（作物遗传育种专业论文）SUSIBA2正反义表达载体的构建及其对水稻的遗传转化.pdf

独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：诤徂玉 日期：口7 多2 7 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，b p 学校 有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分 内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。乇r 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名； 指导教师亲笔签名： 侮怔慨口涉四 同勰 日期：刁r 砰 f 摘要 淀粉是高等植物中碳水化合物的主要贮藏形式，也是粮食作物产品的最主要 成分在植物中，与淀粉生物合成直接相关的酶有：1 ，6 - - - 磷酸腺苷葡萄糖焦 磷酸化酶( a d e g l u c o s eg y r o p h o s p h o r y l a s e ，a o p a s e ) 、可溶性淀粉合成酶( s o l u b l e s t a r c hs y n t h a s e ，s s s ) 、颗粒性淀粉合成酶( g r a n u l e - b o u n ds t a r c hs y n t h a s e ，o b s s ) 、 淀粉分支酶( s t a r c hb r a n c h i n ge n z y m e ，s b e ) 、淀粉去分支酶( d c b r a n c h i n g z y r l l c ， d b e ) 近年来的研究表明：许多淀粉合成酶基因的表达是受到糖信号的诱导。本研 究的s u s i b a 2 ( s u g a rs i g n a l i n gi nb a r l e y ) 基因是瑞典农业大学c h r i s t c r 教授实验 室从大麦中分离出来的，它是结合在异淀粉酶与淀粉分支酶启动子的糖应答元件 上作为激活因子，在大麦胚乳淀粉累积过程中起重要的调控作用。本研究通过构 建s u s i b a 2 基因的正义及反义表达载体，并通过农杆菌介导法，将其基因导入 水稻日本晴的基因组中，获得转基因水稻植株。以期该基因在水稻中发挥调节有 关淀粉酶活性的作用，最终使其淀粉组成发生变化。主要研究结果如下： 1 、用b g l l i 单酶双切从p s l 4 7 3 的载体上切下目的基因s u s i b a 2 ，用b a m h i 单酶切开p t c k 3 0 3 载体，将目的基因连接到载体上，成功地构建了s u s i b a 2 基因的正义及反义表达载体p t c k 3 0 3 s u s i b a 2 ( + ) 和p t c k 3 0 3 s u s i b a 2 ( ) 。 2 、利用冻融法将构建好的植物表达载体p t c k 3 0 3 s u s i b a 2 ( + ) 和 p t c k 3 0 3 - s u s m a 2 ( - ) 成功导入农杆菌l b a 4 4 0 4 中，得到既抗r i f ( 利福平霉素) ， 又抗f a n ( 卡那霉索) 的农杆菌菌落。 3 、通过农杆茸介导的方法，将s u s i b a 2 基因导入水稻基因组中，共获得了 6 株抗性植株，其中4 株为正义表达植株，2 株为反义表达植株 4 、p c r 结果表明，4 株正义表达植株全部为阳性植株，而2 株反义表达植 株则均为假阳性 关键词：糖信号转录因子；直链淀粉；载体构建；遗传转化；日本晴 a b s t r c t s t a r c hi st h em a i ns t o r a g ec a r b o h y d r a t ei nh i g h e rp l a n t s , a n da l s ot h em o s t i m p o r t a n ti n g r e d i e n t i nf o o d c r o p s s e v e r a le n z y m e s , s u c h 勰a d p - g l n c o s e g 舯p h o s p b 0 叫瓣( a 6 p a s e ) , s o l u b l es t a r c hs y n t h a s e ( s 鼹) g r a n u l e - b o u n ds t a r c h s y n t h a s e ( o b s s ) , s t a r c hb r a n c h i n ge n z y m e ( s b e ) ，d e b r a n c h i n ge n z y m e ( d b e ) ，a r c d i r e c t l yr e l a t i v et os t a r c hb i o s y n t h e s i s r e c e n tr e s e a r c h e sh a v ed e m o n s t r