（运动人体科学专业论文）游泳运动对小鼠脾脏tlr2、tlr4诱导表达作用的实验研究.pdf

游泳运动对小鼠脾脏t l r 2 、t l r 4 诱导表达作用的实验研究中文摘要中文摘要目的：通过对实验前、后小鼠脾脏t l r 2 、t l r 4 和c d 4 + c d 2 5 + t r e g 的表达水平变化及其血清n f r b 水平变化的分析，探讨和研究大强度运动对小鼠脾脏t l r 2 、t l r 4的诱导表达作用及其对n f r , b 、c d 4 + c d 2 5 + t r e g 的影响。方法：将昆明种小鼠1 0 0 只，随机分为对照组( 5 0 只) 和运动组( 5 0 只) ；再分为对照0 周组、1 周组、2 周组、3 周组和4 周组；运动o 周组、1 周组、2 周组、3周组和4 周组。在统一饲养条件下，对照组不运动，运动各组分别按运动方案进行负重( 5 体重) 游泳运动。分别于实验前、每周末次运动后2 4 h ，摘取相应组小鼠脾脏和胸腺、采集血样。实验结束后，统一计算脾指数和胸腺指数，流式细胞法检测小鼠脾脏t l r 2 、t l r 4 和c d 4 + c d 2 5 + t r e g 的表达，e l i s a 法测定血清n f 1 c b 含量。运用s p s s l 7 0 软件处理测试所获数据。结果：1 运动组小鼠脾脏指数随着运动时间的延长表现为先增后减的变化趋势，运动1 、2 周时增加( j p o 0 5 ) ，运动3 、4 周时降低( p 0 0 5 ) ，对照组无变化；胸腺指数在4 周运动期间表现为逐日减少的变化趋势，运动2 、3 、4 周时持续降低( 尸 0 0 5 、p 0 0 1 ) ，对照组无变化。2 运动组小鼠脾脏t l r 2 、t l r 4 的表达率，自运动2 周时较对照组升高直至第4 周( 尸 o 0 5 ) ，期间以运动2 周时的升高幅度较大( 尸 o 0 1 ) ，运动3 、4 周时较2 周时降低( 尸 o 0 5 ) 。对照组无变化。3 运动组小鼠血清n f k b 含量，在运动2 周时较对照组升高直至第4 周( p o 0 5 、p 0 0 1 ) ，期间以运动3 、4 周时升高幅度较大( 尸 0 0 1 ) ，且高于运动2周时的血清含量( 尸 0 0 5 ) 。对照组无变化。4 运动组小鼠脾脏c d 4 + c d 2 5 + t r e g 的表达率，在运动2 周时较对照组升高直至第4 周( 尸 0 0 5 、p 0 0 1 ) ，期问以运动4 周时升高的幅度较大( 尸 0 0 1 ) 。对照组无变化。中文摘要游泳运动对小鼠脾脏t l r 2 、t l r 4 诱导表达作用的实验研究结论：1 4 周负重游泳运动可延缓小鼠脾脏生长，加快胸腺萎缩，进而影响免疫器官的发育和功能。2 4 周负重游泳运动可上调小鼠脾脏t l r 2 、t l r 4 的表达水平，提高血清n f 1 c b含量，诱导天然免疫。3 4 周负重游泳运动可使小鼠脾脏c d 4 + c d 2 5 + t r e g 表达水平继而提高，经t l rc d 4 + c d 2 5 + t r e g 途径诱导获得性免疫。关键词：游泳t l r 2t l r 4n f r bc d 4 + c d 2 5 + t r e g作者：吴嫔赞指导教师：吴明方e f f e c to fs w i m m i n go i lo b j e c t i v e ：e x p r e s s l o no lm i c es d l e e nnlt l r 2a n dt l r 4a b s t r a c tw ea n a l y s e dt h ee x p r e s s i o no f m i c es p l e e nt l r 2 ，t l r 4 ，c d 4 + c d 2 5 + t r e g ，a n ds e r u mn f - r d 3t oe l u c i d a t eh i g h i n t e n s i t ye x e r c i s ei n d u c i n gm i c es p l e e nt l r 2 ，t l r 4c h a n g i n ga n di t sr e l a t i o nw i t hn f r b 、c d 4 + c d 2 5 + t r e g m e t h o d s ：d i v i d i n gr a n d o m l y10 0k u n m i n gm i c ei n t ot w og r o u p s ，t h ec o n t r o lg r o u p ( 5 0 )a n de x e r c i s eg r o u p ( 5 0 ) ；t h ec o n t r o lg r o u pc o n t a i n so w e e kg r o u p ，1w e e kg r o u p ，2 w e e kg r o u p ，3 w e e kg r o u p ，a n d4 w e e kg r o u p t h ee x e r c i s eg r o u pi n c l o u d s0 w e e kg r o u p ，1w e e kg r o u p ，2 w e e