（运动人体科学专业论文）游泳运动对大鼠肌细胞中间纤维和超微结构的影响.pdf

扬州大学硕士学位论文 i f d e s p 初 c k 骚心 符号说明表 i n t e r m e d i a t ef i l a m e n t d e s m i n v i m e n t i n c y t o k e r t a i n i n t e r m e d i a t ef i l a m e n ta s s o c i a t e dp r o t e i n d e s ( 一，_ 一) d r md e s m i n - r e l a t e dm y o p a t h i e s c mc a r d i a cm u s c l e s ms k e l e t a lm u s c l e s 删s m o o t hm u s c l e e ce x h a u s t e ds w i m m i n gc o n t r o l e t ce n d u r a n c e s w i m m i n gt r a i n i n gc o n t r o l s e s i n g l ee x h a u s t e ds w i m m i n g s c d e s e v e nc o n s e c u t i v ed a i l ye x h a u s t e ds w i m m i n g l i t l o w i n t e n s i t ye n d u r a n c es w i m m i n gt r a i n i n g m i tm e d i u mi n t e n s i t ye n d u r a n c es w i m m i n gt r a i n i n g h i t h i g hi n t e n s i t ye n d u r a n c es w i m m i n gt r a i n i n g e s t e n d u r a n c es w i m m i n gt r a i n i n g o h 0h o u r 3 h 3h o u r m o dm e a no p t i c sd e n s i t y p s a p e r c e n t a g eo f s t a i n e d & l e a s 中间纤维 结蛋白 波形蛋白 角蛋白 中间纤维结合蛋白 结蛋白显性遗传缺失 结蛋白相关肌病 心肌 骨骼肌 平滑肌 力竭游泳对照( 组) 耐力游泳对照( 组) 1 次力竭游泳( 组) 1 周力竭游泳( 组) 小强度耐力游泳( 组) 中强度耐力游泳( 组) 大强度耐力游泳( 组) 耐力游泳训练 即刻 3 小时 平均光密度 阳性面积百分比 王鑫：游泳运动对大鼠肌细胞中问纤维和超微结构的影响 3 中文摘要 目毋吼本实验通过对不同游泳时间的运动后，大鼠心肌、骨骼肌和平滑肌中间纤 维蛋白的免疫组织化学和超微结构的研究，揭示不同游泳时间的运动对肌细胞的 影响。 2 y 拱- 大鼠分别进行1 次力竭游泳、l 周力竭游泳和8 周不同强度的耐力游泳训练， 取心肌、骨骼肌和平滑肌分别进行石蜡切片样本处理和常规透射电镜样本处理， 石蜡切片分别进行结蛋白和波形蛋白的免疫组织化学染色( e n v i s i o n 法) ，观察和 计算其平均光密度和阳性面积的改变，电镜标本观察肌细胞内超微结构的改变。 结果：( 1 ) 心肌：1 次力竭游泳后从即刻到2 4 小时，心肌结蛋白和波形蛋白持续 降低至最低点，超微结构也出现损伤性改变；运动后4 8 小时，心肌结蛋白和波形 蛋白开始增加，超微结构的损伤也开始改善。1 周力竭游泳训练后，则在末次运动 后3 小时，心肌结蛋白和波形蛋白持续降低至最低点，超微结构损伤也最为严重； 末次运动后2 4 小时，心肌结蛋白、波形蛋白的表达和超微结构的损伤均开始改善。 经过8 周的耐力游泳训练后，小强度组心肌的结蛋白、波形蛋白和超微结构未见 明显改变；中等强度组的心肌结蛋白显著升高，波形蛋白则表现出降低的趋势， 超微结构出现良性改变：大强度训练组心肌的结蛋白和波形蛋白与长期对照组相 比，均显著性升高，超微结构可见损伤性改变。( 2 ) 骨骼肌：1 次力竭游泳后即刻 到2 4 小时，骨骼肌结蛋白持续降低至最低点，而波形蛋白逐渐增多，超微结构也 出现损伤性改变；运动后4 8 小时，骨骼肌结蛋白开始增加，同时波形蛋白达到 最高点，超微结构的损伤开始改善。经过1 周的力竭运动训练，骨骼肌结蛋白、 波形蛋白及超微结构的变化与1 次力竭运动时相似。经过8 周耐力训练后，小强 度组的结蛋白、波形蛋白和超微结构与对照组相比，未见明显改变；中强度组的 结蛋白和波形蛋白明显增加，超微结构可见良性改变；大强度组的结蛋白减少， 波形蛋白表达增多，同时超微结构可见损伤性改变。( 3 ) 平滑肌：1 次力竭运动后 平滑肌的结蛋白、波形蛋白和超微结构与对照组相比，未见明显改变；经过1 周 力竭运动训练后，平滑肌的结蛋白和波形蛋白表达降低，超微结构可见损伤性改 变；8 周耐力训练后，小强度组的结蛋白、波形蛋白和超微结构与对照组相比，未 见明显改变；中强度组的结蛋白和波形蛋白明显增加，且超微结构也产生适应性 改变；大强度组的结蛋白和波形蛋白显著减少，同时超微结构可见损伤性改变。 