（运动人体科学专业论文）补充大豆肽对运动性骨骼肌微损伤的影响研究.pdf

h 中文摘要 目的： 本实验以s d 大鼠为研究对象，通过测定一次离心运动后，大鼠骨骼肌和血清 中各项指标，观察离心运动后骨骼肌和血清中m d a 含量、s o d 活性、g s h p x 活 性的变化，及血清中l d h 的活性变化，探索运动性骨骼肌微损伤中氧自由基代谢 规律、血清酶代谢规律以及二者对运动性骨骼肌微损伤发生发展的影响，并探索 大豆肽作为细胞保护剂对运动性骨骼肌微损伤的影响机理，为运动员训练提供科 学依据。 材料与方法： 雄性s d 大鼠随机分为安静对照组，补蒸馏水运动即刻组，补蒸馏水运动2 4 h 组，补蒸馏水运动4 8 h 组，补蒸馏水运动7 2 h 组，补蛋白运动即刻组，补蛋白运 动2 4 h 组，补蛋白运动4 8 h 组，补蛋白运动7 2 h 组，补活性肽运动即刻组，补活 性肽运动2 4 h 组，补活性肽运动4 8 h 组，补活性肽运动7 2 h 组，每组8 只。运动 后1 小时内分别进行灌胃1 5 大豆肽饮料( 其中含大豆肽0 3 9 ) 2 毫升，1 5 大豆 分离蛋白饮料( 其中含大豆分离蛋白0 3 9 ) 2 毫升及等量蒸馏水。 正式实验时，运动组大鼠进行一次间歇性下坡跑运动，速度为1 6 米分，坡 度为一1 6 0 ，5 分钟运动，2 分钟休息，总运动时间为1 2 0 分钟。分别于运动后即刻， 运动后2 4 小时，运动后4 8 小时，运动后7 2 小时用2 5 乌拉坦麻醉动物，于腹主 动脉取血，测定血清s o d 、g s h p x 、l 阴等，取前肢股四头肌测定s o d ，m d a ，实 验数据用s p s s l l o 统计学软件包进行分析。 结果： 1 离心运动后即刻股四头肌m d a 含量显著升高( p 0 0 5 ) ：s o d 活性下降，无显著 差异。 2 离心运动后股四头肌g s h p x 活性下降，运动后4 8 小时恢复：血液g s h p 爻活 性下降，运动后7 2 小时恢复。 3 补充大豆肽组血液及股四头肌g s h p x 活性下降，运动后4 8 小时恢复；补充大 豆蛋白组血液及股四头肌g s h p x 活性下降，运动后7 2 小时恢复。 i f 4 补充大豆蛋白组运动后各时间点l d h 活性均较运动组降低，变化趋势与运动组 一致；s o d 活性比运动组高，无显著差异。 5 补充大豆多肽组运动后各时间点l d h 活性均较补蛋白组降低，变化趋势与补蛋 白组致；s o d 活性较补蛋白组高，无显著差异。 结论： 离心运动后骨骼肌组织脂质过氧化反应增强，局部耗氧增多，从而引发自由 基连锁反应，过氧化脂质大量生成对肌细胞膜造成损伤，细胞膜通透性增加，细 胞内蛋白漏出，l d h 活性增高。氧自由基增多加速s o d 、g s h p x 的消耗，抗氧化系 统功能受损，补充大豆蛋白和大豆肽能有效提高机体抗氧化能力，减轻骨骼肌微 细损伤，加快受损组织的修复，大豆肽的作用优于大豆蛋白。 关键词：大豆肽；运动：骨骼肌微损伤 1 t h 芦 o b j e c t i v e ： a b s t r a c t t h ep u r p o s eo ft h iss t u d yist oe s t a b lis ht h ea n i m a lm o d e lo fe x e r c is e i n d u c e dm u s c l ei n j u r y ，o b s e r v es k e l e t o n m u s c l em d a 、s o d 、g s h p x ，s e r u m l d h 、s o d ， i n v e s t i g a t eo x y g e nf r e er a d i c a l sm e t a b 0 1 i s mr e g u l a t i o nt o e x e r c i s e i n d u c e dm u s c l ei n j u r y ， a n di n v e s t i g a t es o y b e a np e p t i d e s p r o t e c t i o na c t i o n sf o rt h ee x e r c i s e i n d u c e dm u s c l ei n j u r ym e c h a n i s m ， f o ra t h l e t et r a i n i n gp r o v i d es c i e n c eb a s i s m a t e r i a la n dm e t h o d ： 1 0 4m a l es dr a t sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t os e d e n t a r yc o n t r o l g r o u p ，e x e r c i s eg r o u p s ， e x e r c i s ea n dc o m p l e m e n tp e p t i d e sg r o