kg r o u p ，3 w e e kg r o u p ，a n d4 w e e kg r o u p a l lt h em i c ew e r ef e di nt h es a m ec o n d i t i o n s ，t h ec o n t r o lg r o u pr e c e i v e dn oi n t e r v e n t i o n s ，b u te a c he x e r c i s eg r o u ps w a i nw i t hl o a da b o u t5 t h e i ro w nw e i g h ta c c o r d i n gt ot h ee x e r c i s ed e s i g n w eo b t a i n e dm i c es p l e e n ，t h y m u s ，a n db l o o ds a m p l e sb e f o r ee x e r c i s ei n t e r v e n t i o na n da tt h ee n do fe v e r yw e e k r e c o r d e dt h ew e i g h to fs p l e e na n dt h y m u s ，u s e df l o wc y t o m e t r yt od e t e c tt h ee x p r e s s i o no fm i c es p l e e nt l r 2 ，t l r 4 ，c d 4 + c d 2 5 + t r e g ，a n da n a l y s e ds e r u m n f - r d 3b ye l i s a t h es t a t i s t i c a ls o f t w a r es p s s17 0w a su s e df o rd a t aa n a l y s e r e s u l t ：1 t h es p l e e nw i g h ti n d e xi n c r e a s e da tt h ef i r s tt w ow e e k s ( p 0 0 5 ) ，b u td e c l i n d e di n t h en e x tw e e k s ( p o 0 5 ) i th a dn os i g n i f i c a n c ec o m p a r i n gt ot h ec o n t r o l s ；t h et h y m u sw e i g h ti n d e xd e c r e a s e dd u r i n gf o u rw e e k s ，b u ta l s oh a dn os i g n i f i c a n c ec o m p a r i n gt ot h ec o n t r o l s 2 t h ee x p r e s s i o no fm i c es p l e e nt l r 2 、t l r 4i n c r e a s e df r o m2w e e kt o4w e e ki ne x e r c i s eg r o u p ，a n dt h e yr e a c h e dt o pp o i n ti n2w e e k ( 尸 0 01 ) t h ee x p r e s s i o no fm i c es p l e e nt l r 2 、t l r 4w a sl o w e ri n3w e e ka n d4w e e kt h a ni n2w e e k ( 尸0 0 5 ) t h e r ew a sn os i g n i f i c a n t l yc h a n g i n gi nt h ec o n t r o lg r o u p s a b s t r a c te f f e c to fs w i m m i n go ne x p r e s s i o no fm i c es p l e e nt l r 2a n dt l r 4 3 s e r u mn f 1 出l e v e l sw a sh i # e ri ne x e r c i s eg r o u pt h a ni nt h ec o n t r o l sd u r i n g2 w e e k ，3 w e e k a n d4 w e e k ( p 0 0 5 、p 0 0 1 ) i tr e a c h e dt o pp o i n ti n3 w e e ka n d4 w e e k t h e r ew a sn os i g n i f i c a n t l yc h a n g i n gi nt h ec o n t r o lg r o u p s 4 t h ee x p r e s s i o no fc d 4 + c d 2 5 + t r e gi n c r e a s e df r o m2w e e kt o4w e e ki ne x e r c i s eg r o u p ，a n dt h e yr e a c f i e dt o pp o i n ti n4w e e k ( p