r h 的类似物、激活物及拮抗物的发现，促进了g n r h 的生理功能研究。g n r h 受体( g n r hr e c e p t o r , g n r h r ) 的研究也日渐受到重视。本文就g n r h r 的分类、分子结构和 功能、表达及分布、基因的表达调控等方面进行概述。 1 2 1g n r h - r 的分类、分子结构和功能特点 目前，哺乳动物有g n l 姓- tir 和r 两种。g n r h r 有7 个跨膜区。具有g 蛋白偶联受体的特点。 g 蛋白耦联受体，是受体中非常重要的一类，以与1 3 肾上腺素受体、毒草碱型乙酰胆碱受体和视网 膜视紫红质受体都属于此类。对这些受体的分子结构研究发现，它们在跨膜区域的结构及信号转 导机理方面有着惊人的相似之处：一个单肽链，形成7 个a 螺旋的跨膜结构，每个疏水跨膜区段由 2 0 - 2 5 个氨基酸组成，但各区段之间由数目不等的氨基酸组成的环状结构连接，其中1 - 2 ，3 - 4 ，5 - 6 环在胞内侧，2 - 3 ，4 - 5 ，6 - 7 环在细胞外侧。n 端由3 0 5 0 个氨基酸组成，位于细胞外侧，c 端氨基 酸残基相差很大。位于胞内侧并且已知比较大的5 - 6 细胞内环与c 端都具有亲水性，它们是与g 蛋白相互作用的区域。小分子配体是结合在受体跨膜部的疏水区域，多肽配体结合区既与跨膜部 分有关也与细胞外亲水环有关。持续刺激g 蛋白耦联受体会引起受体脱敏，这一现象是受磷酸化 作用调控的，通常发生在受体c 末端尾部区域。以上此类受体结合的相似之处，表明它们可能来 自同一祖先基因。持续刺激g 蚩白偶联受体可引起典型的受体脱敏现象，这种现象通常是由受体 的磷酸化引起的，经常发生在有细胞内的c 终端区的受体( 胞内末端的尾部对脱敏和内化十分重 要) 。g n r hir 没有一个细胞内的c 终端区，不经受激动剂诱导的受体磷酸化或与8 一抑制素结合， 因此可以抵制受体脱敏。目前发现只在哺乳动物体内存在。g n r h i i r 有一个细胞内的c 一终端区， 区内包含有几个苏氨酸和丝氨酸残基，可能是磷酸化作用位点，这些位点在非哺乳类脊椎动物与 g n r hi i 受体的脱敏作用和内化作用有关( b l o m e n m h re ta 1 ，1 9 9 9 ) 。用g n r hi i 处理，能引起受 体的内化( b l o m e n r o h re ta 1 ，1 9 9 9 ) 。g n r hi ir 在许多脊椎动物中存在，持续刺激可快速脱敏和 内化，同时伴有磷酸化或与b - 抑制素结合。现在已经明确，持续结合g n r h 能引起g n r h r 脱敏， 这种脱敏与受体的下调和内化有关。g n r h ri 在许多系统表现不脱敏，而在c t t 3 1 细胞系g n r h r 表现快速脱敏( m c a r d l ee ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 g n r h i i r 对g n r h i i 有高度选择性，g i l r h i i 在结构上很保守，和g n r h i i r 在神经系统有相 4 中国农业大学博七学位论文 综述促件腺激素释放激素受体研究进展 似的分布，对非生殖功能有作用( m i l l a r , 2 0 0 3 ) ；g n r hir 可与g n r hi 结合，在不同脊椎动物 间，下丘脑g n r hi 的结构变化很大，是通过下丘脑垂体性腺轴调节生殖的关键调节物。 1 2 2g n r h 受体的表达及分布 在多种动物的组织及无限增殖化垂体细胞系( a t 3 1 细胞、g h 3 细胞等) 中均检测到g n r h r 的表达。 1 2 2 1 下丘脑一垂体轴系和脑内其他中枢 r n a 印迹、r t - p c r 、原位杂交和受体结合分析表明，在大鼠、猪、牛和羊等哺乳动物垂体 细胞中g n r h 受体m r n a 水平最高，g n r h 受体是分布在表达l h 和戚f s h 的促性腺细胞上 脑中g n r h 受体分布广泛，g n r h i i r ( 绒猴，m a r m o s e t ) 分布在下丘脑、小脑、视前区、脑桥等 部位( m i l l a r e t a l ，2 0 0 1 ) 1 2 2 2 生殖器官 用r t - p c r 等方法证实卵巢颗粒细胞和黄体细胞( p e n ge ta 1 1 9 9 4 ) 、睾丸间质细胞( l e y d i g c e l l ，d u f a na n dk n o x , 1 9 8 5 ) 、胎盘细胞滋养层细胞和合体滋养层细胞( l i n , 1 9 9 5 ) 、正常子宫组织 ( c h e g i n i ，1 9 9 6 ：c h a t z a k i , 1 9 9 6 ) 、乳腺组织( k n t t l e r , 1 9 9 7 ) 和前列腺( c h i ，1 9 9 3 ) 均有g n r h 受 体m r n a 的表达。 