（生理学专业论文）节点干预对无尺度细胞信号转导网络的影响.pdf

节点干预对无尺度细胞信号转导网络的影响 摘要 目的：建立细胞信号网络构建的方法，对细胞信号网络的拓扑结构属性 获得初步认识，并在此基础上根据实验和计算机仿真技术分析不同类型的节 点在网络中的功能地位，进而认识细胞信号网络对意外差错的承受能力，也 为进一步的深入研究提供指导。方法：细胞信号网络构建及其拓扑结构分 析：根据已知的细胞信号转导途径以及信号转导分子之问的生化作用机制， 进行复杂细胞信号转导网络模型的构建。构建主要包括以下三个步骤：确定 在输入刺激条件下能够产生输出效应( 行使一定生理功能) 的线性途径；分 析途径之间发生相互作用的节点问的连接关系，确定不同节点的连接度；功 能模块的组织及其相互作用。根据构建的网络模型，从节点的连接度、节点 的组织特征、信号交流和随机性节点去除对网络的影响等几个不同的层次分 析其拓扑结构属性。计算机仿真分析：采用自主开发的计算机仿真软件 s i m t r a n 2 0 对上述细胞信号网络中的不同类型的节点分子干扰所致的动力 学改变进行仿真分析，仿真时间为1 2 0 r a i n ，步长为0 2 m i n 。通过改变相应反 应方程的动力学参数来模拟节点遭受的激活性或抑制性攻击。目标节点包括 高连接度和低连接度两大类节点，模拟攻击范围包括单个节点遭受攻击和多 个节点同时遭受攻击，攻击性质分为激活性和抑制性两种。节点抑制对小 鼠神经元信号网络影响分析：小鼠神经元原代培养7 d 后，进行干预处理。实 验共分四组，对照组不加抑制剂，实验一组加入特异性r a s 抑制剂( m a l l u m y c i n a ，m 一1 0 2 5 ) ，实验二组加入特异性j a k 抑制剂( 4 2 0 0 9 9 ) ，实验三组加入特 异性p d e 抑制剂( r o2 0 1 7 2 4 ) ，置于c 0 2 培养箱中( 5 c 0 2 、3 7 c ) 孵育 过夜。抑制剂作用后，对照组和实验组均给予e g f ( 2 0 n g 9 1 ) 刺激，分别作 用0 m i n 、1 0 m i n 、2 0 m i n 、6 0 r a i n 、1 2 0 m i n ，用液氮终止e g f 刺激作用。裂解 细胞，收集蛋白，考马斯亮蓝g - 2 5 0 法蛋白定量，s d s - p a g e 分离蛋白后半 干式电转移至p v d f 膜。采用p h o s p h o - a k t 单克隆抗体和p h o s p o m e k l 2 单 克隆抗体结合持久性化学发光检测技术确定p h o s p h o a k t 、p h o s p o m e k l 2 的相对强度。结果：通过构建得到了一定尺度的复杂性细胞信号网络模型， 网络节点的连接度呈高度的不均一性，其中少数节点与其它众多节点发生连 接，而大多数节点只与其它较少节点发生连接。计算机模拟的动力学曲线 表明：r a s 的持续性激活导致网络输出改变的强度和范围远远大于一过性过度 激活，网络中重要节点( r a s 、p 1 3 k 、p k a ) 的干扰效应明显超过普通节点( p d e 、 p a k 、p l a 2 ) 的干扰效应。多个节点联合干扰所至信号网络动力学的改变 是极其复杂的。w e s t e m 印迹结果表明r a s 节点的抑制导致m e k l 2 和a k t 磷酸化水平明显改变，而p d e 或j a k 节点分别抑制后m e k l 2 和a k t 磷酸 化水平无明显改变。根据相对强度曲线可以清晰看到，r a s 节点阻断后m e k i 2 和a k t 磷酸化水平分别由6 2 8 0 和4 6 1 3 降为8 8 6 和1 5 3 2 ，而p d e 或 j a k 节点分别抑制后m e k l 2 和a k t 磷酸化水平无明显改变。结论：细胞 信号网络具有无尺度属性，其重要节点在网络的组织、行使功能中起着重要 作用。细胞信号网络对一定程度内的随机性节点意外差错具有惊人的承受能 力。细胞信号网络的动力学行为具有明显的非线性。重要节点与普通节 点拓扑结构的差异导致了其网络功能的差异，重要节点通过直接或间接作用 对众多节点起着支配作用，而普通节点则仅仅与少数节点相关联。重要节点 的差错在信号网络紊乱中具有重要地位，而普通节点的差错对信号网络的影 响较小。网络中广泛存在的信号交流并没有导致信号传递的散漫性，细胞 通过多种复杂机制为信号传递的特异性和忠实性提供了保障。 关键词：细胞信号转导网络；拓扑结构；无尺度；计算机模拟；复杂性；动 力学；免疫印迹 t h ee f f e c to fn o d e si n t e r f e r e ro ns c a l e f r e ec e l l u l a rs i g n a l i n gt r a n s d u c t i o n n e t w o r k s a b s t r a c t 0 b j e c t i v e ：t oi n v e s t i g a t e t h e t o p o l o g i c a l s t r u c t u r e p r o p e r t i e so f c e l l u l a rs i g n a l i n gn e t w o r kb a s e do nc o n s t r u c t e dn e t w o r km o d e l 。