o 01 ) t h e r ew a sn os i g n i f i c a n t l yc h a n g i n gi nt h ec o n t r o lg r o u p s c o n c l u s i o n s ：l1 4w e e k sl o a ds w i m m i n gd e l a y e dm i c es p l e e ng r o w i n g ，i n d u c e dt h y m u sa t r o p h yq u i c k l y , a n dh a dn e g a t i v ee f f e c to ni m m u n eo r g e nd e v e l o p i n ga n df u n c t i o n 2 4w e e k sl o a ds w i m m i n gi n c r e a s e dt h ee x p r e s s i o no fm i c es p l e e nt l r 2 、t l r 4 ，e l e v a t e ds e r u mn f 1 c bl e v e l ，a n di n d u c e dn a t u r ei m m u n e 3 4w e e k sl o a ds w i m m i n gi n d u c e dm i c es p l e e nc d 4 + c d 2 5 + t r e gi n c r e a s i n g ，m e d i a t e da d p t i v ei m m u n et h r o u g ht l r c d 4 + c d 2 5 + t r e gp a t h w a y k e yw o r d s ：s w i m m i n gt l r 2t l r 4n f - r bc d 4 + c d 2 5 + t r e gi vw r i t t e nb y ：p i n y u nw us u p e r v i s e db y ：m i n g f a n gw u游泳运动对小鼠脾脏t l r 2 、t l r 4 诱导表达作用的实验研究l 前言土_ 上_ j 1 月l j舌1 1 选题依据天然免疫系统是一个进化保守的防御体系，是机体抵御病原微生物侵入体内的第一道防线，其识别调控机制是近年来免疫学研究的一个重要热点领域。研究显示，哺乳类动物的天然免疫系统主要是通过免疫细胞所表达的相应模式识别受体，识别各种病原体的结构成分，启动细胞内信号传导通路，诱导细胞因子或趋化因子分泌而发挥抗感染作用。t o l l 样受体( t o l l 1 i k er e c e p t o r s ，t l r s ) ，是一种高度保守的跨膜蛋白。作为天然免疫系统一类重要的模式识别受体，t l r s 主要表达于巨噬细胞等免疫细胞表面，通过选择性识别内、外源性配体或病原体相关分子模式等“非己”成分而被激活后，参与天然免疫应答，构成机体抵御病原体入侵的第一道屏障。t l r s 还是连接天然免疫和获得性免疫的主要桥梁；t l r s 启动的炎性信号通路以及诱导分泌的炎性细胞因子与多种疾病相关。其中，t l r 2 、t l r 4 因其表达范围最广、识别病原微生物及其产物种类最多而受备受关注，是t o l l 样受体家族最重要的成员。n f 1 c b ( n u c l e a rf a c t o r k a p p ab ，n f kb ) 是一种具有基因转录多项调控作用的快反应核转录因子，普遍存在于细胞质中，位于t l r s 下游信号通路的枢纽位置，参与免疫反应及细胞增殖与分化等过程。将病原相关分子刺激信号通过跨膜结构转导入细胞内，产生复杂的级联信号反应，从而激活n f k b ，引起多种相应细胞因子及趋化因子分泌，是t l r s 活化后参与天然免疫应答的机制之一。c d 4 + c d 2 5 + t r e g s ( r e g u l a t o r ytc e l l s ，c d 4 + c d 2 5 + t r e g ) 是机体内一个特殊的t细胞群体，对机体免疫平衡状态的维持起着重要作用。由于自然界存在的众多微生物的某些组分均是t l r s 的配体，它们的持续存在可被t l r s 识别，从而诱导t r e g活化，发挥免疫负调控的作用，这是机体维持正常免疫反应的条件之一。诱导c d 4 + c d 2 5 + t r e g s 活化，则是t l r s 调节获得性免疫的重要途径之一。目前，围绕运动与t l r s 的相关研究鲜见报道，但临床动物实验及人体研究结果为开展该领域的研究奠定了理论基础、提供了新的思路，鉴此，本研究通过小鼠运动模型的建立，探讨和分析运动对小鼠脾脏t l r 2 、t l r 4 的诱导表达作用。1 前言游泳运动对小鼠脾脏t l r 2 、t l r 4 诱导表达作用的实验研究1 2 文献综述1 2 1t l r s 家族1 2 1 1t l r s 简介t l r s 的认识最早来自对果蝇的研究。果蝇的跨膜受体有4 种，分别为t o l l ，1 8 - w h e e l e r ( 1 8 w ) ，m s t 和s t s d m 2 2 4 5 ，其中t o l l 是最主要的跨膜受体。