1 2 2 3 肿瘤组织 在垂体腺瘤、人乳腺癌、卵巢上皮癌、人乳头状甲状腺癌和前列腺癌等肿瘤组织和细胞中存 在g n r h 特异结合位点( s t o j i l k o v i ce ta 1 ，1 9 9 9 ) 在肝癌、肾癌、胰腺癌、结肠癌、子宫内膜 癌、子宫肌瘤组织细胞膜上也有分布。 用表达g n r hir 的腺病毒感染有利于乳腺癌和前列腺癌细胞中高亲和力的、磷脂酶c 结合的 g n r h - r 表达，而用g n r h i i r 转染在这些细胞就没有这个效果( m c a r d l e e ta 1 。2 0 0 2 ) 。 1 2 2 4 其他器官 在颌下腺、胃肠道、胰腺、肾上腺、甲状腺、心脏、骨骼肌和单核细胞都有g n r h 受体表达( c h e r t e ia 1 ，1 9 9 9 ；m i l l a re ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 g n r h i i 受体比g n r hi 受体分布更加广泛o v i i l l a r e t a i ，2 0 0 1 ) 。它在垂体、脊髓、脑桥、小脑、 脑核、骨髓、下丘脑视交叉、中脑、枕骨大孔，额叶和胼胝体均有表达。在生殖组织如睾丸、前 列腺、乳腺、精囊、附睾中也有表达。在肾上腺、甲状腺、心脏和骨骼肌中大量表达，但在肝脏、 卵巢和膀胱等组织中没有表达或很少表达。g n r hi i 受体分布的广泛性，表明它功能的多样性。 5 中国农业大学博十学位论文综述促件腺激素释放激索受体研究进展 1 2 2 5 无限增殖化垂体细胞系 在下丘脑一垂体水平研究生殖神经内分泌调控机制，其最大的障碍就是没有理想的细胞模型。 过去的研究主要是在不同动物的活体内进行，或在活体外分散培养的原代垂体细胞上进行。但这 些研究受垂体前叶细胞异质性限制。在成年动物，促性腺激素细胞仅占垂体前叶分泌细胞的6 1 5 ( i b r a h i me ta 1 。1 9 8 6 ) ；另外，在培养系统中，垂体前叶细胞不能增殖，因此，许多研究工作不 能进行。无限增殖化垂体细胞系的出现为研究g n r h 及其受体作用机制提供了一定的帮助。 a t 3 1 细胞 1 9 9 0 年，由m e l l o n 和他的合作者用人的糖蛋白激素o 【亚基基因的1 8 k b 的5 旁侧区序列与类人猿 ( 猿猴) s v 4 0 t 抗原致癌基因的编码蛋白序列相连接，形成融合基因，可用来生产转基因鼠。携 带有这种融合基因的鼠在垂体前叶形成肿瘤。a ”一l 细胞就来自这种鼠的垂体前叶肿瘤，把这些 肿瘤细胞分散开进行单层培养，建立稳定的培养体系，可获得典型的单克隆细胞( w i n d l ee ta i 1 9 9 0 ) 。这些细胞为研究g n r h r 和g n r h 功能以及0 【亚基细胞特异性表达提供了一个连续的细胞 模型体系。r 3 一l 细胞的获得对编码g n r h r 的c d n a s 单分子克隆起了非常重要的作用( r e i n h a r t e ta 1 ，1 9 9 2 ；t s u t s u m ie ta 1 ，1 9 9 2 ) 。 a t 3 一l 细胞表达a 亚基m r n a ，另外，a 亚基蛋白是由这些a t 3 一l 细胞合成并分泌的。用g n r h 处理，这些细胞的o r , 亚基m r n a 水平增加，而用t r h 处理，伍亚基m r n a 水平却保持不变。g n r h 反应是时间、剂量依赖型的。g n r h 拮抗物与g n r h r 的作用。阻断g n r h 反应。而且已经证明在 t 3 1 细胞中，有g n r h 连接希i g n r h rm r n a 的表达。在a t 3 1 细胞中，促性腺激素a 亚基和 g a r h r 的表达与在促性腺激素细胞中的表达一致。但是，它们却不能表达促性腺激素细胞特异 性蛋白的全部补体，特别是l h 3 和f s h 3 亚基。这表明，o 【t 3 1 细胞起源于并不完全分化成促性 腺激素细胞的前体物质，在个体发育中a 亚基的表达要先于l h b 和f s h 3 的表达。在o 【t 3 一l 细胞存 在g n r h 反应，表明这些细胞很可能是在g n r h - r 表达之后产生的( k a i s e re ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 c t t 3 1 促性腺激素细胞的建立，对理解促性腺激素细胞的功能及促性腺激素的调控机制，特别 是亚基基因表达和g n r h r 结构和功能，起了巨大的推动作用。在对g n r h r 基因结构的解释及 g n r h rc d n a s 的克隆方面，c t t 3 1 细胞起了重要作用。它旨定了过去的观点，即g n r h r 是g 蛋 白耦联受体家族中的一员。c t t 3 1 细胞被_ l ；j 来解释g n r h 信号转导路径中的各种成分的作川。在 c t t 3 1 细胞中，g n r h r 与g 9 g 1 1 家族中的g 蛋白耦联，导致i p s 的生成，从而使细胞内c a 2 + 水平 升高，又导致p k c 的活化。在一些研究中发现，c a m p 由g n r h 激活，导致a