a n d t oa n a l y s i st h ef u n c t i o n a ls t a t u so fd i f f e r e n tn o d e sb a s e do ne x p e r i m e n t sa n d c o m p u t e rs i m u l a t i o nt e c h n o l o g i e sf o rr e c o g n i z i n gt h et o l e r a n c ea b i l i t yo fc e l l u l a r s i g n a l i n gn e t w o r ka g a i n s tr a n d o mn o d e se r r o r s ，t h e np r o v i d i n ga s s i s t a n c ef o r f u r t h e rr e s e a r c ho nt h ec o m p l e x i t yo fc e l l u l a r s i g n a l i n gs y s t e m m e t h o d s ： s i g n a l i n gn e t w o r kc o n s t r u c t i o na n dt o p o l o g i c a ls t r u c t u r ea n a l y s i s ：ac o m p l e x c e l l u l a rs i g n a l i n gt r a n s d u c t i o nn e t w o r kw a sc o n s t r u c t e di nt e r m so fa v a i l a b l ec e l l s i g n a l i n g t r a n s d u c t i o n p a t h w a y sa n d r e s e a r c hd a t ao ft h em e c h a n i s mo f b i o c h e m i c a la c t i o na m o n gs i g n a lm o l e c u l e s t h r e em a j o rs t e p sw e r ei n c l u d e di n c o n s t r u c t i o n ：f i r s t l y , l i n e a rp a t h w a y sw h i c hc o u l dp r o d u c eo u t p u te f f e c t sb y s t i m u l u sw e r ed e f i n e d n e x t ，t h ec o n n e c t i o nr e l a t i o n so fn o d e st h a th a v e i n t e r a c t i o n sa m o n gp a t h w a y sw e r ea n a l y z e d f i n a l l y , f u n c t i o n a lm o d u l e sw e r e o r g a n i z e d t h et o p o l o g i c a ls t r u c t u r ep r o p e r t i e so f c e l l u l a rs i g n a l i n gn e t w o r kw e r e a n a l y z e da t s e v e r a ll e v e l s ，s u c ha st h ec o n n e c t i v i t yo fn o d e s ，t h eo r g a n i z i n g f e a t u r e so fn o d e s ，c r o s s t a l k sa m o n gp a t h w a y sa n dt h ee f f e c to fr a n d o mn o d e d e l e t i o no nn e t w o r k ，a c c o r d i n gt ot h en e t w o r km o d e l ( 室) c o m p u t e rs i m u l a t i o n a n a l y s i s ：c o m p u t e rs i m u l a t i o n s o f ts i m t r a n 2 0w h i c hw a sc o m p l i e d b y o u r s e l v e sw a su t i l i z e dt o p e r f o r md y n a m i c s i m u l a t i o n a n a l y s i so fc e l l u l a r s i g n a