最早发现的t o l l 是果蝇胚胎发育早期与背腹侧轴形成有关信号转导中的重要成分，在果蝇对抗病原体微生物的感染中发挥重要作用。1 9 9 7 年，m e d z h i t o v 等发现哺乳动物体内有与果蝇相似的t o l l 蛋白，并命名为t o l l 样受体( t l r s ) 【l 】。接着多种t l r s相继被发现，至今在哺乳动物已发现1 3 种t l r s 而人类只表达1 1 种t l r s ( 即t l r l t l r l l ) 【2 1 。不同的哺乳动物种族之间t l r s 的表达仍存在细微的差异，其中t l r i 9 在人类与小鼠之间存在高度保守【烈，t l r l 0 在人类存在活性，而小鼠t l r l 0 基因的c 末端由无关的序列替代，成为一无功能的假基因；与此相反，小鼠的t l r l l ，1 2 和1 3 基因有功能，而人类的t l r l l 基因上由于存在一终止密码子而失活l 引。这些与果蝇t o l l 蛋白同源的人t o l l 样蛋白代表了一类保守的天然免疫识别受体家族，它们通过某些信号传导途径，可导致细胞活化，激活天然免疫应答。它们的基因分别定位于第1 号( t l r 5 ) 、第3 号( t l r 9 ) 【4 l 、第4 号( t l r l 、2 、3 、6 ) 、第9 号( t l i ) 和性别x 染色体( t l r 7 、8 ) ( t l r l o 的染色体定位未见报道) 。t l r l 分布于各类免疫细胞；t l r 2 、t l r 4 和t l r 5 ，主要分布于除t 、b 、n k细胞以外的免疫细胞；t l r 3 主要表达于幼稚的树突状细胞( d e n d r i t i cc e l l ，d c ) 【5 1 ；t l r 6 9 广泛表达于多种细胞【6 】；t l r l 0 主要表达于淋巴样组织中和脾脏细胞【7 1 。t l r s 可识别不同病毒配体，从而介导各种信号通路，启动不同的免疫效应【g j 。t l r 2 ，4 表达于细胞表面，能直接识别病毒蛋白颗粒，如t l r 2 识别人巨细胞病毒和鼠巨细胞病毒蛋白，t l r 4 识别呼吸道合胞病毒的融合蛋白、柯萨奇病毒的b 4 蛋白、鼠乳腺肿瘤病毒和白血病病毒的包膜蛋白等。t l r 5 可形成同源二聚体或与t l r 4 形成异源二聚体识别鞭毛蛋白。t l r 3 、t l r 7 、t l r 8 、t l r 9 主要表达于细胞内涵体，识别各种病毒核酸。t l r 3 同源二聚体可以识别d s r n a 病毒，如鼠巨细胞病毒、呼肠病毒和微小核糖核酸病毒等。t l r 7 和t l r 8 识别单链r n a ，也可与一些合成的小分子抗病毒成分咪哗喹啉相结合形成复合物来发挥作用。t l r 9 以同源二聚体的形式识别非甲基化的c p gd n a 序列。目前对t l r l l 的研究2游泳运动对小鼠脾脏t l i l i 、t l r 4 诱导表达作用的实验研究i 前言较少，l p s 、p g n 和p o l y ( i - c ) 都不能刺激t l r l l 表达细胞中n f k b 的活化。除此之外，t l r l 、t l r 6 和t l r l 0 不直接识别配体，而通过与其他t l r 配对形成异源二聚体的形式发挥作用【9 1 。1 2 1 2t l r s 的结构t l r s 是一种进化上高度保守的胚系编码的i 型跨膜蛋白，由胞外区、跨膜区和胞内区所组成。胞外区是由1 9 - - 2 5 个富含亮氨酸的重复序列( 1 e u c i n e r i c hr e p e a t s ，l l 讯s ) 组成，含有5 5 0 - - 9 8 0 个氨基酸，其中2 4 - - - 2 9 个氨基酸长度的胞外结构域弯曲呈马蹄状，其中的l r r 部分构成配体结合区，能识别各种病原体相关成分；跨膜区时富含半胱氨酸的结构域；胞内段含有高度保守的蛋白质相互作用区，即( t 0 1 l i l 1 r ，t i r ) 区，约2 0 0 个氨基酸大小，是t o l l 样蛋白和i l 1 r向下游进行信号转导的核心元件。t l r s 信号转导通路上的许多蛋白质，如m y d 8 8 、i l - 1 相关蛋白激酶( i r a k ) 、肿瘤坏死因子受体相关因子6 ( t r a f 6 ) 等都具有t i r 结构域【1 0 】。该结构域可以与胞内其他相同t i r 结构域的街头分子相互作用，启动信号传递。某些t l r s 能够形成同源二聚体或异源二聚体，例如，t l r 2 能够与t l r l 相互作用形成异源二聚体，从而识别三酰基脂多肽，还能与t l r 6 形成异源二聚体识别双酰基脂多肽和肽聚糖；t l r 3 能够二聚体化，识别双链r n a ，其中每个t l r 3 分子通过外部结构域的两个位点结合d s r n a ，定位于马蹄状结构的两个末端，二聚化的两个t l r 3 分子c 末端的分子间相互作用，有助于协同和稳定二聚体。