a t e dt h a tal o t o f s t a r c hb i o s y n t h e s i sg e n e sw c l ee x p r e s s e du n d e rt h ei n d u c e m e n to f s u g a rs i g n a l i n g p r o f c h r i s t c r , s w e d e na g r i c u l t u r eu n i v e r s i t y , g a i n e ds u s i b a 2 ( s u g a rs i g n a l i n gi n b a r l e y ) g e n ef r o mb a r l e y t h es u s i b a 2p r o t e i n , a sa l l a c t i v a t o rb o u n dt h e c i s - e l e m e n ti nt h ep r o m o t e ro fi s o a m y l a s ea n ds b bp l a y si m p o r t a n tr o l ei nt h e p r o c e s so f s t a r c ha c c u m u l a t i o ni nb a r l e ye n d o s p e r m i nt h i sp a p e r , b ym e i so fc o n s t r u c t i n g p t c k 3 0 3 - s u s i b a 2 ( + ) v e c t o ro f s u s i b a 2g e n es e n s es e q u e n c ea n dp t c k 3 0 3 s u s i b a 2 ( - ) v e c t o ro fa n t i - s e n s e s e q u e n c e , s u s i b a 2g e n ew a si n t r o d u c e di n t ot h eg e n o m eo fn i p p o n b a r eb y a g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e d i ti sh o p e dt h a ts u s i b a 2g e n ec o u l dr e g u l a t ea c t i v i t yo f t h ee n z y m e sa b o u ts t a r c hb i o s y n t h e s i st oc h a n g es t a r c hc o m p o s i t i o ni nr i c e t h em a i n r e s u l t sa l ea sf o l l o w s ： ( 1 ) s u s i b a 2g e n e ，d 螗e s t e db yb g l l lf r o mv e c t o rp s l 4 7 3 ，w a sc o n s t r u c t e di n t o p t c k 3 0 3 w ef i n a l l yg o tt h es e n s ev e c t o rp t c k 3 0 3 - s u s i b a 2 ( + ) a n da n t i s e n s e v e c t o rp t c k 3 0 3 - s u s i b a 2 ( ) a f t e ri d e n t i f i c a t i o nb yp c r ( 2 ) t h et w ov e c t o r sw e r ei n t r o d u c e di n t ol b a 4 4 0 4b yf r o z e n - m e l tm e t h o d r e s p e c t i v e l y , a n dt h e nw ec h o s et h ea g r o b a c t e r i u mt h a tw e r er e s i s t a n tt or i f a m p l a i c i n a n dk a n a m y e i n p ) w eg o ts i xt r a n s f o r m e dp l a n t s ，i n c l u d i n g4p l a n t st r a n s f o r m e db yp t c k 3 0 3 一 s u s i b a 2 ( + ) a n d2p l a n t st r a n s f o r m e db yp t c k 3 0 3 - s u s i b a 2 ( - ) ( 4 ) b yp c ri d e n t i f i c a t i o n , 4p l a n t st r a n s f o r m e db yp t c k 3 0 3 - s u s i b a 2 ( + ) a l l w c r ep o s i t i v e , w h i l e2 p h m st r a n s f o r m e db yp t c k 3 0 3 一s u s i b a 2 ( - ) b o t hw e r ef a l s e p o s i t i v e k e yw o r d s ：s u g a rs i g n a l i n gt r a n s c r i p t i o nf a c t o r ；a m y i o s e ；v e c t o rc o n s t r u c t i o n ；g e n e t i c t r a n s f o r m a t i o n ；n i p p o n b a r e 2 阿舌 水稻是重要的粮食作物，世界上有三分之一的人口以它为主要食物。特别是 作为亚洲和中国最主要的粮食作物，栽培范围广、面积大、产量多近年来，随 着生活水平提高，人们对稻米的品质，尤其食昧品质，提出越来越高要求实现 稻米品质改良的突破，培育优质水稻品种满足市场和消费需求，是目前水稻育 种中最重要的研究课题 稻米胚乳淀粉的组成和结构直接影响稻米的外观、加工和食味品质，其中直 链淀粉与支链淀粉的比例是稻米食味品质的主要决定因素。直链淀粉含量高，米 饭硬、粘性小、光泽差；相反，则米饭软粘、光泽好因此，直链淀粉含量已成 为稻米食味品质改良的主要指标。 与植物淀粉生物合成直接相关的酶有；1 ，6 - - - 磷酸腺苷葡萄糖焦磷酸化酶 ( a d p - g l u c o s eg y r o p h o s p h o r y l a s e ，a g p 猫e ) 、可溶性淀粉合成酶( s o l u b l es t a r c h s y n t h a s e ，s s $ 、颗粒性淀粉合成酶( g r a n u l e - b o u n ds t a r c hs y n t h a s e ，g b s s ) 、淀粉 分支酶( s t a r c hb r a n c h i n ge r m y m e ，s b 玢、淀粉去分支酶( d e b r a n c h i n ge n z y m e ，d b e ) 。 目前淀粉分子的生物合成的基本的酶促反应已经阐明，但对这些酶的相互作用、 淀粉分子折叠和排列以及形成淀粉粒的机制尚不完全清楚。 水稻胚乳中直链淀粉的合成是由蜡质基因( w a x y ，w x ) 编码的颗粒性淀粉合 成酶( g b s s ) 控制的，该基因同时可控制水稻花粉和胚囊中直链淀粉的合成，是 一个组织发育和特异性表达的基因。而支链淀粉是腺嘌呤葡萄糖焦磷酸化酶 ( a g p a s e ) 、淀粉合成酶( s s ) 、淀粉分支酶( s b e ) 、脱分支酶( d b e ) 四种酶共同作用 的结果。支链淀粉合成中的两类反应是多重簇结构形成的基础，即分别由s b e 催 化的a 1 ，每分支的形成和s s s 催化的后续a - 1 ，4 - 链的延伸。同时d b e 的作用也很 重要，d b e 包括异淀粉酶和极限糊精酶( r 酶) 。它可以去除多余的高度分支区 以外的不正确位置上形成的a - 1 ，昏糖苷键 近年来的研究表明：许多淀粉合成酶基因的表达是受到糖信号的诱导由于 大麦的糖信号转录因子( s u s i b a 2 ) 是作为激活作用因子结合在启动子区域的糖 应答元件上，而该元件目前在大麦中发现是存在于同支链淀粉合成有关的异淀粉 酶( i s o d 及淀粉分支酶( s b e i l b ) 等淀粉合成酶的启动子上因此，s u s i b a 2 基因的过表达或反义抑制会影响到谷粒中淀粉的产量和品质我们通过将从大麦 3 中克隆的s u s i b a 2 基因构建成正义及反义转入水稻中，以期该基因在水稻中发挥 调节有关淀粉酶活性的作用，最终使其淀粉组成发生变化这对改良淀粉的品质 具有十分重要的意义 4 1 3 c 献综述 1 1 稻米品质的研究进展 1 1 1 稻米品质概述 稻米品质是指从稻谷生产到加工成直接消费品的全部过程中，作为粮食或商 品的各种特性人们通常把稻米品质分为加工品质、外观品质、蒸煮与食用品 质、营养品质等4 个方面。加工品质包括糙米率、精米率和整精米率3 个指标；稻 米外观品质由透明度，垩白率、垩白大小( 垩白度) 和粒型4 个指标构成；蒸煮 食味品质包括糊化温度( 碱滑值) 、胶稠度、直链淀粉含量、蛋白质含量和食味 等，其中食味是稻米品质性状的重要指标；营养品质包括直链淀粉含量、蛋白质 含量、必需氨基酸含量、油份含量和香味有效成分含量等。 1 1 2 稻米品质主要影响因素研究 稻米品质的优劣是由多方面的因素决定的，归纳起来可分为遗传因素f 基因 型) 和非遗传因素( 气候、土壤、营养等) 两大类 1 1 2 1 非遗传因素对稻米品质的影响 1 、气候环境对稻米品质的影响 水稻生长期间每个生育时期都与品质的形成有关，特别是抽穗成熟期的气候 条件最为重要。影响稻米品质的气候因子主要有温度、光照、湿度和风等 ( 1 ) 温度对稻米品质的影响 对稻米外观品质的影响：开花至成熟阶段的高温可显著缩短成熟天数，造成 熟后糙米充实不良，垩白大，胚透明度低，籽粒不饱满，精米率和整米率均低， 米粒无光泽。