（市政工程专业论文）有机氯化物的生物降解技术研究.pdf

武汉理工大学硕士学位论文 摘要 环氧丙烷生产废水中含有较高浓度的有机氯化物，如氯丙醇、丙二醇、二 氯异丙醚、氯丙酮等，是生化法处理的难点。本文以环氧丙烷废水为出发点， 主要研究以下三方面的内容：实验室现有常见细菌对环氧丙烷废水的适应性机 制研究、在生物学领域对环氧丙烷废水中的重要成分氯丙醇的结构类似物一1 ， 3 - 二氯一争丙醇的生物降解进行研究以及利用分子生物学手段对生物降解代谢 途径中的关键酶目的基因的克隆和表达研究。 首先，研究实验室现有常见细菌对环氧丙烷废水的适应性机制。将盐生杆 菌j 7 、大肠杆菌d h 5 a 和细菌w h z ，分别接种到营养成分、p h 值和c l 浓度都 不同的培养基中振荡培养，观察其生长情况。试验结果表明：经过驯化后具有 一定耐盐能力( 可适应a 浓度为1 8 0 0 0 m g l ) 的细菌w h - z j 可以适应a _ 浓度高 达3 2 0 ( ) 0 m g l 的环氧丙烷废水，高盐度并不是限制细菌生长的障碍。细菌不能 有效利用环氧丙烷废水中的有机物，即对环氧丙烷废水有机物的降解能力才是 限制细菌生长的主要因素之一。 其次，在生物学领域采用生物信息学方法对环氧丙烷废水中的重要成分氯 丙醇的结构类似物一l ，3 _ 二氯一 丙醇的生物降解机制进行研究。获取了1 ，3 - 二 氯一2 - 丙醇降解途径中关键酶h a l o h y d r i nc p o x i d a s ca ( 卤代醇环氧酶a ) 和 h a l o h y d r i ne p o x i d a s eb ( 卤代醇环氧酶b ) 的相关信息、序列特性及d n a 序列信息， 并对其进行了同源分析。由同源分析的结果可知，能够合成这两种关键酶的相 关微生物在自然界中分布广泛。其中，具有代表性的同源微生物有：棒状杆菌 属( c o r y n e b a c t e r i u ms p ) 、节杆菌属0 r t h r o b a c t e rs p ) 、根癌土壤杆菌 ( , 4 9 r o b a c t e r i u m - t u m e f a c i e n s ) 、伯克霍尔德氏菌( b u r k h o l d e r i as p ) 、分枝杆菌属 ( m y c o b a c t e r i u m ) 、绿曲挠丝状菌属( c h l o r o f l e x u sa g g r e g a n s ) 和运动螺旋菌 ( h e l i o b a c i l l u sm o b i l i s ) 等。 最后，采用分子生物学方法，选用棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u ms p ) a b 9 1 0 5 4 作 为试验菌株，抽提出了棒杆菌a b 9 1 0 5 4 的基因组d n a ，用p c r 手段扩增出了 目的片段基因h h e b 。 关键词：有机氯化物，生物降解，棒杆菌，克隆表达 武汉理工大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h ee p o x yp r o p a n ew a s t e w a t c rc o n t a i n sh i g hc o n c e n t r a t i o no fc h l o r i n a t e d o r g a n i cc o m p o u n d s , s u c ha sc h l o r o p r o p a n o l ，p r o p y t e n et j y c o l ，d i c h l o r o i s o p r o p y - l e t h e ra n dc m o r o a c e t o n ee t c , w h i c hi st h em bo ft h eb i o d e g r a d a t i o nt r e a t m e n t u s i n g e p o x yp r o p a n ew a s t e w a t e ra sas t a r t i n gp o i n t , t h em a i nr e s e a r c hc o n t e n t si n c l u d e t h r e ea s p e c t s ：t h ea d a p t a b l em e c h a n i s mr e s e a r c ho fe x i s t i n gu s u a lb a c t e r i u mf o rt h e e p o x yp r o p a n ew a s t e w a t e r , t h eb i o d e g r a d a t i o ns t u d y o f1 , 3 - d i c l o r o - 2 - p r o p a n o l s t r u c t u r a lr e s e m b l i n gc h l