t l r 3 的整个外部区域在结合d s r n a 后不发生结构改变，但是相邻的t l r 3 能够通过二聚化胞内t i r 结构域介导下游信号转导通路；t l r 4 能够与髓系分化因子- 2 ( a s s o c i a t e sw i t hm y e l o i df a c t o r2 ，m d 2 ) 形成复合物识别脂多糖( 1 i p o p o l y s a c c h a r i d e ，l p s ) ，l p s 的直接结合介导了2 个t l r 4 m d 2 复合物的二聚化，并以对称方形成t l r 4 m d 2 l p s 多聚体。1 2 1 3t o l l 样受体配体t l r s 配体按来源可分为外源性和内源性配体( 表1 ) 。外源性配体主要来自病原微生物，是微生物进化过程中的保守成分，如细菌的脂多糖，胞壁酸、肽聚糖以及细菌和病毒的核酸等，内源性配体来自宿主细胞，如热休克蛋白、细胞外基质降解成分等等，内源性配体在集体应激或是组织损伤时释放。3i 前言游泳运动对小鼠脾脏t l r 2 、t l r 4 诱导表达作用的实验研究4游泳运动对小鼠脾脏t l r 2 、t l r 4 诱导表达作用的实验研究1 前言1 2 2t l i 之2 与t l l 己41 2 2 1t l r 2同t l r s 家族其他成员一样，t l r 2 也是i 型跨膜蛋白，人t l r 2 基因定位于4 q 3 2 ，整个蛋白结构由7 4 8 个氨基酸组成，可分为：胞外区、胞浆区和跨膜区3部分【l l 】【1 2 】。t l r 2 胞外区含2 1 个拷贝的亮氨酸重复区( 1 e u c i n e r i c hr e p e a t ，l r r ) ，与果蝇t o l l 胞外区具有高度同源性，可识别病原体结构成分：胞浆区与i l 1 受体( i l 一1 r ) 的胞浆区高度同源，因此又称为t i r 区，主要介导胞内信号转导【1 3 】。t l r 2 是表达范围最广，识别病原微生物及其产物种类最多的分子。t l r 2 分布于除t 、b 、自然杀伤细胞外的免疫细胞，主要表达于包括单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等宿主第一线防御相关的细胞，尤其在脾脏和外周血白细胞高表达。近年的研究发现在树突细胞上，一些上皮细胞也证实有t l r 2 表达f l4 1 。( 1 ) 树突状细胞r e 【15 j 等的实验中通过设计t l r 2 的特异引物，采用一步法逆转录聚合酶链反应技术从树突细胞总r n a 中扩增出t l r 2 的e d n a 片段，并经核苷酸序列测定，证实其与基因库提供的t l r 2 序列一致，同时以t l r 2 的e d n a 片段为探针，进行n o r t h e r n 杂交，所得就结果也证明t l r 2 在树突状细胞中表达。t l r 2 激活树突状细胞后产生不同的细胞因子和化学激活因子，t l r 2 激活树突状细胞优先表达i l 一8 、i l 2 3 和p 1 9 ，这些可溶性因子指导t 辅助细胞朝有利于杀灭病原的方向分化为细胞免疫或体液免疫。( 2 ) 上皮细胞近来的研究已经表明，在一些上皮细胞液有t l r 2的表达，有报道在人的气道上皮发现有t l r 2 的表达，同h e r t z 掣1 6 】早期研究表达在人原代气道上皮的t l r 2 和它的功能的实验相一致；a m s t r o n g o r d 等【r 7 】的实验则首次表明，在人的原代肺泡上皮细胞有功能性的t l r 2 表达，肺泡i i 型上皮细胞表达有t l r 2 的信使r n a 和蛋白。在肠上皮细胞株也有t l r 2 发现，它对磷脂壁酸的应答和表达是减低的【l 引。口腔上皮细胞也被证实有低水平的t l r 2 表达，在干扰素启动后它能够增加表达i l9 1 。在肾缺血动物模型中，发现肾上皮细胞有t l r 2表达。( 3 ) 肿瘤细胞有研究发现，多个组织来源的小鼠肿瘤细胞株也普遍表达t l r 2 ，如e m t - 6 、r m 1 为上皮腺癌细胞，n s 1 、s p 2 0 为骨髓瘤细胞，f b l 3 为红白病细胞，虽然它们组织来源不同，但都表达t l r 2 。另外，在b 细胞株及大鼠心肌细胞、脑组织等也有表达。t l r 2 还分布于成纤维细胞、星形胶质细胞。不同物种中同种t l r 的基因分布不尽相同，目前基因定位技术研究证实，人的t l r 2基因在染色体上的位置为4 q 3 2 ( 4 号染色体q 臂3 2 区) ，而小鼠则为3 f 。5l 前言游泳运动对小鼠脾脏t l r 2 、t l r 4 诱导表达作用的实验研究目前研究发现，t l r 2 的胞内信号转导途径至少有2 条。一是髓样分化蛋白m y d 8 8 依赖途径。即活化的t l r 2 的胞内t i r 结构域与m y d 8 8 羟基端相互作用而使后者活化。m y d 8 8 连接t i r 到i l 受体相关激酶家族成员，包括i l 受体相关激酶1 和i l 受体相关激酶4 ，进而激活肿瘤坏死因子a ( t u m o m e c r o s i sf a c t o r - q ，t n f q ) 受体相关因子6 。活化后的t n f a 受体相关因子6 通过转化生长因子1 3活化激酶l 和核因子kb 抑制蛋白激酶信号级联，使n f kb 抑制蛋白磷酸化而降解，最终使m y d 8 8 的核定位信号暴露，促使n f kb 转迁到核内，激活相应基因的转录。m y d 8 8 依赖通路也是所有t l r 共用的，是包括细胞因子产物在内的一系列核心反应。