u p s ，e x e r c i s e a n dc o m p l e m e n tp r o t e i ng r o u p s i nr a t sf e d1 5 s o y b e a np e p t i d e sa n d 1 5 s o y b e a np r o t e i n w h i l ee x p e r i m e n t i n gf o r m a l l y ， r a t si ne a c hg r o u pr a no n t r e a d m i l l ，a c c o r d i n gt ot h em e t h o do fa r m s t r o n g t h es p e e dw a ss e ta t1 6 m m i n w i t ha 1 6d e g r e es l o p e ， 5m i n u t e se x e r c i s e ，2m i n u t eb r e a k ， t o t a ls p o r t t i m ei s1 2 0m i n u t e s r a t sw e r ek i l l e da f t e rf i n i s h i n gt h ee x e r c i s ea n d t a k e nt h eb l o o di nt h es t o m a c ha o r t a m e a s u r e m e n ts e r u ms o d 、g s h p x 、 l 【 ie t c t h ee x p e r i m e n td a t as t a t i s t i c s e st ol e a r nt h es o f t w a r ep a c k a g e p r o c e e d i n ga n a l y s i sw i t ht h es p s s l l 0 r e 8 u l t ： 1 t h i se x p e r i m e n ti n s i d e ， c o m p a r e dw i t hn o r ms e dm u s c l e sm d ac o n t a i ni n e x o c e n t r i ce x e r c i s eg r o u pw a se l e v a t e d( p 0 0 5 ) 2 t h i se x p e r i m e n ti n s i d e ， c o m p a r e dw i t hn o r ms e ds e r u ma n dm u s c l eg s h p xi ne x o c e n t r i ce x e r c i s ew a sd e s c e n d s 。m u s c l eg s h p xc o m e b a c ka r e r e x e r c i s e4 8 h r ； b l o o dg s h p xc o m e b a c ka r e re x e r c i s e7 2 h r 3 c o m p l e m e n ts o y b e a np e p t i d e sb l o o da n dm u s c l e sg s h p xa c t i v i t yd e s c e n t - _ t 。 - m u s c l ea n db l o o dg s h p xc o m e b a c km e re x e r c i s e4 8 h r ；c o m p l e m e n t s o y b e a nm u s c l ea n dg s h p xa c t i v i t yd e s c e n t ： m u s c l ea n db l o o dg s h p xc o m e b a c ka r e re x e r c i s e7 2 m 4 t h i se x p e r i m e n ti n s i d e ， c o m p a r e dw i t h e x e r c i s eg r o u ps e r u ml d h a c t i v i t yi ns o y b e a n p r o t e i ns u p p l e m e n t a t i o ng r o u pe a c ht i m eo r d e r sw a s d e s c e n d ，c h a n g i n gt h et r e n di na c c o r d a n c ew i t ht h ee x e c i s eg r o u p 5 t h i se x p e r i m e n ti n s i d e ， c o m p a r e dw i t hs o y b e a n p r o t e i ns u p p l e m e n t a t i o n g r o u ps e r u m l d ha c t i v i t yi ns o y b