缮i 色( 1 ) 结蛋白和波形蛋白是肌细胞中间纤维的主要成分，它们对维持正常肌 细胞的超微结构有着重要的作用。 ( 2 ) 不同游泳时间的运动对大鼠心肌、骨骼肌和平滑肌肌细胞中间纤维和超微结 构产生不同的影响，中间纤维蛋白降低或者增加，肌细胞超微结构也有相应的变 化。 ( 3 ) 运动后恢复过程中大鼠肌细胞的中间纤维和超微结构也有不同变化。 关鳝厕大鼠；运动；游泳；心肌；骨骼肌；平滑肌；结蛋白；波形蛋白；超微 结构 扬州大学硕士学位论文 a b s t r a c t 4 o b j e c t i v e t oe x p l o r et h ee f f e c t so fs w i m m i n ge x e r c i s e sw i t hd i f f e r e n tt i m eo nm u s c l e s o fr a t t h ec h a n g e so fd e sa n dv i mi m m u n h i s t o c h e m i s t r ya n du l t r a s t r u e t u r ew e r e o b s e r v e di nc m ，s ma n ds m ma f t e rr a t ss w i m m i n ge x e r c i s e sw i t hd i f f e r e n tt i m e m e t h o da f t e re x e r c i s e so fs e ，s c d ea n de st r a t sc m ，s ma n ds m mw e r ec u t o f f t h e s es p e c i m e n sw e r et r e a t e dr e s p e c t i v e l yw i t hr e g u l a rp r o c e d u r e so fp a r a f f i n s e c t i o n sa n dt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e ( t e m ) t h ep a r a f f i ns e c t i o n sw e r es t a i n e d b yd e sa n d v i mi m m a n h i s t o c h e m i s t r y n l eu l t r a s t r u c t u r eo fm u s e l e sw e r e o b s e r v e db yt e m r e s u l tf 1 ) c m ：d e sa n d mo f c mc o n t i n u o u s l yd e c r e a s e df r o mo ht o2 4 ha f t e rs e a n dt h ei n j u r yc h a n g e sw e r ef o u n di nc m u l t r a s t m c t u r e 4 8h o u ra f t e rs e ，d e sa n dv i m o fc mb e g a nt oi n c r e a s ea n dt h ei n j u r yc h a n g e so fu l t r a s t r u c t u r ei m p r o v e d n l i s r e s e a c h e da l s of o u n dt h a td e sa n dv i mo fc mc o n t i n u o u s l yd e c r e a s e dt ot h el o w e s t d o i n ta n dt h ei n j u r yc h a n g e so fc m u l t r a s t r u c t u r # w e r ew o r s ti n3 ha f t e rl a s ts w i m m i n g o fs c d e a n d2 4 ha f t e rl a s ts w i m m i n go fs c d e ，t h ee h a n g e so fd e s ，v i ma n d u l t r a s t r u c t u r ei m p r o v e di nc m a f t e re s t d e s ，v i ma n du l t r a s t m c t u r ei nc mo f l i th a d n os i g n i f i c a n tc h a n g e sc o m p a r e dw i t he t c b u td e sa n dv i mo fc mi n c r e a s e d o b v i o u s l ya n dp o s i t i v ec h a n g e sw e r ef o u di nu l t r a s t m c t u r ea f t e rm i