但是也有研究证明，除了m y d 8 8 依赖通路的核心反应外，尚有依赖于微生物产物的性质而诱导的另一种信号转导通路。目前，已经得到鉴定的含有t i r 结构域的非m y d 8 8 转接蛋白有3 种，分别为t i r a p m y d 8 8 衔接蛋白、t r i f t i c a m 1 以及t i c a m 2 t r a m 蛋白。其中m y d 8 8 衔接蛋白又称t i r a p( t i r d o m i a nc o n t a i n i n ga d a p t o r p r o t e i n ) ，它则在t l r 2 介导的信号通路中起作用，介导了t l r 2 非m y d 8 8 依赖的通路。t l r 2 介导的生物学效应( 1 ) 诱导促炎细胞因子的释放细菌菌体及其菌体成分作用于t l r 2 后，所引起的细胞内信号传导机制的最终效应都是导致t n f q 、i l 6 、i f n q 等促炎细胞因子释放，这些细胞因子可在局部促进单核吞噬细胞的吞噬、杀伤活性，介导炎症反应。不同的病原体p a m p s 分子作用于不同细胞表面的t l r 2 ，所引起的细胞因子的种类和产量都有所不同。如w a n g 等发现g ( + )菌及其p g n 不仅可促使效应细胞合成上述炎症因子，还可促使转染了t l r 2 的h e k 2 9 3 细胞中i l 8 的转录表达。( 2 ) 诱导杀菌活性结核杆菌的1 9 0 0 0 u 脂蛋白可作用于小鼠的t l r 2 ，诱发n o 依赖性的杀菌活性；但所诱导的人单核细胞的杀菌活性则不依赖于n o ，是t l r 2 激活的直接效应。而m e a n s 等用结核杆菌全菌刺激小鼠和人巨噬细胞则得出不同的结论，即n o 的产生与t l r 2 和t l r 4 无关。( 3 ) 促凋亡与抗凋亡作用a l i p r a n t i s 等发现细菌脂蛋白还可通过t l r 2 诱导人单核细胞和表达t l r 2 的上皮细胞发生凋亡；而f r a n t z 等则通过阻断t l r 2 ，增强氧化应激导致的大鼠心肌细胞凋亡，由此证明了t l r 2 的抗凋亡作用。这2 种孑然不同的诱导凋亡和抗凋亡作用都是通过激活n f kb 来实现的，目前对这一现象的解释是：激活n f kb 究竟是启动或抑制细胞凋亡与刺激物的类型和t l i 也表达细胞密切相关。6游泳运动对小鼠脾脏t l 慰、t l r 4 诱导表达作用的实验研究l 前言1 2 2 2 r 】。r 4t l r 4 是人类发现的第1 个t l r 相关蛋白，它表达于所有的细胞系，在骨髓单核细胞中表达尤其多【2 0 l 。广泛分布于t 淋巴细胞、b 淋巴细胞、白细胞、单核巨噬细胞、肥大细胞、小肠上皮细胞、表皮微血管和脐静脉内皮细胞、人齿龈纤维母细胞、人子宫颈平滑肌细胞等等。t l r 4 分子由胞外区、穿膜区及胞内区3 部分组成，其中胞外区富含亮氨酸重复序列( l l 讯) 结构域，可与c d l 4 分子中的l r r 结合而介导蛋白质之间的相互作用。胞内区存在一段序列保守区，该序列与白细胞介素( i l ) 1 受体胞内区的保守序列有高度同源性，被称之为t i r 区域【2 1 1 。因此，t l r 4 分子也属于i l 1 受体超家族的成员。t i r 区域是t l r 4 与其下游相关的信号转导分子，如髓样分化蛋白8 8 ( m y d 8 8 ) 、i l 1 相关蛋白激酶( i r a k ) 、肿瘤坏死因子受体活化因子6 ( t r a f 6 ) 等，以及蛋白激酶相互作用的关键部位。【2 2 t l r 4表达于许多的免疫和非免疫细胞，活化t l r 4 将诱导产生一系列的炎症介质包括细胞因子、趋化因子等从而产生强有力的炎症反应。最初的研究发现t l r 4 是革兰氏阴性细胞细胞壁成分脂多糖l p s 的识别受体；l p s 结合蛋白( l p s b i n d i n gp r o t e i n ，l b p ) 与l b p 结合后，介导l p s 与c d l 4 相互作用，并由c d l 4 将l p s 转运并锚定于由t l r 4 和髓样分化蛋白2 ( m y e l o i dd i f f e r e n t i a t i o np r o t e i n ，m d 2 ) 构成的受体复合物【2 3 1 。c d l 4 缺乏跨膜结构域，不能单独转导l p s 信号，而m d 2 是一种分泌型糖蛋白。研究表明l p s 结合m d 2 后，通过t l r 4 的细胞外富含亮氨酸的重复结构介导t l r 4 的聚合，从而诱导t l r 4 的信号转导【2 4 】。近来的研究显示紫杉醇，呼吸道合胞病毒的融合蛋白，鼠乳腺肿瘤病毒的包膜蛋白，热休克蛋白6 0 ( h o ts h o c kp r o t e i n6 0 ，h s p 6 0 ) ，h s p 7 0 纤连蛋白透明质酸寡聚糖，硫酸肝素多聚糖片段和纤维蛋白原以及h m g b l j u 均能活化t l r 4 2 5 1 ，表明t l r 4 在抗细菌、抗病毒的炎症反应中，以及在应激状态下均发挥重要作用。