e a np e p t i d e ss u p p l e m e n t a t i o ng r o u p e a c h t i m eo r d e r sw a sd e s c e n d ，c h a n g i n gt h et r e n di na c c o r d a n c ew i t h t h es o y b e a np r o t e i ns u p p l e m e n t a t i o ng r o u p c o n c l u 8 i o n ： e x e r c i s ec a nr e s u l ti na ni n c r e a s e dp r o d u c t i o no fr o s ，p r o d u c ea n i 1 b a l a n c eb e t w e e nr o sa n da n t i o x i d a n t s ，w h i c hi sr e f e r r e dt oa so x i d a t i v e s t r e s sa n di sp o s t u l a t e dt oc o n t r i b u t et oe x e r c i s e i n d u c e dm u s c l ei n j u r y r o sp l a ya ni m p o r t a n tr 0 1 ea sm e d i a t o r so fs k e l e t a lm u s c l ed a m a g e t h e o u t s i d es o u r c ec o m p l e m e n ts o y b e a np r o t e i na n ds o y b e a np e p t i d e sc a nl o w e r e f f e c t i v e l yw i t hm d ac o n t a i n 、g s h p x 、 l d h a c t i v i t y ，p r o m o t i n gt h e i n j u r yr e p a i r ， o b v i o u sb e t t e rt h a nt h ef u n c t i o no ft h es o y b e a np r o t e i n i nt h ea n t i o x y g e n a t i o no ft h es o y b e a np e p t i d e s k e y w o r d s ：s o y b e a np e p t i d e s ：e x e r c i s e ：t h es k e l e t o nm u s c l ei n j u r y 补充大豆肽对运动性骨骼肌徼损伤的影响及部分机制研究 - - - - j 一 日i j 吾 运动性骨骼肌微结构损伤( e x e r c i s e i n d u c e dm u s c l ei n j u r y e i m i ) 是一种高 强度或和长时间运动后发生的骨骼肌纤维的微细损伤( m i c r o i n j u r y ) ，不同于运 动创伤学中的肌肉挫伤、拉伤等。常表现为延迟发生的肌肉酸痛( d e l a y e do n s e t m u s e l es o r e n e s s ，d o m s ) 。d o m s 是运动训练实践和日常工作、生活中一个非常普遍 的现象，不论是高水平优秀运动员，还是刚参加训练的新手，这种延迟发生( 运动 后2 4 4 8 h r ) 的疼痛都是难以避免的痛苦经历。 一百年来，人们执着地探寻e i m i 发生的机制和防治的良方，在发生机制方面， 提出许多假说，目前认为机械损伤说和代谢说是非常重要的机制，对运动实践产 生了深刻的影响，也积极地推动了对该领域的深入研究。 近年来，功能活性肽的研究已成为国际生命科学研究的热点。从9 0 年代开始， 寡肽及其相关营养品的开发研究倍受重视。肽作为蛋白质的消化产物，还是一种 营养物质，其营养价值比蛋白质更高，营养作用比蛋白质更具优势。此外，肽还 具有较强的抗氧化性。为了提高运动员的运动能力，促进运动后骨骼肌的修复和 恢复，活性肽的补充应该是非常有意义的尝试。 补充大豆肽对运动性骨骼肌微损伤的影响及部分机制研究 1 综述 运动性骨胳肌损伤多见于周期性运动的耐力项目，是因反复运动所致的肌纤 维损伤，并且易发于骨胳肌离心运动相对时相n 训，严重的肌肉损伤可以使运动员 的运动能力丧失，训练中止。肌肉损伤后会降低它对骨及关节的保护作用，增加 骨及关节损伤的风险，造成一系列不良后果。国内外对运动性骨骼肌损伤的研究 已有一百多年历史，有关运动性骨骼肌损伤发生机制的学说中，目前认为机械性 外力作用和代谢性刺激综合作用，可能诱发加重骨骼肌微结构的损伤。 1 1 氧自由基代谢致运动性骨骼肌微损伤 随着对自由基研究的深入，证实了自由基是引起许多疾病与损伤病理过程的 重要因素。自由基是指外层轨道上具有未配对电子的分子、原子、离子或集团。 这类物质中含有不配对电子的氧，则称为氧自由基。