成熟期的有效积温与米粒的透明为负相关关系( 孟亚利等，1 9 9 7 ) 对加工品质的影响：温度对加工品质影响大，高温使灌浆速度加快，枝梗老 化加速，胚乳细胞孔隙加大j 不透明，垩白多，碎米率增加，整精米率低( 唐建 军等，1 9 8 5 ；唐湘如等，1 9 9 1 ) 据张嵩午等( 1 9 9 3 ) 研究报导：水稻品种均具 有高整精米率的最适温度且粳型低于籼型，温度过高过低均降低整精米率。籼 稻最适温度在2 1 - 2 3 1 2 范围内，粳稻最适温度多在1 8 - 2 0 1 2 对蒸煮食味品质的影响：成熟期温度过高会使蒸煮品质变差，糊化温度提高， 胶稠度变硬，食味品质变差但稻米的直链淀粉含量受温度的影响小，而直链淀 s 粉中等含量或高含量的品种，其直链淀粉的含量受温度的影响大，这些品种在高 温和自然温度下是高直链淀粉含量，而在适温下，直链淀粉含量会下降到中等， 从而提高品质；中等直链淀粉含量的品种，其直链淀粉含量下降幅度更大。粳稻 的直链淀粉含量随平均温度的升高下降( 赵同华等，1 9 9 2 ) 对营养品质的影响：成熟期的高温对蛋白质、氨基酸的含量有明显的影响 成熟期高温( 3 0 ) 能提高蛋白质含量，变幅可达5 6 - 1 6 5 ，而较低的气温 ( 1 7 ) 则使蛋白质降低灌浆期的高水温( 3 0 ) 能明显提高蛋白质含量，低 水温( 1 7 ) 对蛋白质含量的影响不明显温度对氨基酸的合成表现在高温使氨 基酸的总含量降低，适宜温度为日温2 8 ，夜温2 1 c 左右( 贺浩华等，1 9 9 7 ) 。 ( 2 ) 光照对稻米品质的影响 光照对稻米品质的影响是多方面的。水稻生育后期光照不足会影响光合作 用，特别是在营养生长过旺、田间郁闭、通风透光不良的情况下，垩白米发生会 增多。但光照太强，温度相应提高，使成熟过程缩短，也会增大垩白率。此外， 光照强度过强和过弱都会降低蛋白质含量( 张国发等，2 0 0 4 ) ( 3 ) 湿度和风对稻米品质的影响 相对湿度和降雨量对稻米品质也有一定的影响。相对湿度与糊化温度、胶稠 度和垩白面积一般呈正相关，而与直链淀粉含量呈负相关，但品种间不一致。 不同雨量环境对米粒延伸性、直链淀粉含量及糙米蛋自质含量有显著影响，且环 境与品种之间存在显著互作。此外，抽穗吹风处理会使稻米外观品质变劣( 刘建， 2 0 0 2 ) 。 2 、土壤环境对稻米品质的影响 不同类型的土壤对稻米品质有一定的影响，土壤质地对米饭食味的影响表现 在冲积层土壤生产出来的稻米食昧好，灰褐色土壤的壤土型所生产的稻米食味也 较好，而火山灰土壤及泥炭土壤上生产的稻米食味较差( 颜龙安等，1 9 9 9 ) 土 壤质地对稻米品质的影响主要与土壤有机质含量有关，通过长期施用有机肥和生 物性肥料培肥土壤，培育理想的土壤结构，使土壤耕作层深厚、有机质含量高、 质地疏松、微生物活动强、透水透气性好，将有利于保持优质稻的品质特性( 曹 黎明等，2 0 0 1 ) 3 、营养环境对稻米品质的影响 水稻栽培生产过程中，主要是通过肥料的施用来调节稻株生长的营养环境， 6 以满足其高产与优质的要求。肥料对品质的影响分两个方面，一是不同的肥料， 二是施肥时间。肥料的三大要素氮、磷、钾对品质的影响依次是氮 钾 磷( 罗明 等，2 0 0 5 ) 。 氮肥是影响稻米品质的重要因素，施用适宜的氮肥除提高产量外，还可以改 善稻米的外观品质、营养品质和加工品质。适当的氮肥量，可提高整精米率，减 少垩白度，缩小垩白面积，增加蛋白质含量，促进g c 变硬而且不同的施肥方 式对稻米的影响也不同，一次性施氮比生育期均匀施氮能提高a c 含量，降低蛋 白质含量；而分期施氮，特别是抽穗期或齐穗期追施氮肥对提高稻米蛋白质含量 和降低a c 含量效果最佳。 增施钾肥能提高整精米率和蛋白质含量，降低垩白度和垩白率，尤其当钾 肥和氮肥配合施用时，改善稻米品质的效果会更佳。 适当施用有机肥，稻米的氨基酸含量增加，食味品级高，口感好 微量元素对稻米品质也有明显影响，铁、钴、钒、镍能明显地降低垩白率和 垩白度，提高米粒外观品质 1 1 2 2 遗传因素对稻米品质的影响 有关稻米品质的遗传研究，主要集中在整精米率、垩白、直链淀粉含量、蛋 白质含量、糊化温度、胶稠度、香味等指标，但因材料选择、试验设计、分析方 法的不同，研究结果有所差异。 ( 1 ) 直链淀粉含量( a m y l o s e c o n t e n t ，a c ) ：在稻米品质的有关指标中，直 链淀粉含量是重要指标之一直链淀粉含量的遗传相当复杂，多数研究认为高 直链淀粉含量对低直链淀粉含量为显性，受一个主效基因和几个微效基因控制 ( 梁满中等，1 9 9 8 ；t a ne ta 1 ，1 9 9 9 ；m i k a m i ，2 0 0 0 ) 作为编码直链淀粉合成 酶的矸幢基因是研究最深入的，在水稻中w x 基因存在两种类型：耐和矸妒； w , l 主要存在于籼稻中，魄6 主要存在于粳稻中；- 的，的表达量高于w x b 的表达 量，同时w x 基因的表达在三倍体胚乳中存在剂量效应 ( 2 ) 整精米率：整精米率是稻米碾米品质中最重要的指标，有学者认为， f 1 米粒的整精米率与母本及中亲值里显著正相关，因此，要提高杂交稻的整精米 率，关键是要提高不育系的整精米率( 李欣等，1 9 9 9 ) 敖雁等，2 0 0 0 ) ) 但也有 学者认为，f i 米粒的整精米率与父本及中亲值呈显著正相关，提高恢复系整精米 7 率是突破杂交水稻整精米率偏低的关键( 周勇等，1 9 9 6 ) 。 ( 3 ) 垩白：研究认为垩白有受单显性基因控制的，也有受单隐性基因控制 的( 黄发松等，1 9 9 8 ) 。心白和腹白分别为隐性单基因w c 、w b 控制，但也有认 为腹自为显性性状( 吴长明，2 0 0 2 ) ( 4 ) 蛋白质含量：多数研究认为，蛋白质含量属多基因控制的数量遗传性 状，且主要受加性效应的作用，其遗传力低( 2 5 一5 0 ) ，宜高世代选择( 黄 发松等，1 9 9 8 ：吴长明，2 0 0 2 ) 。但也发现某些位点上有显性作用以及基因互作 产生超亲现象，有的还观察到了花粉的母体效应和花粉的直感现象( 吴长明， 2 0 0 2 ) 。有的研究认为，蛋白质含量存在显性效应，低含量对高低含量为显性， 并可能有某些优势基因的作用( 吴长明，2 0 0 2 ) 。 ( 5 ) 糊化温度：有关糊化温度的遗传，从整体看有两种不同的结果。一种 认为仅涉及1 - 2 个主基因，或有若干个修饰基因加入。另一种结果认为糊化温度 是由多基因控制，属于数量性状( g h o s h ，1 9 7 2 ；p u f f ，1 9 8 0 ) 。 ( 6 ) 胶稠度( g e lc o n s i s t e n c y ，g q ：早期的研究认为，硬胶稠度受显性单基 因控制( 黄发松等，1 9 9 8 ) 。但目前多数研究认为胶稠度表现为质量一数量性状， 由若干复等位主效基因和微效基因控制，有显性效应，硬对中等或软、中等对软 为显性( t a ne ta 1 ，1 9 9 9 ；t o m e r ，1 9 8 7 ；z a m a ne ta l ，1 9 8 5 ；汤圣祥等，1 9 9 6 ) 。 杂种胶稠度一般低于双亲平均值，群体平均优势较小，或有一定的超亲优势，易 受环境影响( 石春海，1 9 9 4 ；陈建国，1 9 9 8 ) 其遗传表达主要受胚乳基因型控 制，但也有学者认为其还受母体遗传效应的影响，其中加性方差最大，显性方差 次之，细胞质方差最小( 汤圣祥等，1 9 9 6 ) 在环境互作中，受直接互作效应和 显性互作效应控制，后代胶稠度的改善主要是加性效应和显性显性上位性的作 用( s l i ie ta l ，1 9 9 6 ；何昆明等，1 9 9 8 ：李欣等，2 0 0 0 ) 。 ( 7 ) 香味：稻米香味的遗传研究结果存在明显的分歧。多数研究者认为水 稻的香味受一对隐性核基因控制( 李林峰等，1 9 9 6 ；吴升华，1 9 8 9 ；吴俊升，1 9 9 5 ； 张元虎等，1 9 9 6 ) 。但彭兴富等( 1 9 9 4 ) 报道无香味表现胚乳直感现象胡事君 等( 1 9 9 5 ) 认为稻米香味受一对隐性主基因控制，并存在微效基因修饰作用，没 有细胞质效应。李欣( 1 9 9 6 ) 等还推断出控制水稻米香的基因位于第8 染色体上 王冠军等( 2 0 0 1 ) 结合自己和他人的研究提出，香味性状遗传为质量一数量遗传， 其遗传控制主要受制于两对独立遗传的隐性主基因，同时有至少两对微效基因参 s 与作用此外还有研究指出，因香稻品种差异，控制香味的基因型存在差别，品 种问香味基因是不等位的( 姚方印等，2 0 0 1 ) 。 1 1 j 我国稻米品质育种进展 2 0 世纪踟年代初期，由于杂交水稻的大面积推广，粮食产量大幅增加，迅速 解决了人民的吃饭问题，长期以来被忽略的稻米品质问题日益突出，稻米品质改 良逐渐开始在全国各地展开。在品质改良初期，首要任务就是对现有稻种资源进 行评价和筛选，并在此基础上，制定具体的育种目标由于当时我国没有统一的 优质稻米标准，这些品种可能在某些方面存在一定缺陷，但是却为以后的优质育 种准备了丰富的种质资源( 杨益善等，2 0 0 4 | 缪炳良等，2 0 0 1 ) 。 1 9 8 6 年，由中国水稻所起草、中国农牧渔业部颁布的优质食用稻米标准n y 1 2 2 - - 8 6 开始实施后，很快被全国各地水稻育种单位普遍采用。各地根据这一标 准对本地种质资源进行品质检测和筛选评价，并因地制宜制订具体的品质改良目 标，推动了品质育种的全面发展。1 0 年多来，我国水稻品质改良取得了辉煌的 成就，育成了大量的优质稻品种，优质稻种植面积迅速扩大。同时，此阶段也较 好地协调了优质与高产的矛盾，并实现了早、中、晚稻，籼、粳、糯稻，常规稻 与杂交稻的全面配套发展( 杨益善等，2 0 0 4 ；缪炳良等，2 0 0 1 ) 。 稻米品质性状大多具有数量遗传的特点，且明显受到栽培方式、气象条件等 众多外界因素的影响，不同性状之间还具有明显的相关性。因此，稻米品质的全 面改良显得十分困难，往往顾此失彼，很难育成1 2 项理化指标全部达部颁优质 米标准的品种，如要兼顾产量和抗性则更是难上加难由于1 9 8 6 年颁布的优质 食用稻米标准，指标数过多，部分指标过于严格，在一定程度上脱离了实际。