t a f t e rh i t d e s a n d mo fc mi n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yc o m p a r e dw i t he t c a n dt h ei n j u r yc h a n g e s w e r eo c c u r r e di nu l t r a s t r u c t u r e r 2 ) s m ：t h er e s u l t ss h o w e dt h a td e so fs mc o n t i n u o u s l y d e c r e a s e dt ol o w e s tp o i n tf r o mo ht o2 4 ha f t e rs e v i mo fs mi n c r e a s e da n dt h ei n j u r y c h a n g e sw e r ef o u n di nu l 蛐c t u r e 4 8h o u ra f t e rs e ，d e sb e g a nt oi n c r e a s ea n dv i m i n c r e a s e dt ot h eh i g h e s tp o i n t m e a n w h i l et h et h ei n j u r yc h a n g e so fu l t r a s t r u c t u r ew e r e a l l e v i a t e d a t i e rs c d e , t h ec h a n g eo fd e sa n d mo fs mw a ss i m i l a rt os e i n8 - w e e k e s t - d e s ma n du l t r a s t m c t u r ei r ls mo fl i th a dn oo b v i o u sc h a n g e sc o m p a r e dw i t h e t c i i l t d e sa n dv i mo fs mi n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ya n dt h eu l t r a s t r u c t u r eo fs m h a d p o s i t i v ec h a n g e s i nh i t d e s d e c r e a s e da n dv i mi n c r e a s e d m e a n w h i l et h e u l t r a s t r u c t u r eh a di n j u r yc h a n g e s ( 3 ) s m m ：t h er e s u l t ss h o w e dt h a td e s ，v i ma n d u l t r a s t m e t u r eo fs eh a dn os i g n i f i c a n tc h a n g e sc o m p a r e dw i me c b t i ta f t e rs c d e d e s a n dv i mo fs m md e c r e a s e da n du l t m s t m c t u r eh a di n j u r yc h a n g e s i n8 - w e e ke s t ， d e s v i ma n du l t r a s t r u c t u r ei ns m mo fu th a dn os i g n i f i c a n tc h a n g e sc o m p a r e dw i t h e t c i nm i t , d e sa n dv i mo fs m mi n c r e a s e do b v i o u s l ya n dt h eu l t r a s t r u c t u r eo fs m m h a da d a p t a b l ec h a n g e s i nh ，r d e sa n d 衍md e c r e a s e dr e m a r k a b l y a t 曲es a m et i m e ! t h e i n i u r yc h a n g e sw e r ef o u n di nu l t r a s t r u c t u r eo fs m m c o n c l u s i o nn 1 d e sa n dv i ma r et h ee s s e n t i a li n g r e d i e n t so ft h em u s c l ec e l l ，w h i c hi s i m p o r t a n tt om a i n t a i nc e l l sc o n s t r u c t u r ea n df i m c t i o n ；a n db o t l l t 1 1 ed e c r e a s ea n d i n c r e