（运动人体科学专业论文）补肾健骨中药对女性运动员骨组织保健的机理研究.pdf

补肾健骨中药对女运动员骨组织保健的机理研究 a b s 扛a c t o b j e c t i v e ：1 oc u l t i l 他r a to v 面a ng r a n u l 缸c e l l s 越l do s t e o b l a s t si nv i t r o ，t 1 1 i s e x p r e m e mi s o b s e r v e dl l l ee f r e c t so fa b s t r a c t i v ep a r t so fd u z i l o n gl e a v e sa n di t s c o m p o n c n t so nm ee s 呐g e np r o m l c t i o ni nc u l t i l r e dr a to v 撕a ng 砌u l a rc e l l s ，w h i c h h e l p st op r o b ei i i t om em e c h a n i s m 也a ta b s t m c t i v ep 甜t so fi ) i | z h o n gl e a v e sp r e v e n t s p o s n l l e n o p a l l s mo s t e 叩o r o s i s m e t h o d ：r a to v a r i a l lg r a n u l 盯c e l l sw e r ec l i i t u r e di i ld m e mm e d i l l n la 髓r2 4 h o i u s ，d i 珏b r ；e n tc c e n 打a t i o n so fa t ，s 1 t i v ep a r c so fd l l z h o n gl e a v e sw e a d d e dt o t h em e d i 姗a n do v a r i 觚g r a n u l a rc e l l sw c r ec u l t 毗e df o r4 8h o u 墙c e l l s m i l l t i p l i c a t i o nw 嬲m e a s i | r e db ym ，e s t f a d i o li nd i 仃e r e mm e d i l l l l lw c r cm e 笛u r e d b ye m 可m ei m m u n o 舔s a y p r i m a 巧o s t e o b l 勰吐cc e l l sw e f c o b s t a i l l e df 如mt i i ec a l v a r i a o f w b o ms dm t sb yd i g e s t i o n 晰t t lo 1 c 0 1 l a g e n a s ea n dc u l t u r e di nd m e m m e d i 岫o v a f i 锄g f a n u l 盯c e l l s 柚do s t e o b l a s t s 、v i t l l2 ：1 锄d1 ：2 w e r ed i r 。c t l y c o c i l l t i 玎e df o r7 2h o u r s a l pi nc u l t i l f em e d i u m b yo s t c o b l a s t 、糊st e s t e d r e 蛐i 缸：a f ho v 碰锄g r a n l l l a rc e l l sw e r ec u l t u r e df o r4 8h o u r s ，a b s n a c t i v ep a r t s o fd u z h o n gl e a v e si n c r c 硒e de s 州i o lp 刚u “o n c o m p a r c dw i t l lt l l eb l a n k 黟d u p ， a b s t r a c t i v ep a r t so fd u z h o n gl e a v e sc o i i l dp r o m o t et h eq u a i l t i t yo fe s t r a d i o la ta c o n c e n n a t i o nl o 。