o r o p r o p a n o li nt h ef i e l do fb i o l o g y , a n dt h ec l o n ea n d e x p r e s s i o nr e s e a r c ho ft h ek e ye n z y m eo fg o a lg e n ei nt h eb i o d e g r a d a t i o np a t h w a yb y m o l e c u l a rb i o l o g y f i r s t l y , i ti st h ea d a p t a b l em e c h a n i s m r e s e a r c ho fe x i s t i n gu s u a lb a c t e r i u mi nl a b f o r t h ee p o x yp r o p a n ew a s t e w a t e r h a l o p h y t e sb a c i l l ij 7 , e s c h e r i c h i ac o l td h 5aa n d b a c t e r i aw h - z 1w e r ei n o c u l a t e dr e s p e c t i v e l yt ot h ec u l t u r em e d i u m s ，w h i c hn u t r i e n t s ， p ha n dc o n c e n t r a t i o no fc i w e r ed i f f e r e n t ，a n dt h e ni n v e s t i g a t e dt h eg r o w t ho ft h r e e b a c t e r i ab yv i b r a t i n gc u l t i v a t i o n t h er e s u l t so ft h ee x p e r i m e n ta r ea sf o l l o w s ：a f t e r s a l t - t o l e r a n td o m e s t i c a t i o n , t h eb a c t e r i aw h z j w h i c ha d a p t e dt h ee p o x yp r o p a n e w a s t e w a t e rw i t hl s 0 0 0 m g lc o n c e n t r a t i o no fe l - 锄a d a p tt h ee p o x yp r o p a n e w a s t e w a t e rw i t h3 2 0 0 0 m g lc o n c e n t r a t i o no fe l , w h i c hm e a n st h eh i g hs a l i n i t yi s n o tt h eo b s t a c l et or e s t r i c t i n gt h eg r o w t ho fb a c t e r i a t h eb a c t e r i ac a nn o tm a k eu s eo f t h eo r g a n i cc o m p o u n d si nt h ee p o x yp r o p a n ew a s t e w a t e r , e f f e c t i v e l y t h e r e f o r e ，t h e c h i e fi n g r e d i e n ti nt h er e s t r i c t i n gg r o w t ho fb a c t e r i ai st h eb i o d e g r a d a t i o na b i l i t yt o t h eo r g a n i cc o m p o u n d sc o n s i s t i n gi nt h ee p o x yp r o p a n ew a s t e w a t e r s e c o n d l y , b yu s i n gb i o i n f o r m a t i c si nt h ef i e l do fb i o l o g y , t h eb i o d e g r a d a t i o n m e c h a n i s mo f1 , 3 一d i c l o r o - 2 一p r o p a n o l ，as t r u c t u r a ls i m i l a rw i t hc h l o r o p r o p a n o lt h e m a i ni n g r e d i e n to fe p o x yp r o p a n ew a s t e w a t e rw a si n v e s t i g a t e d t h er e l e v a n t i n f o r m a t i o na n dt h es