a s eo fi fc a nc h a n g et h eu l t r a s t m c t u r eo fm u s c l ec e l l ；( 2 ) s w i m m i n ge x e r c i s e sw i t h 王鑫：游泳运动对大鼠肌细胞中间纤维和超微结构的影响 5 d i f f e r e n tt i m ew i l lh a v ed i f f e r e n te f f e c t so ni fa n du l t r a s t r u c t u r eo f t h em u s c l e ； b o t ht h ed e c r e a s ea n di n c r e a s eo fi f , t h eu l t r a s t r u c t u r eo fm u s c l ec e l lh a v ed i f f e r e n t c h a n g e ( 3 ) i fa n du l t r a s t r u c t a r eo f m u s c l ec e l lh a v ed i f f e r e n tc h a n g eo n t h ed i f f e r e n t t i m ea f t e rs w i m m i n ge x e r c i s e k e yw o r d ：r a t ；e x e r c i s e ；s w i m m i n g ；c a r d i a cm u s c l e ；s k e l e t a lm u s c l e ；s m o o t h m u s c l e ；d e s m i n ；v i m e m i n ；m e a no p t i c sd e n s i t y ；p e r c e n t a g e o fs t a i n e d a r e a s ； u l t r a s t r u c t u r e 扬州大学硕士学位论文 肌细胞中间纤维的研究概况 6 一、前言 细胞骨架是指真核细胞中的蛋白纤维网架体系。其原始的概念是1 9 3 2 年 k o l t z o f f 首先提出的，而直到1 9 6 3 年，采用戊二醛常温固定，在电镜下发现微管 后，才逐渐认识到细胞骨架的存在。广义细胞骨架是指细胞外骨架、细胞膜骨架、 细胞质骨架和细胞核骨架，而狭义细胞骨架仅指在细胞质骨架，包括微丝、微管 和中间纤维( i n t e r m e d i a t ef i l a m e n t ，i f ) 。细胞骨架不仅在维持细胞形态，保 持细胞内部结构的有序性中起重要作用，而且与细胞运动、物质运输、基因表达、 细胞分化等生命活动密切相关。细胞骨架的研究使人们对生命活动的基本单位一 一细胞的结构和功能有了新的认识”3 。 许多年来，人们发现在细胞内存在着无分支并贯穿细胞质内的纤维结构，它 们的直径约为l o n m 介于微管和微丝之间。以前人们认为是微管的降解产物，直到 近二十年才逐渐认识到这就是i f 。它能够抵抗p h 、温度、盐浓度的变化，是细 胞骨架中最稳定的成分，它比微丝更有延展性，比微管更能承受压力，这一特性 决定了它在细胞内和细胞间连接支撑上起最主要作用”“1 。通过免疫细胞化学和 电镜观察，发现i f 与许多细胞结构有明显的联系，如与桥粒、细胞核、胞浆膜、 平滑肌密体、微管、脂细胞脂小体等相连，并且认为i f 与细胞空间的机械完整和 细胞基质的骨骼框架作用有关1 。近年来，发现了许多i f 的功能，包括作为细胞 内空间力量支持者和机械整合作用、对细胞形状的影响、为生化反应提供机械支 架、涉及细胞内运输、基因表达调节和信号传导等“” 肌细胞( 心肌、骨骼肌、平滑肌细胞) 作为高等动物的重要细胞，与其生命 活动息息相关。近年来，关于肌细胞i f 研究的报道很多，本文就目前肌细胞i f 的研究概况作一个介绍，为以后的工作指明方向。 二、各种肌细胞if 的形态和功畿研究 根据基因组结构和氨基酸序列的同源性把中间纤维蛋白分为5 个不同的基因 家族( i v 型) ，它们以组织特异性方式表达“”“。在不同的肌细胞( 心肌c m 、 骨骼肌s m 和平滑肌s m m ) 中，i f 的表达也不同时( 表1 ) 。 表l 不同肌细胞中i f 的表达 王鑫：游泳运动对大鼠肌细胞中间纤维和超微结构的影响 7 从表1 可以看出，d e s 是肌细胞特异性的i f 蛋白，其分子量在哺乳类动物中 为5 1 k ，鸟类为5 0 k ，纤维直径约为i o o a 。根据等电点的不同，它分为两型( a ，b ) ， 这种差别是由于磷酸化程度不同导致的，与氨基酸结构没有关系。无论是鸟类还 是哺乳类动物，d e s 基因都是单拷贝基因，且性质稳定，高、低离子浓度溶液中都 不容易被从细胞中提取出来“。d e s 在肌肉中，主要存在于横纹肌细胞( c m 和s m ) 的z 线和平滑肌细胞的致密体中。d e s 的蛋白丝在z 线形成了一个特殊的三维脚手 架结构( t h et h r e e d i m e n s i o n a ls c a f f o l d ) 。