5 9 m l ( p 2 d 3 水平，促进肠钙吸收h 9 l ；增强成 骨细胞活性，使骨形成增加，实验表明补肾中药町提高大鼠血清中骨钙素( b g p ) 的含量【5 0 j ：抑制破骨细胞增殖分化，减少骨吸收川；调节机体内环境微 量元素平衡，促进矿物质在骨中的沉积。进而发挥抗骨质疏松韵作用1 5 2 l ， 1 3 3 结语 现代医学治疗骨质疏松的药物存在严重的毒副作用，患者难以长期服用，且 药物费用昂责，许多患者难以负担。而祖国医学根据率医“肾主骨”韵理论，针 对原发性骨质疏松病因病机的特点，中医采用以补肾为基础加减论治，取得了较 好的疗效。具有西药不可替代的优势：中药治疗疗效确切，尤其在改善患者 疼痛等裕床症状方面，尤为显著。中药治疗副作j j 稆对较少，患者易于接受。 中医中药治疗费用相对较低，患者能够承受。因而，为了更好的发挥补肾中 药治疗原发性骨质疏松的优势，进一步深入临床和实验研究，制定规范化的原发 性骨质疏松症辩证标准十分必要。 2 实验研究的目的和意义 目的：本研究通过体外分别培养大鼠卵巢颗 细胞、成骨细胞与共同培养这 两种细胞，测定与分析杜仲叶提取物对大鼠颗粒细胞产生雌激素的影响，进一步 观察与分析颗粒细胞所产生的雌激素对成骨细胞分泌碱性磷酸酶( a l p ) 的影响， 从细胞与分子水平探讨补肾健骨中药杜仲叶提取物对i 型骨质疏松症的防治机 理，为保护女性运动员骨组织健康提供营养保健依据。 意义：( 1 ) 从骨组织损伤与保健的角度关注女性运动员的健康。( 2 ) 为补肾 健骨中药杜仲叶用于保护调养女性运动员骨组织健康提供理论依据。( 3 ) 采用现 代生物技术研究分析了杜仲叶提取物作用于成骨细胞、卵巢颗粒细胞的多位点调 节骨代谢的机制。 3 实验研究 3 1 杜仲叶提取物对体外培养的大鼠卵巢颗粒细胞增殖和分泌 激素的影响 3 1 1 实验动物：2 l 2 5 同龄未成年雌性s d 大鼠1 0 只，健康状况良好，清洁 补肾健骨中药对女运动员骨组织保健的机理研究 级，由江西医学院实验动物中心提供。 3 1 2 主要试剂 d m e m 培养基 胎牛血清1 0 0 l l l l 胰蛋白酶2 5 9 型胶原酶l o o m g 噻唑蓝( m t t ) 5 0 0 m g 吐温8 0 二甲基亚砜( d m s 0 ) 注射用血促性素( p m s g ) 定量e 2 酶联免疫诊断试剂盒 碱性磷酸酶试剂盒 3 1 3 主要仪器与器材 超净工作台 倒置显微镜 解剖显微镜 c 0 2 培养箱 9 6 孔培养板 低速离心机 数显恒温水浴锅h h - 4 超声波清洗机 电子天平 全自动酶标仪 半自动生化分析仪 手术器械( 剪刀、镊子、跟科剪、 3 1 4 方法 3 1 4 1 主要试剂的配制 ( 1 ) p b s 缓冲液： n a c i k c l 1 3 g i b c o 公司 杭州四季青生物工程材料有限公司 中国医药上海化学试剂公司 g i b c o 公司 普飞生物 天津市永大化学试剂开发中心 汕头市西陇化工厂 宁波市三生药业有限公司 北京北方生物技术研究所 北京中生公司 苏净集团安泰公司 o i y m p u s m o t i c s a n y o c o s t a r 深圳天南海北实业有限公司 国华电器有限公司 昆山市超声仪器有限公司 北京赛多利斯天平有限公司 b 1 0 1 e ki n s t r u m e n t s r n c 美国 眼科镊、手术刀等) 上海医疗器械厂 8 o g o 2 9 补肾健骨中药对女运动员骨组织保健的机理研究 n a 2 h p 0 一h ：o1 5 6 9 k h 2 p 矾2 o g 加三蒸水定容至1 0 0 0 l ，p h 值在7 2 7 4 ，高压蒸汽灭菌，4 保存。 ( 2 ) d h a n k 7 s 液： n a c l 8 0 9 k c l o 4 9 n a 2 h p 0 4 h 2 0o 0 6 9 k h 2 p 0 4o 0 6 9 n a h c 晚o 3 5 9 酚红o 0 2 9 加三蒸水定容至1 0 0 0 m 1 ，p h 值在7 2 7 4 ，高压蒸汽灭菌，4 保存。 ( 3 ) 胎牛血清：5 6 水浴灭活3 0 分钟。 ( 4 ) d m e m 培养液：d m e m 干粉l o 4 9 n a l i c 0 3 1 2 9 青霉素5 0 万单位 链霉素5 0 万单位 加三蒸水定容1 0 0 0 m l ，调p h 值在7 2 7 4 ，0 2 2 u m 微孑l 过滤除菌。4 保存。 ( 5 ) o 2 5 胰酶：称取o 0 2 5 9 胰酶溶于1 0 m ld h a n k 7 s 液中，调p h 值在 7 2 7 4 ，0 2 2 u m 微孔过滤除菌，一2 0 保存。 ( 6 ) m t t 配制：称取2 0 m g m t t 粉末溶于4 m l p b s 溶液中，过滤除菌，4 保 存。 ( 7 ) 杜仲提取物溶液的配制：杜仲总提物o 1 9 ，先用吐温8 0 溶解，再加d m 叫 培养液稀释到浓度为1 0 g m l ，取l m l l o g m 1 溶于9 m l d m e m 培养液中，配成 1 0 g m 1 ，同样的方法配成l o g m 1 。1 0 一g m l ，1 0 g m l 溶液，分别过滤除 菌，4 保存。对照组加等量的吐温8 0 。 3 1 4 2 大鼠卵巢颗粒细胞的体外分离培养 3 。1 4 2 1 动物处理：2 l 2 5 天龄的s d 雌性大鼠予晨8 ：o o 腹腔注射p m s g l 0 0 u 只，4 8 小时后断颈处死大鼠，获取卵巢细胞颗粒， 4 补肾健骨中药对女运动员骨组织保健的机理研究 3 1 4 2 2 颗粒细胞的培养： ( 1 ) 在进行实验前将实验区开紫外灯消毒5 0 分钟。 ( 2 ) 断颈锥处死大鼠，用7 5 酒精浸泡1 0 分钟，剪开腹部皮肤，暴露腹腔。 ( 3 ) 用眼科镊小心提起子宫，沿两条输卵管方向寻找卵巢，分离卵巢，然后小 心将卵巢放入盛有p b s 缓冲液的培养皿中。重复以上操作直至取完所有卵巢。 ( 4 ) 用眼科镊、剪进一步分离卵巢上所附着的脂肪组织，并尽可能地去除卵巢 上的小血管及血块。 ( 5 ) 用3 0 号针头固定卵巢，2 3 号针头刺破发育好的卵泡并轻轻挤压，以释放 颗粒细胞。 ( 6 ) 吸取含有颗粒细胞的悬浮液于离心管中，以2 0 0 0 转分的速度离心1 0 分 钟弃去上清液，沉淀中加3 m 1o 2 5 胰酶消化5 分钟，再加入含1 0 胎牛血清的 d m 明培养液1 m l 终止消化，离心1 0 分钟，弃取上清液，用d m e m 培养液漂洗2 次后，加入4 m l d m 刚培养液，用吸管轻轻吹打数次，制成颗粒细胞悬液。 ( 7 ) 将上述颗粒细胞悬液用2 0 0 目尼龙网过滤。收集滤液，将其2 0 0 0 转分离 心1 0 分钟，弃上清液，在沉淀中加入含l o 胎牛血清的蹦e m 培养液，轻轻吹打 均匀。 3 1 4 2 3 以台盼蓝染色法进行细胞计数及细胞活力检测，最终细胞存活率为 9 0 ，生长良好。 台盼蓝检测法，其原理是染料台盼蓝可穿透损伤或死亡细胞膜与解体的 d n a 结合并使其着色，而活细胞不能被染色，以此鉴别。本实验以细胞死亡率 在2 0 以下为正常接种细胞。力 法以o 4 的台盼蓝染色液，用血球计数板计数 按下式计算成骨细胞数 细胞数= 四大格细胞数之和，4 1 0 4 3 1 4 2 4 经上步得到的细胞准确计数后，用培养液稀释到2 1 0 5 阳1 ，按4 1 0 4 孔接种到9 6 孔培养板，每孔2 0 0 u l 细胞悬液，放入3 7 5 9 6 c 0 2 培养箱中培养。 待细胞基本贴壁后，进行实验，吸去培养上清，加入不含胎牛血清的d m e m 培养 液及各种浓度的杜仲提取物，每组6 孔，继续培养两天后进行操作。 3 1 4 2 5 收集每组各孔中的上清液，一2 0 保存待测e 2 。 补肾健骨中药对女运动员骨组织保健的机理研究 3 1 4 2 6m t t 法测细胞增值率： ( 1 ) 在上述吸掉上清液的培养板各孔中， 入1 0 u l m t t ，放入培养箱中培养4 小时。 ( 2 ) 4 小时后，取出培养液，吸掉上清， 混匀，4 9 0 波长读取吸光度，测定a 值。 3 1 4 2 7 培养液中e 2 水平测定方法， 加入1 0 0 u 1 蹦踟培养液，再加 在各孔中加入1 5 0 u l d m s o ，充分 ( 1 ) 将各种试剂移至室温( 1 8 2 5 ) 平衡半小时，取浓缩洗涤液，用蒸馏 水l ：z 0 稀释，混匀后备用。 ( 2 ) 将顶包被板从密封袋中取出，每个标准点依次各设两孔，每孔加入相应 标准品5 0 u l ，其余每个检测孔直接加待测样品5 0 u l 。 ( 3 ) 每孔加入酶结合物5 0 u l ，再按耐样的顺序每孔加入抗体5 0 u l ，充分混 匀，贴上不干胶封片，置3 7 温育2 小时。 ( 4 ) 弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置l o 秒甩干，重复3 次后拍干。 ( 5 ) 每孔加显包剂a 液5 0 u l ，显色剂b 液5 0 u 1 ，振荡混匀后，置3 7 避 光显色1 5 分钟，每孔加终止液5 0 u l 。 ( 6 ) 用酶标仪读数，4 5 0 n m 、6 3 0 n m 双波长测定各孔o d 值。再反算出雌二醇 的浓度。 3 1 5 结果 从大鼠卵巢分离的颗粒细胞，在镜下可见细胞完整、呈圆形、单个或成簇状 分布。颗粒细胞体外培养2 4 小时内贴壁，细胞核大、圆，胞质富含颗粒细胞及 空泡。( 见图4 ) 颗粒细胞经2 4 小时的预培养，可使细胞在细胞周期中趋于同步。然后分组 换液，每组在无胎牛血清的细胞培养液中，分别加入不同浓度的杜仲提取物稀释 液( 依次为1 0 一、1 0 刁、l o 母) ，每组设6 个复孔，并设不加药物对照孔6 个，继 续培养4 8 小时。实验结果显示，杜仲提取物直接给药可促进颗粒细胞的增殖和 分泌雌二醇( b ) 的量，并呈一定的剂量依赖性，其中以l o 中药组作用最为明 显。 6 补肾健骨中药对女运动员骨组织保健的机理研究 图4 从大鼠卵巢分离的颗粒细胞( 2 0 ) f i g 4 0 v a r i 觚g 删叭l 盯c e l l s ( 2 0 ) 3 。】5 1 杜仲提取物对卵巢颗粒细胞增殖的影响，见表1 表1 杜仲提取物对卵巢颗粒细胞增殖的影响( m s d ) t a b l e11 1 1 ei n n u e n c eo fa b s t m c t i v cp a r t so fd u 吐o n gi e a ft 0o v a r i a l lg m u l a r c e l l sm u l t i p l i e s ( m s d ) 注：，与对照组比p o 0 5 从表l 可以看出：加药组能增加卵巢颗粒细胞的数量，高浓度的杜仲提取物 可明显增加颗粒细胞数，与空白对照组比，p o 0 5 。另见图5 。 1 7 补肾健骨中药对女逗动员骨组织保健的机理研究 0 3 0 2 9 5 o 2 9 a 值0 2 8 5 o 2 8 o 2 7 5 o 2 7 o 2 6 5 曼系盈u 图5 杜仲提取物对卵巢颗粒细胞增殖的影响 f i g5t h e 砌u e n c eo fa b s 仃a c t i v ep a n so fd u z h o n gl e a ft 0o v a r i 柚g 枷u l a rc e l l s 姗l h i p l i e s 3 1 5 2 杜仲提取物对卵巢颗粒细胞产生e 。的影响。见表2 。 表2 杜仲提取物对颗粒细胞产生e 。的影响( m s d ) t a b l e 2 1 1 1 ei n n u c n c eo f a b s 仃a c t i v ep a n so f d u z l l o n gl e a f t o 岛( m s d ) 注：与对照组比p o 0 5 ， 从表z 可以看出：高、中浓度的杜仲提取物可明显增加卵巢颗粒细胞e 。的生 成，与对照组比，p o 0 5 ，低浓度组对颗粒细胞b 生成的影响不明显。另见图 6 。 8 补肾健骨中药对女运动员骨组织保健的机理研究 e 2 值 p s i 试 组 叵团 图6 杜仲提取物对颗粒细胞产生e 。的影响 f i 9 61 1 地砌u e n c eo f a b s 妇c t i v ep a n so f d u z i l o n gl e a f t oe 2 3 2 杜仲叶提取物对成骨细胞和颗粒细胞混合培养中成骨细胞 分泌碱性磷酸酶的影响 3 2 1 实验动物：新生( 2 4 小时内) s d 大鼠由江西医学院实验动物中心提供。 3 2 2 主要试剂：同上 3 2 3 主要仪器与器材：同上 3 - 2 4 方法 3 2 4 1 主要试剂、溶液的配制：同上 o 1 i i 型胶原酶：称取o 0 l g i i 型胶原酶，溶于1 0 m l d l i a n k s 溶液中，调p h 值在7 2 7 4 ，0 2 2 帅微孔过滤除菌，一2 0 保存。 3 2 4 - 2 大鼠成骨细胞的体外分离培养 ( 1 ) 取新生s d 大鼠5 只，7 5 酒精浸泡l o 分钟。 ( 2 ) 将新生大鼠置于无菌干培养皿中，仔细剪下颅盖骨，置于含p b s 缓冲 液的培养皿中。 ( 3 ) 仔细剥离颅骨周围的软组织及周边软骨，将颅盖骨于p b s 缓冲液中漂 洗两次，取出置于干培养皿中。 ( 4 ) 将颅盖骨剪成直径o 1 胁左右的碎块，转移置5 0 m l 的培养瓶中，加入 4 m l 胰酶，3 7 消化1 5 分钟。 ( 5 ) 弃去消化液，用无血清的培养液清沈2 次，再加入2 m l 的胰酶和2 m l 胶原酶，3 7 消化4 5 分钟。 ( 6 ) 将消化液用吸管吸到加有4 m 1 含l o 胎牛血清的d m e m 培养液的离心管 1 9 补肾健骨中药对女运动员骨组织保健的机理研究 中，剩下的碎片重复( 5 ) 的操作。 ( 7 ) 将( 6 ) 得到的消化液吸到上述离心管中，2 0 0 0 转分离心l o 分钟。 ( 8 ) 弃去上清液，用无血清培养液漂洗卜2 次，再加入含l o 胎牛血清的d m e m 培养液10 i i i l ，与细胞沉淀混匀后，接种于2 个5 0 m l 培养瓶中，置3 7 、 饱和湿度及体积分数为5 的c 0 2 培养箱中培养。 ( 9 ) 2 4 小时后换液一次，约3 4 天细胞长满时传代，弃去培养液，加入o 2 5 胰酶3 m l ，在倒置相差显微镜下观察，待细胞伪足收缩成圆形时，将消化液用吸 管吸到离心管中，在离心管中加入含1 0 胎牛血清的d m e n 培养液中，2 0 转 分离心1 0 分钟，弃去上清，加入含l o 胎牛血清的培养液，反复吹打细胞呈悬 液，一瓶接种两瓶，取第三代成骨细胞进行实验。 3 2 4 3 细胞存活检测 台盼蓝检测法，其原理是染料台盼蓝可穿透损伤或死亡细胞膜与解体的 d n a 结合并使其着色，而活细胞不能被染色，以此攀别。本实验以细胞死亡率 在2 0 以下为正常接种细胞。方法以o 4 的台盼蓝染色液，用血球计数板计数 按下式计算成骨细胞数 细胞数；四大格细胞数之和4 1 0 4 3 2 4 4 成骨细胞染色方法 3 1 2 4 4 1 染色试剂的配制 ( 1 ) 苏术精染液( 2 0 ) ：苏木精0 5 9 、铵矾2 4 9 、水5 0 m l 、碘酸钠o 5 9 、 甘油3 0 i i l l 、冰醋酸2 m l ，使用时用蒸馏水稀释成工作液。 ( 2 ) 1 伊红染液：将1 9 伊红溶于1 0 0 m l 蒸馏水中，充分溶解后过滤。 ( 3 ) 甘油明胶：明胶1 2 9 ，加入1 2 0 m l 蒸馏水，至水浴加温，使其完全溶 锯，再加入6 0 m l 甘油和1 9 苯酚，充分混匀。 3 2 4 4 2 染色步骤 ( 1 ) 取出培养瓶中的盖玻片，用3 7 p b s 液漂洗3 次。 ( 2 ) 用中性甲醛固定3 0 m i n 。 ( 3 ) 用蒸馏水沈1 次，再用苏木精染色3 ( t l l i n 。 ( 4 ) 用自来水冲沈，置入1 n a h c 0 3 中漂沈到盖玻片呈蓝紫色。 ( 5 ) 霄入1 伊 1 染液l i 染色3 0 s 一1 m ：n 。 补肾健骨中药对女运动员骨组织保健的机理研究 ( 6 ) 用蒸馏水冲洗，迅速通过丙酮2 次( 3 5 m i n 次) 。 ( 7 ) 通过丙酮一二甲苯( 2 ：1 ) 3 次( 卜2 m i n ) 。 ( 8 ) 通过丙酮一二甲苯( 1 ：2 ) 3 次( 卜2 m i n ) 。 ( 9 ) 通过纯二甲苯5 一1 0 m i n ，用甘油明胶封片。 i 3 2 4 5 成骨细胞和颗粒细胞混合培养 3 2 4 5 1 颗粒细胞培养：同b i 4 2 2 ，将得到的细胞悬液按1 0 1 0 4 个细胞l n l 稀 释。 3 2 4 5 2 将第三代成骨细胞消化，弃去原培养液，加入3 m l 胰酶消化，待到细胞 伪足变成圆形时，弃去消化液，加入含1 0 胎牛血清的d h 伍m 培养液1 0 m l ，反 复吹打成细胞悬液，按2 5 1 0 4 个细胞，m l 稀释。 3 2 4 5 3 成骨细胞和颗粒细胞的混合培养：将颗粒细胞和成骨细胞按1 ：2 的比 例加到9 6 孔培养板中，每孔含颗粒细胞数1 1 0 4 个、成骨细胞数2 1 0 4 个，对 照组只加成骨细胞，每孔2 1 0 4 个。同时在每孔中加入杜仲提取物，空白对照 组加入等量的培养液，置3 7 、饱和湿度及体积分数为5 的c 0 ：培养箱中培养。 培养三天后取出细胞培养液，一2 0 保存待测碱性磷酸酶( a l p ) 。 3 2 4 5 4 碱性磷酸酶的测定方法：按试剂盒说明书，波长4 0 5 砌，温度3 7 在 半自动生化分析仪上读数。按下表进行测定： 3 2 5 结果 从大鼠乳鼠分离的成骨细胞，刚接种时成球形，2 4 小时贴壁后，在倒置显微 镜下可见细胞形态不规则，多成三角形、多角形、有较多突起，胞质丰富、清晰。 ( 见图7 、8 ) 补肾健骨中药对女运动员骨组织保健的机理研究 图7 成骨细胞( 1 )图8 成骨细胞( 2 0 ) f 主g 7 d 魄t e d 煅( 1 0 0 ) f i 孚80 i 粥把0 i 煅( 2 0 ) 取第三代成骨细胞饿颗粒细胞和成骨细胞的混合培养。分为6 组( 分别为成 骨细胞组、成骨细胞+ 杜仲组、颗粒细胞和成骨细胞比2 ：l 的空白组和桂仲组、 颗粒细胞和成骨细胞比i ：2 的空白组和杜仲组) ，每组5 令孔。培养7 2 小时， 测每孔的碱性磷酸酶( a ”) 值，结果如表3 。 表3 单独培养和混合培养中成骨细胞分泌a l p 值( m s d ) t a b l e 3t h ea i pv a l ：抽a | m 垃a i 籼聪雒l dc o _ c l i m e( m s d ) 注：表示与成骨细胞+ 杜仲组比较p 锄0 5 ，表示与成学细胞空白组比较p ( o 0 5 表示与成 骨细胞空白组比较p ( o 0 1 从表3 可以看出，颗粒细胞和成骨细胞数层比为l ：2 时，无论空白还是加杜 仲组，成骨细胞所产生的a i j 与成骨细胞直接加牡仲所产生的a l p 比较，差异 明显，p 固，0 5 。颗粒+ 成骨( 1 ：2 卜杜仲组与成骨细胞空白组比较有显著性差异 补肾健骨中药对女运动员骨组织保健的机理研究 p o o l 。 3 3 成骨细胞总r n a 的提取及0 p g 的r 卜p c r 实验 3 3 1 主要试剂 异丙醇 氯仿 焦碳酸二乙酯( d e p c ) 乙二胺四乙酸二钠盐( e d t a ) 三羟基甲基胺基甲烷( t r i s ) f 溴化乙锭( e b ) p c r 引物 1 w z o l 试剂盒 r t _ p c r 试剂盒 3 3 2 主要仪器 紫外分光光度计 超低温冰箱 冷冻离心机 电泳仪 p c r 扩增仪 3 3 3 主要试剂的配制 上海生工 上海生工 8 b i 公司 b b i 公司 b b i 公司 b b i 公司 上海生工 1 r i a n g e n p r o m e g a u v - 3 0 0 0 日立公司 三洋公司 美国科峻公司 北京六一仪器厂 美国m j 公司 ( 1 ) o 1 d e p c 水配制：取d e p c l m l ，溶于1 0 0 0 m l 双蒸水中，取l o o l l 高压 蒸汽灭菌，4 保存。其余9 0 0 m l 用于出去塑料器皿中的r n a s e 。 ( 2 ) l t b e 缓冲液：1 0 0 8 9 t r i s ，5 5 9 硼酸，4 m l o 5 me d t a ，定容至l o o o m l ( 3 ) 溴化乙锭( e b ) ：l o o m g e b 溶于1 0 m 1 无卣水中 3 3 4 成骨细胞总r n a 的提取 ( 1 ) 收集细胞，加入t r n z 0 1 试剂l m l ，反复吹打后，1 5 3 0 放置5 m i n 。 ( 2 ) 加氯仿o 2 m l 。振荡1 5 s ，室温放霞3 m i n 。 ( 3 ) 4 离心，1 0 0 0 0 r p m 离心l o 1 5 分钟。 2 3 补肾健骨中药对女运动员骨组织保健的机理研究 ( 4 ) 在得到的水相溶液中加入等体积的乙丙醇，混匀，室温放置2 0 一3 0 分钟。 ( 5 ) 4 1 0 0 0 0 r p m 离心l o 分钟，去上清。 ( 6 ) 加入l m l 7 5 乙醇洗涤沉淀。每使用1 m 1 t r n z o l 至少用1 m 1 7 5 乙醇对 沉淀进行洗涤， ( 7 ) 4 5 0 0 0 r p 肌离心3 分钟。倒出液体，不要倒出沉淀，剩余的少量液 体短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀。 ( 8 ) 室温放置晾干，根据试验需要，加入3 0 - l o o u l 无r n a s e 水，反复吹 打、混匀，充分溶解r n a 。置于一7 0 保存备用。 3 3 5 成骨细胞总r n a 电泳 ( 1 ) 配制一1 琼脂糖凝胶：称驭1 9 琼脂糖，加入l o o m l t b e 缓冲液，加入 0 5 u g m l e b 0 5 u 1 制胶。 ( 2 ) 加样：加入5 u l r n a 样品和l u l b u f f e r d ，通电维持3 0 v ，7 m a ，约需 3 4 小时，电泳如图9 。 