l i n gn e t w o r kw i t hv a r i o u sn o d es u f f e r e dd i s t u r b a n c e s s i m u l a t i o nt i m ew a s 12 0 m i n ，b ys t e po f0 2 m i n t h ed y n a m i cp a r a m e t e r so fc o r r e s p o n d i n gr e a c t i o n e q u a t i o n sw e r ec h a n g e dt oi m i t a t es t i m u l a t i n go ri n h i b i t o r ya t t a c k so nn o d e s t h e h i g h e r o rl o w e rc o r m e e t i v i t i e so fn o d e sw e r ei n c l u d e di nt h et a r g e t s ，a n d s t i m u l a t i n go ri n h i b i t o r ya t t a c k sw e r ee x e r t e do nn o d e s t h ee f f e c t so fn o d e i n h i b i t i o no nn e u r o n a ls i g n a l i n gn e t w o r ko fm i c e ：a f t e ri n t e r f e r i n g ，c u l t u r e d 4 n e u r o n so f m i c ew e r ed i v i d e di n t o4g r o u p s ，i n c l u d i n g1c o n t r o l l e dg r o u pa n d3 e x p e r i m e n tg r o u p s e x p e r i m e n tg r o u p sw e r ea d d e dw i t ht h es p e c i f i ci n h i b i t o ro f r a s ( m a n u m y c i na ) ，j a k ( 4 2 0 0 9 9 ) ，o rp d e ( r 10 9 6 ) r e s p e c t i v e l y , a n d t h e c o n t r o l l e dg r o u pw a sn o ta d d e da n yi n h i b i t o r n e u r o n sw e r ei n c u b a t e da t3 8 。ci n t h ep r e s e n c eo f5 c 0 2o v e r n i g h t t h ee x p e r i m e n ta n dc o n t r o l l e dg r o u p sw e r ea l l a d d e de g f ( 2 0 n g 9 1 ) ，a n ds t i m u l a t e df o r 0 m i n ，1 0 m i n ，2 0 r a i n ，6 0 m i n ，1 2 0 r a i n r e s p e c t i v e l y ，t h e nf l u i dn i t r o g e nw a su s e dt oe n dt h es t i m u l a t i o n so fe g f n e u r o n sw e r el y s e do ni c ew i t ha g i m t i o nf o rh a l fa nh o u r t h ec e l ll y s a t e sw e r e c o l l e c t e dw i t he rt u b e s ，a n dc e n t r i f u g e da t12 0 0 0 r p mf o r30 m i na t4 a tl a s t ， t h e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n sw e r ed e t e r m i n e d b y b r a d f o r dm e t h o d a f t e r s d s p a g e ，t h e s e p a r a t e dp r o t e i n s i nt h e p o l y a c r y l a m i d eg e l s w e r e e l e c t r o t r a n s f e r e dt op v d fm e m b r a n e s t h er e l a t i v ei n t e n s i t i e so fp h o 驴h o a k t a n dp h o s p h o m e k l 2w e r ed e t e r m i n e db yp h o s p h o - a k ta n