体内重要的氧自由基有超氧 阴离子自由基( 0 2 - ) 、羟自由基( 0 盯) 、质子化超氧阴离子自由基( h o _ ：) 、脂氧自 由基( l o - ) 、脂质过氧自由基( l o o - ) 等。这些氧自由基以及由它们衍生的单线态 氧( 0 ：) ，过氧化氢( h ：0 2 ) 和脂氢过氧化物( l 0 0 h ) 又统称活性氧。 氧自由基( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 是分子氧的氧化还原衍生物， 主要是由超氧阴离子自由基( 0 ：) 产生，安静时骨骼肌产生少量超氧阴离子，肌 肉收缩时显著增加口 。0 ：一是体内活性氧的主要来源。r o s 能攻击生物膜磷脂中的多 不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化作用，脂质过氧化作用引起细胞损伤的机制在于， 膜脂改变导致膜功能的障碍和膜酶的损伤1 。 安静时，r o s 可以造成蛋白损伤，据估计，安静时细胞中o 9 的氧消耗用于 蛋白损伤h 1 。一些特定的蛋白成份如组氨酸、蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸对氧化损 伤敏感性较高凹3 。 身体运动时，尤其是有氧运动时，能量需求增加，耗氧量在骨骼肌纤维水平 估计增加大约1 0 0 凹 。如果o ：变为0 2 的比例保持不变，那么r o s 的产生也相应 的增加。 脂质过氧化物( l p 0 ) 是活性氧0 h 、o ：等与多不饱和脂肪酸反应生成的，l p 0 又可在体内代谢生成丙二醛( m d a ) 、乙烷、戊烷等物质。自由基性质极为活泼， 所有的细胞成分均可以是它们的攻击目标。脂质过氧化物与运动损伤有关，m d a 是 l p 0 的代谢产物，其含量可反映脂质过氧化程度n 0 j 。 2 补充大豆肽对运动性骨骼肌微损伤的影响及部分机制研究 氧自由基可使许多生物大分子如核酸、蛋白质、膜多不饱和脂肪酸发生损伤， 引起超氧化反应，生物大分子出现交联或断裂，导致细胞结构和功能的破坏。自 由基不仅使生物大分子直接受到攻击，还能启动一系列多级自由基连锁反应，产 生许多有害的次生自由基和毒性产物。运动实验和人体试验已经证实，长时间剧 烈运动由于组织相对缺氧和无氧代谢加强，体内活性氧生成增多，自由基产生增 加，同时也会使机体抗氧化能力减弱，其结果往往造成细胞膜的脂质过氧化反应 加强，反应产物m d a 增多。 在正常生理条件下，体内自由基保持一种低浓度平衡状态。力竭运动作为一 种生理应激，使机体骨骼肌产生的自由基增多已被许多实验所证实n ，自由基的 异常增多引起肌细胞伤害，使骨骼肌受损，进而影响运动能力。 氧自由基对骨骼肌组织细胞的损伤作用表现在：( 1 ) 氧自由基与膜上的酶、 受体和( 或) 膜的组成成份进行共价结合，从而影响膜成份的活性和( 或) 改变 膜的结构、功能与抗原特异性。( 2 ) 通过共价结合，使一s h 氧化，不饱和脂肪酸 与蛋白质比率改变干扰膜的离子转运。( 3 ) 引起不饱和脂肪酸的过氧化而直接干 扰膜的结构。 m d a 可对膜的流动性、结构与功能带来不利的影响，敏感的磷脂及脂肪酸首先 受损，使生物膜中的脂质过氧化，改变了液态镶嵌的多种酶的空间结构，使膜的 孔隙增大，脆性增加，通透性增加，毛细血管内皮细胞损伤、发生炎症及退行性 变，从而改变了内质网膜、线粒体膜、溶酶体膜、使其肿胀、溶解和破坏，导致 细胞广泛性损伤，而且，氧自由基可引起不饱和脂肪酸过氧化连锁反应，此外， 细胞外环境在运动时产生的自由基还可经离子通道而进入细胞内破坏各种细胞 器。 一般认为运动致氧自由基增高有如下途径：( 1 ) 运动引起肌细胞内a t p 裂解 增多，a d p 、a m p 增加，a m p 转变为次黄嘌呤，在黄嘌呤氧化酶作用下，次黄嘌呤 转变为尿酸同时产生自由基。( 2 ) 各种原因导致血浆和组织中游离的铁离子增加， 通过一系列反应引起组织的氧自由基增加。( 3 ) 运动引起肌细胞内线粒体的氧利 用途径变化致自由基产生。( 4 ) 儿茶酚胺、肌红蛋白等自氧产生自由基。( 5 ) 白 细胞呼吸爆破产生大量自由基。 大强度或长时间的运动时氧自由基增加，还为众多研究者证实。d a v i e s 等报 道大强度或长时间运动可致人或动物的血浆、肝脏、肌肉组织中m d a 显著增加， 补充大豆肤对运动性骨骼肌微损伤的影响及部分机制研究 并首次应用电顺磁共振技术( e s r ) 发现力竭跑后骨胳肌氧自由基含量增加2 3 倍 3 0 3 。在体外实验中，肌肉收缩时，r o s 同样增加m 3 。张蕴琨m 3 等研究力竭性游泳 的小鼠脂质过氧化程度最严重的是骨骼肌组织。胡红梅等人的实验也表明，大鼠 长时间游泳后心肌线粒体m d a 含量增加n2 | 。陈英杰等报道：训练过的大鼠离心运 动至力竭时，骨胳肌内氧自由基升高，并观察到骨胳肌出现损伤的超微结构变化 婚3 。田野3 等人证明非力竭运动同样引起线粒体m d a 含量增加。