图9 总r n a 完整性检验电泳图 f i 9 9 t h ee l e c t r o p h o r e s i sr e s u l to fr n a 3 3 6r t 斗e r 扩增 ( 1 ) 引物序列 o p g 上游5 一t g g a g c t c g a a t t c t g c t t g 一3 下游5 ，一c a t c a a g a t g c g g a g c t g c t 一3 s i z e3 1 8 b p b a c tin 上游5 一g a a a t c g t g c g t g a c a t t a a g 一3 f 游5 一c t a g a a g c a t t t g c g g t g c a 一3 补肾健骨中药对女运动员骨组织保健的机理研究 s i z e4 l o b p ( 2 ) r n a 逆转录反应：2 0 反应体系中加入下列试剂 总r n a4 u l o l i g d t ( 1 5 ) i u l d e p c 水4 2 u l r tb u f f e r d4 o u l m g c l 2 4 8 u 1 d n l p m i x1 0 u 1 r e v e r s et r a n s c r i p a s e1 0 u l 反应条件：2 5 5 分钟、4 2 l 小时1 0 分钟、7 0 1 5 分钟。 ( 3 ) 聚合酶链反应( p c r ) ：1 0 0 u l 反应体系中加入下列试剂 超纯水 5 3 6 u 1 l o b u f f e r8 o u l m g c l 3 2 u 1 n u c l e o t i d em i x1 o d l 上游引物 6 6 u i 下游引物 6 6 u l t a pd n a s e 1 o u l r t 反应产物 2 0 u 1 0 p g 反应条件：9 4 预变性3 m i n ，9 4 变性3 0 s ，5 0 退火l m i n ， 7 2 延伸l m i n ，3 2 个循环，最后7 2 延伸5 m i n 。 b a c t i n 反应条件：9 4 变性4 5 s ，5 5 退火4 5 s ，2 延伸4 5 s ， 2 6 个循环，最后7 2 延伸5 m i n 。 3 3 7p c r 产物琼脂糖凝胶电泳 ( 1 ) 胶板制各：称取琼脂塘o 3 7 5 9 ，加入2 5 m b e 缓冲液配制1 ，5 凝胶， 将凝胶放置电泳槽，加入电泳缓冲液，使液面高出凝胶。 ( 2 ) 上样：用微量移液器将p c r 扩增产物5 u l 和0 2 5 溴酚蓝2 u l 依次加入 样品孔内，对照孑l 加入l u l m a r k e r 。 ( 3 ) 电泳观察：凝胶作电泳，在7 0 v 下电泳3 4 小时，取出凝胶在紫外灯下 补肾健骨中药对女运动员骨组织保健的机理研究 观察。电泳如图l o 图1 0o p g 的r t - p c r 产物电泳图 f 谵1 0 t h ee l e c t r o p h o r e s i sr e s u l to fr t p c rp r o d u c t 注：第l 、2 泳道分为7 2 小时空白和加药b a c t i n 结果，第3 、4 泳道分别为9 6 小时空白和加药 b a c t i n 结果，第5 、6 分别为7 2 小时空白和加药o p g 结果，第7 、8 分别为9 6 小时空白和加药 o p g 结果。 3 3 8 结果 消化下第三代成骨细胞，用含1 0 胎牛血清的d m e m 培养液制成细胞悬液， 接种于培养瓶中，在a c t i n 和o p g 的r n a 表达中，9 6 小时空白组的吸光值为 o 5 8 3 8 4 6 ，加药组的吸光值为o 6 4 6 4 0 2 ，加药组高于空白组。 4 讨论 4 1 中医药防治绝经后骨质疏松的机理探讨 中医的“肾”是一个多功能的体系，它具有生殖遗传( 睾丸、卵巢) 、生长 发育( 垂体、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺) 、神经系统、泌尿系统( 肾、膀胱) 、 免疫系统等方面的功能。历代中医认为，原发性骨质疏松症的基本病机是多种原 因导致的肾虚。精血亏损，骨枯髓减，久而导致骨痿骨痹。中医理论认为，肾主 骨，骨藏精，精生髓，髓居骨中，骨赖髓以充养，骨的生长、发育、枯荣与肾之 精气盛衰密切相关。绝经是天葵衰竭的表现，亦足肾精衰少的征象，精髓不足， 骨失所养。目前认为【5 3 j “肾主骨”系统的主要内容包括：( 1 ) 肾所藏的精、所 土n 0 液可以化尘骨髓，骨髓可以滋养骨髂。( 2 ) 肾与骨在病机上相互影响。( 3 ) “腰为肾之府”。 