通过该结构，d e s 不仅作为收缩单 位的肌纤维整合成一个整体，使力能沿着纤维轴的任何方向传递，并且，在肌细 胞内部，d e s 还使z 线与细胞核膜、线粒体膜等连接在一起“”( 图1 ) 。波形蛋白 ( v i m ) ，分子量约5 3 k d ，也为单拷贝基因，广泛存在于间充质细胞及中胚层来源 的细胞中。胚胎时期，v i m 曾与d e s 在细胞中共同表达，但随着肌细胞的不断成熟， v i m 在肌肉细胞中的含量急剧下降，只存在与肌肉组织的问质细胞和少量平滑肌细 胞中。“。波形蛋白除了单独形成波形蛋白纤维外，主要是与其他的中等径纤维 ( d e s 、角蛋白c k 、神经纤维蛋白、胶质纤维酸性蛋白) 结合，发挥不同的作用。其 他i f 蛋白并不是肌肉组织特异性蛋白，且有的含量较低，功能还有待进一步探索 研究。 图ld e s 在横纹肌组织中位置情况 圈l 显示7d o s 在横纹既组织中位置情况，p e s 主要位于横纹飘的z 线上，并通过b e s 纤维 与相邻肌小节、线粒体和细匏棱等相连接使既囱的收缩单位整合或一个表机的整体。 本函强用自p a t e lt j , , e ta 1 f o r c et r a n s m i s s i o ni ns k e l e t a lm u s c l e f r o ma c t o m y o s i nt o e x t e r n a lt e n d o n s e x e r cs p o r t fr e v , 1 9 9 7 , 2 5 ：3 2 1 3 6 3 2 1 心肌 扬州大学硕士学位论文 在成熟的心肌组织中，i f 蛋白主要为d e s ，约占心肌i f 的9 0 ，分布于整个 心肌细胞中，在闰盘处浓聚；其次为v i m ，约占心肌i f 的1 0 ，主要分布于心肌 结缔组织中m “。在心肌细胞中，d e s 主要位于z 线边缘，形成纵横交错的三维网 状结构。横形网络形成环状带，在z 线环绕肌纤维，在z 线之间形成侧连接，且 核膜与肌膜间相互连接；d e s 纵形纤维在肌纤维间隙与肌纤维平行走向，连接线粒 体，并终止于心肌闰盘的桥粒。d e s 对心肌细胞收缩装置和细胞器的位置的固定有 着重要的作用，并将心肌细胞整合成一个收缩的整体，使肌细胞在收缩和舒张过 程中保持正常结构。另外，在心肌细胞中，d e s 与核骨架联系最密切，形成特有的 中间纤维d e s 核衬层( 1 a m i n a ) 核骨架系统，这提示d e s 在核质物质运输、 信号传递等方面起到重要作用。还有研究表明，d e s 还可能与闰盘膜生物合成有联 系，提示其对心肌细胞电生理活动有一定的影响o ”1 。 如何观察i f 在生物体内的功能成为近年来一个科研热点，其中，最常用的方 法就是，利用基因重组技术敲掉( k n o c k o u t ，k o ) i f 基因、观察i f 显性遗传缺 失给机体带来的变化，从而分析i f 在生物体内的功能4 “。 利用基因重组技术除去组织中的d e s ，观察无d e s 给机体带来的影响，可以 观察到d e s 显性遗传缺失 d e s ( 一) 的小鼠是可以存活的，但它的多个肌肉器 官受损，其中心肌组织损害最为严重。可见到心肌肥大和心肌广泛的坏死、钙化， 心肌肌原纤维紊乱，z 线流和过度收缩等，肌管也出现扩张现象“4 ”。这些表现在 小鼠出生后2 到3 周的右心室最为严重。损害的心肌纤维被分散开，且被间质细 胞和纤维组织所包绕。作为相邻心肌细胞连接区的闰盘，也受到了影响。闰盘外 形较正常更为狭长，与闰盘相连的肌原纤维减少了。而作为i f 附着点的桥粒也减 少了。细胞器也有相应的变化，其中以线粒体最为突出。心肌线粒体肿胀，嵴上 物质减少，并且线粒体在肌原纤维问异常积累，尤其在心肌工作超负荷后表现更 为明显”7 “。在测定d e s ( - 0 的小鼠心肌的机械功能时发现，其心肌心室舒张 压升高，心室重量增加，增厚心室的最适心室舒张期容积增加，心肌收缩蛋白肌 球蛋白和肌动蛋白没有改变，c 矿的敏感性没有改变，但心肌每搏出量降低“，这 些都说明，d e s 缺失后，心室壁增厚，心肌细胞排列紊乱，心脏结构发生重塑，心 肌功能退化。可见，在体内，d e s 对心肌细胞力的产生和力的传递有着重要的影响。 2 2 骨骼肌 在成熟的正常肌肉组织中，d e s 分布于整块肌肉内，在神经肌肉交接处的皱褶 和邻近肌肉肌腱交接处的肌浆中浓聚：v i m 仅出现于肌内膜、肌束膜和肌外膜连接 组织中的成纤维细胞，在肌细胞中并不存在：n e s t i n 分布于神经肌肉交接处下方的 肌浆中和肌肉肌腱交接处的附近，在切片中也表现为与d e s 相似的横纹结构。研 究表明，n e s t i n 和d e s 在神经肌肉接点处的皱褶和邻近肌肉肌腱交接处的胞浆中 浓聚，可以加强高张力条件下的结构稳定性。 在肌肉横向切片中，d e s 围绕着z 线呈网状形式。纵向切片中，d e s 在每个 肌小节之间呈周期性规则横带状排列，并延伸至肌纤维的边缘”。d e s 连接于z 线之间，同时也连接线粒体、细胞核和肌膜。d e s 利用连接z 线而使单个肌原纤 维连接起来，将收缩运动机械地整合在一起，并在细胞内收缩蛋白间架起平行交 错的网络结构，力能沿纤维轴的方向传递，最后，网络结构将各种方向上的力汇 王鑫：游泳运动对大鼠肌细胞中问纤维和超微结构的影响 9 集在连接组织中。