与力竭运动相比， m d a 值的变化趋势相同，但变化幅度低于力竭运动，非力竭运动后2 4 小时m d a 值 比力竭运动低3 0 2 1 ( p 氨基酸，分子量 在2 5 0 0 3 0 0 0 的肽类，其抗氧化性较理想。生物体内最重要的、具抗氧化活性的 9 补充大豆肽对运动性骨骼肌微损伤的影响及部分机制研究 肽是谷胱甘肽( g s h ) ，是谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽，分子中巯基( s h ) 含量很高。其主要功能是在消除氧自由基及衍生物的毒性作用中起重要作用。 最近，大豆肽抗氧化性研究取得一些进展，有人通过亚油酸自动氧化鉴定并 分离出大豆球蛋白，蛋白水解物中6 种多肽具有抗氧化特性，此类多肽具有捕捉 自由基及螯合金属离子作用，而且多肽中都含有组氨酸和酪氨酸，此类多肽抗氧 化机制尚未很明确，有待进一步深入随即。 活性肽对人体的作用具体表现在如下方面：( 1 ) 修复细胞，改善细胞代谢，防 止细胞变性，促进细胞生长、繁殖；( 2 ) 减轻肠胃负担，改善消化系统功能，提高 小肠对营养物质的吸收速度和吸收效率，促进蛋白质代谢，纠正机体负氮平衡； ( 3 ) 清除体内氧自由基，促进红细胞复原，提高红细胞载氧力，增强造血功能，防 止血栓形成；( 4 ) 改善内分泌功能，调节免疫功能和心血管机能；( 5 ) 促进肌肉力 量和质量增长，促进体力恢复、消除疲劳等。 文献报道嘞制，由于小肽具有快速吸收、耗能低和不易饱和的特点。因此，向 特殊身体机能状况下的运动员补充活性肽，可维持运动耐久力，抑制或缩短体内 “负氮平衡”的作用。运动后及时、快速补充氮源，对减少肌肉蛋白质降解，促 进肌肉快速修复和运动疲劳的恢复将产生良好作用，而且不增加胃肠负担阳2 1 。因 此，近年来，许多活性肽产品被开发、研制出来，并用于运动实践效果显著。 运动员在剧烈运动初期，首先消耗体内的三磷酸腺苷，磷酸肌酸，然后分解 糖原，经苯丙酸至乳酸，在这期间还产生三磷酸腺苷又可作为能源。当氧供给充 分时乳酸经三羧酸循环水解成二氧化碳，同时释放能量，这一过程需要有充分的 蛋白质来补充。大豆肽的有效摄取，可以作为肌肉蛋白质的来源。实验表明，饮 服大豆多肽的运动员体内肌红蛋白值在运动期间的减少速度比未饮服大豆肽的 快，增强人体的爆发力及恢复疲劳效果显著。 大量的科学实验证明大豆蛋白活性肽含有一种类似于胰岛素的白蛋白多肽， 是胰岛素的生长因子，可以清除体内的自由基阳。 如1 0 0 n 等哑3 ( 2 0 0 0 ) 研究8 名自行车运动员运动后补充蛋白水解物加碳水化合 物，观察其对运动后肌糖原合成的影响。并比较单独补充碳水化合物( 0 8 9 k g h ) 和补充含蛋白水解物( 0 4 9 k g h ) + 碳水化合物( 0 8 9 k g h ) 混合物的饮料其中有 或无亮氨酸和苯丙氨酸等，并每隔3 0 分钟间歇增加混合物中碳水化合物的摄入 ( 0 4 9 k g h ) ，肌肉活检发现混合补充与单独补充比较，肌糖原合成增加 l o 补充大豆肽对运动性骨骼肌微损伤的影响及部分机制研究 3 5 4 5 1 m o l k g h ，有统计学意义。 大豆活性肽( s o ya c t i v ep e p t i d e ) 是肽基大豆蛋白水解物的简称，是由大 豆蛋白水解后的许多寡肽分子( 3 6 个氨基酸) 组成的混合物，相对分子量分布 以低于1 0 0 0 的为主。大豆肽不仅具有良好的营养特性，而且具有极佳的生理功能 和加工特性，是一种非常有前途的功能食品原料，在食品、医药工业等许多行业 具有十分广泛的用途和广阔的开发应用前景。 我国正处于起步阶段，目前已开发出多种活性肽产品，如大豆蛋白活性肽、 乳清蛋白水解肽及小麦、玉米酶解物等。而大豆是我国传统食品，大豆蛋白含量 达4 5 ，其必需氨基酸模式接近f a o w t 0 所建议模式，是一种完全蛋白质。而我国 也是世界上几个主要的大豆生产国之一。因此，大豆活性肽的开发具有原料来源 广泛、价廉，安全性好，无任何毒副作用，便于产业化的优点，是理想的运动营 养品。 综上所述，国内外对运动性骨骼肌损伤的机制学说中，至今还没有一种学说 能够完全解释所有的问题，目前认为机械性外力作用和代谢性刺激综合作用，可 能诱发、加重了骨骼肌微结构的损伤。对于运动性骨骼肌损伤的修复和恢复，补 充大豆肽是非常有意义的尝试。 补充大豆肽对运动性骨骼肌微损伤的影响及部分机制研究 2 研究对象与方法 2 1 研究对象与分组 2 1 1 研究对象 成年雄性s p r a g u e d a w l e y 大鼠，体重2 7 0 3 0 0 9 ，1 0 4 只，购于北京维通利 华实验动物技术有限公司，在国家体育总局运动医学研究所动物房( 国家二级) 内饲养、训练。室内温度控制在1 8 2 4 ，湿度5 0 6 0 ，昼夜节律用日光灯控 制，每日光照时间为1 2 小时( 早8 点至晚8 点) 。普通大鼠饲料喂养，自由进食、 饮水。 