在t l r 4 信号转导中有许多接头蛋白的参与，包括髓样细胞分化因子8 8 ，m y d 8 8 接头蛋白样蛋白( m y d 8 8a d a p t o r - l i k ep r o t e i n ，m a l ) 、含t i r 接头蛋白分子( t i r c o n t a i n i n ga d a p t o rm o l e c u l e ，t r i f ) 以及t r i f 相关接头蛋白分子( t r i f r e l a t e da d a p t o rm o l e c u l e ，t r a m ) 等。而其中的m y d 8 8 作为一种含t i r结构域的街头蛋白，在t l r 4 信号转导中的作用最具有特征性。目前的证据显示t l r 4 介导的对l p s 反应存在两条信号通路，即早期m y d 8 8 依赖性反应通路和后期m y d 8 8 非依赖性反应通路。7l 前言游泳运动对小鼠脾脏t l r 2 、t l r 4 诱导表达作用的实验研究1 2 3t o l l 样受体家族与天然免疫机体在长期的进化过程中，在病原生物的压力下，适应产生了两套免疫系统，即天然免疫和获得性免疫。天然免疫或非特异性免疫，存在于所有的多细胞生物，与生俱来，包括多种效应细胞和分子，如各种粒细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞( d c ) 、n k 细胞和体液杀菌成分如补体，抗微生物肽、溶菌酶等。获得性免疫即特异性免疫，到脊椎动物才出现，是在个体发育过程中通过i g 超家族基因重排而产生的抗原识别细胞，包括t 和b 淋巴细胞【2 6 1 。天然免疫是机体抗御感染的第一道防线，此功能的发挥首先依赖于相关受体对病原体的识别。天然免疫识别分子即模式识别受体( p a t t e r n r e c o g n i t i o nr e c e p t o r s ，p r r ) ，其对病原体相关分子模式( p a t h o g e n a s s o c i a t e dm o l e c u l a rp a t t e r n s ，p a m p ) 的识别即谓之模式识别作用。病原体种类繁多、结构各异且突变频率很高，而由胚系基因编码的p r r 数量有限，因此天然免疫向识别病原体的保守结构进化，产生了一套非克隆性分布的p r r 来识别p a m p s 。模式识别类似数码识别，模式识别系统是一个数字信息系统。p a m p s位于病原体生存所必需的保守结构之中，缓慢地进化为某一类病原体所共有，故p a m p s 代表病原体的分子信号，如肽聚糖( p e p t i d o g l y c a n ，p g n ) 、脂多糖( l i p o p o l y s a c c h a r i d e ，l p s ) 、脂磷壁酸( l i p o t e i c h o i c a c i d ，l t a ) 、脂阿拉伯甘露聚糖、甘露聚糖分别代表细菌、g 细菌、g + 细菌、分枝杆菌及真菌的信号。有些p r r 识别多种p a m p ，而另一些则协同识别几种类型p a m p 的组合，如t l r s 就能处理大约2 0 种p a m p 组合。实际上，已知的p r r 就足以识别任何种类的感染因子【27 1 。已知p a m p s 是有效的天然免疫的活化剂，目前的研究大多以纯化的微生物成分作为实验材料，但当病原体入侵人体时，机体的免疫系统是对这些成分的混合物作出免疫应答，因此其形式和相互影响可能会更加复杂【2 引。其实人们很早就发现微生物能够非特异性刺激免疫系统，但一直对其作用机制不十分了解，直到t l r s在哺乳动物细胞上被发现，才使人类对天然免疫的认识登上了一个新的台阶，从而大大推动了对p a m p s 的研究1 2 9 。天然免疫系统是机体防御病原微生物感染的第一道防线。天然免疫系统通过t l r s 等p r r 特异性识别p a m p ，从而有效的感知病原微生物的入侵。诱导机体免疫应答，在天然免疫防御中发挥重要作用。当一种t l r s 结合配体后，启动细胞内- 夕| 、信号级联反应，转录因子n f k b 转移至胞核，使得各种细胞因子和趋化因子的基因转录，通过募集宿主的免疫细胞和活化抗微生物防御而触发炎性反应。目前8游泳运动对小鼠脾脏t l r 2 、t l r 4 诱导表达作用的实验研究l 前言研究较为明确的t l r s 主要为t l r 4 和t l r 2 1 3 0 】。t l r s 能够有效识别“非己”成分而被活化，然后通过以下机制参与天然免疫。( 1 ) 直接增强天然免疫细胞的吞噬及杀伤能力通过上调一系列与吞噬有关的基因表达，增强巨噬细胞、中性粒细胞的吞噬能力及杀伤能力等途径，提高天然免疫细胞对病原微生物的清除能力。( 2 ) 促进细胞因子和趋化因子的分泌t l r s 可以激活n f kb 等转录因子，引起多种与免疫有关的细胞因子及趋化因子的分泌，如i l 1 、i l 6 、i l 8 、i l 1 2 、i l 1 8 和t n f a 等。i l 1 、i l 一6 和i l 8 能募集单核巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等到病原体所在部位，而i l 1 2 和t n f a 等能激活天然免疫细胞消灭病原微生物。i 型干扰素能够显著并快速地激活天然免疫细胞并能够显著抑制病毒复制。