dp h o s p h o ：m e k l 2 r a b b i tm a b r e s u l t s ：am o d e lo fc o m p l e xc e l l u l a r s i g n a l i n gn e t w o r kw a s a c h i e v e db yc o n s t r u c t i o na n dt h en e t w o r km o d e lo b v i o u s l ys h o w si n h o m o g e n e o u s t o p o l o g i c a ls t r u c t u r e i nt h i sn e t w o r k ，af e wn o d e sw e r ec o n n e c t e dt om a n yo t h e r n o d e s ，a n dt h em a j o r i t yo fn o d e sw e r ec o n n e c t e dt oo n l yaf e wo t h e rn o d e s c o m p u t e rs i m u l a t i o nr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ea l t e r a t i o ni n t e n s i t ya n dr a n g eo f s i g n a l i n gn e t w o r ko u t p u t sc a u s e db ys u s t a i n e ds t i m u l a t i n go fr a sn o d ew e r e m u c hm o r eo b v i o u s l yt h a nt h o s eo ft r a n s i e n te x c e s ss t i m u l a t i n go fr a sn o d e t h e d i s t u r b a n c ee f f e c t so fi m p o r t a n tn o d e s ( r a s ，p 1 3 k ，p k a ) o nt h en e t w o r kw e r e m o r es e r i o u st h a nt h o s eo fc o m m o nn o d e s ( p d e ，p a k ，p l a 2 ) t h ea l t e r a t i o n s o fn e t w o r kd y n a m i cb e h a v i o rw e r ei n t r i c a t ew h e nm u l t i n o d e ss u f f e r e da t t a c k s i tw a ss h o w nt h a tt h ed e c r e a s e so fp h o s p h o r y l a t e dm e k l 2a n da k tw e r e p r o m i n e n tw h e nr a sn o d ew a si n h i b i t e db yt h es p e c i f i ci n h i b i t o rm a n u m y c i n a b u tt h ec h a n g e sw e r e to b v i o u sw h e nj a ko rp d en o d ew a sb l o c k e db yi t s s p e c i f i ci n h i b i t o rr e s p e c t i v e l y m o r ec l e a r l y , t h ec h a n g e sc o u l db eo b s e r v e di nt h e t i m ec o u r s e so f p h o s p h o r y l a t e dm e k l 2a n da k tb yr e l a t i v ei n t e n s i t yv e r s u st i m e i tw a sn o t i c e a b l et h a tt h ed e c r e a s e so fr e l a t i v e i n t e n s i t yo fp h o s p h o r y l a t e d m e k l 2a n da k tw e r e v e r y o b v i o u sw h e nr a sn o d ew a si n h i b i t e d t h e m a x i m a l l yr e l a t i v ei n t e n s i t yo fp h o s p h o r y l a t e dm e k l 2p r o m i n e n t l yd e c r e a s e d f r o m6 2 8 1t o8 8 6 a n dt h a to f p h o s p h o r y l a t e da