2 1 2 分组情况 1 0 4 只大鼠随机分为安静对照组( a ) ，补蒸馏水运动即刻组( b 1 ) ，补蒸馏水 运动2 4 h r 组( b 2 ) ，补蒸馏水运动4 8 h r 组( b 3 ) ，补蒸馏水运动7 2 h r 组( b 4 ) ， 补蛋白运动即刻组( c 1 ) ，补蛋白运动2 4 h r 组( c 2 ) ，补蛋白运动4 8 h r 组( c 3 ) ， 补蛋白运动7 2 h r 组( c 4 ) ，补活性肽运动即刻组( d 1 ) ，补活性肽运动2 4 h r 组( d 2 ) ， 补活性肽运动4 8 h r 组( d 3 ) ，补活性肽运动7 2 h r 组( d 4 ) ，每组8 只。 2 2 研究方法 2 2 1 训练方案 所有动物经膳食平衡3 天后开始正式实验，采取跑台训练。运动组大鼠在正 式实验前3 天每天均进行一次速度为5 米分，时间为5 分钟，零坡度的跑台运动， 以熟悉跑台。运动后l 小时内分别进行灌胃1 5 大豆肽饮料( 其中含大豆肽o 3 9 ) 2 毫升，1 5 大豆分离蛋白饮料( 其中含大豆分离蛋白o 3 9 ) 2 毫升及等量蒸馏水。 正式实验时，运动组大鼠进行一次间歇性下坡跑运动，速度为1 6 米分，坡 度为一1 6 0 ，5 分钟运动，2 分钟休息，总运动时间为1 2 0 分钟，在大鼠进行运动训 练期间，为保证训练效果使用声、电刺激及人工驱赶。 2 2 2 动物取材 分别于运动后即刻，运动后2 4 小时，运动后4 8 小时，运动后7 2 小时用25 乌拉坦腹腔注射麻醉动物，腹主动脉取血8 1 0 毫升，离心，留血清于一2 0 摄氏 度保存待测；同时迅速取出前肢股四头肌，剔除筋膜等结缔组织，冰冷生理盐水 清洗，滤纸吸干水分，放入冻存管保存于液氮中。组织匀浆后测定s o d 、m d a 、g s h p x 、所测数据用蛋白定量( 考马斯亮蓝法) 进行修正。 1 2 补充大豆肽对运动性骨骼肌微损伤的影响及部分机制研究 2 2 3 制备组织匀浆 取组织块在冰冷的生理盐水中漂洗，滤纸吸干，电子天平称重，放入1 0 毫升 的小烧杯中，用移液管取预冷的匀浆介质( p h 7 4 ，0 0 1 m 0 1 几t r i s h c l ， o 0 0 0 1 m 0 1 le d t a 一2 n a ，o 0 1 m 0 1 几蔗糖，0 8 的氯化钠溶液) ，匀浆介质的体积 总量应是组织块总量的9 倍。用移液管取总量2 3 的匀浆介质于烧杯中，用眼科 小剪尽快剪碎组织块，将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1 3 匀浆介 质和残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆。用t 2 5 自动匀浆机 匀浆，将制备好的1 0 组织匀浆用j 一6 b 低温离心机3 0 0 0 r m i n ，离心1 0 1 5 分钟， 将离心好的匀浆留上清弃下面沉淀。 2 3 指标测定方法 血清l 阴活性测定利用e c m o _ f 6 1 2 4 型半自动生化分析仪测定：5 0 0ul 工作 液+ 2 0ul 血清，延迟3 0 秒，测定其1 分钟内吸光度变化( l d h ) 。酶试剂盒由北京中 生生物工程高技术公司提供。 m d a 含量的测定：用t b a - t c a 法，加样品o 5 ml ，m d a 标准品为a 1 d r i c h 产品。 s o d 活力的测定：加样品o 1 ml ，用亚硝酸盐生成抑制法，所用黄嘌呤为进口 分装s i g m a 产品，黄嘌呤氧化酶为f l u k a 产品。s o d 、m d a 测试盒为南京建成生物工 程研究所产品，测定按试剂盒说明操作，蛋白定量采取考马斯亮兰法。 g s h p x 活力的测定：加样品o 2 ml ，用d t n b 直接显色法，进口分装谷胱甘肽 标准s i g m a 产品，3 0 h ：0 ：标准品，均在使用当日配制。g s h p x 测试盒为南京建成 生物工程研究所产品。 2 4 实验仪器 t 2 5 匀浆器( k i k k a l a b o r t e c h n i k ，g e r m a n ) j 一6 b 低温离心机( b e c k m a nc o ，u s a ) v is 一7 2 2 0 分光光度计( 北京瑞利分析仪器公司) d j 2 6 0 电子精密天平( 中国轻工业机械总公司常熟衡器工业公司) 电热恒温水箱( 北京长安科学仪器厂) e c o m f 6 1 2 4 型半自动生化分析仪 2 5 统计分析 用s p s s l l 0 统计软件包进行统计处理，所有数据均用计算平均数标准差表 示，所测数据进行单因素方差分析，显著性水平为q = 0 0 5 ( p 0 0 5 ) 。 朴充大豆肽对运动性骨骼肌微损伤的影响及部分机制研究 3 、实验结果 3 1股四头肌m d a 、s o d 含量的变化 3 1 1 一次离心运动后股四头肌m d a 、s 0 d 含量的变化 从表l 可以看出，一次离心运动后股四头肌m d a 含量的变化，运动后即刻、 运动后2 4 、4 8 、7 2 小时组均较安静组明显升高，有显著差异( p 0 0 5 ) 。 