1 9 9 9 年1 1 月国家质量技术监督局发布了g b t1 7 8 9 1 1 9 9 9 优质稻谷，并于2 0 0 0 年4 月开始实施。该标准减少了指标数，并适当降低了加工品质和外观品质标 准，提高了蒸煮、食味品质标准。这一新标准的颁布标志着我国水稻品质育种进 入了重点攻关阶段。本阶段品质改良的主攻目标是整精米率、垩白、直链淀粉含 量和食味，这也是多年来我国稻米品质改良的难点；在提高稻米品质的同时，迸 一步将优质与高产、多抗结合在一起，以推动优质稻的大面积推广应用( 杨益善 等，2 0 0 4 ；缪炳良等，2 0 0 1 ) 。根据这一标准，全面达优质米标准的品种大大增 加，如云南省在2 , 0 0 2 年第3 届优质稻评选中，达优质标准的品种( 品系) 有红 9 优5 号、版纳2 l 号等3 3 个( 吴叔康，2 0 0 3 ) ；湖北在2 0 0 0 2 0 0 2 年举行了2 次 优质米评选，共有鉴真2 号、金优9 2 8 等3 6 个品种达优质米标准( 陈亿毅等， 2 0 0 2 ) 以往，我们对稻米品质的研究主要是集中在对最终品质的研究上，对稻米品 质形成中的关键酶类的动态变化的研究相对较少。现阶段，随着对淀粉合成基因 与相关酶基因的相继克隆及水稻遗传转化体系的建立，科研工作者开始利用生物 技术的方法，通过导入有关基因或相应的反义r n a 基因，以调控有关代谢过程 而改变这些器官中的物质组成，从而达到改良稻米品质的目的如胡昌泉等 ( 2 0 0 3 ) 把可溶性淀粉合成酶s s s 基因转入明恢8 6 中，使转基因稻米直链淀粉 含量下降了3 1 8 5 ；吴方喜等( 2 0 0 6 ) 用农杆菌介导法将水稻淀粉分支酶i 正、 反义基因r b ei 导入恢复系明恢8 6 中，结果凡是转r b ei 正向表达结构的直链淀 粉含量总体上明显下降，而转r b ei 反向表达结构的直链淀粉含量总体上明显上 升 1 1 a 稻米品质遗传改良方法 目前我国稻米品质特别是籼稻米品质欠佳，已与国家的经济发展水平和人们 对农产品品质的要求不相适应。同时，我国是世界水稻生产大国，水稻产量占世 界水稻总产量的3 4 ，但因品质较差等原因，只占到5 以下的稻米国际贸易额， 这也与我国加入世界贸易组织后必须大力提高农产品品质以增强国际竞争力的 时代要求格格不入。因此，尽快改良我国稻米品质是一项极其重要且十分紧迫的 任务。 1 1 4 1 常规育种改良稻米品质 传统的常规育种方法主要是通过改良不育系，从而提高杂交稻稻米品质尽 管，目前各地已鉴定出一批优质不育系，但由于其配合力较低，局限性大，难以 成为主导品种( 胡培松等，2 0 0 2 ) 不育系的品质已经成为提高杂交稻品质的制 约因素，加强不育系的品质改良对杂交稻的品质改良具有重要的意义 1 1 4 2 利用生物技术改良稻米品质 由于传统的常规育种方法育种周期长，效率低，且受品种资源的制约，在稻 米品质遗传改良上显得力不从心随着对控制稻米淀粉合成相关基因分子生物学 研究的深入，重要基因的克隆以及水稻遗传转化体系的高效化和规模化，生物技 术可在稻米品质遗传改良中发挥日益重要的作用。 ( 1 ) 分子标记辅助育种改良稻米品质 分子标记辅助育种是今后稻米品质改良的重要方法之一，即利用单个主效 q t l 的回交转移、定向选择以及微效q t l s 的回交转移等多种方式来加快水稻品 质改良的进程。在此基础上，通过穿梭育种加强多家科研单位的合作，理论研究 者应向育种单位提供分子标记，并对分子标记定位的可靠性作出最有效的验证， 以克服分子标记理论研究与实践应用相脱节的问题( 张坚勇等，2 0 0 3 ) ( 2 ) 转基因技术改良稻米品质 目前主要是利用根癌农杆菌介导法和基因枪法改良稻米蒸煮食味品质和营 养品质，并将不同物种的基因导入水稻以培育具有医疗保健功能的新型水稻品种 植株。h i e i 等( 1 9 9 7 ) 对水稻转基因技术进行改进，建立了根癌农杆菌介导的高 效转化系统利用该系统再将反义w x 基因导人高产水稻品种，所获转基因植株 能稳定遗传且胚乳a c 显著降低，并选育出一批高产优质的粳糯新品系和a c 为 1 5 2 0 的新型优良中间育种材料。 1 2 淀粉的合成及相关酶 目前，利用生物技术改良稻米品质仍处于探索阶段，国内外的的一些学者开 始对淀粉合成及其有关酶进行研究( 高振宇等，2 0 0 4 ；徐军望等，2 0 0 0 ) ，试图 通过导入相关酶的基因改变淀粉的含量或种类。 1 2 1 淀粉的合成 淀粉是由许多葡萄糖分子聚缩而成的高聚体，分子式为( q h l o o s ) 。，大部 分由a - l ，4 键连接，少量由“，6 键连接，以分子结构不同分为直链淀粉和支链淀 粉两种直链淀粉是一种重要的线性分子，通过a _ l ，4 键将葡萄糖单体连接起来。 支链淀粉由不同长度的线性链聚合而成，在淀粉中的含量最丰富支链淀粉中将 近5 的葡萄糖单体通过州，6 键连接( 高振宇等，2 0 0 4 ) 支链淀粉结构具有高 度组织性，其直链与支链的连接位点都不是随机的，且分支密集区和稀疏区交替 分布，从而使直链分子插入到平行排列的双螺旋分子中这种保守结构决定了淀粉 颗粒的半水晶状，淀粉颗粒中包裹着大量葡萄糖单体( s m i t h ，2 0 0 1 ；杨晖等， 2 0 0 4 ) 淀粉在光合及非光合组织都有合成，分别以转运淀粉( t r a n s i t o r ys t a r c h ) 和 1 1 贮藏淀粉( s t o r a g es t a r c h ) 的形式存在于叶绿体和淀粉体中白天，叶片进行光 合作物时，转运淀粉在叶绿体中合成，晚问则转运至q 植株的其它部位。