k td e c r e a s e df r o m4 6 1 3t o1 5 3 2 o nt h ec o n t r a r y , t h ec h a n g e so f t i m ec o l 3 r s e so f p h o s p h o r y l a t e dm e k i 2a n da k t w e r es l i g h tw h e nj a ko rp d en o d ew a si n h i b i t e dr e s p e c t i v e l y c o n c l u s i o n ： c e l l u l a rs i g n a l i n gn e t w o r kb e l o n gt os c a l e - f l e en e t w o r k s ，a n dk e yn o d e sp l a ya p i v o t a lr o l ei ni t c e l l u l a rs i g n a l i n gn e t w o r kd i s p l a y sas u r p r i s i n gd e g r e eo f t o l e r a n c ea g a i n s tr a n d o mn o d e se r r o r s t h ed y n a m i cb e h a v i o r so fc e l l u l a r s i g n a l i n g n e t w o r k p r e s e n t n o n l i n e a rf e a t u r e so b v i o u s l y t h e t o p o l o g i c a l d i f f e r e n c e sb e t w e e ni m p o r t a n tn o d e sa n dc o m m o nn o d e si ns i g n a l i n gn e t w o r k s r e s u l ti nt h ed i s t i n g u i s ho ft h e i rn e t w o r kf u n c t i o n i m p o r t a n tn o d e sd o m i n a t e m a n yo t h e rn o d e st h r o u g hd i r e c to ri n d i r e c ti n t e r a c t i o n s ，a n dc o m m o nn o d e so n l y a r er e l a t e dt oaf e wo fo t h e rn o d e s t h ee r r o r so fi m p o r t a n tn o d e sp l a ya n i m p o r t a n tr o l ei nt h et u r b u l e n c eo fs i g n a l i n gn e t w o r k t h en u m e r o u sc o m p l e x c r o s s t a l k se x i s t e di ns i g n a l i n gn e t w o r kd on o ti n d u c et h ed i f f u s i b i l i t yo fs i g n a l t r a n s d u c t i o n ，a n dt h e r ea r ec o m p l e xm e c h a n i s m sf o rt h es p e c i f i c i t ya n df i d e l i t yi n c e l l u l a rs i g n a l i n g k e yw o r d s ：c e l l u l a rs i g n a l i n gt r a n s d u c t i o nn e t w o r k t o p o l o g i c a ls t r u c t u r e s c a l e f r e e c o m p u t e rs i m u l a t i o n c o m p l e x i t y d y n a m i c w e s t e r nb l o t t i n g 6 前言 细胞生存于一定的环境中，细胞的各种行为如增殖、分化、死亡等基本 生命活动，以及分泌、游走和收缩等特化行为都是在一定的内、外环境刺激 下实现的，这些环境刺激称为胞外信号。细胞膜上存在着各种各样的特异受 体，能够对特定的外源信号进行识别并产生反应，从而将胞外信号传递到细 胞内，进而经过细胞内复杂的信号转导网络的整合与处理，最终产生相应的 调控信号以调节靶细胞的离子通透、物质代谢以及基因表达等生理活动。简 言之，信号转导的基本模式是：细胞外信号分子被受体( 接收装置) 所感知， 而后细胞内一系列信号转导分子被依次激活( 信号转导装置) ，信号发生放大 并传递，最后，特定的靶蛋白如参与代谢的酶、基因表达调节蛋白? 细胞骨 架蛋白等被激活，由此引起各种细胞效应。 