表l一次离心运动后股四头肌m d a 、s o d 含量的变化 说明：表示与安静组相比p 0 0 5 1 0 兰8 o e 舍 b 皇 堇4 日 2 0 组别 a b 1b 2b 3b 4 图l一次离心运动后股四头肌m d a 含量的变化 1 4 补充大豆肽对运动性骨骼肌微损伤的影响及部分机制研究 8 叟 詈 4 0 0 厂 3 0 0 - 卜i 一_ 一； 2 0 0卜 1 0 0 0 组别 ab 1b 2b 3b 4 图2一次离心运动后股四头肌s o d 活性的变化 3 1 2 补充大豆分离蛋白和大豆肽对运动后股四头肌m d a 、s 0 d 含量的变化 从表2 可以看出，补肽运动后即刻、2 4 、4 8 小时组与补水运动后即刻、2 4 、 4 8 小时组相比m d a 含量下降，有显著差异( p 0 0 5 ) ：补蛋白运动后即刻与补水运 动后即刻相比m d a 含量下降，有显著差异( p 0 0 5 ) 。 补充大豆肽对运动性骨骼肌微损伤的影响及部分机制研究 表2补充大豆分离蛋白和大豆肽对运动后股四头肌m d a 、s o d 含量的变化 说明：表示与运动后即刻组相比p 0 0 5 ，表示与运动后2 4 h r 组比p 0 0 5 ， 表示与运动后4 8 h r 组比p 0 0 5 ，表示与补肽运动后即刻组比p o 0 5 ， 表示与补肽运动后2 4 h r 比p o 0 5 ，表示与补肽运动后4 8 h r 比p 0 0 5 至 o 兮 鲁 垒 亭 占 1 6 。- _ _ _ _ _ _ _ _ _ - 。_ _ _ _ _ _ _ ，_ _ - 。_ _ _ - 。_ - _ 。 _ _ _ _ _ _ - 。，。_ _ _ _ _ _ _ _ _ 。 ；卜补水组 ；一被蛋白组： 补肽组 ：一一+ 一 含量的变化 补充大豆肽对运动性骨骼肌微损伤的影响及部分机制研究 3 2血液及股四头肌g s h p 活性的变化 3 2 1一次离心运动后血液及股四头肌g s h p x 活性的变化 从表3 可以看出，一次离心运动后血液g s h p x 活性的变化，运动后即刻较安 静组降低，有显著差异( p 0 0 5 ) ；运动后7 2 小时恢复。 一次离心运动后股四头肌g s h p x 活性的变化，运动后即刻较安静组降低，有 显著差异( p 0 0 5 ) ，运动后 4 8 小时g s h p x 活性恢复。 表3一次离心运动后股四头肌及血液g s h p x 活性的变化 说明：表示与安静组相比p o 0 5 8o 盆 6o z 里 4 0 全 血 2 0 匕 善o ab1b 2b 3b 4 组别 图4一次离心运动后血液g s h p x 活性的变化 补充大豆肽对运动性骨骼肌微损伤的影响及部分机制研究 10 0 呈8 0 卜a 荟 6 0 d 昌4 0 o 2 0 o 组别 ab 1b 2b 3b 4 图5一次离心运动后股四头肌g s h p x 活性的变化 3 2 2 补充大豆蛋白和大豆肽股四头肌及血液g s h p x 活性的变化 从表4 可以看出，补肽运动后即刻、2 4 小时组与补水运动后即刻、2 4 小时组 相比血液g s h p x 活性升高，有显著差异( p 0 0 5 ) 。 补肽运动后即刻、2 4 小时组与补水运动后即刻、2 4 小时组相比股四头肌g s h p x 活性升高，有显著差异( p o 0 5 ) 。离心运动后补充大豆肽 股四头肌及血液g s h _ p x 活性运动后4 8 小时恢复。 离心运动后补充大豆分离蛋白股四头肌及血液g s h p x 活性运动后7 2 小时恢 复。 补充大豆肽对运动性骨骼肌徼损伤的影响及部分机制研究 表4 一次离心运动后补充大豆蛋白和大豆肽股四头肌及血液g s h p x 活性的变化 说明：表示与补水运动后即刻组相比p o 0 5 表示与补水运动后2 4 h r 组比p o 0 5 ) ，运动后7 2 小时 s o d 活性恢复。 一次离心运动后l d h 总活性的变化，运动后即刻较安静组升高有显著差异 ( p o 0 5 ) ；运动后2 4 小时较安静组升高有显著差异( p o 0 5 ) ；l d h 总活性的变化在运动后 即刻达到高峰，然后下降，呈恢复的趋势。 2 0 补充大豆肽对运动性骨骼肌微损伤的影响及郝分机制研究 表5 。次离心运动后血清s o d 、l d h 总活性的变化 说明：表示与安静组相比p o 0 5 4 0 0 3 0 0 o 更2 0 0 c p 1o o 0 组别 图8 图9 2 5 0 0 2 0 0 0 15 0 0 1 0 0 0 5 0 0 0 组别 ab 1b 2b 3 一次离心运动后血清s o d 活性的变化 b 4 ab 1b 2b 3 一次离心运动后血清l d h 总活性的变化 2 i b 4 补充大豆肤对运动性骨骼肌微损伤的影响及部分机制研究 3 3 2 补充大豆蛋白和大豆肽血清s o d 、l d h 总活性的变化 从表6 可以看出，一次离心运动后补充大豆分离蛋白s o d 活性的变化，运动 后即刻、2 4 、4 8 、7 2 小时均较安静组下降无显著差异，运动后即刻下降，运动后 7 2 小时恢复。 一次离心运动后补充大豆肽s o d 活性的变化，运动后即刻、2 4 小时均较安静 组下降，无显著差异。运动后4 8 小时恢复；7 2 小时较安静组相比有升高的趋势， 无显著差异。 