e q u e n c ei n f o r m a t i o no fd n ao fh a l o h y d r i ne p o x i d a s eaa n d h a l o h y d r i ne p o x i d a s e b w h i c ha r et h ek e ye n z y m e si nt h ep r o c e s so ft h e b i o d e g r a d a t i o no f1 , 3 一d i c h l o r o - 2 - p r o p a n o l ，w e r ea c q u i r e d a n dt h eh o m o l o g y a n a l y s i so fh a l o h y d r i ne p o x i d a s ea a n dh a l o h y d r i ne p o x i d a s ebw e r em a d e t h e r e s u l ts h o w st h a tr e l e v a n tm i c r o b e st h a tc a ns y n t h e s i z et h o s ek e ye n z y m e sa r ew i d e l y l l 武汉理工大学硕士学位论文 s p r e a d i nt h en a t u r e a n dt h e t y p i c a l r e l e v a n tm i c r o b e sa a sf o l l o w s ： c o r y n e b a c t e r i u ms p ，a r t h r o b a c t e rs p ，a g r o b a c t e r i u m - t u m e f a c i e n s ，b u r k h o l d e r i as p ， m y c o b a c t e r i u m ，c h l o r o f l e x u sa g g r e g a n sa n d h e l i o b a c i l l u sm o b i l i se t c f i n a l l y , b yu s i n gt h em e t h o do fm o l e c u l a rb i o l o g y , t h ec o r y n e b a c t e r i u ms p a b 9 1 0 5 4w a sc h o s et ob et h et e s t i n gb a c t e r i u m a n dt h er e s u l t sa l ea sf o l l o w s ： e x t r a c t e dt h eg e n o m ed n ao fc o r y n e b a c t e r i u ms p a b 9 1 0 5 4 ，a m p l i f i e dt h eh h e b g o a lg e n eb yt h ep c rt e c h n i q u e k e yw o r d ：c h l o r i n a t e do r g a n i cc o m p o u n d s ，b i o d e g r a d a t i o n , c o r y n e b a c t e r i u ms p ， c l o n ea n de x p r e s s i o n 1 1 1 此页若属实请申请人及导师签名。 独创性声明 本人声明，所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢 的地方外。论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得武汉理工大学或其它教育机构的学位或证书而使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：缝邀日期趁礁! ! 关于论文使用授权的说踢 本人完全了解武汉理工大学有关保留、使用学位论文的规定， 即；学校有权保窘送交论文的复印件，允许论文被查圄和借阅； 学校可以公布论文的全部内容可以采用影印、缩印或其他复制 手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 研究生签名：筮鱼 导师签名：盔毳日期型2 圣! ! 目 注：请将此声明装订在学位论文的目录前 武汉理工大学硕士学位论文 第1 章引言 1 1 环氧丙烷废水概述 环氧丙烷( p o ，p r o p y l e n eo x i d e ) ，又名氧化丙烯，是一种无色、具有醚类 气味的低沸易燃液体。凝固点1 1 2 1 3 c ，沸点3 4 2 4 。与水部分混溶，与乙醇、 乙醚混溶。有毒，对人体有刺激性。环氧丙烷是一种重要的有机化工产品，是 丙烯系列产品中仅次于聚丙烯和丙烯腈的第三大衍生物，同时也是一种重要的 基本有机化工原料。