细胞行为受控于诸如物质代谢、蛋白质相互作用、基因表达调控等多种 生物化学网络，信号的正确传递和整合是上述生化网络得以实现和维持的关 键所在。许多疾病的发生、发展，包括癌症、神经紊乱、糖尿病等，都与信 号系统的失调、紊乱紧密相关。理解信号系统中不同信号分子的异常所导致 的网络结构、功能异常及其系统效应对认识病理变化过程是十分有益的。信 号分子的功能状态在正常和病理过程中起着重要作用，因此信号分子为疾病 治疗提供了有力靶点。认识信号转导有助于认识疾病发生、发展的过程，从 而为疾病的治疗提供理论依据。传统的信号转导研究常常对单一的信号转导 分子的特异功能进行分析研究，并采用线性作用的方法鉴定了数十条信号转 导途径，如依赖环一磷酸腺苷( c a m p ) 的信号转导途径、依赖甘油二酯三磷 酸肌醇( d a g i p s ) 的信号转导途径、依赖钙离子钙调素( c a 2 + c a m ) 的信 号转导途径、依赖酪氨酸蛋白激酶( 1 1 p k ) 的信号转导途径等。近年来众多的 研究表明信号转导实质上是众多的信号分子间相互作用、相互调控的复杂性 网络，各条途径并非独立存在，而是存在着广泛的信号交流1 2 埘。信号交流不 仅存在于诸如r a s 和r h o 类似途径之间，也存在于诸如g sq c a m p 和m a p k 等不同途径之削“l 。这提示不能仅仅停留于对单个信号蛋白、单一信号转导 途径的功能活动进行研究，而应当重视从网络系统的角度对信号分子、信号 途径进行研究。 通过对信号分子的干扰来研究信号网络行为的动态改变是研究信号分子 功能和其网络属性的有效途径。在实验中可以采用特异性抑制剂或激动剂对 靶节点进行抑制或激动干扰，进而分析在信号传递过程中发生变化的节点的 动力学过程，由此可以获得由于某一节点或某些节点被干预后所引起的信号 网络动态变化( 包括输出变化和结构变化) 的定性、定量信息，最终分析靶 节点在网络中的功能地位。磷酸化与去磷酸化是信号传递过程中众多节点分 子实现功能转换的分子开关，磷酸化单克隆抗体对于捕捉靶分子活化程度的 变化具有突出优势，抗体芯片技术的发展使得检测达到了一定程度的高通量 化。然而由于特异性抑制剂、激动剂以及单克隆抗体资源的有限性和开展实 验耗资昂贵，计算机仿真技术日趋重要。利用计算机仿真技术对信号网络进 行研究，不仅可以进行实时动力学分析，还能够实现高通量输出分析，这在 细胞信号转导复杂系统的研究中是无可替代的。 本课题根据已知的信号转导途径及其相互作用构建出复杂信号转导网络 模型，并在此基础上对其拓扑结构属性进行分析，进而利用计算机仿真分析 技术研究了不同类型节点干扰对信号转导网络动力学的影响，最后采用 s d s - p a g e 电泳分离及w e s t e r nb l o t t i n g 技术分析研究了不同类型节点抑制对 小鼠神经元信号转导网络的影响。 材料与方法 1 实验器材与仪器 1 1 试验动物 昆明种封闭群- 孚l d , 鼠，由泸州医学院动物科提供。 1 2 免疫印迹材料 医用x 射线胶片( 8 1 0 i n ，1 6 4 0 0 1 3 0 4 ) 购自k o d a k 公司：p v d f 膜( o 2 l am ，1 6 6 5 2 2 a ) 购自b i o - r a d 公司。 l _ 3 主要实验仪器 二氧化碳培养箱( c 2 3 2 3 型，9 8 0 0 8 4 4 4 ) 为美国s l s h e l l a b 公司产品；超 净工作台( s w 二l j 。i f ) 购自苏州安泰空气技术有限公司；倒置显微镜( x s t - d ) 购自重庆光学仪器厂；超纯水仪( m a x l m a s c 型) 为英国e e g ad e m o n 公司 产品；紫外可见分光光度计( u v - 1 1 0 0 型) 购自北京瑞利分析仪器公司：电子 天平( a e l 2 0 0 型) 为中国湘仪天平仪器厂产品；酸度计( p h s 3 c ) 购自成 都市方舟科技开发公司；台式高速离心机( t c l 1 6 g ) 购自上海医用分析仪器 厂；脱色摇床( d y - b 2 型) 为江苏兴化分析仪器厂产品；高速低温离心机( 5 4 1 7 r 型) 为德国e p p e n d 0 击公司产品；二向电泳槽( d y c z - 2 8 l ) 购自北京市六一 仪器厂：半干式电转移仪购自b i o p a d 公司；x 射线摄影暗匣( x j x i i ) 和 增感屏( 稀土高速r b i 4 0 0 q y y q 0 0 1 2 0 0 2 ，2 0 3 m m 2 5 4 m m ) 购自上海跃进 医用光学器械厂；8 5 。c 超低温冰箱为美国福塔公司产品：扫描仪( s c a n j e t 3 5 0 0 c ) 为美国惠普公司产品；数码相机( s 3 0 4 ) 为日本富士公司产品。 