一次离心运动后补充大豆蛋白l d h 总活性的变化，在运动后即刻达到高峰， 然后下降，呈恢复的趋势；补蛋白组各时间点与补水组各时间点相比l d h 总活性 的变化不明显，无显著差异。 一次离心运动后补充大豆肽l d h 总活性的变化，l d h 总活性的变化在运动后即 刻达到高峰，然后下降，呈恢复的趋势；补肽组运动后2 4 、4 8 、7 2 小时组与补 水运动后2 4 、4 8 、7 2 小时组相比l d h 总活性下降，有显著差异( p 0 0 5 ) 。 补充大豆肽对运动性骨骼肌微损伤的影响及部分机制研究 表6一次离心运动后补充大豆蛋白和大豆肽血清s o d 、l d h 总活性的变化 说明：表示与补水运动后2 4 h r 组相比p 0 0 5 ，表示与补水运动后4 8 h r 组相 p o z ，、 c r 比p 0 0 5 ，表示与补水运动后7 2 h r 组相比p 0 0 5 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 5 0 0 l 时间 o h r 2 4 h r4 8 h r7 2 h r i + 补水组1 f 一补蛋白剩 l + 补肽组。 图1 0一次离心运动后补充大豆蛋白和大豆肽血清l d h 总活性的变化 补充大豆肢对运动性骨骼肌微损伤的影响及部分机制研究 4 讨论分析 自由基是体内产生的未配对电子的原子和原子团。氧是生物体内最重要的电 子受体，机体内许多化学反应都与氧有关。氧还原时由于获得电子数不同，可以 形成多种活性氧，如超氧化物阴离子自由基、羟自由基、过氧化物和脂质过氧化 物。这些自由基和活性氧与细胞膜或脂类发生脂质过氧化反应，从而破坏细胞膜 或使细胞内的酶或其它活性蛋白丧失功能。运动耗氧的同时也增加活性氧的生成， 脂质过氧化反应使肌细胞、线粒体和肌浆网膜完整性破坏是造成运动疲劳的重要 原因，这一点已被许多实验证实旧1 。然而，自由基生成的同时，细胞内还存在清 除自由基和抑制自由基反应的体系，机体利用自身形成或从膳食中摄取的抗氧化 剂不断清除自由基。 s o d 是需氧生物体内数千种酶中底物为氧自由基的唯一底酶，其作用是歧化 0 ：，从而阻断毒性更强的羟自由基的产生，起保护细胞的作用。所以，s o d 是机体 自由基清除系统内的一个重要酶。运动后s o d 活性的变化，国内外学者报道不一嫡副。 通常，运动性骨骼肌微结构损伤是一种亚临床状态，可以不经临床治疗也会 自行恢复。但由于它对运动能力的影响，干扰了运动员的心理和训练。因此，减 轻d o m s 症状和肌力衰退、缩短骨骼肌微细损伤的修复时间，对提高运动训练效率 具有重要意义。 本实验以s d 大鼠为研究对象，运动后补充大豆肽，通过直接测定一次性离心 运动后，大鼠骨骼肌和血清中的各项指标，观察它对大鼠离心运动s o d 活性、g s h p x 活性的变化、m d a 含量及血清l d h 的影响，探索离心运动中氧自由基代谢规律和氧 自由基对运动性骨骼肌损伤发生发展的影响，以及自由基清除剂的保护作用与机 理。为运动员训练提供科学依据，并提供一种能够防止和修复运动性损伤，提高 竞技运动能力，安全有效而无副作用的细胞保护剂。 4 1 运动性骨骼肌微损伤的自由基代谢变化 离心运动后，脂质过氧化程度最严重的是骨骼肌组织。因为，骨骼肌是运动 的直接部位，其能量消耗剧烈，局部耗氧增多，肌细胞线粒体负荷加重，从而引 发自由基产生的连锁反应。氧自由基增多一方面加速s o d 的消耗，抗氧化系统功 能受损，加剧自由基生成与清除的不平衡：另一方面，过氧化脂质大量生成对肌 细胞膜的正常结构和功能起直接损伤作用，线粒体功能紊乱，a t p 生成减少，肌细 2 4 补充大豆肽对运动性骨骼肌微损伤的影响及部分机制研究 胞膜通透性增加，细胞内蛋白漏出，出现血清c k 、l d h 活性显著增高，运动能力 下降以致衰竭。 自由基增多是导致细胞膜结构损害的重要因素之一，自由基代谢失衡对运动 性骨骼肌损伤的发生发展有重要影响。 在本实验中我们发现，一次离心运动后股四头肌m d a 含量的变化，运动后各 时间点均均较安静组升高，有显著差异( p 0 0 5 ) ；m d a 含量的变化在运动后即刻 达到高峰，然后下降，呈恢复的趋势。说明离心运动使肌肉组织能量需要剧增， 耗氧增多，氧代谢的结果必然产生自由基，运动后即刻m d a 含量达到高峰，表明 体内脂质过氧化反应增强，势必造成肌细胞膜的损伤，代谢失衡对损伤的发生有 影响。由于机体自身的抗氧化防御机制作用，m d a 含量随后下降，呈恢复趋势。 运动时自由基生成增多与运动能力下降关系密切，自由基使机体内各种器官 的生物膜产生脂质过氧化，其分解终产物之一丙二醛( m d a ) 可以由生成部位扩散 到其它部位产生毒性作用，也可以引起其它物质产生过氧化作用的连锁反应，使 机体的正常生理、生化过程发生紊乱。自由基对机体的损伤程序与谷胱甘肽抗氧 化系统水平有密切的关系。 在抗氧化能力方面，离心运动后即刻s o d 活性下降，然后上升呈恢复的趋势， 无显著差异。说明运动性骨骼肌损伤体内自由基增多，使自由基的产生和清除之 间的平衡被破坏，随着机体自身抗氧化能力增强，s