环氧丙烷广泛应用于化工、轻工、医药、食品和纺织等行 业，需求量逐年增加，具有很好的应用前景，产量也逐年增加。 目前国内都基本采用氯醇法工艺生产环氧丙烷，氯醇法是以烯烃和氯气为 原料，首先将丙烯气体、氯气和水按一定配比送入氯醇化反应器中进行反应， 未反应的丙烯与反应中产生的h c l 及部分的二氯丙烷等自反应器顶部排出，经 冷凝除去氯化氢和有机氯化物，丙烯循环回用。反应器底部得到氯丙醇质量分 数为4 5 的盐酸溶液。将该溶液与过量约1 0 的石灰乳混合后送入皂化塔 中皂化，再经精馏即可得到环氧丙烷。该工艺流程比较短，工艺成熟，收率高， 生产比较安全，且投资少。但缺点是对设备有腐蚀，产生的环氧丙烷废水的特 点是高温( 经闪蒸和换热后达6 0 8 0 ) 、高p h 值( 约为1 0 1 2 ) 、高盐( c a c l 2 质量分数为3 5 4 o ) 、高s s ( s s 浓度为0 3 0 5 ) 、高c o d 值( 约为2 0 0 0 m g l 3 0 0 0 m g l ) ，同时生产过程中还会产生大量含有口一氯丙醇和声一氯丙醇 ( 以下均简称氯丙醇) 、二氯丙烷、二氯异丙醚、氯丙酮等难生物降解的有机氯 化物。这种含有机氯化物的环氧丙烷废水对环境的污染日趋严重。 1 2 有机氯化物处理技术现状 有机氯化物不仅存在于环氧丙烷废水中，也是危险废品和垃圾提取物的重 要组成部分，在地面水和土壤污染中比较普遍。同时，随着入造化学剂如：致 冷剂、灭火剂、油漆、溶剂、除草剂和农药的广泛使用，使得有机氯化物长期 以来在环境中无节制的释放及不断积累，对环境及人类身体健康造成极大的危 害。特别是近年来在一些食品中也发现有许多这类化合物( 如氯丙醇系列物) ， 武汉理丁二大学硕士学位论文 欧盟等国家对此都提出了越来越严格的控制标准川。因而如何处理有机氯化物成 为一个迫切的问题。 1 2 1 有机氯化物物化处理技术进展 对于这类污染物，最初一般采用物理化学方法( 如气提、萃取、土埋、活性 碳吸附、焚烧等) 治理。但这些方法都只是污染物的转移，不能从根本上治理， 且容易造成二次污染，成本也较高，对食品、调味品中存在的类似污染就更无 能为力了。 有机物很难被降解的原因有多种，但大致可分为两大类：一是对微生物有 毒害作用功能；二是化学结构稳定。可针对具体物质利用物理化学手段进行预 处理以改变难生物降解有机氯化物的结构，消除或减弱它们的毒性，增加其可 生化性能n a 。 中国科学院范经华等“脚采用电化学催化方法同步脱硝脱卤进行研究。试 验采用化学沉积法负载钯一铜合金( 4 ：1 ) 的多孔钛板作为电解反应器阴极，电解 硝酸盐氮( n o ；一n ) 和五氯酚( p c p ) 的混合溶液。结果表明：p c p 的脱卤效果与 单独脱卤时相似，但p c p 的存在对研一n 的还原脱除有明显影响。利用多孔 钛板负载的钯一铜二元合金电极，选择合适的反应参数，可有效地脱除水中的 硝酸盐氮和卤代有机物。 近年来，各国科学家广泛开展的利用便宜金属铁及其化合物脱氯降解技术， 为有机氯化物的处理提供了一条新的途径“5 “”。金属铁能够有效地降解有机氯 化物，但也面临着以下挑战：金属铁对某些氯化物反应性较低，降解不完全， 生成含氯产物，有的毒性较大；随着时间的推移，金属铁表面惰性层或金属氢 氧化物的形成，使得铁的反应性降低。科学家们尝试用二元金属( 如p d f e 、n i ：f e 等) 进行脱氯降解。同时，也开展了利用自然界中普遍存在的含铁化合物处理有 机氯化物的研究。但目前这一技术在降解机理上不甚明了，反应动力学方面的 研究也有待于深入。对于二元金属体系，催化剂为钯时，脱氯效果最好，但钯 为贵金属，工程上应用成本较高。应该在催化剂筛选方面做一些研究工作，以 廉价催化剂代替贵金属钯。 华南理工大学的陈元彩等“”采用化学絮凝法处理造纸废水中的有机氯化 物，试验研究表明化学沉淀处理可有效地去除漂白废水中的难于生物降解的高 2 武汉理工大学硕士学位论文 分子物质，因而可提高后续的生物处理效率。但物化混凝处理后水中残存的铝等 金属离子在生物体中的累积效应还有待于进一步研究 广西民族学院的夏璐等“”采用2 5 3 7 n m 的紫外光为光源，二氧化钛作催化 剂，对造纸废水的有毒成分4 - 氯 一愈刨木酚进行了光催化降解。结果表明，化学 纯二氧化钛经过高温焙烧处理可以增大其催化活性，光强、溶液的初始浓度以 及酸碱度都会影响4 _ 氯一愈创木酚的降解率。通过紫外光谱图对4 _ 氯一愈创木酚 的降解进行跟踪，结果表明，有机氯化物中的苯环特征峰完全消失，降解较彻 底。 。 1 2 2 有机氯化物生物处理技术进展 基于采用一般的物理化学方法很难降解，生物降解能够通过微生物作用将 有毒物质转化为无毒物质，投资少且无二次污染，因而近年来已成为各国研究 的热点嗍，因此充分利用微生物降解技术日益重要。只有驯化出高效降解菌株， 详细研究其降解环境污染物的能力和途径，并优选其最适宜的降解条件，才能 更有效的利用微生物来处理和降解各种污染物，更好地保护环境和人们的身体 健康。 s t u t h r i d g e 等哪! 