转运淀粉 颗粒较小，几乎全由支链淀粉组成( k i m ，e ta 1 ，1 9 9 8 ；s l a t t e r y ，e ta 1 ，7 0 0 0 ) 贮藏淀粉是淀粉的主要存在形式，多贮藏于淀粉粒中，具有一定的形状 无论在叶绿体还是在淀粉体中，淀粉的合成都需要以下几种酶的协调催化， 即1 ，6 - - 磷酸腺苷葡萄糖焦磷酸化酶( a d p - g l u c o s ec r y r o p h o s p h o r y l a s e ，a g p a s e ) 、 可溶性淀粉合成酶( s o l u b l es t a r c hs y n t h a s e ，s s s ) 、颗粒性淀粉合成酶 ( g r a n u l e b o u n ds t a r c hs y n t h a s e ，o b s s ) 、淀粉分支酶( s t a r c hb r a n c h i n ge n z y m e ， s b e ) 、淀粉去分支酶( d e b r a n c h i n ge n z y m e ，d b e ) 。在植物中，淀粉的合成的 基本过程如下：在腺嘌呤- 葡萄糖焦磷酸化酶( a d p - 9 1 u c o p y r o p h o s p h o r y l a s e ， a g p ) 的作用下，葡萄糖1 - 觥( m u 1 - p ) 与闰限作用生成a d p 葡萄糖( a d p - g l u ) ， 随后a d p - g l u 在淀粉合成酶( s t a r c hs y n t h 勰e ，s s ) 的作用下进行链的延伸。当链 达到一定长度后，在淀粉分支酶( s t a r c hb f a i l c h i n ge n z y m e ，s b e ) 作用下于线性 链之间引入a 1 ，6 糖苷键形成分支，并进一步在s s 催化下延长分支，脱分支酶 ( s t a r c he b r a n c h i n ge n z y m e ，d b e ) 对分支进行修饰，最后合成具有一定结构特 性的淀粉结晶体( a l i s d a i re ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 1 2 2 直链淀粉的合成及相关酶 水稻胚乳中直链淀粉的合成是由蜡质基因( w a x y ，w x ) 编码的颗粒性淀粉合 成酶( g b s s ) 控制的，该基因同时可控制水稻花粉和胚囊中直链淀粉的合成，是 一个组织发育和特异性表达的基因( 邹良平等，2 0 0 4 i o k a g a k ie ta 1 ，1 9 8 8 ) 缺乏g b s s 时，合成的淀粉便缺乏直链淀粉。利用反义r n a 拱t 术特异地抑制w x 基因的表达，降低g b s s 酶的活性，可使直链淀粉含量显著下降。w x 基因剂量不 同，g b s s 活性差异明显( 邹良平等，2 0 0 4 ) 。 1 2 3 支链淀粉的合成及相关酶 植物支链淀粉是腺嘌呤葡萄糖焦磷酸化酶( a g p a s e ) 、可溶性淀粉合成酶 ( s s s ) 、淀粉分支酶( s b e ) 、脱分支酶( d b e ) 四种酶共同作用的结果 a g p 篮e 负责提供糖链延伸的原料a d p - 葡萄糖，在直链淀粉和支链淀粉合成中均起作 用s 豁、s b e 和d b e 则主要参与支链淀粉合成由s b e 催化a - 1 ，6 - 分支的形 成和s s s 催化后续a 1 ，4 链的延伸。同时d b e 的作用也很重要，d b e 包括异 淀粉酶和极限期精酶( r 酶) ，它可以去除多余的高度分支区以外的不正确位置 上形成的a - 1 ，6 糖苷键。目前s b e 、s s s 、d b e 已成为植物支链淀粉研究的重 点( 高振宇等，2 0 0 4 ) 。 1 2 3 1 腺嘌岭葡萄糖焦磷酸化酶( a g p a s e ) a g p a s e 催化1 磷酸葡萄糖( g l u i - p ) 和a t p 形成a d p g 和焦磷酸，这一反应 在植物淀粉合成中是主要的调节步骤，是植物光合和非光合织织中淀粉合成的起 始步骤。a g p a s e 是淀粉合成过程中的关键酶，其产钐日a o p 葡萄糖是合成直链淀 粉和支链淀粉的底物。在含淀粉组织内，a d p - 葡萄糖是淀粉合成酶、与淀粉粒 结合的淀粉合成酶以及淀粉分支酶等的底物，用于直链淀粉和支链淀粉的合成。 该底物的浓度直接影响淀粉的合成速度和效率。