d e s 这样的分布特点，还使得它能限制肌节在肌肉收缩时被过分 牵拉 d e s ( 一一) 的小鼠的骨骼肌在出生后也出现严重的损害，尤其是那些负重肌 ( 如比目鱼肌) 和持续工作的肌肉( 如横膈肌) ”1 。这些肌肉在电镜下表现为 肌原纤维排列紊乱，不成直线，z 线流，线粒体肿胀等。而d e s ( 一一) 的骨骼肌 特异性标志就是肌原纤维与细胞膜联系的固定装置的丢失，同时神经肌肉接头处 也有结构上的改变，表现为接头后膜( p o s t j u n c t i o n a lm e m b r a n e ) 或终板膜 ( e n d p l a t e m e m b r a t e ) 凹陷形成的皱褶的减少。同时，在研究d e s ( ) 的小鼠骨 骼肌的功能时发现，这些肌肉和正常的骨骼肌相比，产生力小，并且容易疲劳”1 。 在高强度运动下，d e s ( 一- _ ) 小鼠的骨骼肌产生的张力下降的比正常的骨骼肌快， 但这种缺陷在注射了5 m m 的咖啡因就可以弥补了：而5 m m 的咖啡因对正常老鼠骨 骼肌等长收缩产生的张力是没有影响的。咖啡因的作用是刺激肌浆网释放c a 的 ”，这提示d e s 可能对骨骼肌收缩的激发过程有一定的作用。同时发现，d e s ( - - 一) 的小鼠骨骼肌的粘滞度增高，产生的收缩力下降4 “。 2 3 平滑肌 平滑肌中的i f 主要存在于密体中，相邻的密体( d e n s eb o d y ) 之间的中间丝 彼此相连，构成平滑肌的菱形网架。这个i f 形成的菱形网架，对整合平滑肌细胞 质蛋白、稳定平滑肌细胞结构、收缩力的传递，以及与细胞外基质的信号传递等， 都有着重要的作用。 虽然机体内不同部位的平滑肌细胞在形态学上有相似的结构，但已证实，部分 平滑肌细胞在生物化学及免疫学上存在异质性o “叫，表现为细胞i f 蛋白表达的不 同。”。对成人及胎儿平滑肌细胞中间纤维蛋白的研究表明，血管平滑肌细胞主要有 d e s ( + ) v i m ( + ) ( d e s 和v i m 都为阳性表达) ，d e s ( 一) v i m ( + ) ( d e s 阴性表达而v i m 阳性表达) 及d e s ( + ) v i m ( 一) ( d e s 阳性表达而v i m 阴性表达) 3 种不同的表型”。 。近年的研究使人们逐渐认识到，许多组织，特别是胎儿组织，能同时表达两种或 两种以上的中间丝蛋白0 5 ，称之为共表达现象( e o e x p r e s s i o np h e n o m e n o n ) 在共 同表达的两种中间丝蛋白中，波形蛋白通常是其中之一。在胎儿组织中，两种或两 种以上的中间丝蛋白同时表达在一种组织中是很常见的现象，是细胞分化在某一 阶段的表现1 。在成人组织，波形蛋白与其它中间丝蛋白的同时出现，常与细胞的 增殖活跃有关。如主动脉平滑肌就同时表达d e s 和v i m ，因此主动脉平滑肌随年 龄的增长而增殖“0 1 。另外，d e s 还是平滑肌细胞成熟的标志“。值得注意的是， 在d e s 和v i m 同时表达的血管平滑肌中，当d e s 减少或者缺失时，v i m 并没有出 现代偿性增加，与致密斑相关的蛋白也没有出现代偿性增加”“。 对d e s ( 一一) 的小鼠平滑肌功能的研究主要集中于血管平滑肌。d e s ( _ 一一) 的小鼠颈动脉平滑肌表现出发育不全和退化“，电镜下，细胞质中的密体和膜下 的密斑都有减少的，核周物质减少，线粒体肿胀，平滑肌细胞象手指样结构的突 出的周长减少，即细胞丧失了一些与细胞外基质的联系。d e s ( 一一) 的小鼠血管 的功能也发生变化，颈动脉在相同压力下扩张时血管的直径下降，血管壁的粘滞 性增高“，但动脉的厚度并没有多大改变，这主要因为动脉的弹性蛋白和骨 胶原没有改变。通过肌动描记仪研究动脉的张力时发现，d e s 缺乏时，动脉主动和 扬州大学硕士学位论文 被动的张力都有影响。实验发现，d e s ( 十) 的动脉在1 5 0 0 m m h g 压力下就裂开了， 而正常的动脉要在2 1 0 0 m m h g 的压力下才裂开。d e s 在微型血管( 如肠系膜微动脉 等) 中的浓度比在大血管( 主动脉等) 中的浓度高，推测d e s 卜一) 对微血管影 响较大，甚至对动脉血压也产生影响。1 。 2 4 肌肉发育过程中的i f d e s 是出现在心脏和体节中最早的肌源性标志物之”“1 。实验证实d e s 在肌 源基因提交和分化上，扮演一个调控的角色”“1 。抑制d e s 的表达，不但可以阻 止成肌细胞的融合，同时也减少了肌源性基因转移因子m y o d 表达”。 在心肌发育过程中，心肌细胞内多种i f 是共同表达的”1 。通过免疫荧光技 术可以发现“，d e s 呈许多沿着心肌细胞长轴平行排列的线条状结构，细胞内线条 分布均匀，且线条上有排列较规则的横纹结构。而v i m 也为许多平行排列的线条， 线条之间有少量联系。整个v i m 呈一网状结构遍于细胞质，随着逐渐分化成熟， v i m 从心肌细胞内逐步消失，最终只出现在心肌结缔组织中，而d e s 则在z 线附近 形成一个类似脚手架的三维结构。 