对造纸废水活性污泥法的研究发现，被去除的 a o x ( a d s o r b a b l eo r g a n i ch a l o g c n ，可吸附有机卤化物) 只有少量留在污泥里，而 9 9 的a o x 被转化成无机氯。j a n a o l e s z k i e w i c z 等的研究表明，活性污泥法 在短的h r t 和长的s r t 时能提高a o x 的去除率。 广东工业大学的乔庆霞”1 通过驯化选育优势菌使生物法应用于含有机氯化 物的漂白废水的治理。在实验室中通过驯化筛选获得4 株优势菌a 1 ，b 1 ，b 2 和c - 1 。考察了废水相对浓度、p h 值和菌液量对4 株优势菌处理漂白废水效果 的影响，发现随着这些条件的变化，4 株菌的处理效果具有相似的变化趋势。在 废水相对浓度为5 0 ( 原废水浓度的5 0 ) 、p h 值为7 0 、菌液量为2m l 时，对 有机氯化物和c o d , ，的综合处理效果较好。 采用m y c o r 、m y c o p o r 工艺0 1 将白腐菌分别固定在旋转生物转盘和滴滤 器的泡沫载体上，前者处理碱抽提段废水，2 d 内可去除6 2 t o c l 和大于8 0 脱色率；后者在停留时间为6 1 2 h 时，可获得8 7 脱色率、8 0 a o x 去除率和 4 0 c o d 去除率。p a l l e r l a 等“1 用聚氨脂预聚物固定的白腐菌的生物反应器处理 武汉理- t 大学硕士学位论文 漂白废水时，在2 4 h 停留时间的连续流处理中，可脱除7 2 8 0 的颜色和 5 2 5 9 的a o x 。 选择适当的生物降解环境能提高菌种的活性，b r o c h c d u e 等”1 用移动床生 物膜m b b r 反应器处理3 个新闻纸厂的综合废水，在m b b r 反应器中微生物吸 附于反应器中自由移动的塑料载体上，可提高微生物停留时间，在后续的化学 沉淀处理中只需原来1 3 到1 4 药剂量就可获得9 5 的c o d 去除率。m b b r 具 有结构紧凑、运行效果稳定、操作简单等生物膜法的优点，克服了易阻塞等缺 点。 有研究嘲表明，氯代芳香族化合物中氯原子具有强烈的吸电子性，使芳环 上电子云密度降低。在厌氧条件下，电子云密度较低的有机物在酶催化下，易 受到还原剂的亲核攻击，发生氯原子的亲核取代，显示出较好的生物降解性。 氯化有机物在厌氧条件下还原脱氯是一种重要的脱毒反应，且这种还原反应由 非甲烷菌产生，随着氯代程度的增加，还原脱氯速度加快，释放的能量增多。 b o m a n 等。“采用超滤一厌氧，在不产甲烷条件下，获得了6 0 6 5 a o x 和 7 0 8 0 的氯酚去除率。轻工业环境保护研究所的宋云等o ”采用厌氧法处理漂 白废水，厌氧法对漂白废水的a o x 去除效率明显高于活性污泥法。 h a g g b l o m 等人嘲采用厌氧流化床与好氧滴滤池联合处理工艺，对a o x 、氯 酚和c o d 的去除率分别为6 8 、7 7 和6 1 。w a n g ”通过连续流厌氧一好氧法 处理漂白废水对比实验，发现厌氧一好氧工艺可提高有机氯化物的还原脱氯能 力，从而提高漂白废水的a o x 及c o d 的去除率。 对于难生物降解的有机物，传统生物处理工艺不能有效维持连续的驯化培 养物，冲击负荷大，特别是其中的有毒有害组分降解困难。于是，人们试图通 过对代谢菌种的改良来提高难生物降解有机废水的降解效率。有效菌株的获得 主要来自两个方面，其一是从污染现场或处理设施中筛选分离得到，其二是构 建工程菌。 ( i ) 筛选分离有效降解微生物 通过污染现场分离，研究人员得到了不少难降解有机氯化物的高效降解微 生物。比如好氧菌p s e u d o m o n a ss p 和好氧菌b a c i l l u ss p 能降解氯苯、好氧菌 r a l s t o n i ae u t r o p h as p a 5 能降解有机氯农药、厌氧菌d e s u l f i t o b a c t e r i u m d e h a l o g e n a n s 和好氧菌b u r k h o l d e r i as p 以及好氧菌c o m a m o n a st e s t o s t e r o n i 能降 解多氯联苯1 。为了减少分离筛选菌种方面的低水平重复，研究人员开始建设 4 武汉理工大学硕士学位论文 高效降解菌株库，构建系统进化树，从分子生物学水平探讨降解代谢途径的起 源与进化，极大地丰富了微生物资源，并促进了微生物资源的利用。 高效微生物应用于实际生物处理系统中也有很好的表现。如g l l i 等筛选 出1 0 种能降解二氯甲烷的菌种，分解能力可达0 8 9 ( l - h ) ，应用于流化床生物 反应器，二氯甲烷分解能力可提高到1 6 9 ( l h ) 。尽管如此，高效降解微生物在 实际废水的生物处理系统中能否长期有效发挥作用，尚有不少问题需考虑。如 降解菌在废水复杂的生态系统中能否优势生长，系统能否增殖维持相当数量的 目标污染物驯化培养物等。 ( 2 ) 构建工程菌 尽管可以从环境中分离筛选得到菌株，但降解污染物的酶活性往往有限， 同时菌种选育工作费时耗力，虽然理论上微生物能适应降解所有的有机污染物， 但面对今天层出不穷的新化合物的挑战，依靠微生物的自然进化能力显然是滞 后的，远不能满足生物处理的需要。