2 主要实验试剂 1 0 2 1 细胞培养试剂 p r m i m e d i u m1 6 4 0 ( 1 1 7 7 8 4 5 ) 、n e u r o b a s a l 7 m m e d i u m ( 1 2 1 2 2 2 8 ) 、 b 2 7 ( 1 2 2 4 7 7 4 ) 、羟乙基哌嗪乙硫磺酸( h e p e s ，11 4 6 7 7 4 ) 均购自i n v i t r o g e n 公司；新生小牛血清购自h y c l o n e 公司；胰蛋白酶( d i f c o 进口分装，8 8 0 9 1 4 ) 为上海分装厂分装；j a k 抑制剂( 4 2 0 0 9 9 ) 购自m e r c k 公司；r a s 抑制剂 ( m a n u m y c i n ，m 1 0 2 5 ) 、p d e 抑制剂( r o2 0 1 7 2 4 ) 均购自a gs c i e n t i f i c i n c 。 2 2 电泳试剂 丙烯酰胺( a c r ，7 5 5 2 8 a ) 、甲叉双丙烯酰胺( b i s ，7 2 5 9 4 a ) 、十二烷基 磺酸钠( s d s ，1 6 6 0 5 4 a ) 、甘氨酸( g l y ，1 6 7 3 5 7 b ) 、三羟甲基氨基甲烷( t r i s ， 7 5 0 5 8 a ) 、尿素( u r e a ，1 6 6 4 1 3 a ) 、c h a p s ( 1 7 6 6 2 6 a ) 、t b p ( l 9 7 0 3 6 1 3 ) 、矿 物油( 1 6 8 5 6 7 a ) 均购自b i o r a d 公司；分子量标准蛋白( p r e s t a i n e dp r o t e i n m o l e c u l a rw e i g h tm a r k e r , 13 2 2 ) 购自f e r m e n t a s 公司；过硫酸铵( a p s ，16 7 2 5 b ) 购自p r o m e g a 公司：琼脂糖( 9 5 0 3 1 4 ) 为日本进口分装；其它所用试剂为国产 分析纯市售商品。 2 3 免疫印迹试剂 p h o s p h o a k t 单克隆抗体( s e r 4 7 3 ，4 0 5 8 p ) 、p h o s p o - m e k l 2 单克隆抗 体( 2 3 5 4 s ) 均购自c s t 公司；持久性化学发光底物检测试剂盒( s u p e r s i g n a l w e s td u r ae x t e n d e dd u r a t i o ns u b s t r a t e ，3 4 0 7 5 ) 购自p i e r c e 公司：牛血清白蛋 白( b s a ，0 4 0 9 a 0 9 ) 购自上海生物化学工程有限公司。 3 分析数据库及软件 s w i s s - p r o t t r e m b l 蛋白数据库；i m a g et 0 0 1 分析软件；计算机仿真软件 s i m t r a n 2 0 。 4 实验方法 4 1 细胞信号转导网络模型的构建及其拓扑结构属性分析 4 1 1 网络模型的构建 根据已知的细胞信号转导途径以及信号转导分子之间的生化作用机制， 进行复杂细胞信号转导网络模型的构建。构建主要包括以下三个步骤：确 定在输入刺激条件下能够产生输出效应( 行使一定生理功能) 的线性途径。 分析途径之间发生相互作用的节点间的连接关系，确定不同节点的连接度。 功能模块的组织及其相互作用。 4 1 2 拓扑结构属性分析 根据构建的网络模型，从节点的连接度、节点的组织特征、信号交流和 随机性节点去除对网络的影响等几个不同的层次对其拓扑结构进行分析。 4 2 节点干预计算机模拟分析 4 2 1 数学模型的构建 根据外源信号在靶细胞内进行信号转导的两种主要生化机制模式，即依 赖于质量作用定律的信号转导分子之间的相互结合作用和依赖于米氏反应方 程的酶促反应，建立数学模型。在反应过程中，产物量的变化用常微分方程 量化。将反应方程及其作用模式、动力学参数逐一录入计算机仿真数据库， 模型的动力学参数来源于实验数据并经模拟校i 雨1 7 1 。 4 2 2 网络节点攻击的仿真分析 采用自主开发的计算机仿真软件s i m t r a n 2 0 嘲对上述细胞信号网络中 的不同类型的节点分子干扰所致的的动力学改变进行计算机仿真分析，仿真 时间为1 2 0 m i n ，步长为0 2 m i n 。通过改变相应反应方程的动力学参数来模拟 节点遭受的激活性或抑制性攻击。目标节点包括高连接度和低连接度的两大 类节点，模拟攻击范围包括单个节点遭受攻击和多个节点同时遭受攻击，攻 击性质分为激活性和抑制性两种。 4 2 3 模拟结果分析 将不同类型的节点遭受不同性质攻击后引起的网络节点输出改变以无干 预的网络行为为基准进行相互比较，并作相应的动力学曲线。 4 3 节点抑制对小鼠神经元信号转导网络的影响分析 4 3 1 小鼠神经元的原代培养 取出生后l - - 3 天的乳小鼠的全大脑组织，在d h a n k s 液中去除脑膜、 剪碎、洗涤后，加0 2 5 9 l 胰蛋白酶消化1 0 m i n ，静置片刻，取上层细胞悬液 并加h a n k s 液终止胰蛋白酶消化作用，而后1 5 0 0 r p m 离心5 m i n ，收集沉淀， h a n k s 液洗涤沉淀，再次1 5 0 0 r p m 离心5 r a i n ，收集沉淀。