( 3 ) 促进抗微生物肽的分泌t l r s 可能介导了一些抗微生物的肽段( a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e s ，a m p s ) 如防御素( d e n f e n s i n ) 等的分泌，从而调节细菌在上皮表明的直接死亡。所以t l r s 识别p a m p 是机体启动并扩大天然免疫的重要机制。1 2 3 1n f kbn f kb 是调控基因转录的重要因子，它可与许多蛋白质基因启动子和增强子部位的kb 序列结合，诱导这些蛋白质表达增强。n f kb 可被一些细胞因子、蛋白激酶、氧化剂、病毒、脂多糖及紫外线的刺激而激活，活化的n f kb 又可诱导细胞因子、生长因子、急性蛋白、趋化因子、免疫受体和转录因子等多种物质的表达，因此参与炎症反应、肿瘤及动脉粥样硬化等多种疾病的病理过程。n f kb诱导基因表达的功能引起了医学界的广泛关注。有关t l r - n f kb 的信号转导过程主要来自对t l r 2 和t l r 4 的研究【3 1 】，激活的t l r 不仅诱导炎症反应，而且促进抗原特异性获得性免疫反应的分化和成熟【3 2 1 。目前认为l p s 激活t l r 4 - n f kb 有两条途径：一条是髓样分化因子8 8 依赖的信号通路；另一条是m y d 8 8 非依赖的信号通路。m y d 8 8 依赖的信号通路过程：首先在细胞外，炎症刺激因子如l p s 、i l 1 及t n f 等于t l r 4 结合，t l r 4 聚合使得信号转导到胞内。t l r 4 的胞内t i r 区与m y d 8 8 的羧基端结合，同时m y d 8 8 通过氨基酸的死亡域( d d ) 与白介素受体相关激酶( i r a k ) 氨基酸的死亡域结合，激活t r a k 自身的磷酸化，获得游离的i r a k l 、i r a k 2 和i r a k 4 继而激活t r a f 6 ，t r a f 6 激活n f kb 抑制物的激酶( i k k s ) 复合物。ikb 在i k k s 复合物的作用下磷酸化，磷酸化的ikb 被泛素连接酶复合物识别发生泛素化而降解。9l 前言游泳运动对小鼠脾脏t l r 2 、t l r 4 诱导表达作用的实验研究ikb 的降解使n f kb 从静息状态下受ikb 结合处于的抑制状态得以解除，n f kb 转入细胞核中诱导特定基因的表达，启动细胞因子如i l 1 、i l 6 、i l 8 、i l 。1 2等，辅助共刺激分子c d 8 0 和c d 8 6 等基因的转录。另外，l p s 可刺激m y d 8 8 缺陷的巨噬细胞编码i f n 诱导因子转录并表达干扰素诱导蛋白1 0 【3 3 1 ，说明存在m y d 8 8 非依赖的信号通路。表达i f n 诱导基因依赖t l r 4 ，但不依赖m y d 8 8 ，它是通过i f n 调节因子3 ( i f nr e g u l a t o r yf a c t o r3 ，i r f 3 ) 和n f - kb 发生的。关于l p s 激活n f kb 的m y d 8 8 非依赖的信号通路目前还不明确，但认为与l p s 激活蛋白激酶k 、s r c 型酪胺酸激酶及小g 蛋白等有关，这些都能活化n f k b t 3 4 1 。1 2 4t o l l 样受体与获得性免疫t l r s 不仅能激活天然免疫，同时能使抗原提呈细胞( a n t i g e n - p r e s e n t i n gc e l l s ，a p c ) 表面表达c d 8 0 和c d 8 6 【”】，最终激发t 淋巴细胞和b 淋巴细胞介导的获得性免疫反应。作为体内功能最强的a p c ，在启动和诱导获得性免疫反应中起关键作用。t l r s 是连接天然免疫和特异性免疫的主要桥梁，可通过多种途径而调控特异性免疫应答。一方面，t l r s 可诱导d c 成熟。d c 作为重要的a p c ，在天然免疫和特异性免疫中均发挥着重要的作用。t l r s 对d c 的影响作用主要表现在：激活d c 分泌t n f q 、i f n 、i l 6 、i l 1 2 p 4 0 、i l 2 3 等细胞因子，以及c x c l 9 、c x c l l1 等趋化因子；上调d c 表面m h c 分子以及c d 4 0 、c d 8 6 等共刺激分子的表达。t l r s诱导d c 细胞成熟后，成熟的d c 发挥抗原提呈，激活初始t 细胞，参与t 细胞与b 细胞发育，或者诱导免疫耐受、调节t h l t h 2 分化等效应，参与多种免疫反应，实现其免疫调节的功能。但也有研究认为某些t l r s 的配体会阻碍d c 的分化和成熟，参与病原体的免疫逃逸机制，所以关于t l r s 对d c 的影响作用及机制还需要更为深入的广泛的研究。另一方面，t l r s 可以诱导t 细胞向t h l 或t h 2 分化。t h l 和t h 2 的分化和功能平衡在维持机体免疫自稳中占重要地位，t l r s 对其有显著的影响，这种影响作用主要通过d c 介导。在机体内，t h l 往往与抗原核生物、病毒等的应答相联系，t l r s 识别的正式这一类病原体。l p s 、1 3 防御素、c p go d n 等通过激活