如果能对这些菌株进行遗传改造，提高微 生物酶的降解活性，并可大量繁殖，就可以定向获得具有特殊降解性状的高效 菌株，方便有效地应用于污染处理。因此，构建基因工程菌成为现代环境生物 技术的一个重要研究方向，日益受到人们的重视。 许多难降解有机氯化物的降解基因多位于质粒上，质粒不依赖于寄主染色 体而能自主复制，可带着终端重复的d n a 转移。将不同降解性质的质粒转移到 一个受体细胞，能构建不同降解特性的高效工程菌。如i - h u g h n d 等蚴将能降解 2 ，4 - - - - 一氯苯氧乙酸的a l c a l i g e n e se u t r o p h u s 质粒j m p l 3 4 转移到p s e u d o m o n a s p u t i d a a c l l 0 0 ( 该菌株能降解2 ，4 ，5 - 三氯苯氧乙酸) 中，构建了工程菌r i h l ，能 同时降解2 。4 - - - 氯苯氧乙酸和2 ，4 ，5 一三氯苯氧乙酸。 利用分子生物学进行基因重组育种，打破物种界限，加快变异速度，已成 为构建基因茵的新途径。例如l i a w 等“3 将能降解二苯醚的e r w i n as p 的d n a 进 行消化，得到一段2 1 k b 的d n a 片断，接入质粒p u c l 9 ，转入大肠杆菌表达， 使之获得了降解二苯醚的能力。随着基因重组技术的成熟，各种降解特性的基 因库的构建日益引起关注，也极大加速了工程菌的有效构建。 工程菌的实际应用研究也是目前国内外的研究重点。s a t o s h i s o d a 等1 将工 程菌p s e u d o m o n a s p u t i d ab h 接种于序批式反应器( s b r ) 系统中处理酚，大大提 高了酚的去除率，改善了污泥的沉降性能，同时抑制了野生菌种的增殖。但是， 工程菌应用于环境领域尚有不少问题有待解决。如某些质粒的不相容性使降解 5 武汉理工大学硕士学位论文 性状不一定被转移，原生质融合技术可能使酶活性下降，种的壁垒使得外源降 解基因表达能力逐渐下降甚至丧失等。更为重要的是，工程菌的安全性需要详 细评估，例如某些降解纤维素的工程菌可能对与纤维素有关的行业造成毁灭性 的打击。 高效菌种技术是利用生物技术手段通过改良菌种实现对有机物的去除。生 物处理技术是污染物治理中最完全和清洁的技术，通过微生物代谢实现对污染 物的去除，不会造成二次污染。因此应该继续致力于难降解有机物的生物处理 技术研究，将生物技术手段与污染物处理工艺相结合，实现对难降解有机物的 有效处理。 1 3 氯代醇处理技术现状 环氧丙烷废水中含有氯丙醇、二氯异丙醚、二氯丙烷等难生化降解的有机 氯化物，其中，氯丙醇是氯醇法生产环氧丙烷的废水中的重要副产物。不仅环 氧丙烷废水中含有大量的氯丙醇，在酱油、蚝油等调味品的半成品到成品中也 发现有大量残留的氯丙醇系列物，如1 ，3 - - - 氯一2 一丙醇( 1 ，3 - d i d o r o - 2 - p r o p a n o l ， 1 ，3 d c p ) 、2 ，3 一二氯一卜丙醇( 2 ，3 - d i c l o r o - i p r o p a n o l ，2 ，3 d c p ) 、2 - 氯一1 ，3 - 丙 二醇( 2 - m o n o c h l o r e 1 ，3 - p r o p a n e d i o l ，2 m c p d ) 和3 - 氯一1 ，2 - 丙二醇 ( 3 m o n o c h l o r e 1 ，2 - p r o p a n e d i o l ，3 - m c p d ) 等嘲。因此在欧美等国都对调味品中 此类物质的含量作出了越来越严格的规定，甚至查封我国大陆及香港出口的调 味品或禁止销售。调味品中氯丙醇的残留问题也开始引起我国有关部门的重视。 因此，处理氯丙醇系列物是目前急需攻克的技术难题。 重庆协力达生物化学研究所的罗贵伦嘲采用碱法清除氯丙醇，试验结果表 明，氯丙醇在p h i 2 ，即 认为细菌已长好) 。同时做空白对照( 不加细菌) 。 培养基b 、c 的试验方法同培养基a 。 2 3 2 第二阶段试验 ( 1 ) 将盐生杆菌j 7 、大肠杆菌d i l 5 a 和细菌w h 7 _ j 分别接种到3 m l 的l b 液体培养基中1 2 1 8 h 温控摇床过夜培养( 2 0 0 r r a i n ，3 7 c ) 。 ( 2 ) 将过夜培养的三种细菌各取5 0 0 * l 接种至5 m l 培养基d 中，放置温控 摇床中培养( 2 0 0 r r a i n ，3 7 ) ，测试并记录其六天的生长情况( 若o d 6 0 0 一2 ，即 认为细菌己长好) 。同时傲空白对照( 不加细菌) 。 培养基e 、f 、g 、h 和i 的试验方法同培养基d 。 2 4 结果与讨论 武汉理工大学硕士学位论文 2 4 1 第一阶段试验 测试并记录三种细菌在培养基a ，b ，c 中七天的生长情况。试验结果如图 1 所示。 