禾谷类植物胚乳中的a g p a s e 位 于细胞质中，是f l ：1 5 4 和5 1 k d 两种亚基组成的四聚体，分子量为2 0 0 2 4 0 k d ( 余春 梅等，2 0 0 4 ) 植物中a g p a s e 由四个亚基组成，其中两两在组成和结构方面相同，构成了 两种大小明显不同的多肽，其中较大的称为大亚基，其分子量园种不同而变化予 5 4 k d 至0 6 0 k i ) 之间，较小的为小亚基，分子量在5 1 k d 至l j 5 5 k d 之间( c o p e l a n da n d p r e i s s ，1 9 8 1 ) 。 淀粉的合成出现于植物体的不同组织器官，储藏器官内a g p a s e 基因的表达 与其他组织及器官中a g p a s e 基因表达之间的关系怎样是实现对a g p a s e 基因表达 水平调控必须回答的问题。在已研究的植物种类中，包括拟南芥、马铃薯、大麦、 水稻和小麦等，它们的a g p a s e 的大亚基同属多基因编码，这些基因的表达具有 高度专一性。例如在大麦和小麦中，这些基因的表达仅限于叶片或根和胚乳中 ( o l i v ee ta 1 ，1 9 8 9 ) 另外，它们的表达在特定条件的诱导下发生，如在马铃薯 中增加蔗糖诱发该基因的表达，遗传分析也证实了大亚基的等位形式随器官及组 织分化而出现( g i r o u xa n dh a n n h ，1 9 9 4 ) 玉米s h 2 突变出现在胚乳中，这必然 有另外的基因在胚和叶中编码a g p a s e 大亚基。事实上玉米胚中另一个编码大亚 基的转录子也在胚乳中被发现，但其量极低( w e b e re ta l ，1 9 9 5 ) 大豆中a g p a s e 小亚基的两个c d n a 克隆已被识别，它们表现组织表达专一性，一个仅表达于叶 中；另一个则表达于叶和子叶内( p r i o u le ta l ，1 9 9 4 ) 玉米中被识别的两个小 亚基的c d n a 也表现明显不同的组织专一性( d e n y e r e ta l ，1 9 9 6 ) 1 2 3 2 可溶性淀粉合成酶( s s s ) 可溶性淀粉合成酶的作用是在支链淀粉的合成过程中，通过1 ，4 - 糖替键将 a d p g 中的葡萄糖加到侧链的非还原端，延长侧链。s s s 根据其结构与功能可分 为：s s s i 、s s s i i 和s s s m 等多种同工型。研究表明，各同工酶对底物的亲和和 催化有长度特异性，s s s i 的功能可能主要是负责起始支链淀粉链的延长，合成短 链。链长延伸至一定的长度，不再适合s s s i 催化时，f l a s s si i 来负责合成中等长 度链而s s s l l i 贝i j 合成支链淀粉的长链。因此，单一辎s 同工酶的缺失不会使淀 粉合成终止，但能改变支链淀粉的分子结构和淀粉粒形态( c o m m u f ic t a l ，2 0 0 1 ) 如a i k o 等( 2 0 0 1 ) 研究发现，水稻a c 突变体中s s s i 活性比野生型显著降低，从而 导致了支链淀粉短链的显著减少。 1 2 3 3 淀粉分支酶( s b d s b e 是支链淀粉合成的关键酶，又称q 酶。它是一种具有双重催化作用的 酶，一方面它能切开a - 1 ，4 糖苷键连接的葡聚糖( 包括直链淀粉或支链淀粉的直 ，链区、，另一方面它又能把切下的短链通过a - 1 ，6 糖苷键连接于受体链上。该催 化反应不仅产生分支，而且非还原端可供a - 1 ，4 葡聚糖链进一步延伸。 s b e 有多种同工型。据b u r t o n 等( 1 9 9 5 ) 的工作，s b e 按其是否有n 末端 多肽延伸和c 端多肽延伸区分为同种型a 和b ：有n 末端多肽延伸的s b e 称其 为s b e b ，有c 端多肽延伸的s b e 称其为s b e a 。现在逐渐趋向于用同种型s b e i i 和s b e i 代替s b e a 和s b e b s b e 的催化作用具有底物特异性，b 型s b e ( 水 稻、玉米和马铃薯的s b ei ) 对转移较长分支的糖链催化活性高，以直链淀粉为 底物是活性明显高于a 型；a 型s b e ( 水稻的s b el l a 和s b ei i b 、玉米的s b el i b 及马铃薯的s b ei i ) 则相反，催化转移较短分支的糖链或以支链淀粉为底物时活 性相对较高( s m i t hc ta t ，1 9 9 7 ) 。两者均可被磷酸盐激活s b e 特定结构域的 分析结果表明，s b e 的。端可能对底物的专一性和催化活性，n - 端决定转移的 寡糖链的长度 s b e 编码基因呈现时间和组织特异表达b u r t o n 等( 1 9 9 5 ) 发现豌豆s b ei 在胚发育早期表达量相对较高，而s b e 2 在较晚时期表达n a i r 等( 1 9 9 r 7 ) 发现小 麦胚乳s b e1 i 基因的m g n a , s c 平在早期( 授粉后5 - 1 0 d ) 较高，而其后则下降；在 e 缺失型大肠杆菌中表达小麦s b e 2 基因c d n j 诃产生具有功能的s b e 。! m o r c l l 1 4 等( 1 9 9 7 ) 发现小麦s b e 2 在胚乳发育的中后期稳定表达。s b eia 和s b eib 在胚 乳发育后期表达。体外条件下，s b e i 对直链淀粉的亲和性高于s