在骨骼肌发育过程中，n e s t i n ，v i m 和d e s 共同位于同一网络”，如同心肌 发育一样，开始时v i m 和d e s 分布于细胞质中，形成平行于细胞长轴的纵条结构。 当分化超过肌管阶段后，v i m 逐渐消失，d e s 则成为骨骼肌肌肉中主要的i f 蛋白。 d e s 中间丝网从纵向转变成占主导地位的横向与z 线连接”2 ”1 由于平滑肌细胞中的i f 蛋白表达不同，因此在发育肌中也有不同的表现。一 般来说，在胚胎发育过程中，未分化平滑肌细胞首先只表达v i m ，随着发育逐渐成 熟，d e s 才开始出现，且表达逐渐增强，故同时表达v i m 和d e s ；待平滑肌细胞成 熟后，或表达某种蛋白，或者仍旧共同表达。“”1 。具体机制还待证实。 2 5 肌肉再生过程中的i f 在成熟肌细胞中，再生能力最强的细胞是骨骼肌细胞。骨骼肌再生肌纤维是 从相邻肌纤维基底膜下的卫星细胞发展而来。肌纤维可由于多种原因引起坏死， 但只要它们的基底层，血管和卫星细胞仍保持完整，骨骼肌卫星就会被激活，它 们分裂、融合，最终形成肌小管，而肌纤维随着卫星细胞的激活而再生。国外众 多学者利用向肌肉中注射毒素、进行过度训练等方法，建立肌肉损伤再生的模型， 以研究再生过程中骨骼肌i f 的变化“7 7 。7 。大量实验表明，d e s 的分布和重排在 再生肌纤维和胎儿肌生成发育中遵循同样的路径。d e s 在再生肌纤维中数量增加， 也和v i m 和n e s t i n 短暂地共同表达，而在坏死纤维中下降。d e s 表达因此也被 认为是辨别再生肌纤维的一个有用的诊断工具m 。而骨骼肌i f 在骨骼肌损伤后 再生过程中肌纤维排列的规则化、促进肌管细胞融合等方面起到积极的作用。 通常认为成熟的心肌细胞是终末分化组织，不象成熟的骨骼肌细胞那样，在 损伤后具有自我增殖修复的能力，心脏内没有干细胞，心肌受损伤后，只能形成 疤痕组织来修复4 ”。最近的研究显示，心肌梗死后，有少量心肌细胞发生分裂增 生，其过程与胚胎时期心肌发育过程类似，但这些少量的心肌细胞不能完全修复 心肌组织”1 。现在临床上主要还是应用骨骼肌卫星细胞移植术、骨髓问质干细胞 移植和胚胎干细胞移植等来治疗心机梗死后的心肌再生8 3 。不论哪种治疗方法， i f 都在其中起到一定的作用：判断提取的是否是骨骼肌卫星细胞的方法，就是通 王鑫：游泳运动对大鼠肌细胞中间纤维和超微结构的影响 1 1 过免疫组化的方法看这些细胞是不是d e s 阳性；国内的实验中，将骨髓间质干细 胞移植到大鼠心肌梗死区域，在移植后4 8 周发现，在心肌梗死区域出现较多的 幼稚心肌细胞，呈梭形，而在移植后2 4 时，在心肌梗死区发现d e s 阳性表达， 周围间质细胞为阴性，而正常的骨髓间质干细胞是没有d e s 表达的”：胚胎干细 胞是目前发现的唯一的全能干细胞，可以分化成体内所有的组织和细胞，即它在 不同的部位可以分化为不同的组织和细胞，但这种全能干细胞转化成心肌细胞受 到多种因素影响的，目前还没有找到能够使胚胎干细胞完全分化成心肌细胞的方 法。k e h a t 。”等在体外培养胚胎干细胞时发现，有8 1 的细胞出现节律性收缩， 并聚集形成一跳动的细胞团，这些细胞具有和心肌细胞类似的动作电位的变化， 而这些细胞团d e s 染色是阳性。以上事实似乎可以说明，d e s 是最早表达于未分 化肌母细胞的肌源性蛋白，是肌源性细胞的标志性结构，通过检测心肌梗死区域 中d e s 阳性与否，来判断移植是否成功，移植细胞有没有向心肌细胞分化的倾向。 在体内，在正常的血流应切力的作用下，正常的血管平滑肌是处于一种代谢 较低的状态，而这种状态是以细胞的休眠期和i f 正常表达为特征的。当机体动脉 由于某种原因发生损伤时( 如发生动脉硬化) ，血管内的平滑肌也会受到损害，经 过损伤期后，血管平滑肌可以出现增殖，但在增殖的平滑肌细胞中，d e s 的表达是 下调的”3 。d e s 在增殖平滑肌细胞中的作用还有待进一步研究。 三、肌细胞i f 与疾病 几种肌肉和神经障碍的人类疾病，与中间纤维异常有关。例如，d e s 相关肌 病，通常涉及过量d e s 引起的非正常沉积”“1 ，如i i 型糖尿病，脊柱肌萎缩症， 晶状体中v i m 和d e s 的过度表达已经表明会导致白内障形成和晶状体细胞死亡 1 0 0 。d e s 染色被广泛用于鉴别与肌细胞相关或含肌细胞的肿瘤”。 ( 1 ) d e s 相关肌病( d e s m i n r e l a t e dm y o p a t h i e s ，d r m ) d r m 是一组涉及心肌、骨骼肌和平滑肌异常的疾病“，是一种散发的、家庭 性的、有着不同临床表现的神经肌肉疾病，特点为d e s 所形成的三维网络结构的 消失，取而代之的是d e s 在肌纤维中异常聚合，病理性增加。现在研究表明，d r m 与d e s 基因错义突变和删除有关。临床特征表现为一个或多个系统的疾病，如骨 骼肌肌病、心肌病、神经性肌病和平滑肌紊乱等。心脏的损伤一般先于其他系统， 且表现的较为严重，主要为传导异常、心律失常和充血性心力衰竭等，同时还发 现心肌闰盘发生了重塑“”。 ( 2 ) 心脏疾病与i f 在心肌肥厚和心力衰竭时，d e s 丝排列紊乱，横纹消失，d e s 和v i m 的含量增 加，而收缩蛋白( a c t i n 等) 减少“”。”。因为d e s 和v i m 是支持蛋白，它们的含 量增加，将增加心肌细胞的内部负荷，造成细胞收缩和舒张障碍，推动心衰向前 发展，这可能是肥厚心肌功能降低的原因之一”“1 。 在心肌缺血性疾病研究中可以观察到，d e s 在心肌缺血1 5 分钟后就可在心肌 细胞中发现小灶性缺失，在2 小时内，d e s 缺失的面积随时间的延长而增加，在2 小时后，d e s 缺失已经比较完全。而v i m 在心肌缺血2 小时内，并没有太大变化， 扬州大学硕士学位论文 2 小时后，v i m 在心肌组织中可见减少“”。现在在临床上，d e s 已经作为判断心 肌早期缺血敏感而又可靠的指标之一，同时在法医鉴定中也有重要的辅助作用“” 1 1 0 ( 3 ) 骨骼肌相关疾病 在d u c h e n n e 氏肌营养不良的病人，可见d e s 横带丢失，这可能因为肌原纤 维被压缩或拉长，d e s 难以抵抗压缩和营养不良肌拉长所产生的过度拉力，由此 d e s 偏离正常的位置，无法维持肌原纤维横向的定位“3 。 ( 4 ) 血管疾病： 血管中平滑肌细胞i f 蛋白表达的异常，能够导致血管功能的异常。在人的腹 主动脉瘤时，由于主动脉中的平滑肌的d e s 丢失，导致细胞骨架蛋白的改变，以 致破坏腹主动脉结构而削弱了抗压性，在高速血流作用下而呈现渐进性局限性扩 张。如果在动脉内膜平滑肌细胞的d e s 含量多，那动脉就很少发生动脉粥样硬 化，提示d e s 有抗动脉粥样硬化( a s ) 的作用“”1 。 四、运动与肌细胞l f 4 1 肌细胞i f 缺乏对运动能力的影响 基因敲除术和转基因动物的实验已经表明基因的缺乏或某一突变结构蛋白的 表达对运动有各种各样的负面影响。例如：有人发现，非随意游泳训练导致d e s 基因敲除鼠5 0 的死亡率，d e s 基因敲除鼠后肢比天然鼠的后肢产生的力量弱且更 容易疲劳“1 1 6 。h a u b o l d “1 等人研究了野生鼠和d e s 基因敲除鼠在随意的转笼跑 和被动的跑台的运动表现。实验表明，d e s 基因缺乏会对小鼠承受急慢性运动带来 不利影响，这有可能是d e s 基因敲除鼠由于缺乏d e s ，造成心肌、骨骼肌肌原纤维 紊乱、肌肉收缩装置被破坏，肌肉产生的力量减弱，力的传递也发生障碍，导致 运动能力下降：同时也可能是，d e s 的缺乏影响了心肌和骨骼肌线粒体的功能，线 粒体功能下降反过来影响有氧运动能力。d e s 基因敲除降低了心肌和骨骼肌线粒体 的功能“”“。因此，d e s 在力的传递和稳定肌原纤维的结构成分以及锚定细胞器 的位置中所起的作用似乎比单纯在运动中防止由于机械外力损伤更重要。 4 2 运动对肌肉细胞i f 的影响 目前，研究运动对肌肉细胞i f 的影响主要集中在离心运动对骨骼肌i f 的影 响上。许多学者观察到大强度离心运动后，出现d e s 丢失的现象“”2 1 。例如， l i e b e r 等使用在兔后腿皮下植入电极刺激坐骨神经，使后腿产生离心收缩，观察了 兔胫骨前肌和趾长伸肌中d e s 随时间变化而丢失的情况。”1 。k o m u l a i n e n 等以雄性 大鼠胫前肌被动拉长收缩，发现d e s 阴性纤维出现在离心运动后6 h ，4 天后d e s 阴性染色最严重“。 肌原纤维z 盘被认为是收缩力的弹性成分和细胞骨架的结合点，在主动的和被 动的力的传递中扮演了个关键角色“2 。”，同时，z 盘也被认为是在肌原纤维中 最薄弱的部分“”。大运动量训练( 特别是离心运动) 会产生运动性肌肉损伤，导 致骨骼肌超微结构的破坏，其中主要包括z 线变化，按程度不同依次出现锯齿样 变化，z 线流，z 线溶解和肌原纤维蛋白成分消失，局部z 线消失，z 线受破坏。 王鑫：游泳运动对大鼠肌细胞中间纤维和超微结构的影响 旦 这些变化必然会导致z 线附近的i f 蛋白如d e s 等的变化。一般认为：肌原纤维损 伤如z 线流和d e s 细胞骨架破坏是离心运动诱导损伤的形态学标志“。1 为什么离心运动导致骨骼肌i f 蛋白变化呢? 这可能由于肌肉收缩时肌小节长 度可有1 的变化，肌肉收缩时，肌节间的运动速度就不一致，根据k a t z 速度一力量 关系曲线在向心收缩时，相邻的肌节间所受到的张力的差异只有1 2 最大张力， 而在离心收缩时的差异可达5 0 ，甚至超过肌节所能承受的最大张力值”1 ，离心收 缩时这些负荷加在z 线上，就造成了z 线流变，z 盘的结构遭到破坏，d e s 介导的丝 状网络和肌节间的机械整合作用发生在z 线水平，肌动蛋白和肌球蛋白相互作用 产生的力传出肌节时，不仅沿着肌原纤维传到肌肉一肌腱接点，而且呈放射状由 整个肌纤维传输到肌纤维表面“”1 。因此，离心运动时肌肉产生的力就可以作用于 d e s 网络，并可能使其破裂。 但是，也有学者在研究中发现运动后，骨骼肌i f 其他的变化规律。y u “”1 等使 用免疫组化方法分析人体在离心运动后发生延迟性肌肉酸痛的情况，在肌肉活检 中惊奇地发现，在离心运动后2 “