图2 1 三种细菌在培养基a ，b ，c 中的生长情况 由图2 - 1 可以看出： ( 1 ) 培养基c 中细菌w h - z j 在第三天就已经生长好了( o d c m o 2 ) 。盐生杆 菌j 7 虽然在第六天开始生长，僵此时d z ( 空白对照) 也生长出细菌，有污染，因 而不能说明确实是盐生杆菌j 7 生长了。 ( 2 ) 在培养基a 和培养基b 中三种细菌都没有生长。这可能有两种原因：一 是氯离子浓度过高，抑制了细菌的生长：二是p h 值抑制了细菌的生长。为进一 步了解抑制的原因，做了第二阶段试验。 2 4 2 第二阶段试验 由于第一阶段试验中培养基未灭菌导致试验有污染，因此本阶段试验中垮 养基均采取过滤灭菌。测试并记录了三种细菌在培养基d ，e ，f ，g ，h 中六天的 生长情况。试验结果如图2 2 所示， 武汉理工大学硕士学位论文 图2 _ 2 三种细菌在培养基d ，e ，f fg ，h 中的生长情况 由图2 - 2 可以看出： ( 1 ) 在培养基d ，c ，f 中，细菌w h - z i 在p h = 7 时可以生长，而在p h = 1 0 和p h = 1 1 时不生长；在培养基g ，h 中，细菌w h z j 在p h - - - - - 7 时可以生长，而 在p h = 1 0 时不生长。这说明：已经有一定耐盐能力的细菌w h 刁( 适应c 1 浓度为1 8 0 0 0 m g x j 可以适应a 浓度为2 4 0 0 0 m g r l ，甚至3 2 0 0 0 m g l ；p h 值 是抑制细菌生长的主要因素之一。这主要是因为微生物在生长过程中机体内发 生的绝大多数反应是酶促反应，而酶促反应都有一个最适p h 值范围，在此范围 内只要条件适合，酶促反应速率最高，微生物生长速率最大。因此微生物生长 有一个最适生长的p h 值范围。此外，微生物生长还有个最低与最高的p h 范 围，低于或商出这个范围，微生物的生长就被抑制。 p h 通过影响细胞质膜的透性，膜结构的稳定性和物质的溶解性或电离性来 影响营养物质的吸收，从而影响微生物的生长速率。质子是一种唯一不带电子 武汉理工大学硕士学位论文 的阳离子，它在溶液里能迅速地与水结合成水合氢离子( h 3 0 + ) 等。在偏碱性条 件下，o r 占优势，水合氢离子和o r 对营养物质的溶解度和离解状态，细胞表 面电荷平衡和细胞的胶体性质等方面均会产生重大影响；在酸性条件下，h + 可 以与营养物质结合，并能从可交换的结合物或细胞表面置换出某些阳离子，从 而影响细胞结构的稳定性；同时由于p h 值较低，c 0 2 溶解度降低，某些金属离 子如m n 2 + ，c a 2 + 等溶解度增加，导致它们在溶液中的浓度增加，从而对机体产 生不利的作用； ( 2 ) 在培养基d ，c ，f ，g ，h 中，大肠杆菌d h s a 都没有生长，说明大肠杆 菌d i - 1 5 a 不能适应氯离子的浓度，过高的氯离子浓度抑制了它的生长； ( 3 ) 在培养基d ，c ，f g ，h 中，盐生杆菌j 7 也都没有生长，因为盐生杆 菌的生长非常缓慢，通常需要生长1 5 天以上才能观察到生长，而且盐生杆菌j 7 的生长需要光照。因此在本实验生长6 天的情况下，没有观察到生长。但本试 验对用于生物处理的细菌要求是：细菌的生长要快：细菌利用有机物的效 率要高；细菌对生长条件的要求不高。由此可以看出，盐生杆菌j 7 并不符合 本试验所需细菌的要求。 ( 4 ) 在培养基i 中都观察不到三种细菌的生长，说明细菌不能有效利用环氧 丙烷废水中的有机物，即对环氧丙烷废水有机物的降解能力是限制细菌生长的 主要因素之一。 2 5 小结 1 培养基的p h 值是抑制细菌生长的主要因素之一。 2 没有经过耐盐能力驯化的大肠杆菌d h 5 a 不能适应氯离子的浓度，即过 高的氯离子浓度抑制了它的生长，更不用说能够有效利用废水中的有机物。 3 经过鄯i 化具有一定耐盐能力( 可适应a 。浓度1 8 0 0 0 m g l ) 的细菌w h z j 可以适应a 浓度高达3 2 0 0 0 m g l 的环氧丙烷废水，即高盐度并不是限制细菌生 长的障碍。细菌不能有效利用环氧丙烷废水中的有机物，即对环氧丙烷废水有 机物的降解能力才是限制细菌生长的主要因素之一。 1 6 武汉理工大学硕士学位论文 第3 章有机氯化物生物降解机制研究 3 1 引言 第二章试验研究表明细菌对环氧丙烷废水中有机氯化物的降解能力才是限 制细菌在环氧丙烷废水中生长的主要因素。因此寻找能够利用环氧丙烷废水中 有机氯化物的微生物对于环氧丙烷废水的降解将有显著帮助。 环氧丙烷废水中含有氯丙醇、二氯异丙醚、二氯丙烷等难生化降解的有机 氯化物，是生化法处理的难点。根据环氧丙烷的生产机理，氯丙醇以及氯代烷 烃是氯醇法生产环氧丙烷的废水中的重要副产物。因此，本研究选择氯丙酵作 为研究对象，研究氯丙醇的降解代谢途径以及降解的关键酶。而在现有的生物 催化一生物降解数据库中没有有关氯丙醇降解代谢途径的信息。t ，3 - 二氯- 2 - 丙 醇是氯丙醇的相似有机氯化物，了解1 ，3 - 二氯一2 - 丙醇的代谢途径和降解的关键 酶即可了解氯丙醇的代谢途径和降解关键酶。 