加入r p m i 1 6 4 0 培养基( 含1 0 d 、牛血清) ，吹散、混匀、计数，以2 1 1 0 6 个m l 的密度接种 于培养瓶中，置于c 0 2 培养箱中( 5 c 0 2 、3 7 ) 培养。2 4 h 后更换为 n e u r o b a s a l t mm e d i u m ( 含2 b 2 7 ) 维持培养基，以后每2 3 d 换液一次。 4 3 2 抑制剂孵育及e g f 刺激 小鼠神经元培养7 d 后，进行干预处理。实验共分四组( 每组五瓶神经元) ， 对照组不加抑制剂，实验一组加入特异性r a s 抑$ 1 齐s j ( m a n u m y c i n a ，m 一1 0 2 5 ) ， 实验二组加入特异性j a k 抑制剂( 4 2 0 0 9 9 ) ，实验三组加入特异性p d e 抑制 剂( r o2 0 1 7 2 4 ) ，置于c 0 2 培养箱中( 5 c 0 2 ，、3 7 。c ) 孵育过夜。抑制剂作 用后，对照组和实验组均给予e g f ( 2 0 n g 9 1 ) 刺激，分别作用0 m i n 、1 0 m i n 、 2 0 r a i n 、6 0 m i n 、1 2 0 r a i n ，相应时间后用液氮终止e g f 刺激作用。 4 3 3 神经元蛋白的提取与定量 倒尽上述e g f 作用相应时间后的培养液并终止反应后，加入4 的h a n k s 液5 m l 清沈神经元细胞两遍，沥干，加入细胞裂解液( 8 m o l l 尿素，1 t b p ， 4 c h a p s ) 5 0 m l 摇床冰浴3 0 m i n 。用e p 管收集裂解液，高速低温( 1 2 0 0 0 r p m ， 4 c ) 离心3 0 m i n ，取上清液用考马斯亮蓝g 一2 5 0 法进行蛋白质定量。 4 3 4s d s p a g e 以s d s p a g e 电泳分离蛋白质，用o 5 琼脂糖封闭凝胶板，将胶板置于 垂直电泳槽中，制备聚丙烯酰胺凝胶( t 为7 ，c 为4 ) ，聚胶后在电泳槽 中加入1 0 0 0 m l 电极缓冲液( 0 0 2 5 m o l l t r i s ，0 2 m o l lg l y ，0 i s d s ，p h 8 _ 3 ) ， 在凝胶一端加入分子量为2 6 k d 11 8 k d 的预染标准蛋白，其余泳道上端加入蛋 白样品，进行s d s - p a g e 。设置稳流1 0 m a 垂直电泳3 0 m i n 后，加大电流至 2 0 m a ，当溴酚蓝前沿达凝胶底部时停止电泳。 4 3 5 化学发光w e s t e r nb l o t t i n g 4 3 5 1 半干式电转移 s d s p a g e 结束后取下凝胶，将凝胶浸入阴极缓冲液( 0 0 2 5 m o l l t r i s ， 0 , 0 4 m o l l g l y , o i s d s ，p h7 6 ) 中平衡1 5 m i n ，在后1 0 m i n 内进行以下操作： 将与胶等大的p v d f 膜浸入l o o 甲醇中1 5 s 至p v d f 膜呈均一透明并沉下， 取出膜浸入纯水中2 r a i n ，然后浸入阳极缓冲液i i ( 0 0 2 5 m o l l t r i s ，1 0 甲醇， 1 4 p h 】0 4 ) 中平衡5 m i n 。取2 张与膜等大的滤纸浸入阳极缓冲液i ( o 0 3 m o l l t r i s ，1 0 甲醇，p h1 0 4 ) 中至饱和，1 张与膜等大的滤纸浸入阳极缓冲液i i 中 至饱和，再取3 张滤纸浸入阴极缓冲液中至饱和。在半干式转移仪的阳极板 上制作三明治，从阳极板到阴极板的摆放顺序依次为3 张浸过阳极缓冲液的 滤纸、p v d f 膜、凝胶、3 张浸入过阴极缓冲液的滤纸，盖好阴极板，1 0 m a c m 2 膜电泳转移1 h 。电泳转移结束后，用考马斯亮蓝r - 2 5 0 对转膜后的凝胶进行 染色检查转膜效果。 4 3 5 2 化学发光 电转移结束后将p v d f 膜用洗涤缓冲液i t b s t ( o 0 2 5 m o l l t r i s ， o 0 1 5 m o l l n a c l ，o 0 0 5 m o l l t w e e n 2 0 ) 沈涤3 次( 5 m i n 次) ，封阻缓冲液( 5 b s a ) 在室温下密闭轻摇动封阻l h ，稀释缓冲液洗涤3 次( 5 m i n 次) 后， 将p v d f 膜分别与i 抗稀释液( p h o s p h o a k t 单克隆抗体或p h o s p o m e k i 2 单克隆抗体，i 抗与封阻缓冲液之比为l ：2 0 0 ) 室温下轻摇动孵育l h ，稀释 缓冲液洗涤3 次( 5 m i n 次) ，将p v d f 膜分别与i i 抗稀释液( i i 抗与封阻缓 冲液之比为1 ：2 0 0 ) 于室温下轻摇动孵育1 h ，稀释缓冲液洗涤3 次( 5 m i n 次) 。在弱光下加入化学发光底物( 0 1 2 5 m l c m 2 ) 摇动5 m i n 后，取出夹在透 明的塑料袋中，排除膜与塑料问的气泡，然后在暗室中