补肾健骨中药对女运动员骨组织保健的机理研究 现代中医对绝经后骨质疏松病因病机的认识：( 1 ) 肾虚精亏素问上古 天真论日：女子“四七，胫骨坚，发长极，身体盛五七，阳明脉衰，面始焦， 发始堕七七，任脉虚，天葵竭，地道不通”，这充分说明了“肾藏精，主骨生 髓”的理论是正确的科学的【州。 关于补肾中药防治骨质疏松的实验，从文献报道来看，学者们主要采用雌性 老年鼠和去卵巢的雌性鼠为实验对象，给予相应得补肾中药治疗5 8 j ，从骨组织 计量学、骨密度、骨代谢、骨无机元素含量以及骨生物力学的变化等诸多方面观 察，证实补肾中药确有防治骨质疏松的作用。近几年来，我国学者不仅加紧了中 医中药在防治绝经后骨质疏松症的基础研究，而且也加快了中药的临床基础研究 和效果观察。研究发现0 5 1 1 补肾中药通过对性激素的调节，抑制骨吸收，预防绝 经后妇女的骨量丢失；增加骨量，延长成骨细胞成骨期，恢复骨骼的正常功能。 基于上述理论，中医治疗骨质疏松症在于分型辨证论治，从补肾阳、肾阴、益气、 补血入手，效果非常显著，但其作用机制尚待深入研究，而且目前的研究以复亢， 制剂居多，单味药较少。本实验所选的杜仲，具有补肾壮阳、强筋健骨的功效， 杜仲治疗骨质疏松症的疗效已为临床所证实【6 26 3 l ，但其分子机理还不很清楚，尤 其是治疗绝经后骨质疏松的机理。实验通过体外细胞培养深入研究杜仲叶提取物 对卵巢产生雌激素和成骨细胞分泌碱性磷酸酶的影响，进一步在分子水平上研究 杜仲防治绝经后骨质疏松的作用机理，同时，为研制杜仲防治骨质疏松新药建立 理论和实验依据。 药物直接作用于体外培养的成骨细胞和颗粒细胞的研究，受体内其他因素的 干扰少，作用直接，便于观察。药物通过机体的转化和吸收，可经多种途径，多 靶点作用于内分泌系统、循环系统、神经系统合免疫系统等，调节骨代谢，这正 是中医疗效的主要特点和优势，本研究针对雌激素调节是引发绝经后骨质疏松的 重要因素这一环节进行试验研究。 4 2 对动物选择的评价 t 2 1 2 5 日龄的s d 雌性幼鼠下丘脑垂体卵巢轴功能尚未发育成熟，其颗粒 细胞在离体前未受到内源性促性腺激素的刺激，处于未分化状念，因此，性成熟 前的动物也是研究卵泡发育规律的良好模型删6 辩。受p m s g 刺激后，未成熟卵 巢可同时产生大量同步发育的颗粒细胞。因不同发育阶段的颗粒细胞功能有所不 补肾健骨中药对女运动员骨组织保健的机理研究 同，故此方法更能客观的反映药物对颗粒细胞的影响。以往的报道也表明，在性 未成熟哺乳动物体内，尤其是p m s g 处理后，雌二醇的主要来源是卵巢中的卵 泡硎，故本实验中的动物选择可最大限度的排除卵巢外因素的干扰。而且原代 细胞培养的优势在于能最大限度的保持细胞的原始特性，使体外的实验结果更接 近于体内的情况。 4 3 卵巢颗粒细胞的收集 选用2 5 3 0 龄健康雌性w i s t e r 大鼠，皮下注射p m s g1 0 0 u ，只【6 刀刺激卵泡发 育，4 8 小时后断头处死，或腹部皮下注射脱氧己烯雌酚注射油剂( d e s ) 0 5 m g o 1 m l 只【6 8 l ，连续注射4 天，刺激卵泡发育，第五天将动物断头处死，取 出双侧卵巢，用不锈钢针刺破卵泡，释放颗粒细胞于培养液中。 选择2 0 日龄小鼠每只皮下注射o 2 5 m g d e s ，连续注射3 天，于第四天处死。 在无菌条件下取出卵巢，收集颗粒细胞【删。 选用健康新西兰雌性兔皮下注射p m s g 5 0 u g 只，4 8 小时后耳缘静脉注射 3 0 m g 1 ( g 戊巴比妥钠，迅速取出双侧卵巢，置于冰冷培养液中，用不锈钢针刺破 乱泡，收集颗粒细胞【7 0 l 。 取成年猪的卵巢，分离卵泡，将直径为2 - 4 衄的卵泡置于p b s 中，用针刺 破卵泡壁，收集颗粒细胞【7 1 】。 4 4 杜仲提取物直接给药对大鼠卵巢颗粒细胞增殖和分泌功能的影响 4 4 1 杜仲提取物直接给药对颗粒细胞增殖的影响 颗粒细胞是卵巢的主要功能细胞，其增殖能力直接影响卵泡的发育、优势卵 泡的选择、排卵以及甾体激素的分泌等。本研究通过m t t 法观察杜仲提取物对 基础状态下大鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响。实验结果表明，杜仲提取物直接给药 可促进颗粒细胞的增殖，且作用与药物剂量有明显相关性。 4 4 2 杜仲提取物直接给药对颗粒细胞甾体激素分泌的影响 卵巢颗粒细胞包括卵泡颗粒细胞和黄体颗粒细胞，排卵前颗粒细胞称为卵泡 颗粒细胞，排卵后，卵泡颗粒细胞在黄体生成素刺激下