因此，本章旨在生物学领域对环氧丙烷废水中的重要成分氯丙醇的结构类 似物一1 ，3 - - - 氯一2 _ 丙醇的生物降解进行研究。采用生物信息学方法对1 ，3 二氯 一2 _ 丙醇生物降解途径中的关键酶进行分析，获知能合成该关键酶的相关微生 物，了解相关微生物的分布及其它特征，了解相关功能基因以及同源微生物， 促进关键酶基因工程菌的构建，以为后续工作使用。 3 2 前期验证试验 3 2 1 试验材料和仪器 3 2 1 1 试验菌株 试验所用细菌取自武汉沙湖污水处理厂a 2 o 池中好氧段的活性污泥。 3 2 1 2 试剂 试验中用到的主要试剂如表3 - 1 所示。 1 7 武汉理工大学硕士学位论文 表3 - 1 主要试剂 3 2 1 3 培养基 ( 1 ) 无机培养基m 捌： k 2 h p 0 4 1 0 9 k h 2 p 0 4 1 0 9 m 茚0 4 7 1 1 2 00 5 9 n h 4 n 0 3 1 0 9 c a 0 20 0 2 9 h 2 0 1 0 0 0 m l 1 2 1 灭菌2 0 r a i n ( 2 ) l b ( i _ a r i - b e r t a n i ) 培养基叭1 ： 胰蛋白胨 1 0 9 酵母浸粉 5g n a a 1 0 9 h 2 0 1 0 0 0 m l p h 7 2 7 4 1 2 1 灭菌2 0 r a i n 3 2 1 4 仪器 试验中用到的主要仪器如表3 2 所示。 武汉理工大学硕士学位论文 表3 _ 2 试验中用到的常用仪器 试验仪器 生产厂家 y x q l s 1 8 s l 型不锈钢手提式压力蒸汽灭菌器 u v - 1 7 0 0 紫外可见分光光度计 j a 2 0 0 3 型电子精密天平 s w c j - 2 d 双人净化工作台 q y c 2 0 0 型全温空气摇床 7 8 1 型磁力加热搅拌器 上海博讯实业有限公司医疗设备厂 日本岛津( s h i m a d z u ) 公司 上海良平仪器仪表有限公司 苏州净化设备有限公司 上海福玛实验设备有限公司 江苏省姜堰市银河仪器厂 3 2 2 试验方法 ( 1 ) 将从武汉沙湖污水处理厂取回的活性污泥6 0 0 z l 接种于4 m l 的l b 液体 培养基中1 2 1 8 h 温控摇床过夜培养( 2 0 0 r r a i n ，3 7 c ) 。取过夜培养的菌液2 0 0 , l 接种于4 m l 的l b 液体培养基中扩大培养以待用。 ( 2 ) 以氯丙醇或1 ，3 - - - - - 氯一2 一丙醇作为唯一的碳源加入到无机培养基中，加 入量依次为：5 0 m g l 、1 0 0 m g l 和2 0 0 m g l 。同时做不加细菌的空白对照试验和 以甘油( 丙三醇，2 0 0 m g l ) 作为唯一碳源的对照试验。温控摇床中培养( 2 0 0 r m i n ， 3 7 ( 2 ) ，测试并记录其六天的生长情况( 若o d 6 0 0 一2 ，即认为细菌已长好) 。 3 2 3 结果与讨论 测试并记录细菌在各种培养基中六天的生长情况。试验结果如图3 1 所示。 1 9 武汉理工大学硕士学位论文 图3 - 1 细菌在各种培养基中的生长情况 由图3 1 可以看出，在以甘油作为唯一碳源的无机培养基中细菌第三天就已 经生长好，说明细菌能将甘油作为唯一的碳源有效利用；而在以氯丙醇和1 ，3 - 二氯一2 _ 丙醇作为唯一碳源的无机培养基中细菌却没有生长，说明氯丙醇和1 ，3 - 二氯一2 - 丙醇很难被降解，细菌不能利用氯丙醇和1 ，3 - 二氯一2 - 丙醇作为碳源。 3 3 微生物降解有机氯化物的常见机理与途径 微生物降解卤化物过程中的关键反应是去卤化反应。此反应中，有毒性的 卤素原子常被羟基或氢代替。去除卤素原子有助于进一步的生物降解，减小下 游步骤生成毒性中间体的可能性。在氧化反应中，卤化物可能形成酰卤或2 - 卤 代醛，由于它们有很高的亲电活性，可能引起细胞灭亡。 没有一个机制能够适用于所有的有机卤化物，在生物脱卤中有四种不同的 基本代谢方式，如图3 2 所示。 第一种是亲核置换机理，主要是与水发生置换( 水解) ，这种机理经常发生 在带有一个氯原子的氯代烷烃上。 。 在其他情况下，不活跃的氯代芳香烃和烯烃化合物不能通过亲核置换完成 反应，这时还原的脱氯反应更容易进行。还原的脱氯反应需要两个电子和两个 质子，生成c h 键和h a ，这种反应在厌氧细菌催化的反应中更为常见。这至少 有两个原因，其一是厌氧菌有大量低氧化还原电位辅助因子和酶能够高效地催 化还原性脱氯反应，其二是一些厌氧微生物经过进化具有了利用特定的有机氯 化物作为最终电子受体的能力。根据定义，厌氧化合物不能以分子氧作为最终 的电子受体，而是利用其他的化合物。有机物和无机物都可以作为氧化反应产 生电子的接受者。有机卤代物是人们所知的另一类细菌代谢的最终电子受体。 在另外一种脱氯代谢机制中，人们观察到氧化有多种功能，卤代烷烃氧化 后产生不稳定的氯羟基，并自发地消去h c l ，产生羟基化合物。这种代谢途径对 武汉理工大学硕士学位论文 于卤代烯烃和卤代芳香烃化合